Podłoże molekularne NF1 i RASopatii. Możliwości diagnostyczne. MONIKA G O S Z AKŁAD G ENETYKI MEDYCZ NEJ, I N STYTUT MATKI I DZIECKA SYMPOZJUM A LBA - JULIA WARSZAWA, 2-3.12.2017
Czym jest gen? Definicja: fragment DNA (lub u niektórych wirusów RNA) kodujący określone białko lub RNA. W bardziej potocznym rozumieniu gen jest odcinkiem DNA warunkującym wystąpienie określonej cechy organizmu. DNA RNA białko organizm - cegła - dach - okna - drzwi PROJEKT dom ZAMÓWIENIE PRODUKCJA PRODUKT
Jak dziedziczą się geny? Każdy człowiek ma w swoich komórkach po dwie kopie każdego chromosomu i w związku z tym po dwie kopie każdego genu. KOMÓRKI ROZRODCZE Każdy z rodziców przekazuje swojemu dziecku po jednym chromosomie z danej pary (czyli po jednej kopii). W efekcie każde ich dziecko posiada także dwie kopie danego chromosomu jedną odziedziczoną od mamy, drugą od taty. ZAPŁODNIENIE GENOTYP vs. FENOTYP
Cechy dominujące i recesywne
RASopatie dziedziczenie dominujące Choroba dziedzicząca się autosomalnie dominująco ujawnia się wtedy, gdy uszkodzony jest jeden allel danego genu. mutacje de novo (około 50% przypadków) mozaikowość somatyczna i/lub germinalna (bardzo rzadko)
RASopatie dziedziczenie dominujące Efekt plejotropowy Niepełna penetracja Zmienność obraz klinicznego WAŻNE: CHOROBA DZIEDZICZY SIĘ NIEZALEŻNIE OD PŁCI OSOBY CHOREJ LUB POTOMSTWA; RYZYKO POSIADANIA CHOREGO POTOMSTWA JEST STAŁE DLA KAŻDEJ KOLEJNEJ CIĄŻY I WYNOSI: 50% DLA DZIEDZICZENIA AUTOSOMALNEGO DOMINUJĄCEGO 25% DLA DZIEDZICZENIA AUTOSOMALNEGO RECESYWNEGO
Dlaczego RASopatie? RAS/MAPK
Podstawą prawidłowego funkcjonowania komórek jest wzajemne oddziaływanie białek szlaki przekazywania sygnału w komórce Źródło: Wikipedia
Szlak RAS/MAPK w komórce
Szlak RAS/MAPK w organizmie
Czym jest mutacja? Brak białka Białko o nieprawidłowej budowie X
Szlak RAS/MAPK a rozwój organizmu Mutacje germinalne zaburzenia rozwojowe RASopatie NS, CFCS, CS - dysmorfia twarzoczaszki - niskorosłość - wady serca - zaburzenia pigmentacji - wyższe ryzyko rozwoju nowotworów Mutacje germinalne podwyższona aktywność szlaku RAS/MAPK
Dlaczego RASopatie? RAS/MAPK
NF1 inne objawy kliniczne niż w przypadku klasycznych RASopatii (plamy CAL, guzki, glejaki) PhD thesis, Welti S.
Zespół Gen Częstość mutacji Locus Noonan PTPN11 SOS1 RAF1 KRAS RIT1 MAP2K1 BRAF NRAS 50% 10-13% 3-17% <5% 4-9% <2% <2% <1% 12q24.13 2p22.1 3p25.1 12p12.1 1q21.2 15q22.31 7q34 1p13.2 Costello HRAS 95-100% 11p15.5 CFC BRAF MAP2K1 MAP2K2 KRAS 75% 12% 12% <2% 7q34 15q22.31 19p13.3 12p12.1 NF1 NF1 95% 17q11.2 LEOPARD PTPN11 RAF1 razem 93% 12q24.13 3p25.1 Legius SPRED1? 15q14 Głównie mutacje punktowe, rzadziej delecje / duplikacje
Dlaczego powinno się wykonać diagnostykę molekularną? potwierdzenie rozpoznania klinicznego - prawidłowa diagnoza dla celów poradnictwa genetycznego dla celów prognostycznych (prognozowanie przebiegu choroby) dla celów terapeutycznych
KREW gdna MLPA RNA cdna sekwencjonowanie Metoda sekwencjonowanie MLPA ew. FISH MLPA Cytogenetyka Wykrywane mutacje nonsens, missens, małe delecje i insercje, mutacje splicingowe duże delecje małe delecje / duplikacje rearanżacje komplekowe
Sekwencjonowanie Sekwencjonowanie metodą Sangera (DNA, RNA) Sekwencjonowanie następnej generacji (DNA)
Badanie delecji /duplikacji (MLPA) Uwaga NF1: P122 vs. P081/P082 nazwa zestawu powinna być na wyniku badania
Doświadczenia własne Choroby: RASopatie zespół Noonan i inne NF1 (DNA, RNA) NF2 (DNA) Techniki: Sekwencjonowanie metodą Sangera (RNA, DNA) Sekwencjonowanie następnej generacji (panele własne panel RAsopatie) MLPA analiza delecji/duplikacji Badania statutowe IMiD: Nerwiakowłókniakowatość typu I podłoże molekularne choroby. Ocena korelacji pomiędzy obrazem klinicznym choroby a genotypem pacjenta. Granty Narodowego Centrum Nauki UMO-2011/01/D/NZ5/01347 i UMO-2013/09/B/NZ2/03164
NF1 sekwencjonowanie metodą Sangera MATRYCA: RNA (cdna) r. 1466_1527del r. 6757_6858del c.1466a>g, p.tyr489cys c.6792c>a, p.tyr2264ter Anna Abramowicz
Pacjenci NF1/NFNS/NS (NF1/NS - kwestionariusz kliniczny) Pacjenci Delecja 323 MLPA(243) 13; probantów (IMiD - PG, 10% PN; Gdańsk, Wrocław, Łódź, Białystok, Kraków) 288 NF1, NFNS 19, NS 6, zespół 30; Legiusa 22% 9 89 pacjentów zbadanych Delecja / 88 potencjalnie patogenna zmiana Sanger 21; + 16% /1/; 39 NGS/DNA; 37 rodziny: 45 osób RAZEM: 133 osoby (m/-) MLPA /1/; 6 MLPA; 8 Insercja 12; 9% Nonsens 30; 23% Sanger ; 34 Missens Splicing 27; 20% Sanger/RNA; 9
Pacjenci NF1/NFNS/NS I:1 I:2 c. 7206_7207delCA I:1 I:2 c.7907+3a>g/- II:1 II:2 c. 7206_7207delCA III:1 c. 7206_7207delCA -/- II:1 c.7907+3a>g/- II:2
Plany na przyszłość 1) zapewnienie kompleksowej opieki pacjentom z RASopatiami, z uwzględnieniem NF1 i zespołu Legiusa poradnia.nf1@imid.med.pl 2) kontynuacja badań dotyczących podłoża molekularnego RASopatii 3) zapewnienie kompleksowej diagnostyki molekularnej dla pacjentów z RASopatiami 4) stworzenie rejestru pacjentów z RASopatiami (wniosek do Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego)
Kontakt Zespół Pracowni Genetyki Molekularnej, Pracownia Genetyki Rozwoju dr Monika Gos, mgr Anna Abramowicz monika.gos@imid.med.pl; 22-32 77 176 Poradnia Neurofibromatoz dr Katarzyna Bilska poradnia.nf1@imid.med.pl Poradnia Genetyczna dr Natalia Bezniakow, dr Ewa Obersztyn natalia.bezniakow@imid.med.pl