WPŁYW CZYNNIKÓW FIZYCZNYCH I CHEMICZNYCH ORAZ WARUNKÓW PRZECHOWYWANIA NA WZROST BAKTERII PROBIOTYCZNYCH LACTOBACILLUS CASEI Probiotyki Probiotyki to pojedyncze lub mieszane kultury żywych mikroorganizmów, które podawane człowiekowi lub zwierzętom wywierają na ich organizmy korzystny wpływ, zapewniając właściwą równowagę mikroflory zasiedlającej organizm. Określenie probiotyk jest zastrzeżone do produktów lub preparatów, które spełniają następujące kryteria: zawierają żywe komórki mikroorganizmów, poprawiają stan zdrowia człowieka i zwierząt, spożyte wywierają korzystny efekt w jamie ustnej, bądź w przewodzie pokarmowym (podawane jako dodatki do żywności lub preparaty farmaceutyczne), w górnych drogach oddechowych (stosowane w postaci aerozoli) lub w przewodzie moczowo-płciowym (preparaty miejscowe). Przy rozpatrywaniu potencjalnie prozdrowotnych właściwości preparatów probiotycznych i produktów fermentowanych z udziałem mikroflory jelitowej należy uwzględnić, że produkt musi zawierać dostateczną liczbę żywych i aktywnych komórek w chwili spożycia, minimalnie 10 6 komórek/ml produktu. W przypadku autochtonicznej mikroflory jelitowej dominującym ilościowo jest rodzaj Bacteroides oraz Bifidobacterium i Lactobacillus. Mikroflora allochtoniczna, czyli przejściowa, w tym także chorobotwórcza, rywalizuje o miejsce bytowania i w niektórych sytuacjach (np. po kuracji antybiotykowej) wypiera prawidłowe mikroorganizmy. Podawanie preparatów probiotycznych pozwala przywrócić naturalną mikroflorę. Bakterie probiotyczne muszą być odporne na niskie ph soku żołądkowego i na sole żółci. 1
Do drobnoustrojów o udokumentowanych cechach probiotycznych zalicza się głównie bakterie kwasu mlekowego, np. Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, bakterie z rodzaju Bifidobacterium. Jako preparaty farmaceutyczne bądź suplementy do pasz dla zwierząt na rynku są dostępne także liczne niemlekowe szczepy np. Bacillus cereus ( toyoi ), B. clausii, B. pumilis, Escherichia coli (Nissle), Propionibacterium freudenreichii, P. jensenii, P. acidopropionici, P. thoenii oraz Saccharomyces cerevisiae ( boulardii ). Z wykorzystaniem tych szczepów produkuje się napoje fermentowane typu bio, np. bio-jogurty. Popularnym napojem jest także tzw. mleko acidofilne czy słodkie mleko bifidusowe. Wytwarza się je poprzez schłodzenie mleka (do 4C lub niżej), zaszczepienie kulturami bakterii Lactobacillus acidophilus i/lub Bifidobacterium bifidum, opakowanie i przechowywanie w temperaturze 4C aż do spożycia. Zapobiega to fermentacji i mleko zachowuje swój słodki smak. Lactobacillus casei Lactobacillus acidophilus Bifidobacterium Bifidobacterium sp. Lactobacillus sake Lactobacillus paracasei Bakterie kwasu mlekowego (LAB) Bakterie kwasu mlekowego (LAB z ang. lactic acid bacteria), inaczej bakterie fermentacji mlekowej, to niejednorodna grupa mikroorganizmów, które przeprowadzają beztlenową fermentację mlekową. Różnią się kształtem, tolerancją na ph, optymalną temperaturą, środowiskiem bytowania i sposobem metabolizowania cukrów. Zależnie od 2
gatunku bakterie fermentacji mlekowej produkują od 0,6 do 3% kwasu mlekowego. Kwas mlekowy wykazuje właściwości konserwujące. Zaliczamy tutaj gramdodatnie: regularne, nie przetrwalnikujące pałeczki: Lactobacillus ziarniaki : Streptococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus SYSTEMATYKA (WG SYSTEMA NATURAE 2000) Królestwo: Bakterie (Bacteria) Typ: Firmicutes Klasa: Bacilli Rząd: Lactobacillales Rodzina: Lactobacillaceae Rodzaj: Lactobacillus Rodzaj: Pediococcus Rodzina: Leuconostocaceae Rodzaj: Leuconostoc Rodzaj: Oenococcus Rodzina: Streptococcaceae Rodzaj: Streptococcus Rodzaj: Lactococcus Ze względu na podobne wykorzystanie i podobieństwo prowadzonych procesów coraz częściej do bakterii fermentacji mlekowej zaliczane są również nieregularne, nie przetrwalnikujące pałeczki Bifidobacterium (beztlenowce). Cechy charakterystyczne LAB grupa silnie zróżnicowana morfologicznie (pałeczki, laseczki, formy kuliste), nie wytwarzają przetrwalników, są to bakterie gramdodatnie, są beztlenowcami (zwykle względnymi, choć Bifidobacterium jest bardzo wrażliwe na tlen), mają zdolność rozkładu laktozy do kwasu mlekowego (który wykazuje właściwości konserwujące), 3
nie wytwarzają katalazy, nie redukują azotanów, do swojego wzrostu wymagają adeniny, tyminy i hipoksantyny. Bakterie fermentacji mlekowej często dzieli się ze względu na optimum temperaturowe i intensywność kwaszenia: gatunki mezofilne (20-28C) produkują do ok. 1,5% kwasu mlekowego, przedstawicielami są: Lactococcus lactis, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, rodzaj Leuconostoc, gatunki termofilne (40-45C) wytwarzają do 3% kwasu mlekowego, np. Lactobacillus delbrueckii, Streptococcus thermophilus. Streptococcus thermophilus Fermentacja mlekowa jest procesem przemiany cukrów do produktów końcowych, wśród których dominuje kwas mlekowy. Pozostałe produkty to: kwas octowy, aldehyd octowy, etanol, CO2, acetoina, diacetyl, butanodiol. Ze względu na szlaki przemian cukrów klasyfikuje bakterie mlekowe na: homofermentatywne, heterofermentatywne. HOMOFERMENTACJA MLEKOWA Jest to proces przemiany glukozy w szlaku EMP (rys. 1.), w wyniku którego tworzone są 2 cząsteczki pirogronianu. Powstały kwas pirogronowy pod wpływem dehydrogenazy mleczanowej i w obecności NADH podlega redukcji do kwasu mlekowego. Niewielka część pirogronianu ulega dekarboksylacji i powstają uboczne metabolity węglowe i CO2. 4
Typowymi przedstawicielami są: Lactococcus lactis, Lactobacillus delbrueckii Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus. Lactobacillus plantarum Lactobacillus delbrueckii Rys. 1. Homofermentacja glukozy Podczas hodowli bakterii mlekowych w mleku podstawowym substratem fermentacji jest laktoza. Wolna laktoza (u bakterii termofilnych) hydrolizowana jest wewnątrz komórki do glukozy i galaktozy (-galaktozydaza); glukoza wchodzi w szlak glikolityczny (EMP) 5
bezpośrednio, galaktoza jest przekształcana w ufosforylowaną glukozę w szlaku Leloira. Laktoza do komórki jest transportowana przez zależną od ATP permeazę laktozową zlokalizowaną w błonie cytoplazmatycznej. Transport laktozy do wnętrza bakterii mezofilnych odbywa się z jednoczesną jej fosforylacją przez fosfotransferazę (PTF), z udziałem fosfoenolopirogronianu (PEP). Ufosforylowana laktoza jest hydrolizowana przez fosfo--galaktozydazę do glukozy i galaktozo-6-fosforanu, który następnie jest przekształcany do fosfodihydroksyacetonu i aldehydu trifosfoglicerynowego (szlak tagatozowy) i w takiej postaci są włączane do szlaku EMP (rys. 2.). Rys. 2. Homofermentatywna przemiana laktozy przez bakterie fermentacji mlekowej HETEROFERMENTACJA MLEKOWA Jest procesem przemiany glukozy w szlaku fosfoketolazy pentozowej, który jest odgałęzieniem cyklu heksozomonofosforanowego (HMP). W wyniku tych przemian z 1 mola glukozy powstaje 1 mol kwasu mlekowego, 1 mol kwasu octowego (warunki tlenowe) lub etanolu (warunki beztlenowe) oraz 1 mol CO 2 (rys. 3.). Heterofermentatywne bakterie pobierają laktozę ze środowiska za pomocą systemu PEP/PTS z jednoczesną jej fosforylacją. 6
Typowymi przedstawicielami są: Lactobacillus brevis, Lactobacillus fermentum oraz bakterie z rodzaju Leuconostoc. Rys. 3. Heterofermentacja glukozy (szlak fosfoketolazy pentozowej) Rys. 4. Heterofermentatywna przemiana laktozy przez bakterie fermentacji mlekowej 7
Lotne metabolity fermentacji mlekowej Bakterie mlekowe oprócz kwasu mlekowego produkują wiele związków nadających wyrobom fermentowanym specyficzny aromat. Do najważniejszych lotnych związków tworzonych przez bakterie fermentacji mlekowej należą: diacetyl, aldehyd octowy, kwas octowy, alkohol etylowy, w mniejszych ilościach kwasy lotne (propionowy, mrówkowy), lotne kwasy tłuszczowe, alkohole, aceton i estry. Diacetyl Jest to diketon (CH3COCOCH3), o temperaturze wrzenia 88 C, daje orzechowy aromat. W wyrobach fermentowanych typu wino, piwo czy fermentowane wędliny uważa się go za składnik niekorzystny, natomiast jest podstawowym i pożądanym składnikiem aromatu masła, śmietany, mlecznych napojów fermentowanych i serów twarogowych. W produktach mlecznych jest tworzony przez Lactococcus lactis ssp. lactis var. diacetylactis (do 10 mg/dm 3 ) oraz Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris (do 5 mg/dm 3 ). Diacetyl jest produkowany z pirogronianu powstającego w wyniku fermentacji cytrynianów (rys. 5.), stąd poziom diacetylu zależy od zawartości cytrynianów w mleku. Mleko zawiera średnio 0,2% cytrynianu. Przy ph poniżej 5,0 wykorzystanie cytrynianu jest niskie. Rys. 5. Biosynteza diacetylu przez bakterie fermentacji mlekowej 8
Aldehyd octowy Bardzo lotny związek, o temperaturze wrzenia 20 C, wyczuwalny już w stężeniu 0,4 mg/dm 3. Istotny składnik aromatu produktów mleczarskich, niepożądany w maśle, śmietanie i serach (posmak trawiasty), niezbędny w jogurtach (typowy aromat to 10-15 mg aldehydu/kg). Aldehyd octowy powstaje w wyniku metabolizmu glukozy, laktozy, kwasów nukleinowych i treoniny. Gatunki: Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus Etanol Charakterystyczny składnik napojów mlecznych typu kefir czy kumys, jednak powstaje w nich głównie w wyniku fermentacji laktozy przez drożdże. Rodzaj Lactobacillus Do rodzaju Lactobacillus należy ok. 110 gatunków, występujących pospolicie na roślinach, błonach śluzowych i w mleku. Tworzą komórki proste o długości kilku mm, pojedyncze lub w łańcuszkach, nieruchliwe, gramdodatnie, katalazoujemne, względnie beztlenowe; lepiej rosną w atmosferze wzbogaconej w 10% CO2. Zależnie od gatunku zdolne do wzrostu w zakresie temperatur od 10 do 55 C L. casei Najważniejsze gatunki: L. acidophilus, L. amylovorus, L. casei, L. crispatus, L. gasseri, L. paracasei, L. plantarum, L. reuteri, L. rhamnosus. 9
Najważniejsze priobiotyczne szczepy o znaczeniu przemysłowym i przypisywane im właściwości zdrowotne Lactobacillus rhamnosus GG (ATCC 53013) Kolonizacja przewodu pokarmowego, obniżenie aktywności enzymów fekalnych, ochrona przed biegunkami po antybiotykoterapii, leczenie i zapobieganie biegunkom rotawirusowym, leczenie powracających biegunek spowodowanych przez Clostridium difficile, ochrona przed ostrymi biegunkami, leczenie choroby Crohna i dziecięcego artretyzmu reumatoidalnego, właściwości antagonistyczne w stosunku do bakterii wywołujących próchnicę zębów. Lactobacillus casei Shirota Ochrona przed zaburzeniami jelitowymi, leczenie biegunek rotawirusowych, utrzymywanie w równowadze mikroflory jelitowej, obniżanie aktywności enzymów fekalnych, ochrona przed mutagenami pokarmowymi, pozytywne efekty w leczeniu raka pęcherza moczowego,wspomaganie układu odpornościowego we wczesnych stadiach raka okrężnicy, brak wpływu na system immunologiczny zdrowych osobników, leczenie obstrukcji. Lactobacillus acidophilus NCFB 1748 Obniżanie aktywności enzymów fekalnych, zapobieganie biegunkom po radioterapii, leczenie obstrukcji. Lactobacillus casei Defensis DN 114 001 Stymulacja układu odpornościowego, zapobieganie i leczenie infekcji jelitowych, zmniejszenie częstości i skrócenie czasu trwania ostrych biegunek u dzieci, dobra przeżywalność w żołądku i dwunastnicy. Bifidobacterium animalis DN 173 010 Wysoka przeżywalność w żołądku i dwunastnicy. Pozytywne efekty w skróceniu pasażu jelitowego pokarmu, szczególnie u osób starszych. 10
Lactobacillus Johnsonie (La1) (NCC533) Adherencja do komórek ludzkiego jelita, stymulacja układu odpornościowego, pozytywne efekty w leczeniu nieżytów przewodu pokarmowego, antagonizm w stosunku do Helicobacter pylori. Bifidobacterium breve Yakult Ochrona przed mutagenami pokarmowymi, utrzymanie w równowadze mikroflory jelitowej, ochrona przed biegunkami. Lactobacillus acidophilus NCFM Obniżenie aktywności enzymów fekalnych, wysoka aktywność -galaktozydazy, dobra przeżywalność w przewodzie pokarmowym Lactobacillus acidophilus LA-5 LA-5 jest szczepem Lactobacillus acidophilus pochodzącym z kolekcji czystych kultur Chr. Hansen's. Od 1979 roku szczep jest stosowany jako dodatek do żywności i jak dotąd nie zaobserwowano działań ubocznych. LA-5 wywiera pozytywny wpływ na zdrowie przewodu pokarmowego. Badania potwierdzają, że LA-5 p oprawia funkcjonowanie jelita, łagodzi zaparcia, poprawia właściwości kału i mikroflory, przywraca mikroflorę jelitową po kuracji antybiotykowej, może zmniejszać ryzyko biegunek podróżnych 11