Imię i nazwisko Uzyskane punkty Nr albumu data /3 podpis asystenta ĆWICZENIE 5 ANALIZA JAKOŚCIOWA WĘGLOWODANÓW Wstęp merytoryczny Węglowodany (syn. cukry, cukrowce sacharydy) należą do grupy związków organicznych o charakterze polihydroksyaldehydów (aldozy) lub polihydroksyketonów (ketozy). Związki te powszechnie występują w organizmach żywych stanowiąc około 80% suchej masy organizmów roślinnych i do 2% suchej masy organizmów zwierzęcych. Najpowszechniej występującymi w komórkach węglowodanami są triozy, pentozy i heksozy zawierające odpowiednio 3, 5 i 6 atomów węgla w cząsteczce. Ze względu na budowę węglowodany wyróżnia się: - monosacharydy (cukry proste), które nie podlegają hydrolizie do prostszych związków cukrowych; - disacharydy, które ulegają hydrolizie na dwie cząsteczki cukrów prostych; - oligosacharydy zawierające od 3 do 10 cząsteczek monosacharydów połączonych wiązaniami glikozydowymi - polisacharydy zawierające w swojej strukturze więcej niż 10 cząsteczek monosacharydów. Monosacharydy Monosacharydy (syn. cukry proste) mogą występować w postaci anomerów D i L. W organizmach żywych występują prawie wyłącznie izomery szeregu D, gdyż jedynie one mają możliwość prawidłowego dopasowania się do chiralnie ukształtowanej struktury centrum katalitycznego enzymów. U ssaków wyjątkiem są: L-fukoza, L-gulonian i L-iduronian. L-fukoza występuje głównie w postaci związanej w łańcuchach oligosacharydowych glikoprotein i glikolipidów błonowych i rozpuszczalnych, stanowiąc m.in. stanowi istotny element antygenów grupowych krwi ABH oraz struktur cukrowych typu Lewisx, Lewisy, Lewisa i Lewisb. Cukier ten odgrywa znaczącą rolę w procesach rozpoznawania komórek oraz oddziaływań pomiędzy komórkami i macierzą zewnątrzkomórkową. L-gulonian i L-iduronian, będące metabolitami glukozy, są odpowiednio: metabolitem szlaku kwasu uronowego i składnikiem glikozaminoglikanów. Monosacharydy w roztworach wodnych mają strukturę pierścieniową, przyjmowaną w wyniku utworzenia wewnątrzcząsteczkowego hemiacetalu lub hemiketalu. Powstający wtedy sześcioczłonowy układ cykliczny nosi nazwę pierścienia piranowego, zaś pięcioczłonowy pierścienia furanowego. str. 1
Efektem zajścia cyklizacji jest pojawienie się dodatkowego asymetrycznego atomu węgla w cząsteczce monosacharydu (węgiel C1 w przypadku pierścienia piranowego lub C2 w przypadku pierścienia furanowego), przy którym znajduje się dodatkowa grupa hydroksylowa. Powstałe w ten sposób nowe formy cukrów określa się jako anomery α- i β-. Różnią się one między sobą skręcalnością właściwą i mogą wzajemnie w siebie przechodzić (zjawisko mutarotacji). Monosacharydy wykazują właściwości redukujące. Do najważniejszych ze względów monosacharydów występujących u zwierząt należą: ryboza i deoksyryboza: pentozy występujące w strukturze nukleotydów. glukoza: główny cukier metaboliczny (substrat energetyczny dostarczający 4 kcal/g = 17kJ/g energii), w stanie wolnym występuje w owocach i miodzie, składnik disacharydów (laktozy, mannozy, sacharozy), magazynowany w postaci polisacharydów (skrobia, glikogen). Do najważniejszych przemian metabolicznych glukozy należą: glikoliza (utlenianie), glukoneogeneza (biosynteza z substratów niecukrowych), glikogenogeneza (biosynteza glikogenu), glikogenoliza (katabolizm glikogenu), cykl pentozofosforanowy (dostarczanie równoważników redukcyjnych do reakcji redukcji oraz cukrów pięciowęglowych) oraz procesy glikozylacji białek. Nadmierne spożycie glukozy prowadzi do rozwoju nadwagi i otyłości. fruktoza: występuje w stanie wolnym w owocach, nektarze, miodzie oraz spermie ssaków (materiał energetyczny wykorzystywany przez plemniki), składnik sacharozy. U ssaków metabolizowana w mięśniach i tkance tłuszczowej oraz wątrobie (odpowiednio do fruktozo-1-fosforanu lub fruktozo-6-fosforanu włączanych do glikolizy), a także w plemnikach. Nadmierne spożycie fruktozy prowadzić może m.in. do rozwoju nadwagi i otyłości, zespołu metabolicznego oraz zaburzenia żołądkowo-jelitowe. galaktoza: składnik laktozy, antygenów zgodności grupowych erytrocytów (układu AB0) oraz substancji mózgu, wykorzystywana jako substrat energetyczny po przekształceniu w UDP-glukozę (szlak Leloira). str. 2
Disacharydy Disacharydy (syn. dwucukry) zbudowane są z dwóch cząsteczek monosacharydów połączonych wiązaniem glikozydowym. Wyróżnia się wśród nich grupę trehaloz (wiązanie glikozydowi tworzone jest pomiędzy grupami -OH znajdującymi się przy węglach asymetrycznych obu cząsteczek monosacharydów, np. sacharoza) oraz grupę maltozy (wiązanie glikozydowi tworzone jest pomiędzy grupami -OH znajdującymi się odpowiednio przy węglu asymetrycznym jednej cząsteczki oraz przy węglu 3, 4 lub 6 drugiej cząsteczki monosacharydu, np. laktoza, maltoza). sacharoza (syn. cukier buraczany): zbudowana z α-d-glukozy i -D-fruktozy połączonych za pomocą wiązania α,β-1,2-glikozydowego, występuje w burakach cukrowych i trzcinie cukrowej, nie wykazuje właściwości redukujących, podlega hydrolizie przy udziale sacharozo-izomaltazy dwufunkcyjnego enzymu rąbka szczoteczkowego nabłonka jelitowego z grupy disacharydaz; laktoza (syn. cukier mlekowy): zbudowana z -D-galaktozy i D-glukozy połączonych za pomocą wiązania β-1,4-glikozydowego, występuje w mleku ssaków, wykazuje właściwości redukujące, podlega hydrolizie przy udziale laktazy - enzymu rąbka szczoteczkowego nabłonka jelitowego z grupy disacharydaz; maltoza (syn. cukier słodowy): zbudowana z dwóch cząsteczek D-glukozy połączonych za pomocą wiązania α-1,4-glikozydowego, produkt katabolizmu glikogenu i skrobi, wykazuje właściwości redukujące, podlega hydrolizie przy udziale maltazy - enzymu rąbka szczoteczkowego nabłonka jelitowego z grupy disacharydaz; trehaloza: zbudowana z dwóch cząsteczek α-d-glukozy połączonych za pomocą wiązania O-glikozydowego, główny cukier organizmów niższych (glony, grzyby), nie posiada właściwości redukujących, podlega hydrolizie przy udziale trehalazy - enzymu rąbka szczoteczkowego nabłonka jelitowego z grupy disacharydaz; izomaltoza: zbudowana z dwóch cząsteczek α-d-glukozy połączonych za pomocą wiązania α-1-6-glikozydowego, podlega hydrolizie przy udziale sacharozo-izomaltazy dwufunkcyjnego enzymu rąbka szczoteczkowego nabłonka jelitowego z grupy disacharydaz. Polisacharydy Polisacharydy są to nierozpuszczalne w wodzie produkty polikondensacji cukrów prostych, pozbawione słodkiego smaku. W organizmach żywych pełnią funkcję zapasową i strukturalną. Ze względu na budowę wyróżnia się homopolisacharydy (zbudowane z jednakowych jednostek cukrowych) oraz heteropolisacharydy (zbudowane z różnych monosacharydów i ich pochodnych). Do najważniejszych polisacharydów zalicza się: skrobię: materiał zapasowy roślin, zbudowana z dwóch rodzajów cząsteczek: amylozy (nierozgałęziona, zbudowana z około 300 cząsteczek D-glukozy połączonych za pomocą wiązań α-1,4-glikozydowych, stanowi 20 35% struktury skrobi) oraz amylopektyny (rozgałęziona, zbudowana z cząsteczek D-glukozy połączonych za pomocą wiązań α-1,4- i α-1,6-glikozydowych, stanowi 65-80%), podlega hydrolizie przy udziale α-amylaz: ślinowej i trzustkowej do mieszaniny dekstryn, glukozy, maltozy i izomaltozy; glikogen: materiał zapasowy zwierząt (wątroba, mięśnie) i grzybów, zbudowany z cząsteczek D-glukozy połączonych w proste łańcuchy wiązaniami α-1,4-glikozydowymi, w których co 8 12 monomerów występuje rozgałęzienie tworzone przez wiązanie α-1,6-glikozydowe, w przewodzie pokarmowym podlega hydrolizie przy udziale α-amylaz: ślinowej i trzustkowej, zaś w wątrobie i mięśniach podlega reakcjom fosforolizy i hydrolizy odpowiednio przy udziale fosforylazy str. 3
glikogenowej (wiązania 1,4-glikozydowe) i enzymu usuwającego rozgałęzienia (wiązania 1,6-glikozydowe) do glukozo-1-fosforanu i glukozy; celulozę (syn. błonnik): materiał strukturalny roślin, glonów, grzybów i niektórych protestów, zbudowana z 3000-14000 cząsteczek -D-glukozy połączonych wiązaniami β-1,4-glikozydowymi, nie podlega trawieniu w przewodzie pokarmowym większości ssaków (u człowieka hydrolizę mogą w ograniczonym stopniu prowadzić mikroorganizmy flory bakteryjnej jelita grubego); chitynę: składnik pancerzy owadów i skorupiaków, materiał strukturalny grzybów, zbudowany z monomerów N-acetylo-D-glukozoaminy połączonych wiązaniami β-1,4- glikozydowymi, nie podlega trawieniu w przewodzie pokarmowym większości ssaków; glikozoaminoglikany (syn. mukopolisacharydy): heteroglikany zawierające oprócz składników cukrowych (aminocukry) kwasy uronowe, składniki proteoglikanów (substancja podstawowa tkanki łącznej) zatrzymujące wodę i mające zdolność pęcznienia; glikoproteiny: białka zawierające w strukturze łańcuchy poliwęglowodanowe, składniki błon komórkowych, wydzielin śluzowych oraz osocza krwi. CZĘŚĆ I WYKRYWANIE WĘGLOWODANÓW Doświadczenie 1 Cel: Odróżnianie cukrowców od innych związków organicznych za pomocą Molischa. Reakcja Molischa jest reakcją umożliwiającą wstępne wykrycie w badanej próbce zarówno węglowodanów wolnych jak i związanych. Ujemny jej wynik wyklucza obecność cukru, dodatni zaś nie zawsze jest wystarczający do stwierdzenia jego obecności, gdyż podobną reakcję dają aldehydy, aceton i inne związki. Reakcja Molischa polega na kondensacji pochodnych furfuralowych (utworzonych przez odwodnienie i cyklizację cukru w środowisku stężonego kwasu mineralnego) z α-naftolem, co przejawia się powstaniem czerwono-fioletowego zabarwienia. Do 0.5 cm 3 roztworów wzorcowych cukrów, analizowanego cukru oraz wody należy dodać po 2 krople roztworu α-naftolu, a następnie dokładnie wymieszać zawartość probówek. Następnie należy ostrożnie podwarstwić próbki dodając 0.5 cm 3 stężonego H 2 SO 4 (kwas należy powoli wprowadzić po ściance skośnie ustawionych probówek). Nie należy mieszać zawartości probówek. 2% etanolowy roztwór α-naftolu stężony H 2 SO 4 (pod wyciągiem) str. 4
Doświadczenie 2 Cel: Odróżnianie cukrów redukujących od nieredukujących 2.1. Reakcja Fehlinga Monosacharydy (aldozy, ketozy) posiadające wolną grupę aldehydową lub ketonową mają właściwości redukcyjne - dają pozytywny wynik reakcji Fehlinga. Reagentami w tej reakcji są: roztwór CuSO 4 (odczynnik Fehlinga I) i alkaliczny roztwór winianu sodowo-potasowego (odczynnik Fehlinga II). W obecności cukrów redukujących wodorotlenek miedzi (II), powstały przez zmieszanie odczynników I i II, ulega redukcji do ceglastoczerwonego tlenku miedzi(i) (Cu 2 O). Do 0.5 cm 3 roztworów wzorcowych cukrów, analizowanego cukru oraz wody należy dodać 0.5 cm 3 odczynnika Fehlinga I i 0.5 cm 3 odczynnika Fehlinga II. Po wymieszaniu roztworów probówki należy inkubować przez kilka minut w temperaturze powyżej 85 o C. odczynniki Fehlinga I i II str. 5
2.2. Reakcja Benedicta Cukry redukujące powodują redukcję jonów Cu 2+ do jonów Cu +. W ćwiczeniu stosuje się niebiesko zabarwiony odczynnik Benedicta (roztwór zasadowy, zawierający kompleksowy miedzi(ii) z anionami kwasu cytrynowego). W wyniku redukcji jonów Cu 2+ wytrąca się ceglastoczerwony osad tlenku miedzi(i) (Cu 2 O). Reakcja ta należy do najbardziej czułych prób na właściwości redukcyjne cukrów. Do 0.5 cm 3 roztworów wzorcowych cukrów, analizowanego cukru oraz wody proszę dodać po 1 cm 3 odczynnika Benedicta. Po wymieszaniu roztworów probówki należy inkubować przez kilka minut w temperaturze powyżej 85 o C. odczynnik Benedicta str. 6
2.3. Odróżnianie monosacharydów od disacharydów redukujących - Barfoeda Reakcja ta pozwala na odróżnienie mono- od disacharydów redukujących na podstawie redukcji w środowisku lekko kwasowym. W odpowiednich warunkach (ph oraz czas) utleniają się tylko monosacharydy. Jednocześnie jony Cu 2+ ulegają redukcji do jonów Cu + i wytrąca się ceglastoczerwony osad tlenku miedzi (I) (Cu 2 O). Disacharydy po dłuższym ogrzewaniu (powyżej 15 minut), gdy ulegną hydrolizie do monosacharydów, również mogą dać wynik dodatni. Odczynnik Barfoeda zawiera octan miedzi (II) w kwasie mlekowym. Do 0.5 cm 3 roztworów wzorcowych cukrów, analizowanego cukru oraz wody należy dodać po 2.5 cm 3 odczynnika Barfoeda i inkubować próbki przez kilka minut w temperaturze powyżej 85 o C. odczynnik Barfoeda str. 7
Doświadczenie 3 Cel: Odróżnianie pentoz od heksoz za pomocą reakcji Biala. Pentozy w środowisku stężonego kwasu solnego ulegają odwodnieniu do furfuralu, który w obecności jonów żelaza(iii) tworzy z orcynolem zielony (lub zielono-niebieski) produkt. Do 0.5 cm 3 roztworów wzorcowych cukrów, analizowanego cukru oraz wody należy dodać 2 cm 3 odczynnika Biala. Po wymieszaniu roztworów probówki należy inkubować przez kilka minut w temperaturze powyżej 85 o C. odczynnik Biala str. 8
Doświadczenie 4 Cel: Odróżnianie ketoz od aldoz za pomocą reakcji Seliwanowa Otrzymany w wyniku dehydratacji ketoz (dla których przebiega znacznie szybciej niż dla aldoz) w środowisku kwaśnym 5-hydroksyfurfural kondensuje z rezorcyną tworząc barwny (czerwonawołososiowy). Warunkiem uzyskania prawidłowego wyniku reakcji jest odpowiednie stężenie kwasu (12%) oraz czas ogrzewania (nie dłuższy niż 60 sekund), w przeciwnym razie jest nieswoista dla ketoz. Do 0.5 cm 3 roztworów wzorcowych cukrów, analizowanego cukru oraz wody należy dodać po 0.5 cm 3 odczynnika Seliwanowa i wstawić na 60 sekund do wrzącej łaźni wodnej. odczynnik Seliwanowa str. 9
Cel: Wykrywanie skrobi za pomocą reakcji z jodem Doświadczenie 5 Reakcja polega na zdolności tworzenia przez skrobię barwnych połączeń z jodem. W środowisku wodnym skrobia daje z odczynnikiem Lugola (I 2 w roztworze KI) produkt o barwie granatowej powstający w wyniku wniknięcia cząsteczek jodu w helikalną strukturę łańcucha polisacharydowego. Do 0.5 cm 3 roztworów wzorcowych cukrów, analizowanego cukru oraz wody należy dodać kilka kropli odczynnika Lugola i wymieszać zawartość probówek. 1% roztwory: glukozy, maltozy, skrobi i nieznanego cukru odczynnik Lugola str. 10
Biochemia z elementami Chemii CZĘŚĆ II ANALIZA NIEZNANYCH WĘGLOWODANÓW Na podstawie prób wykonanych dla nieznanych roztworów dokonaj ich identyfikacji. Molisha Fehlinga Benedicta Barfoeda Biala Seliwanowa z I 2 w KI glukoza + + + + słabo - - - fruktoza + + + arabinoza + + + + słabo + słabo - brunatny + niebieskozielony sacharoza + - - - - brunatny + - - - + - maltoza + + słabo + - - - - trehaloza + - - - - - - skrobia + - - - - - + Numer badanej próbki str. 11