PODSTAWY INTERPRETACJI WIDM MASOWYCH
1. Ustalanie masy cząsteczkowej Metody: widmo EI 70 ev i np. 12 ev; łagodne metody jonizacji (FAB, LSIMS, CI, ESI, APCI, MALDI, FI) w celu otrzymania jonu molekularnego.
TERMINOLOGIA Jon molekularny: jon o masie równej masie czasteczkowej badanego związku (z dokładnością do masy elektronu) powstający w wyniku oderwania lub (znacznie rzadziej) przyłączenia elektronu przez cząsteczkę. Jon pseudomolekularny, quasimolekularny lub jon typu jonu molekularnego: jon powstający w wyniku przyłączenia prostego jonu (najczęściej H +, Na +, Cl - ) do cząsteczki badanego związku lub oderwania jonu H + od tej cząsteczki. Obecnie zaleca się stosowanie nazw typu: protonowana cząsteczka, deprotonowana cząsteczka itp.
REGUŁA AZOTOWA Parzysta liczba atomów azotu = = parzysta masa cząsteczkowa (nominalna) Nieparzysta liczba atomów azotu = = nieparzysta masa cząsteczkowa (nominalna) W spektrometrii mas dotyczy jonów nieparzystoelektronowych. Dla jonów parzystoelektronowych jest na odwrót. Jony parzystoelektronowe: M + H +, M H +, M + Na +, M + Cl itp. powstają w wyniku jonizacji ESI, APCI, MALDI Jony nieparzystoelektronowe: M + powstają w wyniku jonizacji EI
LICZBA MIEJSC NIENASYCENIA Dla cząsteczki o wzorze C x H y N z O n liczba miejsc nienasycenia N wynosi: N = x z 1 y + 1 + 2 2 Ogólniej: typ x: C,Si typ y: typ z: 1 H, F, Cl, Br, I N, P typ n: O, S Dla cząsteczek obojętnych i kationo- lub anionorodników liczba miejsc nienasycenia musi być całkowita i dodatnia lub równa 0. Dla jonów parzystoelektronowych ułamkowa i nie mniejsza niż 0.5.
Warunki, które musi spełnić jon molekularny w widmie EI (konieczne, ale nie wystarczające) 1. Musi być jonem o najwyższej masie w danym widmie (z uwzględnieniem jonów izotopowych). 2. Musi być jonem nieparzystoelektronowym, czyli odpowiadający mu wzór sumaryczny musi spełniać regułę azotową. 3. Masy najbliższych mu jonów fragmentacyjnych (czyli fragmentów o najwyższych masach) muszą dać się wyjaśnić utratą fragmentów obojętnych (cząsteczek lub rodników) o logicznych masach.
5. W przypadku próbek o charakterze amfoterycznym (np. peptydy) dodatni jon pseudomolekularny powinien mieć masę o dwie jednostki większą niż ujemny jon pseudomolekularny (dotyczy jonów M + H + i M H + ). Warunki, które musi spełnić jon pseudomolekularny w widmie LSIMS, ESI lub APCI 1. Musi być jonem parzystoelektronowym, a odpowiadający mu wzór sumaryczny musi spełniać regułę azotową po odjęciu lub dodaniu jonu odpowiedzialnego za jonizację (najczęściej H +, Na +, Cl - itp.). 2. Jego masa musi umożliwić wyjaśnienie obecności ewentualnych klasterów typu (nm+ Kat) +, (nm Kat) lub (nm+ A), a także klasterów z matrycą (w LSIMS) lub rozpuszczalnikiem (w ESI). 3. Jego masa musi być zgodna z masami obserwowanych jonów naładowanych wielokrotnie (w ESI, czasem także w LSIMS). 4. W większości przypadków zakwaszenie próbki powinno spowodować wzrost intensywności jonu M + H +, a dodanie soli sodowej jonu M + Na +.
Zależność wyglądu widma EI octanu etylu od energii elektronów 43 61 70 88 M + O C H 3 C O CH 2 CH 3 M = 88
PROFILE IZOTOPOWE JONÓW W FUNKCJI ICH MASY C 3 H 7 NO 2 C 6 H 12 N 2 O 3 C 15 H 33 N 5 O 9 C 30 H 68 N 10 O 19 C 60 H 138 N 20 O 39 C 150 H 348 N 50 O 99 89 89.05 89.09 160 160.09 160.17 Masa nominalna 427 427.23 427.43 872 872.47 89.93 1762 1762.94 1763.87 4432 4434.37 4436.69 Masa monoizotopowa Masa średnia
Przykład widma związku cynoorganicznego Sn,10 111.90482300, 0.95, 1 113.90278100, 0.65, 1 114.90334410, 0.34, 1 115.90174350, 14.24, 1 116.90295360, 7.57, 1 117.90160660, 24.01, 1 118.90331020, 8.58, 1 119.90219900, 32.97, 1 121.90344000, 4.71, 1 123.90527100, 5.98, 1 Sn M = 236 M +
2. Jaki jest skład elementarny związku (wzór sumaryczny)? Metody: dokładny pomiar masy jonu molekularnego lub peudomolekularnego i komputerowe dopasowanie możliwych składów elementarnych, badanie profilu izotopowego.
H, 2 Dokładne masy atomowe i składy izotopowe najlżejszych pierwiastków 1.00782504, 99.985 2.01410179, 0.015 He, 2 3.01602930, 0.00013 4.00260325, 99.99987 Li, 2 6.01512320, 7.52 7.01600450, 92.48 Be, 1 9.01218250, 100.0 B, 2 10.01293800, 18.98 11.00930530, 81.02 C, 2 12.00000000, 98.892 13.00335484, 1.108 N, 2 14.00307401, 99.635 15.00010898, 0.365 O, 3 15.99491464, 99.759 16.99913060, 0.037 17.99915939, 0.204 F, 1 18.99840325, 100.0 Ne, 3 19.99243910, 90.92 20.99384530, 0.257 21.99138370, 8.82 Na, 1 22.98976970, 100.0 Mg, 3 23.98504500, 78.60 24.98583920, 10.11 25.98259540, 11.29 Al, 1 26.98154130, 100.0 Si, 3 27.97692840, 92.18 28.97649640, 4.71 29.97377170, 3.12 P, 1 30.97376340, 100.0 S, 4 31.97207180, 95.018 32.97145910, 0.750 33.96786774, 4.215 35.96707900, 0.107 Cl, 2 34.96885273, 75.4 36.96590262, 24.6
Definicje zdolności rozdzielczej spektrometru mas R 10% = M M M FWHM = M M h M h 0,5 h 0,1 h M 0,05 h 10%-owa dolina (R 10% ) - odpowiada szerokości na poziomie 5% M Szerokość połówkowa (FWHM Full Width at Half Maximum)
Wpływ definicji zdolności rozdzielczej spektrometru na wygląd widma R 10% FWHM Widma dla takiej samej nominalnie rozdzielczości R 10% i FWHM
Przykład wymagań dotyczących rozdzielczości niezbędnej dla rozróżnienia pików M M R CO 27,9949 0,0113 2478 N 2 28,0062 0,0250 1120 C 2 H 4 28,0312
Wpływ zdolności rozdzielczej spektrometru na wygląd widma 100 80 60 40 20 0 R = 10 000 100 80 60 40 20 0 R = 5 000 100 80 60 40 20 0 R = 3 000 M 1 =100,00 M 2 =100,02
Wpływ masy jonów przy stałej różnicy masy i rozdzielczości na wygląd widma 100 80 60 40 20 0 R = 10 000 M = 100 M = 0,02 100 80 60 40 20 0 R = 10 000 M = 200 M = 0,02 100 80 60 40 20 0 R = 10 000 M = 350 M = 0,02
Ważne: Dokładny pomiar masy - wymagania Dokładny pomiar masy nie zastępuje analizy elementarnej, ponieważ nie dostarcza informacji o czystości próbki. Pozwala jedynie na stwierdzenie, że w widmie masowym badanej próbki znajduje się pik o masie odpowiadającej założonemu wzorowi sumarycznemu. Czystość związku należy udowodnić w inny sposób. Wymagania większości czasopism odnośnie dokładnych pomiarów masy są następujące: 1. Pomiar musi dotyczyć jonu molekularnego lub pseudomolekularnego (a nie jonów fragmentacyjnych). 2. Dokładność pomiaru powinna wynosić 5 ppm (w niektórych czasopismach dopuszcza się 10 ppm). 3. Można mierzyć masy nie przekraczające 800 u.
Wpływ dokładności pomiaru masy na liczbę możliwych wzorów sumarycznych Elements: C12:20 H1:30 N14:4 O16:6 S32:l Tolerance window: 2 mmu (ok. 8 ppm) Mass Deviation Formula (u) (mmu) 260.08306.0 C:10 H:16 N:2 O:4 S:l -.7 C:16 H:10 N:3 O:l S:0.7 C:18 H:12 N:0 O:2 S:0 Elements: C12:20 H1:30 N14:4 O16:6 S32:l Tolerance window: 5 mmu (ok. 19 ppm) Mass Deviation Formula (u) (mmu) 260.08306-4.0 C:5 H:16 N:4 O:6 S:l.0 C:10 H:16 N:2 O:4 S:l -3.4 C:13 H:12 N:2 O:4 S:0 2.7 C:13 H:14 N:3 O:1 S:l 4.0 C:15 H:16 N:0 O:2 S:l -.7 C:16 H:10 N:3 O:1 S:0.7 C:18 H:12 N:0 O:2 S:0
Wpływ wyboru pierwiastków na liczbę możliwych wzorów sumarycznych Elements: C12:12 H1:30 N14:4 O16:4 S32:l Tolerance window: 5 mmu Mass Deviation Formula (u) (mmu) 260.08306.0 C:10 H:16 N:2 O:4 S:l Elements: C12:16 H1:30 N14:4 O16:4 S32:l Tolerance window: 5 mmu Mass Deviation Formula (u) (mmu) 260.08306.0 C:10 H:16 N:2 O:4 S:l -3.4 C:13 H:12 N:2 O:4 S:0 2.7 C:13 H:14 N:3 O:1 S:l 4.0 C:15 H:16 N:0 O:2 S:l -.7 C:16 H:10 N:3 O:1 S:0 Elements: C12:16 H1:30 N14:4 O16:4 Tolerance window: 5 mmu Mass Deviation Formula (u) (mmu) 260.08306-3.4 C:13 H:12 N:2 O:4 -.7 C:16 H:10 N:3 O:1 Elements: C12:20 H1:20 O16:2 S32:l Tolerance window: 5 mmu Mass Deviation Formula (u) (mmu) 260.08306 4.0 C:15 H:16 O:2 S:l.7 C:18 H:12 O:2 S:0
Profile izotopowe kombinacji pospolitych pierwiastków dwuizotopowych typu M+2
Porównanie profilu izotopowego zmierzonego i obliczonego 100 90 80 782.2 Widmo zmierzone Intensity (%age) Intensity (%age) 70 60 50 40 30 20 10 0 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 776 778 780 782 784 786 788 790 792 Low Resolution M/z 776.17602 776.2 777.1 778.2 778.17517 779.2 779.1754 780.1 781.2 781.17543 783.1 782.17345 784 784.17414 785.1 Widmo obliczone dla składu: C 35 H 38 F 6 N 2 O 5 Ru 786.18044 787.18277 789.19169 776 778 780 782 784 786 788 790 792 Mass
3. Czy związek jest czysty? Metody: zachowanie próbki podczas parowania w źródle jonów (w EI), stwierdzenie obecności więcej niż jednego jonu molekularnego, stwierdzenie wzajemnej niezgodności widm jonów dodatnich i ujemnych.
Badanie zachowania próbki podczas parowania w źródle jonów EI 278 35-300 255 255 270 270 278 295 295
4. Jaka jest budowa cząsteczki związku (wzór strukturalny)? Metody: analiza fragmentacji w standardowym widmie EI, identyfikacja związków znanych przez porównanie widma eksperymentalnego z widmami z komputerowej biblioteki widm, badanie ścieżek fragmentacji poprzez rejestrowanie jonów metastabilnych i jonów powstających w wyniku aktywacji zderzeniowej (CID), dokładne pomiary masy jonów fragmentacyjnych, wymiana izotopowa, otrzymywanie i badanie pochodnych.
Identyfikacja produktu reakcji na podstawie widma masowego O OC 2 H 5 OH OH OC 2 H 5 NaOH EtOH czy? 100 315 x 5 90 80 70 344 59 = C 3 H 7 O Intensity (%age) 60 50 40 30 160 189 316-59 403 M + 20 10 105 130 234 0 50 100 150 200 250 300 350 400 Low Resolution M/z
α-pinen (96 %) 2.33 β-pinen (97 %) 3.17 Chromatogram GC/MS olejku cytrynowego. Składniki zidentyfikowano na podstawie biblioteki widm Wiley a sabinen (97 %) mircen 3.33 (96 %) 3.96 4.78 limonen (99 %) γ-terpinen (97 %) 5.82 linalool (97 %) 11.57 octan linalylu (91 %) 11.72 12.12 α-bergamoten (98 %) 12.30 β-kariofilen (99 %) 11.50 12.00 12.50 13.00 13.50 14.00 p-cymen (97 %) α-terpinolen 11.57 6.40 (98 %) 12.12 6.66 β-bisabolen (95 %) Z-cytral (97 %) 13.52 α-terpineol (91 %) 13.69 13.52 14.07 geranial (96 %) 14.19 14.19 octan geranylu (91 %) 14.45 14.45 14.50 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 min. Liczby w nawiasach określają w procentach współczynnik zgodności widma zmierzonego i bibliotecznego
Statystyka procedury porównywania widm Average of 14.039 to 14.086 min.: CYTR6.D olejek cytrynowy w heksanie 0.2 ul PBM Search of library d:\database\wiley275.l Name MolWt Formula Qual 1..BETA.-BISABOLENE 204 C15H24 92 2..beta.-Farnesene $$ 1,6,10-Dodecatriene, 204 C15H24 90 3. NEROL 154 C10H18O 90 4. trans-.beta.-farnesene $$ (E)-.beta.-Far 204 C15H24 90 5..beta.-Bisabolene $$ Cyclohexene, 1-meth 204 C15H24 81 6..BETA.-BISABOLENE 204 C15H24 72 7..beta. bisabolene $$ BETA-BISABOLENE 204 C15H24 70 8. (Z)-.beta.-Farnesene $$ 1,6,10-Dodecatri 204 C15H24 70 9. 5-BROMO-3-PENTENE $$ 1-Pentene, 5-bromo- 148 C5H9Br 60 10. CIS-.ALPHA.-BISABOLENE 204 C15H24 53 11..alpha.-Humulene $$ 1,4,8-Cycloundecatri 204 C15H24 52 12..alpha.-Humulene $$ 1,4,8-Cycloundecatri 204 C15H24 50 13..alpha.-Humulene $$ 1,4,8-Cycloundecatri 204 C15H24 50 14..alpha.-Humulene $$ 1,4,8-Cycloundecatri 204 C15H24 50 15..ALPHA.-HUMULENE $$ ALPHA-HUMULENE 204 C15H24 50 16..alpha.-Humulene $$ 1,4,8-Cycloundecatri 204 C15H24 38 17. CIS-.ALPHA.-BISABOLENE 204 C15H24 38 18..beta.-Bisabolene $$ Cyclohexene, 1-meth 204 C15H24 38 19..beta.-Bisabolene $$ Cyclohexene, 1-meth 204 C15H24 38 20..beta.-Bisabolene $$ Cyclohexene, 1-meth 204 C15H24 38
Wykorzystanie wymiany izotopowej do ustalania liczby wymienialnych atomów wodoru O N H 2 M = 137 OH Intensity (%age) Intensity (%age) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Widmo standardowe 37 39 46 52 55 60 65 Widma EI 66 74 80 92 93 108109 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 Low Resolution M/z Widmo po kilkakrotnym odparowaniu próbki z CH 3 OD 33 37 39 44 47 52 55 61 65 66 73 74 77 81 89 92 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 Low Resolution M/z 93 108109 120 120 121 121 131 136 137 d 1 138 d 2 d 3 141 149
Wykorzystanie wymiany izotopowej do ustalania liczby wymienialnych atomów wodoru O N H 2 M = 137 OH % Intensity % Intensity 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 138 M + H + M + Na + 160 139 161 Widma ESI Widmo w MeOH/H 2 O 0 100 120 140 160 180 200 Mass (m/z) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 d 2 -M + D + d 3 -M + H + d-m + D + d 2 -M + H + M + D + d-m + H + 140 141 139 142 d 2 -M + Na + 162 d 3 -M + D + 161 163 d 3 -M + Na + d 1 -M + Na + Widmo w MeOD/D 2 O 100 120 140 160 180 200 Mass (m/z)
Typowe zanieczyszczenia próbek obserwowane w widmach masowych
Węglowodory nasycone (na przykładzie triakontanu C 30 H 62 ) M = 422
Silikony Abundance 73 #275767: SILIKONFETT SE30 (GREVELS) 9000 CH 3 CH 3 8000 7000 RO CH 3 Si O CH 3 Si O CH 3 n Si OR CH 3 6000 5000 147 221 M = 74 4000 207 355 3000 281 429 m/z--> 2000 1000 0 26 111 295 503 401 181 325 577 253 475 534 652 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650
Ftalan di-n-butylu M = 278
Ftalan diizooktylu M = 390
Widmo ESI ftalanów 100 90 80 Spec /2:19 ASC[BP = 413.3, 542] 413.3 ftalan diizooktylu + Na + 413 542.4 70 60 % Intensity 50 40 30 ftalan di-n-butylu + Na + 301 301.1 20 414.3 (ftalan diizooktylu) 2 + Na + 393.3 10 302.1 349.2 437.2 803.6 149.0 311.3 360.3 394.3 481.3 447.3 525.3 691.4 103.0 182.9 215.0 251.1 285.2 357.2 421.3 475.3 569.4 613.4 657.5 717.5 745.5 805.5 0 0 100 280 460 640 820 1000 Mass (m/z) 803
Siarka (widmo rzeczywistej próbki zanieczyszczonej siarką) 100 64 256 S 2 S 90 8 Intensity (%age) 80 70 60 50 40 S 5 160 S 4 128 S 6 192 30 S 3 20 10 34 41 55 66 96 85 108 136 162 184 S 7 224 247 260 0 50 100 150 200 250 300 Low Resolution M/z