Prol. z-rv. dr hab. Krzysztol'Kosrro Wydzilr i Meciycyny Wcterynlrrr, j ne.i Uniwersytetu Przyrocln iczego r,r, I.Lrblinie RECENZJA dysertacji doktorskiej Pani mgr Justyny JARCZAK pt.,,ekspresja wybranych gen6w ukladu odpornoiciowego k6z w odpowiedzi na obecnoit wirusa zapalenia mdzgu i staw w (CAEV)" wykonanej pod kierunkiem prof. dr hab. Emilii Bagnickiej i dr hab. Jaroslawa Kaby w Instytucie Genetyki i Hodowli Zwierzyt PAN w Jastrzgbcu Ch6w i hodowla k6z w warunkach krajowych poci4ga za sobq zagroaenia stanu zdtowia zwierzqt zwi1zane zwlaszcza z chorobami zaka1nymi. Przyk<tadem jest zapalenie staw6w i m6zgu k6z wywolane przez wirus CAEV, kt6ry wraz z wirusem maedi-visna owiec tworzyjedn4 grupg tzw. lentiwirus6w matych przezuwaczy (Small ruminant lentiviruses - SRLV). W przebiegu klinicznym choroby dominuj4 objawy zapalenia staw6w, wymienia, pluc oraz zapalenia m6zgu w postaci postgpuj4cych niedowlad6w koriczyn. Zatem z chorob4 tq zwiqzane jest wystgpowanie znacznych strat ekonomicznych w wyniku obnizenia produkcji mleka i produkowaniem mleka gorszej jakosci, eliminacji zwierzqt chorych z hodowli, atakle rodzenia slabych kofllqt i ich wysokim wskaznikiem SmiertelnoSci. Wniknigcie wirusa CAEV do ustroju wywoluje reakcjg ze strony ukladu immunologicznego w postaci uruchomienia kom6rkowych i humoralnych mechanizm6w odpornosci przeciwzakafunej. Fakt ten jednoczesnie wskazuje iz podstawow4 rolg w rozwoju i zwalczaniu zakaleft wirusem CAEV u k6z odgrywa zachowanie sig j.go stanu czynnosciowego. NaleZy podkresli6 iz kom6rkami docelowymi dla wirusa CAEV s4 m.in. makrofagi, monocyty i kom6rki dendrytyczne, kt6re pelni4 funkcjg kom6rek prezentuj4cych antygen w swoistej odpowiedzi immunolo gicznej. Profil immunolo giczny oparty o mechanizmy odpornosci naturalnej i nabytej umozliwia dokladne przeiledzenie odpowiedzi immunologicznej oraz oceng stanu odpornosci swoistej organizmu w wyniku tocz1cego sig procesu chorobowego. Jednym z wahnych element6w tej oceny jest poznanie proces6w zwiezanych z
funkcjonowaniem ukladu immunologicznego nie tylko przy ulyciu metod konwencjonalnych, ale r6wniez na poziomie molekularnym. W chwili obecnej dzigki badaniom molekularnym m.in. nad zr62nicowan4 ekspresj4 gen6w ukladu immunologicznego stosuj4c metody z zakresu genomiki, transkryptomiki oraz proteomiki jest mozliwe stworzenie racjonalnych podstaw immunoprofilaktyki i immunoterapii chorob zaka1nych koz, tym bardziq, Ze istnieje dostgpnos6 pelnej sekwencji genomu tego gatunku. St4d tez podjgcie przez Doktorantkg badari nad okresleniem wplywu zakuhen k6z mlecznych wirusem CAEV na funkcjonowanie ukladu immunologicznego na poziomie molekularnym oraz na profil biochemiczny surowicy jako wska1niki stanu czynnosciowego narzqd6w wewngtrznych, a takae oznaczenie bialek ostrej fazy jako wskaznika natghenia stan6w zapalnych w organizmie zakahonych zwierz4t jest w pelni zasadne i aktualne. W kraju badania te mqq charakter pionierski i posiadaj4 przy tym duhe znaczenie poznawcze i wymierne wartosci aplikacyjne. Mam na mysli gl6wnie aspekty zdrowotne i ekonomiczne poniewaz ch6w k6z mlecznych w ostatnich latach dos6 intensywnie rozwija sig, co wymaga poznania wplywu zakaleh lentivirusem malych przehuwaczy utego gatunku zwierzfi. St4d tez uzyskane przez Doktorantkg wyniki badan mogq przyczynid sig w przyszlofici do opracowania swoistej immunoprofilaktyki jako skutecznej metody zapobiegania wirusowemu zapaleniu staw6w i m6zgu u k6z. Dysertacja doktorska licz1ca 125 stron tekstu oruz 17 tabel i 29 rycin napisana wedlug powszechnie stosowanych wymog6w zawiera kolejno alfabetyczny spis stosowanych skr6t6w, nazw wirus6w i chor6b, gen6w i bialek, wstgp, cel i uzasadnienie podjgcia bada;h, przeglqd pismiennictwa, material i metody, wyniki, dyskusjg, podsumowanie, wnioski, streszczenie w jgzyku polskim i angielskim,wykaz tabel i rycin oraz 145 pozycji pismiennictwa, gl6wnie angielskoj Qzycznego z ostatnich kilkunastu lat. Taki uklad dysertacji uwaham za celowy i interesuj4cy, poniewa umozliwil on Doktorantce bardziej przejrzyst4prezentacjg przeprowadzonych badari. W obszernym, chociaz trochg chaotycznie napisanym,,wstgpie" stanowi4cym przeglqdpi5miennictwa Doktorantka w pierwszej jego czgsci dokonala charakterystyki lentiwirusa matych przehuw aczy przedstawiajqc kolej no taksonomig, charakterystykg genomu wirusa, przebieg zakahefi lentiwirusem malych przehuwaczy i ich
diagnostykg laboratoryjne. W dalszej kolejnosci zwrocita uwagg na kompleksowy charakter ukladu immunologicznego omawiaj4c kolejno wybrane aspekty mechanizm6w odpornosci nieswoistej, zar6wno kom6rkowej, jak i humoralnej oraz odpornosci swoistej humoralnej i kom6rkowej w zakaaeniach wirusowych, a takae podkreslila przeciwzaka1na rolg mechanizmow obronnych gruczolu sutkowego k6z mlecznych. Nieco wigcej miejsca poswigcila cytokinom jako mechanizmie nieswoistej odpornosci humoralnej o dzialaniu przeciwwirusowym. Bardzo cenny jest podrozdzial po5wigcony wplywie zakahefi wirusowych na ekspresjg gen6w cytokin i bialek w r6znych tkankach i narzqdach zwierz4t, w kt6rym Doktorantka na podstawie wynik6w badah innych autor6w wskazuje na zr62nicowan4 odpowiedz immunologiczna organizmu na zakailenie wywolane roanymi wirusami oraz ich wptyw na poziom ekspresji i produkcji cytokin. W koricowej czgsci wstgpu Doktorantka omawia interakcje lentiwirusa malych przeauwaczy z ukladem immunologicznym zakahonych zwierzqt podkreslajqc,zejego obecnosi w organizmie powoduje zmiang ekspresji gen6w cytokin a tym samym wptywa na wielko56 odpowiedzi immunologicznej. Jednoczesnie w pelni uzasadnia potrzebg przeprowadzenia badafi nad wptywem zakuzeri wirusem CAEV u k6z mlecznych na poziom ekspresji gen6w wybranych cytokin w kom6rkach somatycznych mleka oraz krwi obwodowej, atakhe na stan czynnoscio.vqy narzqd6w wewnetrznychpodajqc, Le badania w warunkach in vivo na poziomie gerlr oraz bialka nie byly dotychczas przedmiotem badari. T4 czes6 dysertacji oceniam pozytywnie i lqcznie z rczdzialem,,cel pracy i tzasadnienie podjgcia tematu" w spos6b jednoznaczny wskazujq na potrzebg podjgcia badafi, kt6re s4 prezentowane przez Doktorantkg w ocenianej przeze mnie dysertacj i doktorskiej. Cel badah, jakim jest,,okreslenie wplywu zakaaenia k6z mlecznych lentiwirusem malych przezuwaczy na ekspresje gen6w wybranych cytokin w kom6rkach somatycznych mleka oraz krwi, a takae na funkcjonowanie poszczegslnych narz4dow w organizmie zakalonych zwierzqt" zostal w pelni zrealizowany. Jednym z glownych cel6w pracy jest pr6ba wyjasnienia, czy zakaaenie naturalne wirusem CAEV u k6z mlecznych mohe modyfikowac poziom ekspresji gen6w wybranych cytokin w zalelnosci od czasu jego trwania, a tym samym
modulowad odpowiedz immunologiczn4 organizmu. Uzyskane wyniki mog4 stanowi6 podstawg do wykorzystania oceny stanu zdrowiak6z mlecznych bgd4cych w r61nym stadium laktacji w oparciu o profile biochemiczne oraz oceng wielkosci odpowiedzi immunologicznej u zwierzqt zakahonych CAEV na podstawie rclnic w ekspresji gen6w wybranych cytokin zwiqzanych z czasem trwania zakazenia w badanym przez D oktorantk g wirus owym zap aleniu staw6w i mozgu. Podjgte przez Doktorantkg badania zostaly w pelni zrealizowane przy uzyciu adekwatnych do tego celu metod badawczych opisanych w rozdziale,,material i metody". Badania zostaly wykonane na rcprezentatywnej \iczbie zwierz4t. Zaproponowany przez Doktorantkg podzial zwieruqt na grupg doswiadczalnq oraz grupg kontroln4 jest w pelni do zaakceptowania. R6wniez zastosowane przez Doktorantkg metody oznaczania wybranych parametr6w biochemicznych w surowicy krwi obwodowej oraz profrle ekspresji wybranych gen6w u zwierzqt" doswiadczalnych s4 adekwatne do zamierzonego celu. 54 one stosowane powszechnie w tego typu badaniach i nie budz4 merytorycznych zastrzelefi. Przeprowadzone eksperymenty, jak to przedstawiono w rozdziale pt.,,wyniki" umozliwily w pelni odpowiedz na pytania postawione przez Doktorantkg w rozdziale pt.,,cel badan". wyniki przedstawione w spos6b nie budz1cy zastrzezen, zobiektywizowane statystycznie wykorzystuj4c wieloczynnikow4 analize wariancji, uwzglednie4ca staly wplyw zakahenia wirusem, rasy, wieku zwieru4t i okresu laktacji, s 4 przekonywuj 4ce i p orw alaj4 na wyc i 4gni gci e j ed noznacznych wnio sk6w. w,,dyskusji,, kt6rej poswigcono vii rozdzial pracy, uzyskane wyniki badah wlasnych zostaly skonfrontowane krytycznie z trafnie dobranym pismiennictwem. Doktorantka nie boi sig przedstawid wlasnych pogl4d6w w oparciu o uzyskane wyniki badaft i wlasne przemyslenia oraz wskazuje naprzydatnos6 wlasnych wynik6w badafi do okreslenia wplywu naturalnych zakuzeri wirusem CAEV na stan czynnosciowy ukladu immunologicznego oraz wykorzystania wybranych wskaznik6w biochemicznych do monitorowania zdrowia oraz natghenia reakcji zapalnej u k6z w przebiegu wirusowego zapalenia staw6w i m6zgu. Nalezy pamigtal, Le tylko pojedyncze prace dotycz4 zagadniefi bgd4cych przedmiotem rozprawy doktorskiej, przy czym dotyczq one tylko zwierz1t zaka2onych do5wiadczalnie.
Przedstawione przez Doktorantkg,,wnioski w liczbie 5 wynikaj q z badafr bgd4cych tematem dysertacji doktorskiej. Obfita, a przy tym bardzo czytelna dokumentacja faktografrczna w postaci figur i tabel jest dodatkowym walorem recenzowanej dysertacj i. Do niew4tpliwych osi4gnigd Doktorantki moim zdaniem naleay zaliczy(; 1. Wykazanie, 2e jednoczesne okreslenie poziomu ekspresji gen6w wybranych cytokin w krwi obwodowej i kom6rkach somatycznychmleka k6zzwybranymi wskaznikami biochemicznymi stwarza mo2liwos6 dokonania pelniejszej oceny stanu zdr ow ia k6z mie czny ch zakuhony ch naturaln i e wirus e m C AEV. 2. DuZq wartos6 poznawczq i aplikacyjn4 ma14 uzyskane pruez Doktorantkg wyniki dotyczqce obnizenia ekspresji gen6w IL-lo,, IL-lp i IL-6 w krwi k6z zaku2onych CAEV oraz spadku poziomu ekspresji dla IL-6 i IL-lo zwiqzanq z czasem trwania zakahenia, co Swiadczy o silnych wlasciwosciach immunosupresyjnych wirusa CAEV hamuj4cych odpowiedz immunologiczn4 organizmu na zakuzenie, z kt6r4 zwiqzany jest rozw6j nabytej odporno5ci swoistej. 3. Cenne zuwagina dt24 wartosd poznawcz4 s4 wyniki dotycz1ce specyficznego wzoru ekspresji gen6w dla okreslonych cytokin w kom6rkach somatycznych mleka, kt6re wskazuj4 iz w zakaheniu wirusem CAEV istotn4 rolg w odpowiedzi immunologicznej odgrywaj4 r6wniez lokalne mechanizmy odporno6ci przeciwwirusowej gruczolu sutkowego, kt6ry jest jednym z miejsc doceloweg o dzialania wirusa. Przy \<rytycznej ocenie pracy nasuwajq sig nastgpuj4ce uwagi: 1. Praca jest zbyt obszerna i moim zdaniem wystarczaj4co byloby przedstawienie jedynie wynik6w dotycz1cych ekspresji gen6w wybranych cytokin w kom6rkach krwi oraz w kom6rkach somatycznych mleka k6z zakahonych wirusem CAEV. Natomiast wyniki dotyczqce profilu biochemicznego oraz bialek ostrej fazy przedstawi6 w postaci odrgbnej publikacji 2. Wydaje sig, 2e bardziej przekonywuj4ce efekty Doktorantka by uzyskala w zakresie ksztaltowania sig surowiczego poziomu bialek ostrej fazy u k6z zakuhonych wirusem CAEV okreslaj4c zamiast stgzenie bialka CRP surowiczy
poziom haptoglobiny (Hp) i dodatkowo fibrynogenu. U przeauwaczy bialkiem ostrej fazy pierwszego rzutu jest gl6wnie Hp. 3. Zdaniem recenzenta nale?y rozwalyc tytul pracy w celu dokladniejszego odzwierciedlenia jej zawartosci. Proponowany tytul pracy po tej drobnej korekcie mialby brzmienie,,ekspresja gen6w wybranych cytokin oraz profrl biochemiczny surowicy krwi u k6z zakuzonych naturalnie wirusem zapalenia staw6w i m6zgu". JednoczeSnie informuje iz prawidlowa nazwa tej jednostki chorobowej brzmi:,,wirusowe zapalenie staw6w i mozgu k6z (caprine arthritis/encephalitis - CAE)" 4. Nie wszystkie wnioski zostaly przejrzyscie zredagowane. W zwiqzktr, z czym proponujg przercdagowanie wniosku 2 i 3 pod wzglgdem stylistycznym. Doktorantka nie unikngla tez pewnych drobnych btgd6w i uchybieh, na kt6re zwr6cilem uwagg nanoszqc je w wydruku pracy. Np. Tytul niekt6rych rycin brzmi w jezyku polskim, natomiast legenda w jgzyku angielskim. W rozdziale,,material i metody" u?yte do badafi molekularnych niekt6re odczynniki opisane s4 niejednoznacznie, co moze utrudnia6 okreslenie ich pochodzenia. Nie wplywaj4 one zupelnie na wartos6 merytoryczn4 ocenianej dysertacji doktorskiej. Koricowa ocena dysertacj i Dysertacja doktorska Pani mgr Justyny Jnczak zwiera wiarygodny i precyzyjny opis badafi i dostarcza wiele nowych i ciekawych spostrzezeri o znaczenit poznawazym i aplikacyjnym. Badatia, w kt6rych wykorzystano nowoczesne techniki, lvymagaty duzego wkladu pracy, dobrego opanowania nie tylko technik badawczych i pismiennictwa, ale tel pracowitosci, sumiennosci i umiejgtnosci krytycznego podejscia do problemu, kt6rego rczwiqzanie bylo celem pracy Doktorantki. Te wszystkie wymogi Pani mgr Justyna Jarczak wypelnila, przedstawiaj4c dysertacjg doktorsk4 pt.,,ekspresja wybranych gen6w ukladu odpornosciowego k6z w odpowiedzi na obecnos6 wirusa zapaleniamozgu i staw6w (CAEV)". Na podkreslenie zasluguje przy tym dule znaczenie uzyskanych wynik6w dla wiedzy o wplywie zakahen wirusem CAEV na stan czynnosciowy ukladu immunologicznego oraz narz4d6w wewngtrznych u k6z mlecznych, bndzo duza wartosd aplikacyjna baduh, a
tak2e wyczerpuj 1ca, a przy tym przejrzysta dokumentacja faktografi czna wynik6w badari. Krytyczne uwagi, jakie zawarlem w tej recenzjinie zmieniq4mojej pozytywnej oceny dysertacji, kt6r4 uwuharn za wartosciowy przyczynek w poznawaniu mechanizm6w odpowiedzi immunologicznej u k6zw przebiegu naturalnychzakaaeh o etiologii wirusowej. Doktorantka wykazala sig umiejgtnosci4 stworzenia interesuj4cego modelu doswiadczalnego i jednoczesnie wykorzystania bogatego warsztatu laboratoryjnego dla oceny szeregu parametr6w charakteryzujqcych wybrane wskazniki immunolo giczne i b iochem iczne u k6z mlecznych. Dysertacja doktorska spelnia calkowicie wymogi stawiane pracom na stopieri doktora i zgodnie z art. 13 Ustawy z dnia 14 marca 2003r o stopniach i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki stanowi podstawg do dopuszczenia Pani4 mgr Justyng Jarczak do dalszych etap6w przewodu doktorskiego. JednoczeSnie wysoka ocena dysertacji upowaznia mnie do wyst4pienia do Rady Naukowej Instytutu Genetyki i Hodowli Zwierzqt PAN w Jastrzgbcu z prosb4 o przedstawienie jej Autorki do stosownej Nagrody. Lublin, dnia 20 I 5-0l-20 *J^w