Olsztyn, 29.0t.20t5 r.

Transkrypt

1 Olsztyn, 29.0t.20t5 r. Prof, dr hab. Urszula Czarnik Katedra Genetyki Zw ierzqt Wy dzi al B i oiniynierii Zw ier z qt UWNIw }lsztynie Recenzja pracy doktorskiej mgr in2. f ustyny larczak pt. EI$PRESJA WYBRANYCH GENOw UKLADU ODPORNOSCIOwnCOKOr w odpowiedzi NA obecnosc WINUSA ZAPALENIA M6ZGU I STAW6W (CAEV) wykonanej pod kierunkiem prof. dr hab. Emilii Bagnickiej i dr hab. faroslawa Kaby Zdrowotno 3t, zwierzat jest jednym z czynnik6w warunkuj4cych efektywno5d hodowli a poznanie naturalnych predysp ozycji obronnych, niwecz4cych oddzialywanie czynnik6w patogennych bylo i jest nadal w centrum zainteresowania nauki i praktyki hodowlanej. Eliminacja chor6b infekcyjnych z populacji jest bardzo trudna ze wzglqdu na zlozono$i odpowiedzi immunologicznej organizmu. Mimo wielkiego zaangahowania licznych o$rodk6w naukowych funkcjonowanie ukladu odporno6ciowego na poziomie molekularnym podczas infekcji wirusowych wci42 pozostaje malo poznanym obszarem wiedzy. U ludzi badania z tego zakresu stymulowane s4 m.in. zagro2eniem powodowanym wirusem zespolu niedoboru odpornosci (HIVJ, zapalenia w4troby typu C (HCVJ czy te1 brodawczaka ludzkiego [HPV), przyczyniaj4cego siq do powstania raka szyjki macicy. W populacji bydla nadal nieznane s4 mechanizmy odporno6ci na infekcjq BLV powoduj4c4 enzootyczn4 bialaczkq bydla, natomiast w populacii k6z mlecznych istnieje zagrozenie wystqpowania lentiwirusa malych przeiluwaczy (SRLV), bqd4cego przyczyn4stan6w zapalnych wielu narz4d6w,w tym podklinicznego zapalenie wymion. Zakailenie wirusem stymuluje mechanizmy obronne organizmu a do najwa2niejszych czynnik6w determinuj4cych odpowiedz immunologiczn4zaliczane s4 cytokiny. S4 one mediatorami reakcji pro- i przeciwzapalnych, tworz4c czuly system powi4zari pomiqdzy kom6rkami uktadu odpornosciowego (tzw. sie6 cytokin), w kt6rym poszczeg6lnelementy wzajemnie siq reguluj4 i kontroluj4. Zatem uwa2am, 2e badania zmierzajyce do poznania poziomu ich ekspresji podczas patogenezy chor6b wirusowych sq zasadne i przyczyni4 sig do poszerzenia wiedzy z zakresu mechanizm6w

2 oddzialywania wirusa na uklad odpornosciowy gospodarza. W tym nurcie tematycznym mie6ci siq praca doktorska Pani mgr inz. Justyny larczak. Charakterystyka pracy Praca doktorska mgr in?. Justyny farczak ma formq klasycznej rozprawy naukowej i obejmuje rozdzialy: Wstqp, Hipotezy badawcze, Cel badari, Material i metody, Wyniki, Dyskusja, Podsumowanie, Wnioski oraz Pi6miennictwo tworz4ce l4cznie wraz ze spisem tresci, wykazem stosowanych skr6t6w, streszczeniem w jqzyku polskim i angielskim, wykazem tabel i rycin przejrzyst4 strukturq catosci opracowania licz4c4125 stron maszynopisu. Autorka d,oi4czyla te2 informacjq o opublikowaniu czqsci uzyskanych wynik6w w formie jednej oryginalnej pracy. Praca zostala napisana z zachowaniem wlasciwej sekwencji omawianych zagadnieri, jqzykiem naukowym w dobrym stylu, z dbalo6ci4 o rzeczowo5d przekazywanych tre6ci. Na podkreslenie zasluguje bardzo staranny opis metod laboratoryjnych i statystycznych, dobra konstrukcja i w konsekwencji przystqpna czytelno tabel i 29. rycin. Wykaz cytowanej literatury jest obszerny i obejmuje 145 pozycji, w tym 5 polskojqzycznych, z kt6rych 4 s4 opracowaniami ksi4zkowymi a ich wykorzystanie bylo uzasadnione. WiqkszoSi prac zostala opublikowana w czasopismach o uznaj renomie miqdzynarodowej. Pozycje pi5miennictwa dobrane zostaly w spos6b przemy5lany a jednocze6nie oszczqdny, ograniczony gl6wnie do zakresu badari. Problematykq rozprawy Autorka zasygnalizowala w kr6tkim dwustronicowym wstqpie, a nastqpnie przyjmuj4c nadrzqdne zalolenie, 2e zakahenie k6z mlecznych lentiwirusem malych prze uwaczy (SRLV) wplywa na funkcjonowanie ukladu immunologicznego na poziomie molekularnym sprecyzowa*a cel pracy, kt6rym bylo okre6lenie ekspresji gen6w wybranych cytokin na poziomie mrna i bialka w kom6rkach somatycznych mleka (KSM) i krwi oraz zweryfikowanie wplywu tego zakailenia na funkcj o nowani e poszczeg6l nych narzed6w. Pelne uzasa dni eni e podj qtych badari na tle bogatej literatury Autorka przedstawila w rozdziale Przegl4d pismiennictwa. W tej czq6ci w spos6b czytelny i systematyczny om6wila taksonomig SRLV i organizacjq jego genomu, chor6b wywolywanych jego obecnosci4 i ich diagnostykq. Du2o miejsca poswiqcila na om6wienie mechanizm6w obronnych organizmu podczas infekcji wirusowych, ze szczeg6lnym uwzglqdnieniem roli cytokin oraz ekspresjich gen6w podczas zaka2enia wirusem SRLV. Wielow4tkowa i staranna kompilacja wynik6w badari krajowych i zagranicznych z tego zakresu Swiadczy o dobrej

3 orientacji Autorki w obszarze badawczym, w kt6rym mie6ci siq przygotowana rozprawa W mojej ocenie zbqdnym byto zamieszczanie w tej czg6ci pracy podrozdzialu dotyczqcego gen6w referencyjnych, stosowanych w analizie ilo5ciowej transkryptu metod4 real-time PCR, Informacje te powinny wzbogacid podrozdzial dotycz1cy analizy stabilnosci gen6w metabolizmu podstawowego zamieszczony w dyskusji, zwlaszcza 2e tematyka ta byla przedmiotem oddzielnej i juz opublikowanej pracy Autorki i wsp. Mimo du2ej starannosci opracowania Autorka nie uniknqla drobnych blqd6w redakcyjnych i niefortunnych sformulowafi, kt6re zaznaczylam w maszynopisie pracy. np. nie wiem co rozumie Autorka pod pojqciem, str. 23 -,,cale mleko" i str. 49. "mleko calkowite" - czy to dotyczy skladu czy objqtosci?, str. 2t- cyt. "SRLV zakaza przede wszystkim makrofagi, monocyty i kom6rki dendrytyczne. Makrofagi i kom6rki dendrytyczne sa elementami mechanizm6w odpornosciowych zar6wno wrodzonych jak i nabytych." - czy to oznacza, 2e monocyty nie s4 kom6rkami odporno6ciowymi?, str.26 - cyt. "aktywno56 przeciwcial, wytwarzanych gl6wnie przez limfocyty T i B" - czy wg Autorki limfocyty T wytwarzaj4 przeciwciala, czy stymuluje do ich wytwarzania? W rozdziale Material i metody Autorka opisala uwzglqdniony w badaniach material zwierzqcy, zastosowane techniki molekularne, przeprowadzone analizy laboratoryjne i statystyczne. Badania przeprowadzila w dw6ch r6wnych liczebnie grupach k6z mlecznych (13 szt.), wolnych od zakaleniaizakahonych SRLV, utworzonych na podstawie badari serologicznych i nale2ecych do dw6ch ras - polskiej bialej (PWI) i polskiej barwnej uszlachetnionej(pfi), Na uwagq zasluguje ulatwiaj4ce percepcjq bardzo dobre graficzne przedstawienie kolejnosci dzialafi objqtych metodyk4 badari, zmierzaj4cych do osi4gniqcia przyjqtego celu pracy. Niezrozumialym jest dla mnie natomiast dlaczego w tytule pracy Autorka zapowiedziala, ze przedmiotem fej badafi jest ekspresja wybranych gen6w ukladu odporno6ciowego k6z w odpowiedzi na obecno5d wirusa zapalenia m6zgu i staw6w (CAEV), natomiast w metodyce, w tym w opisie badari serologicznych w kierunku obecno6ci przeciwcial antywirusowych jak r6wniez calej pracy ulywa szerszej nazwy gatunkowej - lentiwirus malychprze?uwaczy (SRLVI, Wcze5niej jednak wyja5nila, 2e CAEV jednym z wariant6w tego gatunku. Wyniki analiz laboratoryjnych i badari molekularnych Autorka w formie graficznej i tabelarycznej wraz z ich om6wieniem przedstawila w czqsci wynikowej opracowania. Przystqpuj4c do realizacji gt6wnego celu pracy Autorka wykonala badania mikrobiologiczne mleka na obecno56 bakterii patogennych, co uznajq za du?y atut tej

4 pracy, gdyl uzyskane wyniki upowalnily Iq do wykluczenia oddzialywania innych czynnik6w niz SRLV na stan zdrowotny gruczolu mlekowego. W celu okre6lenia wptywu wirusa na og6lny stan zdrowia oznaczyla parametry biochemiczne surowicy krwi charakteryzuj4ce funkcjonowanie wqtroby, nerek, serca oraz trzustki. Do badari ekspresji gen6w na poziomie mrna metod4 real-time PCR w kom6rkach somatycznych mleka i surowicy krwi Autorka na podstawie danych literaturowych wybrala 13. cytokin, w tym: 9 interleukin, (IL-7a,IL-lB,IL-2,1L-4,1L-6, L0, IL-72, IL-76, IL-L8),3 Wpy interferonu (lfnq, IFNB, IFNy) oraz czynnik martwicy nowotwor6w (TNF-a). fest to bardzo szeroka paleta badanych cytokin a uwzglqdniaj4c ich rolq, jako mediator6w kaskady procesu zapalnego oraz udzial interferonu w obronie przeciwwirusowej uwazam, 2e Pani mgr fustynalarczak dokonala wla6ciwego wyboru. W przyszlo5ci moze warto rozwalyt r6wnie2 uwzglqdnienie IL-8, bqd4cej aktywatorem neutrofili, a jej znaczenie w odpowiedzi na zakaienie SRLV u k6z i HIV u ludzi jest wskazywane w literaturze. Do badari ekspresji na poziomie bialka metod4 immunoenzymatycznq ELISA w w/w materiale biologicznym z palety 13 cytokin wybrala 3 interleukiny {ll-la IL-IP, IL-6) 2 Wpy \FNF, IFNy) oyaz czynnika martwicy nowotwor6w (TNF-a) - natomiast w Zadnym rozdziale pracy nie dopatrzylam siq argumentacji dokonanego wyboru. Mozna siq jej jedynie domyslad, Le jednym z powod6w byly r62nice w poziomie mrna miqdzy grupe osobnik6w wolnych od zakalenia a zaka2ona SRLV, a je6li tak to dlaczego pominiqta zostala IL-16. W tym rozdziale niedosyt budzi lakoniczny i malo udokumentowany opis zale2nosci miqdzy dlugo6ci4 trwania zakahenia a poziomem transkrypt6w i bialek w KSM i krwi k6z w grupie do6wiadczalnej mimo, 2e jest to jedna z trzech hipotez badawczych pracy. Opisuj4c tg zale2nosi na poziomie mrna Autorka ogranicza siq jedynie do podania r6wnania regresji dla IL-6, natomiast na poziomie bialka dla IL-6 i IL-i.a. Dwa podrozdzialy odnosz4ce siq do gl6wnych cel6w pracy, czyli dotycz4ce badafi nad ekspresj4 gen6w na poziomie mrna i bialka w kom6rkach somatycznych mleka i surowicy krwi Autorka zakoriczyla podsumowaniem. Wydaje siq, 2e jest to zbqdne dublowanie wynik6w, gdy podsumowanie stanowi odrqbny rozdzial pracy, a informacje o krotno6ci r62nic na poziomie mrna miqdzy badanymi grupami k6z powinny by6 zamieszczone w podrozdziale opisujqcym wyniki badari. W analizie wynik6w bardzo przydatne i umo2liwiajqca calosciowe spojrzenie jest natomiastabela L7 obrazujqca wystqpowanie lub brak synergizmu na poziomie mrna i bialka u k6z

5 zakailonych lentiwirusem malych przeiuwaczy (SRLVJ w por6wnaniu do osobnik6w wolnych od zaka2enia. Dyskusja wynik6w nawi4zuje do tematyki przeprowadzonych badari i zostala napisana z dobrq znajomo5cie zagadnienia i literatury 2r6dlowej. Jednak ze wzglqdu na ograniczony zakres dostqpnej literatury bezpo6rednie odniesienie bardzo szerokiego wachlarza wlasnych analiz na tle badari innych autor6w bylo utrudnione. Wyniki analiz dotycz4ce profilu biochemicznego surowicy krwi, uwzglqdniaj4c pokrewieristwo wirus6w, Autorka mogla odnie6i jedynie do uzyskanych u pacjent6w zakahonych wirusem HIV. Natomiast badania ekspresji gen6w cytokin podczas infekcji SRLV prowadzone byly gl6wnie u k6z zakahonych eksperymentalnie lub w warunkach in vitro. Wa2nym elementem tego rozdzialu jest podjqcie pr6by wyja5nia odmiennego wzoru ekspresji gen6w u osobnik6w wolnych od zakalenia i zakailonych SRLV oraz w KSM w por6wnaniu do krwi, co stanowi bardzo interesuj4c4czgit, rozprawy. Mimo duzej staranno5ci opracowania Autorka na str. 94 napisala cyt.,,w przypadku /FNa nie stwierdzono r62nic zar6wno w poziomie transkryptu, jak i bialka miqdzy grupami w obu rodzajach badanego materialu" a przecie2 stqzenie tej cytokiny nie bylo badane. Praca zakofrczona jest podsumowaniem najwazniejszych rezultat6w przeprowadzonych badari, zawartych w 9. pkt i piqcioma logicznie sformulowanymi wnioskami odnosz4cymi siq do przyjqtychzaloheri i celu pracy. Wydaje mi siq jednall 2e wniosek 4 dotycz4cy istnienia niezale2nej odpowiedzi immunologicznej gruczolu sutkowego k6z na podstawie specyficznego wzoru ekspresji gen6w IL-lq, IL-6 oraz IFNB w kom6rkach somatycznych mleka, w odpowiedzi na obecno56 SRLV w organizmie ma zbyt pewne brzmienie. Podsumowanie Reasumuj4c stwierdzam, 2e praca doktorska mgr in2. fustyny Jarczak jest nowatorsk4 i cenn4 pozycj4 pismiennictwa naukowego. Wnosi oryginalne wyniki, istotnie uzupelniajqce widzq z zakresu funkcjonowanie ukladu odporno5ciowego na poziomie molekularnym u k6z mlecznych w odpowiedzi na obecno5d lentiwirusa malych przezuwaczy (SRLVJ. WartoS6 rozprawy powiqksza kompleksowosd ujqtych zagadnieri, dotycz4cych ekspresji wielu gen6w cytokin badanych w warunkach in vivo, wzbogaconych informacjami o wplywie tego zakahenia na funkcjonowanie wybranych narz4d6w, okreslaj4cych og6lny stan zdrowotny organizmu, Z pewnosci4 bqdzie to

6 cytowana pozycia literatury naukowej. wszechstronnosi przeprowadzonych analiz swiadczy o duzej wiedzy merytorycznej oraz opanowaniu nowoczesnych technik analitycznych mgr inz. fustyny larczak. za wainy dla oceny uwazam fakt, zebadania te byly realizowane w ramach projektu badawczego BIOZywNoSc - zwierzq, Lywnos(,, czlowiek oraz Narodowego centrum Nauki, wymienione w recenzji uwagi maj. wyl4cznie charakter porz4dkor'rryr i dyskusyjny i nie obni2aie og6rnej, pozytywnej oceny merytorycznej opracowania. Wniosek koficowy Oceniai4c wysoko poziom naukowy i oryginalnosd uzyskanych wynik6w stwierdzam,2e praca doktorska mgr in2. ustyny larczak pt, Ekspresja wybranych gen6w ukladu odporno{ciowego k6z w odpowiedzi na obecno{6 wirusa zapalenia m6zgu i staw1w (CAEV) spelnia wymogi okreslone ustawq z dnia!4 marca2003 o stopniach naukor,rrych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz.U. Nr 65, poz. 5g5 z p62' zmianami)' Dlatego zglaszam wniosek do wysokiej Rady Naukowej Inst5rtutu Genetyki Hodowli zwierz4tpolskiej Akademii Nauk w fastrzqbcu o przyjqcie pracy mgr inz' fustyny larczaki dopuszczenie do dalszych etap6w przewodu doktorskiego.