1.3. Oznaczanie składu reszt kwasów tłuszczowych w glicerydach i fosfolipidach

Transkrypt

1 1. Lipidy 36 Odparować z nich rozpuszczalnik i zanalizować je w argentacyjnej chromatografii cienkowarstwowej (zob. s. 33). Uzyskane frakcje nasyconych, jedno- i dwunienasyconych lipidów rezorcynolowych rozdzielić na homologi różniące się długością łańcuchów alifatycznych w wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej na fazach odwróconych stosując kolumnę wypełnioną hydrofobowym żelem krzemionkowym (Si 60 RP-18) i elucję mieszaniną metanolu z wodą (96:4). Detekcja UV przy 280 nm. Poszczególne homologi zbierać do oddzielnych naczyń, odparować z nich rozpuszczalnik i rozpuścić w określonej ilości metanolu. Oznaczyć stężenie lipidów rezorcynolowych metodą z Fast Blue B (zob. rozdział dotyczący metod ilościowych). Przechowywać w 0 0 C Oznaczanie składu reszt kwasów tłuszczowych w glicerydach i fosfolipidach Aby stwierdzić, jakiej długości reszty acylowe występują w badanych przez nas lipidach, należy przeprowadzić hydrolizę tych lipidów w celu uwolnienia kwasów tłuszczowych, które następnie zostaną poddane analizie chromatograficznej. Ponieważ najbardziej popularną metodą analizy kwasów tłuszczowych jest chromatografia gazowa, konieczne jest przeprowadzenie kwasów tłuszczowych w lotne pochodne, zwykle estry metylowe. Najczęstszym postępowaniem umożliwiającym równoczesną hydrolizę glicerydów i fosfolipidów i ich modyfikację jest alkoholiza w środowisku kwaśnym. Uzyskane estry metylowe mogą być analizowane bezpośrednio w chromatografii gazowej lub też w chromatografii cienkowarstwowej (szczególnie jakościowo) Transestryfikacja lipidów (wg Christie W. W., w: Handbook of chromatography (red. Mangold H. K.) CRC Press, Boca Raton, 1984, vol. 1. s ) heksan; 5% HCl w bezwodnym metanolu (A) lub 1% stężony kwas siarkowy w absolutnym metanolu (B) lub 14% trójfluorek boru w metanolu (C); 5% NaCl; 4% węglan potasu; bezwodny siarczan sodu w substancji.

2 1.3. Oznaczanie składu reszt kwasów tłuszczowych 37 Sprzęt: mikrostrzykawki; zakręcane probówki reakcyjne; łaźnia wodna. l ml roztworu benzenowego zawierającego mg lipidów umieścić w zakręcanej probówce i dodać 3 ml odczynnika modyfikującego (A, B lub C). Zakręcić probówkę i umieścić w temperaturze 60 C na 30 min. Po ochłodzeniu próbki dodać 5 ml 5% roztworu NaCl i po wymieszaniu ekstrahować mieszaninę 3-krotnie 5 ml porcjami n-heksanu. Ekstrakty heksanowe połączyć, przemyć 10 ml 4% roztworu węglanu potasu, a następnie osuszyć bezwodnym siarczanem sodu. Osuszone ekstrakty zagęścić przez odparowanie części rozpuszczalnika np. strumieniem azotu i użyć do dalszej analizy Rozdział estrów metylowych kwasów tłuszczowych w cienkowarstwowej chromatografii argentacyjnej (wg Ackman R. G., w: Handbook of chromatography (red. Mangold H. K.) CRC Press, Boca Raton, 1984, vol. 1. s ) Materiały, odczynniki i roztwory: płytki do chromatografii cienkowarstwowej pokryte żelem krzemionkowym; 10% azotan srebrowy w 50% metanolu; heksan; eter etylowy; roztwór 2',7'-dichlorofluoresceiny (zob. s. 45). Sprzęt: komora chromatograficzna; suszarka; lampa UV. Przygotowane płytki zanurzyć w płaskim naczyniu do 10% roztworu azotanu srebrowego, wytrząsać delikatnie przez 2-3 min, odsączyć od nadmiaru roztworu i wysuszyć na powietrzu przez 5 min, a następnie w 70 C przez 30 min. Roztwór estrów metylowych w heksanie nanieść na płytki w postaci kresek i chromatogram rozwijać jednokrotnie lub dwukrotnie (po rozwinięciu wysuszyć płytkę i ponownie rozwinąć chromatogram w tym samym kierunku i w tym samym układzie rozpuszczalników) w układzie heksan/eter etylowy (95:5).

3 1. Lipidy 38 Po rozwinięciu chromatogramu płytki wysuszyć i w celu detekcji plam spryskać roztworem dichlorofluoresceiny, oglądać chromatogramy pod lampą UV (366 nm). Poczynając od frontu rozpuszczalnika kolejność migracji jest następująca: nasycone, jedno- i dwunienasycone estry kwasów tłuszczowych. Można również zaobserwować rozdzielanie izomerów cis i trans (izomery trans migrują szybciej od izomerów cis). Stosując płytki do chromatografii preparatywnej można wydzielić poszczególne grupy estrów w ilości wystarczającej do ich analizy w chromatografii gazowej Analiza estrów metylowych kwasów tłuszczowych w chromatografii gazowej Sprzęt: chromatograf gazowy z detektorem FID 4 i rejestratorem; butle z gazami: helem, wodorem i powietrzem; kolumna kapilarna z fazą stacjonarną SE-54; mikrostrzykawka do nanoszenia próbek. Ustawić następujące parametry pracy chromatografu: kolumna 25 m x 0.25 mm, gaz nośny He, ciśnienie MPa, 18:1 20:0 16:0 18:2 18:3 18:0 0 min Rys. 2. Rozdział mieszaniny estrów metylowych kwasów tłuszczowych w kapilarnej chromatografii gazowej na kolumnie z SE-54 4 Flame Ionization Detector - detektor płomieniowo-jonizacyjny.

4 1.4. Metody ilościowe analizy lipidów 39 detektor płomieniowo-jonizacyjny; H 2, MPa; O 2, 0.1 MPa; temperatura komory nastrzykowej C, temperatura detektora C, rozdział izotermiczny w temperaturze 190 C, czułość wzmacniacza 1x10 9 lub 3 x l0 9, wielkość próbki l μl, dzielnik l :50 Po ustabilizowaniu termicznym i elektronicznym aparatu wstrzyknąć do komory nastrzykowej l μl roztworu heksanowego estrów metylowych kwasów tłuszczowych; zaznaczyć moment wstrzykiwania na rejestratorze. Śledzić proces rozdziału przez 30 min. W celu porównania i identyfikacji frakcji przeprowadzić rozdział mieszaniny standardowej metylowanych kwasów tłuszczowych. Na Rys. 2 przedstawiono typowy chromatogram wzorców. Określić ilościowy skład reszt acylowych w analizowanej mieszaninie Metody ilościowe analizy lipidów Oznaczanie lipidów całkowitych metodą wanilinową kwas siarkowy stężony; 0.01 M wanilina w 11.5 M kwasie o-fosforowym (do 115 ml 85% kwasu ortofosforowego dodać 20 ml wody), odczynnik trwały przez rok; wzorzec mg cholesterolu rozpuścić w 100 ml metanolu. Podstawą oznaczania jest reakcja fosfowaniliny z wiązaniem nienasyconym. Reakcję dodatnią dają również ketony, wyższe alkohole, związki z aktywną grupą metylenową, hydrazyny i niektóre leki. W suchej probówce umieścić próbę badaną (50 μl) i dodać do niej 2 ml kwasu siarkowego, po ostrożnym wymieszaniu ogrzewać przez 20 min we wrzącej łaźni wodnej, ochłodzić, podobnie postąpić z próbą wzorcową używając 50 μl roztworu cholesterolu. Pobrać do probówek po 0. l ml powyższych hydrolizatów (próby badanej lub wzorca), dodać 4 ml odczynnika wanilinowego, wymieszać i odstawić na 20 min. Odczytać absorbancje próby badanej oraz wzorcowej przy 525 nm wobec próby ślepej odczynnikowej zawierającej zamiast hydrolizatu 0.1 ml stężone-

5 1. Lipidy 40 go kwasu siarkowego. Odczyty powinny być dokonane w ciągu 30 min od zakończenia reakcji. Obliczenia: μg lipidu w próbie = Oznaczanie cholesterolu całkowitego (wg Courchaine A. J., Miller W. H., Stein D. B. Jr., Clin. Chem. 5 (1959) ) Produkty reakcji cholesterolu z silnym kwasem dają barwne kompleksy z solami żelazowymi. kwas octowy; odczynnik żelazowy - 4 ml FeCl 3 (2.5 g FeCl 3 x 6 H 2 O rozpuścić w 100 ml 85% kwasu ortofosforowego) uzupełnić ostrożnie do 50 ml stężonym kwasem siarkowym; odczynnik jest trwały do utraty klarowności; wzorzec - 10 mg cholesterolu rozpuścić w 100 ml kwasu octowego. Próbkę lipidów zawierającą do 100 μg cholesterolu umieścić w suchej probówce i odparować z niej rozpuszczalnik. Do pozostałości dodać l.5 ml stężonego kwasu octowego i l ml odczynnika żelazowego. Po dokładnym wymieszaniu odczekać 10 min i odczytać absorbancję próby przy 550 nm wobec ślepej odczynnikowej. Ilość cholesterolu w próbie określić z krzywej kalibracyjnej sporządzonej dla μg cholesterolu Oznaczanie glikolipidów metodą fenolową (wg Roughan P. G., Batt R. D., Anal. Biochem. 22 (1968) 74-88) Stężone kwasy odwadniają reszty cukrowe gliko- i galaktolipidów do oksymetylenofurfurali, które z fenolem dają barwne produkty. stężony kwas siarkowy; 5% (w/v) roztwór fenolu w wodzie; wzorzec cukru mm roztwór wodny galaktozy.

6 l.4. Metody ilościowe analizy lipidów 41 Do l ml roztworu fenolu wstrzyknąć próbkę chloroformowego roztworu lipidów (do 50 μl). Dodać ostrożnie (!) 4 ml stężonego kwasu siarkowego, wymieszać na mikrowytrząsarce i ostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Odczytać absorbancję próby przy 485 nm wobec próby ślepej odczynnikowej. Przy 500 nmolach galaktozy absorbancja sięga 0.7 A. Oznaczyć zawartość cukru w próbie w oparciu o krzywą kalibracyjną wykonaną dla nmoli galaktozy ( μl) Oznaczanie fosforu w fosfolipidach Fosfolipidy ogrzewane z kwasem nadchlorowym ulegają destrukcji dając CO 2, H 2 O oraz PO W środowisku kwaśnym ortofosforan tworzy z molibdenianem amonowym fosforomolibdenian amonowy. Związek ten pod wpływem czynników redukujących ulega redukcji do mieszanych tlenków molibdenu, tzw. błękitu molibdenowego (Mo 2 O 5 x MoO 3 ), którego ilość określana jest kolorymetrycznie. Metoda I (wg Bartlett G. R., J. Biol. Chem. 234 (1959) ) molibdenian amonowy; stężony kwas siarkowy; dwusiarczyn sodowy Na 2 S 2 O 5 ; siarczyn sodowy Na 2 SO 3 ; kwas l -amino-2-naftaleno-4-sulfonowy; 70% kwas nadchlorowy. Roztwory robocze: Rozpuścić 2.2 g molibdenianu w 20 ml 98% kwasu siarkowego (traktując stężony jako 100%) stosując ciągłe mieszanie przez 10 min, uzupełnić wodą destylowaną do 1000 ml. Odczynnik Fiske-Subbarowa: g dwusiarczynu sodowego oraz l g siarczynu sodowego rozpuścić w 200 ml wody destylowanej, dodać 0.5 g kwasu aminonaftalenosulfonowego i mieszać przez 15 min w temperaturze ok. 40 C, odstawić na noc w ciemne miejsce, a następnie przesączyć do ciemnej butelki. Odczynnik trwały przez ok. 8 tygodni w 4 C. Roztwór standardowy: mg KH 2 PO 4 rozpuścić w 250 ml wody. 10 ml tego roztworu uzupełnić do 250 ml wodą; l ml zawiera 10 μg P i.

7 1. Lipidy 42 Próbkę lipidów uwolnić od rozpuszczalników przez ogrzanie kilka min w 120 C. Dodać 300 μl kwasu nadchlorowego, wymieszać, przykryć kulką szklaną i umieścić na 30 min w bloku grzejnym ( C). Ochłodzić i dodać 3 ml molibdenianu, zmieszać. Dodać 120 μl odczynnika Fiske-Subbarowa i zmieszać. Przykryć kulką szklaną i ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 15 min. Ochłodzić i odczytać absorbancję próby przy 830 nm (barwa stabilna przez 24 godz.). 90 nmoli P i daje absorbancję ok Oznaczyć ilość fosforu w próbie posługując się wykonaną krzywą kalibracyjną (10-90 nmoli P i ). Etap spalania może być tu pominięty. Metoda II (wg Rouser G., Siakotos A. N., Fleischer S., Lipids l (1966) 85-86) Roztwory: 70% kwas nadchlorowy; 2.5% wodny roztwór molibdenianu amonowego; 10% wodny roztwór kwasu askorbinowego (na świeżo!); standardowy roztwór fosforanu jw.; krzywa kalibracyjną jest liniowa do 10 μg P i. Próbkę lipidów umieścić w suchej probówce, odparować rozpuszczalnik i dodać 0.9 ml kwasu nadchlorowego. Przykryć probówkę kulką szklaną i spalać 30 min w 180 C. Ochłodzić i dodać 5 ml wody spłukując przy okazji ścianki probówki. Dodać l ml molibdenianu, l ml kwasu askorbinowego oraz 2 ml wody, dokładnie wymieszać. Przykryć kulką i ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 5 min. Ochłodzić w strumieniu zimnej wody. Odczytać absorbancję klarownego supernatantu przy 825 lub 797 nm wobec ślepej odczynnikowej (w przypadku oznaczeń frakcji z TLC ślepą stanowić będzie podobna jak w próbie badanej ilość żelu, lecz zdrapana z miejsca, w którym nie wykazano fosfolipidów). Odczytać ilość fosforu w próbie posługując się krzywą kalibracyjną.

8 l.4. Metody ilościowe analizy lipidów Oznaczanie fosfolipidów w zawiesinach wodnych (np. w liposomach) (wg Hallen R. M J. Biochem. Biophys. Methods 2 (1980) ) Metoda opiera się na tworzeniu rozpuszczalnych w chloroformie kompleksów fosfolipidów z błękitem molibdenowym. Metoda jest niewrażliwa na dodatki mogące być obecne w zawiesinie, takie jak 5% etanol, 0.05 M CaCl 2, 0.1 M NaCl, 0.5% dezoksycholan sodowy, 0.01 M fosforan sodowy, 0.5% albumina surowicy, 0.5% cholesterol. chloroform; metanol; roztwór roboczy: A. 5 g molibdenianu amonowego rozpuścić w 200 ml 75% kwasu siarkowego; B. 3 g molibdenianu amonowego rozpuścić w 50 ml stężonego kwasu solnego, a następnie mieszać przez 30 min na mieszadle magnetycznym z 2 ml rtęci. Przesączyć i dodać powoli do roztworu A. Uzyskany ciemnoniebieski roztwór (C) pozostawić do ostygnięcia i przelać do ciemnej butelki. Odczynnik trwały w temperaturze pokojowej co najmniej 3 miesiące. 2 ml zawiesiny fosfolipidów w roztworze wodnym (liposomów) zawierającej nie więcej niż l μmoli lipidu umieścić w zakręcanej probówce i dodać l ml roztworu C. Wymieszać i ogrzewać przez 2 min we wrzącej łaźni wodnej. Przestudzić próbę przez 5 min, a następnie dodać 3.5 ml mieszaniny chloroformu z metanolem (9:1). Zakręcić probówkę i dokładnie wymieszać fazy przez jej odwracanie. Odstawić probówkę na 30 min dla rozdzielenia faz. Pobrać fazę chloroformową (dolna) i odczytać absorbancję niebieskiego kompleksu przy 760 nm wobec chloroformu jako ślepej odczynnikowej. Krzywa kalibracyjną jest liniowa w zakresie A, co odpowiada stężeniu do 0.6 μmola lipidu Oznaczanie lipidów rezorcynolowych (wg Tłuścik F., Kozubek A., Mejbaum-Katzenellenbogen W., Acta Soc. Bot. Polon. 50 (1981) ) Metoda opiera się na tworzeniu barwnych związków dwuazowych w wyniku reakcji barwników dwuazonionych z fenolami. Lipidy rezorcynolowe dają swoiste fioletowoczerwone związki, których ilość oznaczana jest kolorymetrycznie.