(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11)

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (86) Data 1 numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/FR95/01126 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , W096/06924, PCT Gazette nr 11/96 (13) B1 (51) IntCl7 C12N 1/20 A23C 9/123 C12N 9/38 C12P 19/14 (54)Sposób wytwarzania produktów żywnościowych wzbogaconych w galakto-oligosacharydy, pożywka do otrzymywania produktów żywnościowych wzbogaconych w galakto-oiigosacharydy oraz produkt żywnościowy wzbogacony w galakto-oligosacharydy (30) Pierwszeństwo: , FR,94/10468 (73) Uprawniony z patentu: COMPAGNIE GERVAIS DANONE, Levallois-Perret, FR (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 15/97 (72) Twórcy wynalazku: Jean-Pierre Blareau, Steenvoorde, FR Francis Lecroix, Godewaersvelde, FR Bernard Maerten, Hazebrouck, FR Paul Pronnier, Brive-la-Gaillarde, FR (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 06/02 (74) Pełnomocnik: Rokicki Bogdan, Kancelaria Prawnicza i Patentowa PL B1 (57)1. Sposób wytwarzania produktu żywnościowego wzbogaconego w galaktooligosachaiydy przy użyciu pożywki na bazie mleka krowiego, znamienny tym, że składa się z jednego etapu, podczas którego do hodowli wprowadzany jest szczep Streptococcus thermophilus w pożywce, której zawartość suchej masy wynosi co najmniej 15% wagowych, i która ponadto zawiera składniki pokarmowe potrzebne do wzrostu wyżej wymienionej bakterii oraz co najmniej 0,1% wagowych (w stosunku do suchej masy) hydrolizatu protein mleka i co najmniej 20% wagowych (w stosunku do suchej masy) laktozy.

2 Sposób wytwarzania produktów żywnościowych wzbogaconych w galakto-oligosacharydy, pożywka do otrzymywania produktów żywnościowych wzbogaconych w galakto-oligosacharydy oraz produkt żywnościowy wzbogacony w galakto-oligosacharydy Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób wytwarzania produktu żywnościowego wzbogaconego w galaktooligosacharydy przy użyciu pożywki na bazie mleka krowiego, znamienny tym, że składa się z jednego etapu, podczas którego do hodowli wprowadzany jest szczep Streptococcus thermophilus w pożywce, której zawartość suchej masy wynosi co najmniej 15% wagowych, i która ponadto zawiera składniki pokarmowe potrzebne do wzrostu wyżej wymienionej bakterii oraz co najmniej 0,1% wagowych (w stosunku do suchej masy) hydrolizatu protein mleka i co najmniej 20% wagowych (w stosunku do suchej masy) laktozy. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że zawartość suchej masy w pożywce wynosi od 30 do 50% wagowych a pożywka zawiera od 0,2 do 3% wagowych (w stosunku do suchej masy) hydrolizatu protein mleka oraz od 25 do 60% wagowych (w stosunku do suchej masy) laktozy. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że hydrolizat protein mleka posiada stopień hydrolizy wynoszący od 15 do 50%, najlepiej wyższy niż 20%. 4. Sposób według zastrz. 1albo 2, albo 3, znamienny tym, że pożywka obsiana jest szczepem Streptococcus thermophilus posiadającym aktywność hodowli w wymienionej pożywce wyższą niż 0,9 U β-gal/g po upływie 4,5 godzin hodowli w pożywce i w którym hydrolizat protein mleka posiada stopień hydrolizy wyższy niż 22%. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że szczep Streptococcus thermophilus wybrany jest z grupy: - szczep LFL-01, zdeponowany 25 sierpnia 1994 roku w CNCM, pod numerem ; - szczep DN , zdeponowany 23 sierpnia 1995 w CNCM, pod numerem Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że po zakończeniu fermentacji produkt suszy się. 7. Pożywka do otrzymywania produktów żywnościowych wzbogaconych w galaktooligosachaiydy, zawierająca zagęszczone mleko krowie oraz dodatki niezbędne do wzrostu hodowli, znamienna tym, że zawartość suchej masy w pożywce wynosi co najmniej 15% wagowych, a ponadto pożywka zawiera co najmniej 0,1% wagowych (w stosunku do suchej masy) hydrolizatu protein mleka i co najmniej 20% wagowych (w stosunku do suchej masy) laktozy. 8. Pożywka według zastrz. 7, znamienna tym, że zawartość suchej masy wynosi 30-50% wagowych a pożywka zawiera 0,2-3% wagowych (w stosunku do suchej masy) hydrolizatu protein mleka oraz 25-60% wagowych (w stosunku do suchej masy) laktozy. 9. Pożywka według zastrz. 7 albo 8, znamienna tym, że hydrolizat protein mleka posiada stopień hydrolizy wynoszący od 15 do 50%, najlepiej wyższy niż 20%. 10. Produkt żywnościowy wzbogacony w galakto-oligosacharydy, otrzymany na bazie mleka krowiego, znamienny tym, że jest to odwodniony produkt żywnościowy posiadający aktywność β-galaktozydazy w granicach 0,5-5U β-gal na gram suchej masy i zawierający od 0,5 do 5g galakto-oligosacharydów na 100 g suchej masy. 11. Produkt żywnościowy według zastrz. 10, znamienny tym, że posiada aktywność β-galaktozydazy w granicach 1,5-3 U β-gal na gram suchej masy i zawierający od 0,8 do 2,5 g galakto-oligosacharydów na 100 g suchej masy. 12. Produkt żywnościowy według zastrz. 10, znamienny tym, że zawiera co najmniej jeden szczep bifidobakterii.

3 Produkt żywnościowy według zastrz. 12, znamienny tym, że bifidobakterie są wybrane z grupy złożonej z Bifidobacterium breve, Bifidobackerium infantis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum. 14. Produkt żywnościowy według zastrz. 12, znamienny tym, że bifidobakterie są w formie liofilizatu. * * * Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania w wyniku fermentacji produktów mlecznych wzbogaconych w galakto-oligosacharydy, pożywki do otrzymywania produktów wzbogaconych w galakto-oligosacharydy, szczepu Streptococcus thermophilus do wytwarzania produktów wzbogaconych w galakto-oligosacharydy oraz produktu żywnościowego wzbogaconego w galakto-oligosacharydy, nadającego się przede wszystkim do karmienia niemowląt. Wiadomo, że produkty mleczne w rodzaju jogurtu otrzymane drogą fermentacji mają duże znaczenie przy odżywianiu dzieci. Faktycznie, bakterie mlekowe, tradycyjnie wykorzystywane do produkcji tych produktów posiadają względnie wysoką aktywność ß-galaktozydazy, co ułatwia trawienie laktozy i w wyniku tego tolerowanie produktu żywnościowego. ß-galaktozydaza odpowiada za hydrolizę laktozy w glukozę i galaktozę. Badania nad aktywnością przygotowania ß-galaktozydazy wykazały, że poczynając od pewnego stopnia stężenia laktozy, enzym ten również ulega katalizacji, równolegle do hydrolizy laktozy, która doprowadza do utworzenia glukozy i galaktozy, reakcji transgalaktozylacji, która doprowadza do wytworzenia rodziny oligosacharydów (od dwu- do sześciosacharydów) nazywanymi galakto-oligosacharydami [patrz np. SMART, Appl. Microbiol. Biotechnol., 34, (1991)]. Tak więc, zostało wykazane, że galakto-oligosacharydy są czynnikiem stymulującym wzrost bifidobakterii i wpływają w związku z tym na wzbogacenie flory jelit w bifidobakterie kosztem innych mikroorganizmów, zwłaszcza bakterii chorobotwórczych [Tanaka i inni. Bifidobacteria Microflora, t. 2 (1), 17-24, (1983)]. Zaproponowane zostało wykorzystanie ß-galaktozydazy rozmaitego pochodzenia do przygotowania galakto-oligosacharydów, na przykład w celu otrzymania produktów mlecznych o wysokiej zawartości galakto-oligosacharydów. Opisane zostały dwa sposoby wytwarzania zmierzające do osiągnięcia tego celu: Pierwszy sposób posługuje się obróbką substratu zawierającego laktozę, na przykład mleka, przez przygotowanie ß-galaktozydazy oczyszczonej z różnorodnych mikroorganizmów. Znany jest również z europejskiego zgłoszenia patentowego Nr , sposób polegający na obróbce mleka zwierzęcego przez przygotowanie ß-galaktozydazy ekstrahowanej ze Streptococcus thermophilus lub z Lactobacillus bulgaricus, w celu przetworzenia co najmniej 15% laktozy zawartej w tym mleku w galakto-oligosacharydy. W procesie tym nie otrzymuje się produktu sfermentowanego a ponadto otrzymuje się produkt wzbogacony co prawda w galakto-oligosacharydy, jednakże pozbawiony ß-galaktozydazy w postaci aktywnej. Proces ten prowadzi do dezaktywacji ß-galaktozydazy. Zostało również zaproponowane [Z.MOZAFFAR i inni. Journal of Food Science, 50, str , (1985)] wytwarzanie galakto-oligosacharydów na bazie mleka używając ß-galaktozydazy ekstrahowanej z Bacillus circulans. Negatywną stroną tych sposobów jest konieczność wcześniejszego oczyszczenia ß-galaktozydazy i problemy ze stabilizacją aktywności enzymatycznej, występujące na ogół przy wszelkiego rodzaju przygotowywaniu oczyszczonych enzymów. Drugi sposób zakłada wykorzystanie bakterii posiadających aktywność ß-galaktozydazy, bez wcześniejszego ekstrahowania enzymu. Jednak, w tym wypadku hodowla Streptococcus thermophilus posiada ß-galaktozydazę wewnątrzkomórkową, co powoduje problemy z dostępnością do substratu. Aby to osiągnąć, powinno się doprowadzić

4 albo do rozpadu bakterii, lub co najmniej do ich przepuszczalności, na przykład stosując jakiś rozpuszczalnik organiczny lub powierzchniowo czynny. Przepuszczalność, chociaż jest mniej drastyczna niż rozpad, jest jednak szkodliwa dla żywotności bakterii i również wpływa ujemnie na aktywność ß-galaktozydazy; w związku z tym zaproponowane zostało wykorzystanie bakterii przepuszczalnych, w celu przedłużenia ich żywotności i ochrony aktywności ß-galaktozydazy. W tym celu była, na przykład, zalecana obróbka przy pomocy gliceryny lub sorbitu. Inny rodzaj obróbki, opisany w japońskim zgłoszeniu patentowym na nazwisko YAKULT HONSHA KK, opublikowanym 28 czerwca 1991 roku pod numerem , posługuje się procesem, gdzie przepuszczalne bakterie są poddawane obróbce przez galakto-oligosachaiydy w celu ochrony aktywnego centrum ß-galaktozydazy. Pozwala to na opóźnienie utraty aktywności tego enzymu podczas konserwacji bakterii i podczas reakcji tworzenia galaktooligosacharydów. Bez względu na to, którym z dwóch sposobów posługujemy się, nawet jeżeli aktywność ß-galaktozydazy jest jeszcze obecna w produkcie po reakcji transgalaktozylacji, aktywność ta nie jest zachowywana w produkcie gotowym do konsumpcji. W rzeczywistości, ani oczyszczony enzym ani enzym obecny w przepuszczalnych bakteriach, nie wytrzymuje różnego rodzaju obróbek kończących się otrzymaniem gotowego produktu. Aktywność ß-galaktozydazy nie wytrzymuje działania soków trawiennych po spożyciu przez konsumenta. Chociaż byłoby pożądane, w szczególności w wypadku żywności dla dzieci i noworodków, istnienie produktów mlecznych wzbogaconych jednocześnie w aktywną ß-galaktozydazę i galakto-oligosacharydy, to nie zostało do tej pory zaproponowane wykorzystanie tego samego mikroorganizmu w celu uzyskania tego podwójnego celu. Niniejszy wynalazek ma na celu przygotowanie produktów mlecznych wzbogaconych jednocześnie w galakto - oligosacharydy i aktywną ß-galaktozydazę. Niniejszy wynalazek zakłada wykorzystanie mikroorganizmu posiadającego aktywność ß-galaktozydazy, która na pierwszym etapie jest wykorzystywana do produkcji galaktooligosacharydów, w warunkach, kiedy mikroorganizm pozostaje nienaruszony, co pozwala na drugim etapie chronić aktywność ß-galaktozydazy, najpierw podczas różnorodnych czynności prowadzących do otrzymania gotowego do konsumpcji produktu, a następnie, po spożyciu przez konsumenta, przed działaniem soków trawiennych aż do poziomu jelitowego. Twórcy zdecydowali się, aby w tym celu wykorzystać bakterię Streptococcus thermophilus. Streptococcus thermophilus jest bakterią gram dodatnią tlenowość-beztlenowość obojętna. Powoduje ona fermentację homolaktacyjną. Bakteria ta posiada różne cechy umożliwiające jej bezpośrednie dodawanie do produktów nadających się do przechowywania w stanie świeżym oraz do produktów przeznaczonych do różnorodnego rodzaju obróbki (na przykład odwadniania) i produktów, które mogą być stosowane do karmienia zwłaszcza noworodków. Przede wszystkim, Streptococcus thermophilus: - wytwarza jedynie kwas mlekowy L(+) i w dodatku w niewielkiej ilości inaczej niż w wypadku mikroorganizmów w rodzaju Lactobacillus, które wytwarzają kwas mlekowy D(-), który u niemowląt nie ulega metabolizmowi. - jest bardzo odporny na wysuszanie w wysokiej temperaturze, która jest stosowana przy otrzymywaniu mleka w proszku; - posiada bardzo słabą aktywność proteolityczną, co ogranicza możliwość tworzenia się związków posiadających nieprzyjemny smak w czasie magazynowania gotowych produktów. W normalnych warunkach hodowli Streptococcus thermophilus posiada ß-galaktozydazę wewnątrzkomórkową co powoduje problemy z dostępnością do substratu, o których już wcześniej była mowa. MOLOTOV i inni, [Biotekhnologiya, (1991) ] stwierdza, wbrew obserwacjom poczynionym przez większość autorów, istnienie w pewnych warunkach hodowli aktywności (ß-galaktozydazy wydzielanej przez bakterie. To wydzielanie jest jednak zjawiskiem margi-

5 nesowym, które zostało zaobserwowane w hodowlach starszych lub hodowlach gdzie zamiast laktozy wykorzystywana jest glukoza. Tak więc, aby rozważyć wykorzystanie Streptococcus thermophilus do przygotowania drogą fermentacji produktów mlecznych wzbogaconych równocześnie w aktywną β-galaktozydazę i galakto-oligosacharydy, trzeba osiągnąć dobry wzrost bakteryjny, aby z jednej strony pozwolić na fermentację substratu, a z drugiej zapewnić obecność w czasie fermentacji wystarczającą aktywność β-galaktozydazy w celu umożliwienia wzbogacenia sfermentowanego produktu w galakto-oligosacharydy. Warunki w jakich MOLOTOV dokonał swych obserwacji są niezbyt korzystne dla dobrego wzrostu bakterii i otrzymania wysokiej aktywności β-galaktozydazy, poza tym nie są odpowiednie dla reakcji transgalaktozylacji, która pozwala na otrzymanie galakto-oligosacharydów. Wynalazcy nieoczekiwanie stwierdzili, że możliwe jest hodowanie pewnych szczepów Streptococcus thermophilus w pożywce zawierającej laktozę, a zwłaszcza w pożywce zawierającej zagęszczone mleko w taki sposób, aby otrzymać fermentację pożywki, której towarzyszy podniesiona produkcja galakto-oligosacharydów, stanowiących od 2 do 6% laktozy obecnej początkowo w pożywce hodowli i otrzymanej przy zachowaniu nienaruszonych komórek. Celem niniejszego wynalazku jest opracowanie sposobu wytwarzania drogą fermentacji produktu wzbogaconego równocześnie w aktywną β -galaktozydazę oraz galaktooligosacharydy, który to sposób charakteryzuje się tym, że składa się z jednego etapu, podczas którego umieszcza się w hodowli jeden szczep Streptococcus thermophilus w pożywce, której zawartość suchej masy wynosi co najmniej 15% wagowych i, która zawiera, poza pożywieniem potrzebnym do wzrostu Streptococcus thermophilus, co najmniej 0,1% wagowych (w odniesieniu do suchej masy) hydrolizatu protein mleka i co najmniej 20% wagowych (w odniesieniu do suchej masy) laktozy. Normalne warunki hodowli Streptococcus thermophilus i składniki pożywieniowe potrzebne do jej wzrostu są dobrze znane osobom zajmującym się tą dziedziną: stosuje się, na przykład, hodowlę tej bakterii w pożywce M17 lub na odtłuszczonym mleku przygotowanym o zawartości 10% suchej masy z dodatkiem 0,1% ekstraktu drożdżowego. Zgodnie z preferowanym zastosowaniem sposobu według wynalazku, zawartość suchej masy w pożywce mieści się w granicach 30-50% i pożywka ta zawiera 0,2-3% hydrolizatu protein mleka i 25-60%, w stosunku wagowym do suchej masy, laktozy. Poprzez "hydrolizat protein mleka" należy rozumieć hydrolizat kazeiny, będący hydrolizatem retencyjnym ultrafiltracji mleka lub hydrolizatem pełnych protein mleka. Można, jeżeli istnieje taka potrzeba, wykorzystywać oczyszczoną frakcję peptydową utworzoną poprzez ultrafiltrację jednego z wyżej wymienionych hydrolizatów. W takim wypadku, wybrać należy frakcję zawierającą peptydy o średnim ciężarze molekularnym niższym niż 5000 Da, najlepiej niższym niż 2000 Da. Zgodnie z preferowanym zastosowaniem sposobu według wynalazku, wymieniony hydrolizat protein mleka posiada stopień hydrolizy wynoszący 15-50%, najlepiej wyższy niż 20%. Korzystnym jest, aby pożywka obsiana była szczepem Streptococcus thermophilus posiadającym aktywność hodowli w wymienionej pożywce wyższą niż 0,9 U (β-gal/g po upływie 4,5 godzin hodowli, w którym hydrolizat protein mleka posiada stopień hydrolizy wyższy niż 22%. Jako szczep Streptococcus thermophilus korzystnie stosuje się szczep wybrany z grupy: - szczep LFL-01, zdeponowany 25 sierpnia 1994 roku w CNCM pod numerem I-1470; - szczep DN , zdeponowany 23 sierpnia 1995 roku w CNCM pod numerem Stopień hydrolizy (DH) jest określony jako stosunek procentowy azotu aminowego do azotu całkowitego. Najkorzystniejsze jest, kiedy ten hydrolizat jest otrzymany przez hydrolizę enzymatyczną protein mleka. Liczne peptydazy, na przykład, trypsyna (EC ), chymotrypsyna (EC ) lub mieszanki peptydaz takie jak, katalaza, pankreatyna, itp. mogą być odpowiednie

6 do otrzymania tego hydrolizatu. Warunki hydrolizy zostaną dobrane, aby osiągnąć wyżej wskazany DH. Hydrolizat protein mleka korzystnie posiada stopień hydrolizy wynoszący od 15 do 50%, najlepiej wyższy niż 20%. Po zakończeniu fermentacji korzystnie suszy się sfermentowany produkt. Celem niniejszego wynalazku jest również określenie pożywki hodowli pozwalającej na stosowanie sposobu według wynalazku. W celu zastosowania sposobu według wynalazku, wykorzystuje się mleko krowie o zawartości suchej masy co najmniej 15% wagowych, do którego dodaje się, poza składnikami umożliwiającymi zastosowanie sposobu według wynalazku, niezbędne dodatki konieczne do przygotowania gotowego do spożycia produktu, który chcemy otrzymać. Jeżeli, na przykład, chce się otrzymać mleczny produkt żywnościowy dla niemowląt, należy dodać laktozę, malto-dekstrynę, składniki mineralne, witaminy, substancje tłuszczowe, składniki umożliwiające odtworzenie składu mleka matki. Jeżeli jest taka potrzeba, dodawane są substancje tłuszczowe, a następnie homogenizowane z roztworem w celu otrzymania stabilnej emulsji. Pożywka zawiera ponadto składniki pokarmowe potrzebne do wzrostu bakterii Streptococcus thermophilus oraz co najmniej 0,1% wagowych, korzystnie 0,2-3% wagowych (w stosunku do suchej masy) hydrolizatu protein mleka i co najmniej 20% wagowych, korzystnie 25-60% wagowych (w stosunku do suchej masy) laktozy. Roztwór zawiera wówczas od 15 do 50% wagowych suchej masy, najlepiej w granicach 30-45%, przed schłodzeniem do C, najlepiej w granicach C i zaszczepiony hodowlą Streptococcus thermophilus zawierającą od 107 do 109 bakterii/ml. Zakres optymalnej temperatury hodowli wynosi od 40 do 45 C. Wybór szczepu Streptococcus thermophilus umożliwiającego otrzymanie najlepszych wyników jest dokonywany przez wcześniejszą selekcję w drodze hodowli na pożywce zgodnej z wynalazkiem; pożądana aktywność ß-galatozydazy w gotowym do użycia produkcie wynosi ponad 0,15U. ß-gal/ml, najlepiej mieści się w przedziale 0,2-04 U. ß-gal/ml, dokonywany jest wybór szczepu posiadającego aktywność w hodowli na pożywce zgodnej z wynalazkiem wyższą niż 0,9U ß-gal/g po 4,5 godz. hodowli. Jedna jednostka ß-galaktozydazy odpowiada jednemu hydrolizowanemu mikromolowi ONPG (ortonitrofenylo- ß-D-galaktozyd) na minutę przy ph 7,3 i w temperaturze 37 C. Dla przykładu, szczepy Streptococcus thermophilus dostępne w handlu i, które szczególnie dobrze nadają się do zastosowania sposobu według wynalazku, są to szczepy ST 12 i ST 14 sprzedawane przez spółkę BOLL (Le Moulin d'aulnay; BP 64; Saint-Germain les-arpajon Arpajon Cedex France). Z drugiej strony, szczepy Streptococcus thermophilus nadające się również do zastosowania w sposobie według wynalazku, zostały zdeponowane w CNCM (Krajowy Zbiór Hodowli Mikroorganizmów) znajdującym się w Instytucie Pasteur'a 25 rue du Docteur Roux w Paryżu: szczep posiadający nazwę LFL-01 został zdeponowany 25 sierpnia 1994 roku, pod numerem I-1470, a szczep posiadający nazwę DN został zdeponowany 23 sierpnia 1995, pod numerem I W czasie fermentacji substratu przez Streptococcus thermophilus przy stosowaniu sposobu według wynalazku, aktywność ß-galaktozydazy tworzona jest równolegle z kwasowością. Wielkość ph w warunkach hodowli i dla składu określonej pożywki, umożliwia więc obserwację, czy została otrzymana pożądana aktywność ß-galaktozydazy. Produkt zostaje wówczas schłodzony do temperatury C w celu zatrzymania fermentacji. Można poza tym zaszczepić pożywkę fermentacyjną przy pomocy bifidobakterii takich, jak: Bifidobacterium Breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum. Bakterie te mogą być dodawane na początku fermentacji dokonywanej przez Streptococcus thermophilus, w czasie jej trwania lub po jej zakończeniu. Poddany fermentacji produkt może następnie przechodzić różnorodnego rodzaju obróbkę, której rodzaj jest zależny od tego, jakiego rodzaju produkt gotowy do spożycia chcemy otrzymać. Mogą, na przykład, zostać dodane środki konsystencyjne, smakowe, dodatki

7 witaminizowane lub mineralne, substancje tłuszczowe, itp. jeżeli nie zostały one wcześniej dodane w czasie fermentacji. W wypadku, kiedy chcemy otrzymać produkt odwodniony, należy przeprowadzić suszenie. Suszenie może zostać wykonane wszelkimi stosowanymi metodami, na przykład poprzez atomizację lub liofilizację. W czasie suszenia poprzez atomizację, chociaż ß-galaktozydaza jest szczególnie odporna, zalecana jest wyjściowa temperatura powietrza niższa niż 90 C w celu zachowania maksymalnej aktywności ß-galaktozydazy. Przedmiotem niniejszego wynalazku jest również mleczny produkt żywnościowy wzbogacony w galakto-oligosacharydy i zawierający równocześnie aktywną ß-galaktozydazę. W związku z tym, niniejszy wynalazek obejmuje zwłaszcza: - mleczne produkty żywnościowe świeże; - produkty mleczne odwodnione; - produkty mleczne odtworzone poprzez dodanie wody do mlecznych produktów odwodnionych otrzymanych sposobem według wynalazku. Produkt żywnościowy według wynalazku posiada ß-galaktozydazę o aktywności w granicach 0,5-5U ß-gal, najlepiej w granicach 1,5-3U ß-gal na gram suchej masy oraz zawiera 0,5-5 g, a najlepiej w granicach 0,8-2,5 g galakto-oligosacharydów na 100 g suchej masy. Odwodniony produkt żywnościowy według wynalazku zawiera korzystnie również liofilizat bifidobakterii. Najlepiej, jeżeli te bifidobakterie zostaną wybrane z grupy, do której należą Bifidobackerium Breve, Blfidobackerium infantis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum. Produkty mleczne otrzymane sposobem według wynalazku są lepiej tolerowane niż znane produkty mleczne, zwłaszcza przez osoby cierpiące na niedobór ß-galaktozydazy, z tego powodu, że zawierają one ß-galaktozydazę żywych bakterii mlekowych co zapewnia lepsze trawienie laktozy, a poza tym, produkty mleczne otrzymane sposobem według wynalazku, bogate są w galakto-oligosacharydy, co dodatnio wpływa na rozwój bifidobakterii flory jelit in situ. Nadają się one szczególnie dobrze jako pokarm dla dzieci. Poza w/w cechami, wynalazek ma jeszcze inne cechy, które pojawią się wraz z opisem odnoszącym się do przykładów wytwarzania produktów zgodnie ze sposobem według wynalazku, a zwłaszcza produktów żywnościowych przeznaczonych dla dzieci. Przykład I. Przygotowanie pożywki fermentacyjnej pozwalającej na zastosowanie sposobu według wynalazku Do odtłuszczonego mleka krowiego, podgrzanego do temperatury 75 C dodaje się roślinną substancję tłuszczową i lecytynę. Przeprowadza się homogenizację w tej samej temperaturze w dwóch etapach, pierwszy - pod ciśnieniem 200 kg/cm2, drugi pod ciśnieniem 50 kg/cm2. Dodaje się trzecią część stanowiącą roztwór zawierający witaminy. Końcowa mieszanina jest pasteryzowana w 115 C, a następnie zagęszczana poprzez odparowanie do 43% wagowych suchej masy. Koncentrat posiada następujący skład (Tabela 1) wyrażony w gramach na 100 gramów suchej masy. Tabela 1 Roślinna masa tłuszczowa W tym lecytyna Proteiny mleka (z czego 80% kazeina i 20% protein surowiczych) Laktoza Malto dekstryny Sole mineralne Witaminy 24,0 g 0,25 g 12,85 g 40,0 g 20,4 g 2,6 g 0,15 g

8 Przykład II. Wybór szczepu Streptococcus thermophilus Przeprowadzone zostały próby z różnorodnymi szczepami Streptococcus thermophilus. Szczepy są na początku hodowane na sterylizowanym, odtłuszczonym mleku wzbogaconym w ekstrakt drożdży (1 g/l), aż do momentu uzyskania hodowli zawierającej około 108 zarodników/ml. Na koncentracie mleka dla dzieci przygotowanym zgodnie z opisem w przykładzie I, zostaje posiana hodowla w stosunku 5% v/v, a następnie inkubowana do 44 C. Odmierzane są kwasowości, a fermentacja jest zatrzymywana w granicach 110 D lub po sześciu godzinach fermentacji, jeżeli kwasowość w wysokości 100 D nie zostaje osiągnięta. Mierzona jest wówczas aktywność β-galaktozydazy. Wyniki są wskazane w poniższej tabeli 2: kwasowość jest wyrażona w stopniach Domic'a ( D) : jeden stopień Domic'a odpowiada 1mg kwasu mlekowego/10 ml mleka; aktywność β-galaktozydazy wyrażana jest w U β-gal/g koncentratu. Tabela 2 KWASOWOŚĆ ( D) β - gal Szczep 2 godz. 3,5 godz. 4,5 godz. 6 godz. Koniec fermentacji STB01* ,53 STB05* ,52 TH3* ,42 ST9* nie skrzepnięte Dpoh ,93 ST ,55 LFL DN ,30 * Szczepy sprzedawane przez Spółkę BOLL Szczepy ST12 i ST13 (BOLL) zostały sprawdzone w takich samych warunkach i pozwalają otrzymać odpowiednio 0,97 i 0,94 U β-gal/g koncentratu po 4,5 godzinach inkubacji. Szczepy DPch, LFL-01, DN oraz szczepy ST12 i ST13 posiadają aktywność pozwalającą na zastosowanie sposobu według wynalazku. P r z y k ł a d III. Wpływ rodzaju hydrolizatu proteinowego na aktywność β-galaktozydazy Aby zbadać wpływ rodzaju hydrolizatu proteinowego oraz stopnia hydrolizy na aktywność β-galaktozydazy do współmiernych frakcji pożywki wyjściowej otrzymanej zgodnie z przykładem I i zagęszczonej do 40% dodawane są różnorodne hydrolizaty, o współczynniku izoproteinowym (co odpowiada 1,1 g protein/l g zagęszczonego roztworu). Koncentraty są szczepione przy pomocy 5% (v/v) hodowli Streptococcus thermophilus (szczep LFL-01) na mleku wzbogaconym w ekstrakt drożdży. Temperatura inkubacji wynosi 44 C. Kwasowość i aktywność β-galaktozydazy są mierzone po 4 godzinach inkubacji. Wyniki zostały przedstawione w poniższej tabeli: Tabela 3 Rodzaj hydrolizatu Kwasowość β-galaktozydaza Żaden 84 D 0,11U β-gal/g Kazeina 121 D 0,95U β-gal/g Proteiny z serwatki 113 D 0,45U β-gal/g Soja 115 D 0,58U β-gal/g Mięso indyka 111 D 0,36U β-gal/g Albumina mleka 118 D 0,71U β-gal/g

9 Przykład IV. Wpływ rodzaju hydrolizatu (kazeina, mleko lub retentat mleka) dodanego do koncentratu mleka dla dzieci na aktywność β-galaktozydazy Hodowle Streptococcus thermophilus (szczep LFL-01), i dawkowanie są takie same jak w przykładzie III. W wypadku każdego hydrolizatu, sprawdzane są trzy dawki: 0,9 g, 1,5 g i 3,6 g hydrolizatu na kilogram 40% koncentratu. Wyniki są wskazane w poniższej Tabeli 4. Tabela 4 Rodzaj Doza 3 godziny 4 godziny hydrolizatu (g/kg) aktywność β-gal kwasowość ( D) Kazeina 0,9 77 0, ,15 1,5 79 0, ,09 3,6 82 0, ,24 Retentat mleka 0,9 80 0, ,95 1,5 85 0, ,15 3,6 93 0, ,31 Mleko 0,9 88 0, ,93 1,5 92 0, ,98 3,6 95 0, ,06 Wyniki są dość zbliżone jedne do drugich, jednak, hydrolizat kazeinowy pozwala otrzymać najwyższą aktywność β-galaktozydazy przy najmniejszym wkładzie proteinowym i minimalną kwasowość. Przykład V. Wpływ stopnia hydrolizy hydrolizatu kazeinowego na aktywność β-galakozydazy. Hodowle Streptococcus thermophilus (szczep LFL-01) i dawkowanie są tak same jak w przykładzie III. Kazeinat potasu jest mieszany z wodą w stosunku 100 g/l, pasteryzowany w 92 C, schłodzony do 50 C. Roztwór zostaje przeniesiony do fermentora, wyposażonego w regulację ph i temperatury. Do roztworu dodawane jest 1g/l pankreatyny 3NF (Biologiczne Laboratorium Przemysłowe, Soisy-sous-Montmorency, France). Temperatura zostaje ustawiona na 50 C a współczynnik ph na poziomie 7,3 tlenku wapniowego. Regularnie pobierane są próbki i przetrzymywane 20 min w 85 C w celu zniszczenia enzymu, a następnie schładzane do 5 C. Na tych próbkach przeprowadza się oznaczanie azotu całkowitego i azotu aminowego. Stosunek procentowy azot aminowy/azot całkowity określa stopień hydrolizy proteiny. Aby zbadać wpływ stopnia hydrolizy, do współmiernych frakcji koncentratu mleka dla dzieci z Tabeli 1 są dodawane identyczne ilości (azotu całkowitego) z różnych próbek hydrolizatów odpowiadające rosnącemu stopniowi hydrolizy. Rezultaty są przedstawione w poniższej tabeli 5. Żądana aktywność β-galaktozydazy (>0,90U β-gal/g) jest otrzymana w wypadku hydrolizatów kazeiny, których stopień hydrolizy jest wyższy niż 22%

10 Tabela 5 Stopień 3 godziny fermentacji 4,5 godziny fermentacji hydrolizy β-gal β-gal Kwasowość w D Kwasowość w D NH2/NT U β-gal/g U β-gal/g 9,0% 55 0, ,24 17,6% 82 0, ,70 22,1% 85 0, ,96 25,0% 85 0, ,97 29,3% 88 0, ,10 32,3% 88 0, ,10 34,9% 94 0, ,03 Przykład VI. Produkcja β-galaktozydazy i galakto-oligosacharydów w czasie fermentacji koncentratu mleka dla dzieci Koncentrat mleka jest przygotowany tak, jak jest to podane w przykładzie I i obsiany w stosunku 5% v/v hodowlą w Streptococcus thermophilus (szczep LFL-01), a następnie inkubowany w 44 C. Aktywność β-galaktozydazy (U β-gal/g koncentratu), wytwarzanie galakto-oligosacharydów (ilość gramów na 100 g koncentratu) i kwasowość są mierzone po upływie określonego czasu (w godzinach). Wyniki zostały podsumowane w poniższej tabeli 6: Tabela 6 Czas Kwasowość Oligosacharydy β-gal ,03 0, ,07 0, ,30 0, ,40 1,15 4, ,42 1,16 Wszystkie te wartości zmieniają się równolegle i osiągają najwyższą wartość po 4,5 godzinach fermentacji. Zagęszczony roztwór został wysuszony poprzez pulweryzację i został odtworzony tak, aby otrzymać produkt o zawartości 14% suchej masy. Wartości aktywności β-galaktozydazy i koncentracji galakto-oligosacharydów w koncentracie, w proszku i następnie w odtworzonym produkcie są identyczne i zostały przedstawione w poniższej Tabeli 7 : aktywność β-galaktozydazy jest wyrażona w U β-gal/g dla koncentratu i proszku i w U β-gal/ml dla odtworzonego produktu; zagęszczenie galakto-oligosacharydów jest wyrażone w gramach na 100 g w wypadku koncentratu i proszku i w g/l w wypadku odtworzonego produktu. Tabela 7 Koncentrat Proszek Odtworzony produkt β-gal 1,16 2,40 0,33 U Oligosacharyd 0,42 g%g 0,90 g%g 1,26 g/l

11 Przykład VII. Otrzymywanie produktów gotowych do spożycia: Zgęszczony roztwór przygotowany tak, jak w przykładzie I szczepi się 5%, w stosunku do objętości hodowli zawierającej około 108 zarodników Streptococcus thermophilus LFL-01. Zgęszczony roztwór poddaje się fermentacji przez około 5,5 godziny w temperaturze 44 C, do otrzymania kwasowości 106 D i aktywności β-galaktozydazy 1U β-gal/g koncentratu. Sfermentowany, zagęszczony roztwór schładza się do 20 C. Przygotowany produkt jest następnie suszony poprzez pulweryzację w temperaturze wejściowej 165 C oraz w temperaturze wyjściowej niższej niż 90 C. Otrzymujemy proszek posiadający aktywność β-galaktozydazy w wysokości 2,4 U na gram proszku, zawartość resztkową w wodzie około 2 do 3% i który można przechowywać 13 miesięcy w temperaturze 20 C tracąc maksymalnie 10-15% jego wskaźnika aktywności β-galaktozydazy. Proszek ten pozwala, przy zastosowaniu 140 g proszku na około 900 ml wody, na odtworzenie mleka zakwaszonego, szczególnie przeznaczonego dla niemowląt.

12 Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz. Cena 4,00 zł.