Molekularne strategie terapeutyczne w chorobie Huntingtona

Transkrypt

1 Molekularne strategie terapeutyczne w chorobie Huntingtona Michał Milewski 1, Dorota Hoffman-Zacharska 1,2 Jerzy Bal 1 1 Zakład Genetyki Medycznej, Instytut Matki i Dziecka, Warszawa 2 Instytut Genetyki i Biotechnologii, Uniwersytet Warszawski, Warszawa Zakład Genetyki Medycznej, Instytut Matki i Dziecka, ul. Kasprzaka 17a, Warszawa; michal.milewski@imid. med.pl Artykuł otrzymano 21 września 2014 r. Artykuł zaakceptowano 27 listopada 2014 r. Słowa kluczowe: choroba Huntingtona, huntingtyna, neurodegeneracja, terapia genowa, interferencja RNA, autofagia Wykaz skrótów: AAV (ang. adeno-associated virus) wirus satelitarny adenowirusa; ASO (ang. antisense oligonucleotides) antysensowne oligonukleotydy; (CAG) n trójnukleotydowa sekwencja powtórzona cytozyna-adenina-guanina; BDNF (ang. brain-derived neurotrophic factor) czynnik neurotroficzny pochodzenia mózgowego; HD (ang. Huntington s disease) choroba Huntingtona; HTT gen lub białko huntingtyny; mirna (ang. micro RNA) mikrocząsteczka kwasu rybonukleinowego; RNAi (ang. RNA interference) interferencja kwasu rybonukleinowego; sirna (ang. small interfering RNA) mały interferujący kwas rybonukleinowy; shrna (ang. short hairpin RNA) mały kwas rybonukleinowy o strukturze szpilki do włosów; UPR (ang. unfolded protein response) odpowiedź na nieprawidłowo zwinięte białka Podziękowania: Praca powstała podczas realizacji projektu badawczego N N STRESZCZENIE Choroba Huntingtona jest postępującą chorobą neurodegeneracyjną o podłożu genetycznym, dla której wciąż brak jest skutecznego sposobu leczenia przyczynowego. W ostatnich latach podjęto szereg nowatorskich prób wypracowania molekularnych form terapii tej choroby, wykorzystujących między innymi różne sposoby selektywnego wyciszania ekspresji zmutowanego genu odpowiedzialnego za chorobę oraz rozmaite formy neutralizacji toksycznego produktu ekspresji tego genu. Niniejsze opracowanie omawia wszystkie najważniejsze molekularne strategie terapeutyczne dla choroby Huntingtona, próbując jednocześnie ocenić szanse ich powodzenia oraz możliwość ewentualnego zastosowania w leczeniu szeregu innych chorób neurozwyrodnieniowych z grupy proteinopatii, wykazujących przypuszczalnie zbliżony mechanizm patogenezy. WPROWADZENIE Choroba Huntingtona (HD, ang. Huntington s disease) jest uwarunkowaną genetycznie chorobą neurodegeneracyjną, której najbardziej charakterystycznym objawem klinicznym jest występowanie mimowolnych ruchów pląsawiczych, od których zwykło się ją nazywać pląsawicą Huntingtona. Pełen obraz kliniczny HD jest w rzeczywistości znacznie szerszy i obejmuje nie tylko szereg zaburzeń różnych funkcji motorycznych i poznawczych, ale także nasilające się objawy psychiatryczne, co łącznie przyczynia się do drastycznego obniżenia komfortu życia chorych i ich rodzin [1]. HD ma charakter postępujący i pozostaje przy tym wciąż schorzeniem nieuleczalnym. Chorzy umierają zwykle po upływie lat od zaobserwowania pierwszych objawów, pojawiających się na ogół pod koniec trzeciej lub w czwartej dekadzie życia. Ponieważ HD jest chorobą dziedziczoną autosomalnie dominująco, do wystąpienia jej objawów wystarcza obecność patogennej mutacji w jednym z dwóch alleli genu HTT, znanego też pod nazwami HD lub IT15. Mutacja ta ma przy tym zawsze postać nadmiernie wydłużonego ciągu trójnukleotydowych powtórzeń (CAG) n zlokalizowanego w pierwszym eksonie genu HTT. Ciąg ten u osób zdrowych zawiera mniej niż 36 kopii CAG (na ogół powtórzeń), podczas gdy u osób chorych liczba ta najczęściej przekracza 40 powtórzeń. Ten charakterystyczny typ mutacji, polegający na wydłużeniu się mikrosatelitarnej sekwencji powtórzonej składającej się najczęściej z trójnukleotydowych powtórzeń, określa się często terminem mutacji dynamicznej [2], gdyż wykazuje ona tendencję do wydłużania się patogennej liczby powtórzeń podczas przekazywania zmutowanego genu potomstwu, czemu zwykle towarzyszy zjawisko tzw. antycypacji genetycznej, czyli coraz wcześniejsze występowanie początków choroby oraz zaostrzanie się jej objawów w kolejnych pokoleniach. Na poziomie białka mutacja ta przejawia się w tym przypadku wydłużeniem kodowanego przez sekwencję (CAG) n ciągu poliglutaminowego (poli-q), zlokalizowanego w pobliżu aminowego końca dużego białka o nazwie huntingtyna. Białko to, oznaczane powszechnie skrótem HTT, pełni kluczową, choć nie w pełni jeszcze poznaną rolę w rozwoju układu nerwowego człowieka, przy czym jego zmutowana postać ulega wzmożonej proteolizie, prowadzącej do powstawania krótkich N-końcowych fragmentów zmutowanej huntingtyny, wykazujących tendencję do wzmożonej agregacji i gromadzących się w cytoplazmatycznych lub jądrowych ciałach inkluzyjnych, obserwowanych post mortem w mózgach chorych osób. Choć wewnątrzkomórkowe inkluzje zmutowanej huntingtyny są znakiem rozpoznawczym HD, wciąż nie wiadomo czy są one główną przyczyną choroby, czy jedynie nieszkodliwym efektem ubocznym lub nawet pożyteczną formą obrony komórek przed toksycznym działaniem krótkich, agregujących fragmentów zmutowanego białka, przy czym ostatnio większość badaczy zdaje się przychylać właśnie ku tej ostatniej opcji [3]. Efektem końcowym długotrwałej ekspresji zmutowanego genu huntingtyny jest pojawiająca się w dorosłym (lub 18

2 rzadziej młodzieńczym) okresie życia postępująca neurodegeneracja niektórych obszarów mózgu, obserwowana najczęściej w obrębie prążkowia, a w mniejszym stopniu także w kilku innych strukturach jąder podstawnych mózgu [4]. Choć obecności zmutowanego białka towarzyszą liczne zmiany patologiczne rejestrowane zarówno na poziomie molekularnym, jak i komórkowym, wciąż nie znany jest dokładny mechanizm patofizjologiczny prowadzący od mutacji do pojawienia się kluczowych objawów klinicznych HD. Klasyczny monogenowy sposób dziedziczenia choroby Huntingtona wyróżnia ją niewątpliwie spośród wielu pozostałych neurodegeneracyjnych chorób agregacyjnych [5], takich jak chociażby znacznie częściej występująca choroba Alzheimera (AD, ang. Alzheimer s disease) czy też choroba Parkinsona (PD, ang. Parkinson s disease), które mogą być wywołane mutacjami w różnych genach. U zdecydowanej większości chorych na AD lub PD nie udaje się nawet zidentyfikować żadnego defektu genetycznego odpowiedzialnego za chorobę, podczas gdy wszyscy chorzy na HD nie tylko wykazują mutację w tym samym genie, ale w dodatku jest to zawsze ten sam typ mutacji. Teoretycznie powinno to sprzyjać rozwojowi rozmaitych celowanych strategii terapeutycznych, ukierunkowanych na zmutowaną formę konkretnego genu lub białka i skutecznie zapobiegających chorobie lub też znacząco łagodzącej jej objawy. Tymczasem dotychczasowy brak spektakularnych sukcesów w tej dziedzinie, czyli brak skutecznego leku przeciwko chorobie Huntingtona, jest nie tylko złą wiadomością dla tysięcy osób cierpiących na HD, ale także niezbyt dobrym prognostykiem dla badaczy poszukujących efektywnej terapii dla pozostałych neurodegeneracyjnych chorób agregacyjnych, cechujących się znacznie bardziej skomplikowanym podłożem genetycznym. W ostatnim czasie zaobserwować można znaczną intensyfikację prac nad nowymi podejściami terapeutycznymi do choroby Huntingtona, co daje uzasadnioną nadzieję na wypracowanie skutecznego sposobu jej leczenia (Ryc. 1). Celem niniejszego opracowania jest scharakteryzowanie wszystkich najbardziej obiecujących strategii leczenia HD, w których główną rolę odgrywają elementy molekularne, a które jednocześnie są efektem znacznego wzbogacenia naszej wiedzy na temat przynajmniej niektórych aspektów molekularnej patogenezy choroby Huntingtona. W świetle powyższych informacji na temat patofizjologii choroby Huntingtona, próba zablokowania ekspresji zmutowanego genu wydaje się najbardziej oczywistą strategią przy wyborze optymalnego sposobu leczenia HD. Wynika to między innymi z tego, że całkowite usunięcie lub naprawa zmutowanego genu wydają się w chwili obecnej zbyt trudne do przeprowadzenia od strony technicznej (choć jest to teoretycznie osiągalne), natomiast samo zahamowanie ekspresji genu kodującego zmutowaną huntingtynę powinno prowadzić do wystarczającego terapeutycznie obniżenia poziomu produkcji toksycznej formy białka, nawet jeśli dotąd nie wiadomo dokładnie w czym ten kluczowy element toksyczności zmutowanej huntingtyny się właściwie przejawia. W ciągu kilku ostatnich lat przeprowadzono szereg badań w pełni potwierdzających słuszność powyższego założenia, przynajmniej w przypadku testowania tej strategii na mysich modelach choroby Huntingtona, gdzie obniżenie poziomu ekspresji zmutowanego genu HD prowadziło nie tylko do zahamowania postępu choroby, ale nawet do cofnięcia się obserwowanych wcześniejszych objawów HD. W większości dotychczasowych badań skuteczne wyciszenie ekspresji genu HD osiągano wykorzystując mechanizm interferencji RNA (RNAi, ang. RNA interference) [6,7], przy czym z powodzeniem wykorzystywano zarówno technologie oparte na sirna (ang. small interfering RNA), jak i na mirna (ang. micro RNA) lub na zbliżonych do nich strukturalnie cząsteczkach shrna (ang. short hairpin RNA) [8,9]. Rozpoczęcie testów klinicznych wykorzystujących mechanizm RNAi napotyka jednak szereg przeszkód, co wiąże się z co najmniej trzema głównymi zastrzeżeniami wysuwanymi wobec tego podejścia terapeutycznego, z których wszystkie związane są z kwestiami bezpieczeństwa pacjentów poddanych ewentualnemu leczeniu. Pierwsze z tych zastrzeżeń odnosi się do generalnie niskiego stopnia specyficzności cząsteczek terapeutycznych wykorzystujących mechanizm RNAi, co ilustrowane jest dość częstymi przypadkami zaburzenia profilu ekspresji innych genów [10,11] i trudnym do określenia ryzykiem pojawienia się niekorzystnych skutków ubocznych. Drugie zastrzeżenie wysuwane wobec strategii terapeutycznych opartych na RNAi dotyczy niewielkich możliwości regulowania czasu trwania terapii, co wiąże się zarówno z małą stabilnością stosowanych w niektórych terapiach cząsteczek sirna (a co za tym idzie stosunkowo krótkim czasem ich półtrwania i koniecznością częstego powtarzania procedury podawania leku), jak i z trudnościami dotyczącymi kontrolowania czasu działania dostarczanych przez wektor wirusowy cząsteczek shrna lub mirna, które zapewniają co prawda długoterminowe działanie, ale nie umożliwiają skutecznego kontrolowania ich aktywności, włącznie z ewentualną możliwością zatrzymania terapii [6]. Warto jednak zaznaczyć, że niektóre badania przeprowadzone na modelu mysim wskazują na skuteczne powstrzymanie rozwoju choroby nawet w wyniku sto- ZAHAMOWANIE EKSPRESJI ZMUTOWANEGO GENU HD Rycina 1. Schemat przedstawiający potencjalne cele molekularnych strategii terapeutycznych dla choroby Huntingtona. Postępy Biochemii 61 (1)

3 sunkowo krótkotrwałego wyciszenia ekspresji genu HD [12]. Podejrzewa się więc, że nawet chwilowe zahamowanie ekspresji zmutowanego genu daje komórkom szansę na szybkie pozbycie się nadmiaru toksycznego polipeptydu i niejako wyzerowanie jego poziomu, co może skutecznie odwlekać ponowne pojawienie się objawów choroby, wymagające niewątpliwie długotrwałej akumulacji toksycznej formy huntingtyny, o czym świadczy chociażby stosunkowo późny wiek zachorowania na HD. Trzecia kontrowersja dotycząca terapeutycznego stosowania RNAi w chorobie Huntingtona wiąże się z faktem, że większość metod opartych na interferencji RNA nie różnicuje pomiędzy zmutowanym i prawidłowym allelem genu, co prowadzi do jednoczesnego obniżenia poziomu obu form huntingtyny w neuronach. Co prawda wiele wskazuje na to, że obecność prawidłowej huntingtyny jest niezbędna głównie na etapie rozwoju zarodkowego ssaków, a późniejszemu istotnemu obniżeniu poziomu tego białka nie towarzyszą żadne znaczące patologie [13,14], jednak wielu badaczy zdecydowało się na opracowanie takich wariantów opisywanej metody, które selektywnie wyciszają jedynie zmutowane warianty genu. Zaprojektowanie stosunkowo krótkiej cząsteczki terapeutycznej o sekwencji skutecznie rozpoznającej jedynie patogennie wydłużone ciągi (CAG) n, a nie ich nieco krótsze odpowiedniki, nie jest jednak łatwe, więc postanowiono w tym celu wykorzystać rozmaite warianty polimorficzne, które u danej osoby mogą być sprzężone jedynie ze zmutowanym allelem genu. W tym kontekście należy wspomnieć o skutecznym zastosowaniu w tym celu zupełnie innej formy terapeutycznych oligonukleotydów, które w odróżnieniu od sirna lub mirna są jednoniciowymi cząsteczkami DNA (a nie RNA), a w procesie wyciszania genów wykorzystują nie interferencję RNA, lecz zupełnie inny mechanizm oparty na degradacji rozpoznawanej sekwencji RNA przez RNAzę H. Metoda wykorzystująca takie chemicznie modyfikowane antysensowne jednoniciowe cząsteczki DNA (ASO, ang. antisense oligonucleotides) do wyciszenia wybranych wariantów danego genu została z powodzeniem wykorzystana do specyficznego wyłączania zmutowanych kopii genu HTT [15-17], co zostało ogłoszone jako wstęp do nowej zindywidualizowanej formy leczenia HD [18], wymagającej projektowania leku pod kątem danego pacjenta, którego zmutowany gen HD zawiera specyficzny zestaw polimorfizmów typu SNP (ang. single nucleotide polymorphism), towarzyszących mutacji. WIĄZANIE ORAZ INAKTYWACJA TOKSYCZNEGO WARIANTU HUNTINGTYNY Nieco mniej intensywnie badaną potencjalną metodą skutecznego leczenia HD jest strategia polegająca na wykorzystaniu przeciwciał specyficznie rozpoznających zmutowane warianty huntingtyny [19,20]. Chodzi tu nie tyle o klasyczne formy przeciwciał, co o ich zmodyfikowane przy użyciu inżynierii genetycznej fragmenty produkowane wewnątrz komórki i skierowane przeciwko wewnątrzkomórkowym białkom docelowym. W piśmiennictwie anglojęzycznym określa się tego typu przeciwciała terminem intrabodies lub rzadziej nanobodies. Wewnątrzkomórkowe przeciwciała projektowane pod kątem terapii HD rozpoznają często nie tyle zmutowaną sekwencję aminokwasową huntingtyny, co raczej charakterystyczną strukturę przestrzenną przyjmowaną przez przypuszczalnie toksyczne N-końcowe fragmenty zmutowanego białka. Mechanizm, dzięki któremu wiązanie się wewnątrzkomórkowych przeciwciał z fragmentami zmutowanego białka obniża poziom toksycznych peptydów huntingtyny w komórce, wpływając jednocześnie na zahamowanie procesu ich akumulacji w ciałach inkluzyjnych, nie jest do końca jasny. Można jednak z dużym prawdopodobieństwem przypuszczać, że oddziaływania takie stabilizują prawidłową nietoksyczną konformację zmutowanej huntingtyny, co z jednej strony powinno chronić ją przed wzmożoną agregacją, a z drugiej powinno ułatwiać jej degradację w proteasomach, które w innym przypadku są nie tylko niezdolne do skutecznego degradowania zmutowanej huntingtyny, ale też próby takiej degradacji nieprawidłowo zwiniętego białka powodują zablokowanie proteasomu, co jest jednym z hipotetycznych mechanizmów odpowiedzialnych za patogenezę HD. Wysoka specyficzność wewnątrzkomórkowych przeciwciał w odniesieniu do zmutowanej formy huntingtyny jest często przeciwstawiana znacznie niższemu poziomowi specyficzności osiąganemu w przypadku wyciszania zmutowanego genu HD z zastosowaniem RNAi lub ASO, co pozwala budzić duże nadzieje na szczególnie wysoką skuteczność terapeutyczną omawianych przeciwciał. Warto jednak zaznaczyć, że niektóre wewnątrzkomórkowe przeciwciała skierowane przeciwko zmutowanej huntingtynie mogą wykazywać w pewnych okolicznościach działanie odwrotne od zamierzonego, inicjując na przykład agregację białka lub zwiększając toksyczność komórkową. Z kolei dość powszechnie używane przeciwciała skierowane przeciwko wydłużonemu ciągowi poli-q wykazują znaczące powinowactwo do innych białek zawierających wydłużone ciągi poliglutaminowe, co oczywiście zwiększa szanse ich zastosowania w leczeniu dość licznej grupy chorób poliglutaminowych, ale jednocześnie zwraca uwagę na potencjalne efekty uboczne związane ze zmniejszoną specyficznością. Te i inne aspekty potencjalnie leczniczego działania przeciwciał wewnątrzkomórkowych sprawiają, że badania nad ich zastosowaniem w terapii HD są jeszcze na bardzo wczesnym etapie badań przedklinicznych i nie należy raczej oczekiwać szybkiego rozpoczęcia fazy klinicznej. Wspomniany powyżej aspekt stabilizacji prawidłowej konformacji przestrzennej białka przez oddziaływanie z przeciwciałami wewnątrzkomórkowymi przypomina oczywiście podobny mechanizm działania białek opiekuńczych. Nic więc dziwnego, że jednym z poważnie rozpatrywanych wariantów leczenia nie tylko choroby Huntingtona, ale także innych chorób związanych z patogenną agregacją białek, jest nadprodukcja wybranych białek opiekuńczych lub też innych białek lub peptydów o podobnym działaniu [21]. W przypadku choroby Huntingtona na szczególną uwagę zasługują zwłaszcza udane próby wykorzystania w tym celu białka szoku termicznego Hsp40 (ang. heat shock protein 40 kda) oraz wykrytego metodą przesiewową peptydu o nazwie PBQ1 (ang. polyq-binding peptide 1) [22], w obu przypadkach dotyczące na razie jedynie badań przedklinicznych. 20

4 Wiele opisanych powyżej form terapii molekularnej, zarówno tych związanych z nadprodukcją wewnątrzkomórkowych przeciwciał lub białek opiekuńczych, jak i tych wykorzystujących mechanizm RNAi, można zaliczyć do klasycznych postaci terapii genowej, bowiem w każdym takim przypadku mamy do czynienia z wprowadzeniem do leczonego organizmu nowego genu, kodującego białko lub cząsteczkę kwasu nukleinowego o działaniu terapeutycznym [23]. Kluczowym elementem takiej terapii genowej jest wybranie odpowiedniego wektora i sposobu jego wprowadzania do organizmu, tak aby zapewnić wysoką skuteczność dostarczania terapeutycznego genu do odpowiedniego rodzaju komórek. W przypadku terapii HD najczęściej wykorzystywanym do tego celu wektorem jest satelitarny wirus adenowirusa AAV (ang. adeno-associated virus), który nie tylko cechuje się wyjątkowo niską immunoreaktywnością, ale ponadto zapewnia skuteczne wprowadzenie genu do niedzielących się komórek nerwowych w odpowiednich obszarach mózgu. Na uwagę zasługuje też obserwacja, że obniżenie poziomu zmutowanego białka wymagane jest w tym przypadku nie tylko w odniesieniu do prążkowia, a więc miejsca szczególnie narażonego na neurodegenerację w chorobie Huntingtona, ale także, lub może nawet przede wszystkim, do kory mózgu [24]. Jest to zgodne z hipotezą, że toksyczne działanie zmutowanej huntingtyny obejmuje przede wszystkim wpływ na obniżenie produkcji czynników neurotroficznych przez korę mózgu, co dotyczy w szczególności czynnika BDNF (ang. brain-derived neurotrophic factor), produkowanego przez korę i dostarczanego następnie do komórek prążkowia, które w przypadku pozbawienia dostępu do BDNF ulegają przyśpieszonej śmierci komórkowej [25]. POWSTRZYMYWANIE ŚMIERCI KOMÓRKOWEJ Sugerowana powyżej kluczowa rola braku czynników neurotroficznych jako głównej przyczyny podwyższonej podatności komórek prążkowia na śmierć wywołaną toksycznym działaniem zmutowanej huntingtyny wskazuje na możliwość skutecznego leczenia choroby Huntingtona poprzez osłabienie wrażliwości komórek nerwowych na toksyczność huntingtyny i tym samym znaczące zwiększenie ich przeżywalności. Powstrzymanie postępującego procesu neurodegeneracji w prążkowiu wydaje się możliwe do osiągnięcia na przykład poprzez dostarczenie tamtejszym neuronom wystarczającej dawki czynników neurotroficznych. Poza wspomnianym już powyżej czynnikiem BDNF rozpatrywane jest także wykorzystanie w tym celu innych czynników troficznych, takich jak GDNF (ang. glial cell line-derived neurotrphic factor), blisko z nim spokrewniona neurturyna (NRTN), lub też CNTF (ang. ciliary neurotrophic factor) [23,26]. Oprócz dostarczenia neuronom tych czynników troficznych w postaci wektorów wirusowych AAV, zawierających cdna odpowiadających im genów, rozważa się także wykorzystanie niskocząsteczkowych związków będących agonistami receptorów komórkowych dla tychże czynników. Obejmować to może chociażby liczne związki o działaniu potencjalnie agonistycznym wobec kinazy TrkB (ang. tropomyosin related kinase B), które miałyby za zadanie uruchomić szlak pobudzany przez BDNF, a więc czynnik troficzny, który wykonuje swą podstawową funkcję komórkową właśnie poprzez łączenie się z receptorem TrkB. Niestety stosunkowo niska wydajność tego konkretnego wariantu terapeutycznego nie wydaje się zapewniać oczekiwanego efektu leczniczego [27]. Warto jednak zwrócić uwagę na nieco bardziej obiecującą pokrewną strategię terapeutyczną dotyczącą próby wykorzystania innych niskocząsteczkowych związków do osłabienia obserwowanej w przypadku HD represji transkrypcyjnej genu BDNF, wywołanej działaniem czynnika transkrypcyjnego REST (ang. RE1-silencing transcription factor), znanego też jako NRSF (ang. neuron-restrictive silencer factor) [28]. Innym potencjalnym sposobem powstrzymywania śmierci komórkowej w HD jest wykorzystanie licznej grupy związków o działaniu przeciwutleniającym, wpływających ochronnie na funkcjonowanie neuronów. W kontekście terapii HD szczególne nadzieje wiąże się zwłaszcza z zastosowaniem peroksydazy glutationowej, która nie tylko wyróżnia się skutecznością w łagodzeniu objawów neurologicznych obserwowanych w mysim modelu choroby, ale także, w przeciwieństwie do wielu innych przeciwutleniaczy o potencjalnym zastosowaniu terapeutycznym, nie hamuje procesu autofagii, odgrywającego prawdopodobnie kluczową rolę w usuwaniu zmutowanej huntingtyny z komórki (patrz dalej) [29]. Warto zwrócić też uwagę na fakt, że powstrzymywanie samego procesu śmierci komórek nerwowych, będącego w gruncie rzeczy ostateczną przyczyną wystąpienia objawów klinicznych choroby, jest strategią mogącą mieć potencjalne zastosowanie nie tylko w chorobie Huntingtona, ale także w całej, bardzo licznej grupie chorób neurodegeneracyjnych, zwłaszcza w przypadku chorób związanych dodatkowo z agregacją toksycznych, nieprawidłowo zwiniętych białek. Dotyczy to przede wszystkim tych strategii terapeutycznych, które oparte są na blokowaniu rozmaitych szlaków kluczowych dla indukcji i przebiegu procesu apoptozy, czyli programowanej śmierci komórkowej. Szczególną rolę w leczeniu chorób agregacyjnych odgrywać może przy tym zablokowanie apoptozy będącej wynikiem odpowiedzi na pojawienie się w komórce nadmiernej ilości nieprawidłowo zwiniętych białek (UPR, ang. unfolded protein response) [30]. Istnieje wiele potencjalnych dróg blokowania tychże procesów, ale warto zauważyć, że jedna z nich spotkała się ostatnio ze szczególnym zainteresowaniem nie tylko wielu badaczy zajmujących się tą tematyką, ale także licznych mediów na całym świecie. Chodzi mianowicie o zeszłoroczną bardzo udaną próbę skutecznego powstrzymania śmierci neuronów w mysim modelu choroby prionowej [31], co osiągnięto blokując enzym o nazwie PERK (ang. protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase), stanowiący jeden z głównych regulatorów odpowiedzi UPR. Choć wielu fachowych komentatorów ostrzega przed zbyt wczesnym entuzjazmem, trudno nie zauważyć, że ewentualny sukces badań klinicznych z użyciem tej formy terapii stanowiłby prawdopodobnie przełom w leczeniu licznej grupy neurodegeneracyjnych chorób agregacyjnych [32], co budzi szczególne nadzieje u ogromnej rzeszy osób, których krewni cierpią na chorobę Alzheimera, ale podobnych korzyści można także oczekiwać w przypadku choroby Huntingtona. Postępy Biochemii 61 (1)

5 AKTYWACJA SZLAKÓW USUWANIA ZMUTOWANEJ HUNTINGTYNY Ostatnia z omawianych tutaj grup molekularnych strategii leczenia HD obejmuje te podejścia terapeutyczne, które skupiają się na aktywacji lub przyspieszeniu różnych procesów prowadzących do usunięcia zmutowanej huntingtyny z komórki. Naturalny proces degradacji prawidłowej huntingtyny obejmuje udział zarówno systemu ubikwitynowo-proteasomalnego (UPS, ang. ubiquitin-proteasome system), jak i autofagosomalnej drogi degradacji białka. Jak wspomniano już powyżej, pojawienie się zmutowanej huntingtyny z nadmiernie wydłużonym ciągiem poli-q blokuje funkcję proteasomu [33], co oczywiście znacząco zmniejsza szansę na wykorzystanie tej drogi degradacji w terapii HD. Prowadzone są jednak próby wykorzystania niektórych aktywatorów ścieżki proteasomalnej do przyśpieszenia degradacji zmutowanej huntingtyny, i choć brak jest na razie spektakularnych sukcesów w tej dziedzinie, to warto podkreślić, że jeden z takich aktywatorów o nazwie NUB1 (ang. NEDD8 ultimate buster-1) wykazuje pożądaną aktywność u muszki owocowej, obniżając poziom zmutowanej huntingtyny i redukując jej toksyczność [34], a nieopublikowane jeszcze wyniki badań na mysim modelu choroby wydają się być równie obiecujące, zwłaszcza w świetle faktu, że podwyższenie poziomu NUB1 można osiągnąć podając interferon β, stosowany już w leczeniu stwardnienia rozsianego [35]. W ostatnim czasie znacznie więcej uwagi zwraca się jednak na alternatywną ścieżkę degradacji huntingtyny, czyli autofagię, przy czym dotyczy to zarówno tzw. autofagii związanej z białkami opiekuńczymi (CMA, ang. chaperone-mediated autophagy), jak i klasycznej makroautofagii, do której odnosi się zazwyczaj sam termin autofagia [36]. Już po pojawieniu się pierwszych doniesień sugerujących kluczową rolę autofagii w degradacji białek poliglutaminowych [37] wskazywano na potencjalne zastosowanie tej ścieżki degradacji zmutowanej huntingtyny w leczeniu HD. Dotychczasowe badania w tym kierunku obejmowały testowanie rozmaitych molekularnych modulatorów procesu autofagii przy użyciu różnych mysich modeli choroby Huntingtona, przy czym wszystkie te badania wskazywały bez wyjątku na znaczącą poprawę fenotypu chorych myszy, czemu towarzyszyło zawsze obniżenie poziomu akumulacji huntingtyny w agregatach białkowych [34]. Warto zaznaczyć, że skuteczne okazało się wykorzystywanie dwóch różnych szlaków aktywacji autofagii, a więc zarówno tego zależnego, jak i niezależnego od mtor (ang. mammalian target of rapamycin). Do najciekawszych testowanych modulatorów autofagii zaliczyć można trehalozę, czyli nietoksyczny cukier, który można podawać doustnie, a także inhibitory deacetylazy histonowej (HDAC, ang. histone deacetylase). Przypadek HDAC jest o tyle znamienny, że białko to było od dawna podejrzewane o zaangażowanie w proces patogenezy nie tylko choroby Huntingtona, ale także wielu innych chorób neurodegeneracyjnych. HDAC oddziałuje z różnymi białkami poliglutaminowymi i uważany jest za kluczowe ogniwo łączące niewydolny system UPS z alternatywną ścieżką degradacji na drodze autofagii [38,39]. Choć na ogół uważa się, że autofagia przyczynia się głównie do eliminacji zagregowanej formy zmutowanej huntingtyny, istnieją dowody na to że CMA, czyli wariant autofagii przebiegający za pośrednictwem białek opiekuńczych, jest ukierunkowany głównie na niezagregowane (rozpuszczalne) formy N-końcowych fragmentów zmutowanej huntingtyny [40], które podejrzewa się powszechnie o szczególnie wysoką toksyczność, co znajduje odbicie w znaczącym spadku toksyczności huntingtyny pod wpływem indukcji CMA w mysim modelu choroby [41]. Sprawia to oczywiście, że tę konkretną postać molekularnej terapii HD uważa się obecnie za jedną z najbardziej obiecujących. Intensywnym badaniom nad zaangażowaniem modulatorów autofagii w proces leczenia HD towarzyszy dyskusja dotycząca wyboru optymalnego momentu indukcji autofagii u osób chorych. Przypuszcza się bowiem, że o ile stosunkowo wczesna aktywacja procesu autofagii powinna być korzystna dla pacjentów, umożliwiając im pozbycie się toksycznych form agregującego białka zanim doprowadzą one do pojawienia się istotnych zmian patologicznych, o tyle zaawansowane przypadki choroby mogą cechować się na tyle poważnym rozregulowaniem systemu proteasomalnego i lizosomalnego, że wydajność indukcji procesu autofagii okaże się na tym etapie choroby znikoma. Przyszłe badania powinny zweryfikować te przypuszczenia, dostarczając danych pozwalających opracować optymalną procedurę takiej terapii. INNE PODEJŚCIA TERAPEUTYCZNE Choć prezentowane opracowanie poświęcone jest zasadniczo tylko tym potencjalnym formom terapii choroby Huntingtona, które opierają się przede wszystkim na technikach molekularnych, należy też wspomnieć o dwóch innych obiecujących sposobach leczenia HD, którym poświęca się ostatnio niemal równie wiele uwagi. Pierwsza z tych nowo opracowywanych metod leczenia przewiduje wykorzystanie przeszczepu komórek do związanych z patogenezą choroby obszarów mózgu, przy czym teoretycznie możliwe jest wykorzystanie w tym celu zarówno płodowych komórek prążkowia, jak i zarodkowych komórek macierzystych lub też indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (ipsc, ang. induced pluripotent stem cells) pochodzących od samego pacjenta i poddanych wcześniej korekcie defektu genetycznego w genie HTT [42,43]. Każdy z tych wariantów wiąże się niestety nie tylko z określonymi ograniczeniami technicznymi, ale często także z dość poważnymi dylematami natury etycznej, co sprawia, że ten sposób leczenia jest przez wielu uważany za co najmniej kontrowersyjny. Drugie z sygnalizowanych niemolekularnych podejść terapeutycznych do choroby Huntingtona dotyczy magnetycznej lub elektrycznej stymulacji mózgu, techniki stosowanej z dość dużym powodzeniem w przypadki niektórych innych chorób neurologicznych. W leczeniu HD próbuje się wykorzystać zarówno nieinwazyjne techniki stymulacji mózgu, takie jak przezczaszkowa stymulacja magnetyczna (TMS, ang. transcranial magnetic stymulation) [44], jak i głęboką stymulację mózgu (DBS, ang. deep brain stimulation) 22

6 [45,46], co w obu przypadkach wydaje się głównie redukować objawy pląsawicze. UWAGI KOŃCOWE W przypadku przynajmniej niektórych spośród wymienionych powyżej potencjalnych metod leczenia HD, ich skuteczność zależeć będzie w ogromnej mierze od tego, czy pozwolą one na usunięcie głównej przyczyny choroby Huntingtona, co w świetle naszej bardzo ograniczonej wiedzy o patofizjologii tego schorzenia jest niestety dość trudne do przewidzenia. Jeśli ostatecznie potwierdzą się ostatnie doniesienia sugerujące, że podstawowy patomechanizm odpowiedzialny za wszystkie choroby poliglutaminowe, w tym także za HD, wykorzystuje odkryty niedawno proces RAN-translacji (ang. repeat-associated non-atg translation), polegający na produkowaniu przez nadmiernie wydłużone sekwencje mikrosatelitarne licznych transkryptów kodujących kilka rodzajów toksycznych peptydów homopolimerowych, odczytywanych z sekwencji RNA przy użyciu różnych ramek odczytu [47], może to oznaczać, że wszelkie terapie ukierunkowane na zablokowanie lub usunięcie zmutowanej formy huntingtyny okażą się niewystarczająco skuteczne, gdyż nie wyeliminują równoległego szlaku patogenezy, być może odgrywającego kluczową rolę w rozwoju choroby. Pokazuje to bardzo dobitnie, jak ogromną rolę w planowaniu skutecznej terapii odgrywają badania zmierzające do zidentyfikowania kluczowego mechanizmu patogenezy choroby Huntingtona [48,49]. W świetle powyższego zagadnienia należy zwrócić uwagę na znaczną liczbę leków lub potencjalnie terapeutycznych związków niskocząsteczkowych wykrywanych przy okazji rozmaitych badań przesiewowych, których mechanizm działania nie jest do końca poznany, jednak mogą one być z powodzeniem wykorzystywane w przyszłej terapii, o ile tylko pomyślnie przejdą wszystkie etapy wymaganych testów klinicznych. W tym kontekście ciekawy wydaje się też fakt, że wiele spośród powszechnie stosowanych leków psychotropowych, w tym także tych, które stosuje się w leczeniu objawów psychiatrycznych u chorych z HD, wykazuje także dodatkowe działanie neuroprotekcyjne, które jest przedmiotem dość intensywnych badań, prowadzonych zarówno na etapie przedklinicznym, jak i klinicznym [50]. PIŚMIENNICTWO 1. Walker FO (2007) Huntington s disease. Lancet 369: Milewski M, Bal J (1993) Mutacje dynamiczne. Funkcja niestabilnych sekwencji DNA w niektórych chorobach genetycznych człowieka. Postepy Biochem 39: Truant R, Atwal RS, Desmond C, Munsie L, Tran T (2008) Huntington s disease: revisiting the aggregation hypothesis in polyglutamine neurodegenerative diseases. FEBS J 275: Gil JM, Rego AC (2008) Mechanisms of neurodegeneration in Huntington s disease. Eur J Neurosci 27: Bąk D, Milewski M (2005) Choroby związane z agregacją białek. Postepy Biochem 51: Wyszko E, Szaflarski W, Barciszewski J (2003) Interferencyjny RNA - molekularny regulator ekspresji genu. Postepy Biochem 49: Bąk D (2003) RNAi - interferencja RNA - skuteczny sposób na ciszę. Postepy Biochem 49: Harper SQ (2009) Progress and challenges in RNA interference therapy for Huntington disease. Arch Neurol 66: Zhang Y, Friedlander RM (2011) Using non-coding small RNAs to develop therapies for Huntington s disease. Gene Ther 18: McBride JL, Boudreau RL, Harper SQ, Staber PD, Monteys AM, Martins I, Gilmore BL, Burstein H, Peluso RW, Polisky B, Carter BJ, Davidson BL (2008) Artificial mirnas mitigate shrna-mediated toxicity in the brain: implications for the therapeutic development of RNAi. Proc Natl Acad Sci USA 105: Denovan-Wright EM, Rodriguez-Lebron E, Lewin AS, Mandel RJ (2008) Unexpected off-targeting effects of anti-huntingtin ribozymes and sirna in vivo. Neurobiol Dis 29: Aronin N, DiFiglia M (2011) Huntingtin-lowering strategies in Huntington s disease: Antisense oligonucleotides, small RNAs, and gene editing. Mov Disord 29: Boudreau RL, McBride JL, Martins I, Shen S, Xing Y, Carter BJ, Davidson BL (2009) Nonallele-specific silencing of mutant and wild-type huntingtin demonstrates therapeutic efficacy in Huntington s disease mice. Mol Ther 17: Drouet V, Perrin V, Hassig R, Dufour N, Auregan G, Alves S, Bonvento G, Brouillet E, Luthi-Carter R, Hantraye P, Déglon N (2009) Sustained effects of nonallele-specific Huntingtin silencing. Ann Neurol 65: Kordasiewicz HB, Stanek LM, Wancewicz EV, Mazur C, McAlonis MM, Pytel KA, Artates JW, Weiss A, Cheng SH, Shihabuddin LS, Hung G, Bennett CF, Cleveland DW (2011)Sustained therapeutic reversal of Huntington s disease by transient repression of huntingtin synthesis. Neuron 74: Østergaard ME, Southwell AL, Kordasiewicz H, Watt AT, Skotte NH, Doty CN, Vaid K, Villanueva EB, Swayze EE, Bennett CF, Hayden MR, Seth PP (2013) Rational design of antisense oligonucleotides targeting single nucleotide polymorphisms for potent and allele selective suppression of mutant Huntingtin in the CNS. Nucleic Acids Res 41: Skotte NH, Southwell AL, Ostergaard ME, Carroll JB, Warby SC, Doty CN, Petoukhov E, Vaid K, Kordasiewicz H, Watt AT, Freier SM, Hung G, Seth PP, Bennett CF, Swayze EE, Hayden MR (2014) Allele-specific suppression of mutant huntingtin using antisense oligonucleotides: providing a therapeutic option for all huntington disease patients. PLoS One 9: e Kay C, Skotte NH, Southwell AL, Hayden MR (2014) Personalized gene silencing therapeutics for Huntington disease. Clin Genet 86: Butler DC, McLear JA, Messer A (2012) Engineered antibody therapies to counteract mutant huntingtin and related toxic intracellular proteins. Prog Neurobiol 97: Messer A, Joshi SN (2013) Intrabodies as neuroprotective therapeutics. Neurotherapeutics 10: Nagai Y, Fujikake N, Popiel HA, Wada K (2010) Induction of molecular chaperones as a therapeutic strategy for the polyglutamine diseases. Curr Pharm Biotechnol 11: Popiel HA, Takeuchi T, Fujita H, Yamamoto K, Ito C, Yamane H, Muramatsu S, Toda T, Wada K, Nagai Y (2012) Hsp40 gene therapy exerts therapeutic effects on polyglutamine disease mice via a non-cell autonomous mechanism. PLoS One 7: e Ramaswamy S, Kordower JH (2012) Gene therapy for Huntington s disease. Neurobiol Dis 48: Wang N, Gray M, Lu XH, Cantle JP, Holley SM, Greiner E, Gu X, Shirasaki D, Cepeda C, Li Y, Dong H, Levine MS, Yang XW (2014) Neuronal targets for reducing mutant huntingtin expression to ameliorate disease in a mouse model of Huntington s disease. Nat Med 20: Zuccato C, Cattaneo E (2007) Role of brain-derived neurotrophic factor in Huntington s disease. Prog Neurobiol 81: Zuccato C, Liber D, Ramos C, Tarditi A, Rigamonti D, Tartari M, Valenza M, Cattaneo E (2005) Progressive loss of BDNF in a mouse model of Huntington s disease and rescue by BDNF delivery. Pharmacol Res 52: Todd D, Gowers I, Dowler SJ, Wall MD, McAllister G, Fischer DF, Dijkstra S, Fratantoni SA, van de Bospoort R, Veenman-Koepke J, Flynn G, Arjomand J, Dominguez C, Munoz-Sanjuan I, Wityak J, Bard JA Postępy Biochemii 61 (1)

7 (2014) A monoclonal antibody TrkB receptor agonist as a potential therapeutic for Huntington s disease. PLoS One 9: e Rigamonti D, Mutti C, Zuccato C, Cattaneo E, Contini A (2009) Turning REST/NRSF dysfunction in Huntington s disease into a pharmaceutical target. Curr Pharm Des 15: Mason RP, Casu M, Butler N, Breda C, Campesan S, Clapp J, Green EW, Dhulkhed D, Kyriacou CP, Giorgini F (2013) Glutathione peroxidase activity is neuroprotective in models of Huntington s disease. Nat Genet 45: Hetz C, Chevet E, Harding HP (2013) Targeting the unfolded protein response in disease. Nat Rev Drug Discov 12: Moreno JA, Halliday M, Molloy C, Radford H, Verity N, Axten JM, Ortori CA, Willis AE, Fischer PM, Barrett DA, Mallucci GR (2013) Oral treatment targeting the unfolded protein response prevents neurodegeneration and clinical disease in prion-infected mice. Sci Transl Med 5: 206ra Scheper W, Hoozemans JJ (2013) A new PERKspective on neurodegeneration. Sci Transl Med 5: 206fs Ortega Z, Díaz-Hernández M, Lucas JJ (2007) Is the ubiquitin-proteasome system impaired in Huntington s disease? Cell Mol Life Sci 64: Lu B, Al-Ramahi I, Valencia A, Wang Q, Berenshteyn F, Yang H, Gallego-Flores T, Ichcho S, Lacoste A, Hild M, Difiglia M, Botas J, Palacino J (2013) Identification of NUB1 as a suppressor of mutant Huntington toxicity via enhanced protein clearance. Nat Neurosci 16: Yu S, Liang Y, Palacino J, Difiglia M, Lu B (2014) Drugging unconventional targets: insights from Huntington s disease. Trends Pharmacol Sci 35: Cortes CJ, La Spada AR (2014) The many faces of autophagy dysfunction in Huntington s disease: from mechanism to therapy. Drug Discov Today 19: Ravikumar B, Duden R, Rubinsztein DC (2002) Aggregate-prone proteins with polyglutamine and polyalanine expansions are degraded by autophagy. Hum Mol Genet 11: Pandey UB, Nie Z, Batlevi Y, McCray BA, Ritson GP, Nedelsky NB, Schwartz SL, DiProspero NA, Knight MA, Schuldiner O, Padmanabhan R, Hild M, Berry DL, Garza D, Hubbert CC, Yao TP, Baehrecke EH, Taylor JP (2007) HDAC6 rescues neurodegeneration and provides an essential link between autophagy and the UPS. Nature 447: Jia H, Kast RJ, Steffan JS, Thomas EA (2012) Selective histone deacetylase (HDAC) inhibition imparts beneficial effects in Huntington s disease mice: implications for the ubiquitin-proteasomal and autophagy systems. Hum Mol Genet 21: Qi L, Zhang XD (2014) Role of chaperone-mediated autophagy in degrading Huntington s disease-associated huntingtin protein. Acta Biochim Biophys Sin 46: Bauer PO, Goswami A, Wong HK, Okuno M, Kurosawa M, Yamada M, Miyazaki H, Matsumoto G, Kino Y, Nagai Y, Nukina N (2010) Harnessing chaperone-mediated autophagy for the selective degradation of mutant huntingtin protein. Nat Biotechnol 28: Chen Y, Carter RL, Cho IK, Chan AW (2014) Cell-based therapies for Huntington s disease. Drug Discov Today 19: Ross CA, Akimov SS (2014) Human-induced pluripotent stem cells: potential for neurodegenerative diseases. Hum Mol Genet 23: R17-R Berardelli A, Suppa A (2013) Noninvasive brain stimulation in Huntington s disease. Handb Clin Neurol 116: Demeestere J, Vandenberghe W (2011) Experimental surgical therapies for Huntington s disease. CNS Neurosci Ther 17: Gonzalez V, Cif L, Biolsi B, Garcia-Ptacek S, Seychelles A, Sanrey E, Descours I, Coubes C, de Moura AM, Corlobe A, James S, Roujeau T, Coubes P (2014) Deep brain stimulation for Huntington s disease: long-term results of a prospective open-label study. J Neurosurg 121: Pearson CE (2011) Repeat associated non-atg translation initiation: one DNA, two transcripts, seven reading frames, potentially nine toxic entities! PLoS Genet 7:e Golde TE (2009) The therapeutic importance of understanding mechanisms of neuronal cell death in neurodegenerative disease. Mol Neurodegener 4: Munoz-Sanjuan I, Bates GP (2011) The importance of integrating basic and clinical research toward the development of new therapies for Huntington disease. J Clin Invest 121: Lauterbach EC (2013) Neuroprotective effects of psychotropic drugs in Huntington s disease. Int J Mol Sci 14: Molecular therapeutic strategies for Huntington s disease Michał Milewski 1,, Dorota Hoffman-Zacharska 1,2, Jerzy Bal 1 1 Department Medical Genetics, Institute of Mother and Child, 17a Kasprzaka St., Warsaw, Poland 2 Institute of Genetics and Biotechnology, Warsaw University, 5a Pawińskiego St., Warsaw, Poland michal.milewski@imid.med.pl Key words: Huntington s disease, huntingtin, neurodegeneration, gene therapy, RNA interference, autophagy ABSTRACT Huntington s disease is a progressive neurodegenerative disorder of genetic origin that still lacks an effective treatment. Recently, a number of new attempts have been undertaken to develop a successful molecular therapy for this incurable condition. The novel approaches employ, among others, some new methods to selectively silence the mutated gene or to neutralize its toxic protein product. This paper reviews all major strategies that are currently considered for molecular therapy of Huntington s disease while discussing their potential effectiveness regarding the treatment of both the Huntington s disease and a large group of related neurodegenerative disorders associated with abnormal protein aggregation. 24