Aktywność enzymatyczna grzybów drożdżopodobnych z rodzaju Candida wyizolowanych z wydzieliny zapalnej gruczołu mlekowego krów

Transkrypt

1 PRACE ORYGINALNE / ORIGINAL ARTICLES Mikologia Lekarska 2012, 19 (3): Copyright 2012 Cornetis ISSN X Aktywność enzymatyczna grzybów drożdżopodobnych z rodzaju wyizolowanych z wydzieliny zapalnej gruczołu mlekowego krów The enzymatic activity of yeast-like fungi of the genus isolated from mastitic bovine milk Henryk Krukowski 1, Andrzej Lisowski 1, Łukasz Wlazło 1, Magdalena Dobrowolska 1, Elżbieta Puacz 2 1 Katedra Higieny Zwierząt i Środowiska UP w Lublinie 2 Krajowa Izba Diagnostów Laboratoryjnych w Warszawie STRESZCZENIE Wprowadzenie: Infekcje gruczołu mlekowego bydła wywoływane przez grzyby są coraz częściej opisywane, ze względu na ich nasilające się występowanie. Grzybicze zapalenia wymienia u krów wywołują głównie grzyby drożdżopodobne należące do rodzaju. Cel pracy: Celem pracy była ocena aktywności enzymatycznej szczepów grzybów drożdżopodobnych z rodzaju wyizolowanych z 93 przypadków mastitis u krów. Materiał i metody: Do badań wykorzystano 93 szczepy z rodzaju. Aktywność enzymów hydrolitycznych oznaczona została przy użyciu testu paskowego API ZYM. Wyniki: Największą aktywność u badanych drożdżaków wykazywała arylamidaza leucynowa, wysoką fosfataza kwaśna i α-glukozydaza, średnią esteraza, lipaza esterazowa, arylamidaza walinowa. Nie ujawniały aktywności α-fukozydaza, α-mannozydaza, β-glukuronidaza, α-galaktozydaza, α-chymotrypsyna i trypsyna. Wnioski: 1. Najwyższą aktywność u grzybów drożdżoidalnych z rodzaju wyizolowanych od krów z zapaleniem wymienia wykazywał enzym arylamidaza leucynowa. 2. Enzymy: α-fukozydaza, α-mannozydaza, β-glukuronidaza, α-galaktozydaza, α-chymotrypsyna i trypsyna nie ujawniały aktywności enzymatycznej u badanych grzybów. SŁOWA KLUCZOWE: mastitis, krowy,, API ZYM ABSTRACT Introduction: The bovine mammary infections caused by fungi are increasingly being reported, due to their increasing incidence. Fungal mastitis in cows cause mostly yeast-like fungi of the genus. Aim of the study was to evaluate enzymatic activity of strains of genus isolated from 93 cases of mastitis in cows. Material and methods: In this study 93 strains of genus were used. The activity of hydrolytic enzymes was measured by API ZYM (biomérieux) strip tests according to the manufacturer s instructions. Results: The greatest activity in the studied yeasts showed leucine arylamidase, high activity of acid phosphatase and α-glucosidase, the activity of average: esterase, esterase lipase and valine arylamidase. No activity showed α-fucosidase, α-mannosidase, β-glucuronidase, α-galactosidase, α-chymotrypsine and tripsine. Conclusions: 1. The highest activity of yeast-like fungi of the genus isolated from cows with mastitis showed enzyme leucine arylamidase 2. Enzymes: α-fucosidase, α-mannosidase, β-glucuronidase, α-galactosidase, α-chymotrypsine and tripsine did not show enzymatic activity in the examined fungi. KEY WORDS: mastitis, cows,, API ZYM Wprowadzenie Paradoksalnie, w związku z ogromnym postępem medycyny i weterynarii oraz wprowadzaniem nowych metod diagnostycznych i terapeutycznych stwierdzany jest na całym świecie wzrost zakażeń wywołanych przez grzyby drożdżoidalne [1, 2]. W ostatnich latach obserwuje się istotne zmiany w etiologii i epidemiologii grzybiczych zakażeń układowych, a szczególnie wzrost różnorodności patogenów. Niektóre gatunki, które dotychczas były uznawane za niepatogenne, stają się obecnie przyczyną grzybi- 115

2 Krukowski H., Lisowski A., Wlazło Ł., et al. The enzymatic activity of yeast-like fungi of the genus isolated from mastitic bovine milk Mikologia Lekarska 2012, 19 (3) 116 czych zakażeń [1, 3, 4]. Zarówno grzyby żyjące w środowisku zewnętrznym, jak i zasiedlające organizm produkują pozakomórkowe enzymy, których zadaniem jest rozkład makrocząsteczek (węglowodanów, białek, lipidów) do prostych związków, łatwo transportowanych do wnętrza komórki. W organizmie żywiciela aktywność wydzielanych enzymów zwraca się przeciwko komórkom i tkankom gospodarza, służąc pozyskiwaniu substancji odżywczych, inwazji i rozprzestrzenianiu się grzybów w tkankach. Enzymy hydrolityczne są odpowiedzialne za rozkład związków wielkocząsteczkowych, takich jak wielocukry, białka, tłuszcze czy węglowodany, przez co ułatwiają grzybom kolonizację, natomiast przez chemiczne i fizyczne oddziaływanie na środowisko hydrolazy zapewniają przetrwanie grzybom w tkankach i uczestniczą bezpośrednio w degradacji białek organizmu gospodarza. Wydzielane przez grzyby drożdżopodobne z rodzaju fosfolipazy uszkadzają komórki błon śluz owych gospodarza, przez co ułatwiają grzybom penetrację w głąb tkanek [5-10]. Infekcje gruczołu mlekowego krów wywoływane przez grzyby są coraz częściej opisywane, ze względu na ich nasilające się występowanie. Grzybicze zapalenia wymienia (łac. mastitis mycotica, ang. fungal mastitis, yeast mastitis, mycotic mastitis) u krów wywołują głównie grzyby należące do rodzaju [11-14]. Cel pracy Celem pracy była ocena aktywności enzymatycznej szczepów grzybów drożdżopodobnych z rodzaju wyizolowanych z 93 przypadków mastitis u krów. Materiał i metody Badaniami objęto 93 szczepy grzybów z rodzaju wyizolowanych od krów z grzybiczym zapaleniem wymienia. Rozpoznanie mastitis mycotica przeprowadzono na podstawie badań klinicznych wymienia, makroskopowych mleka, liczby komórek somatycznych w mleku oraz badań mikrobiologicznych prób mleka ćwiartkowego. Grzyby identyfikowano na podstawie jednolitego wzrostu na podłożu Sabourauda i czystego jednolitego wzrostu na podłożu krwawym (przy jednoczesnym braku wzrostu na podłożach McConkeya i Edwards-Chodkowskiego). Wyrosłe kolonie grzybów z podłoża krwawego i podłoża Sabourauda barwiono metodą Grama i oceniano pod mikroskopem. Następnie kolonie identyfikowano do poziomu gatunku testem API 20 C AUX (biomérieux) i programem komputerowym APIWEB (biomérieux). Były to następujące grzyby: krusei/incospicua (n=12), kefir (n=15), inconspicua (n=4), humicola (n=9), lusitaniae (n=10), tropicalis (n=12), rugosa (n=14), sp. (n=17). Aktywność enzymatyczną określano za pomocą testów API ZYM (biomérieux), zawierających substraty do wykrycia 19 hydrolaz: I kontrola, II fosfatazy zasadowej, III esterazy, IV lipazy esterazowej, V lipazy C14, VI arylamidazy leucynowej, VII arylamidazy walinowej, VIII aryl amidazy cystynowej, IX trypsyny, X α-hymotrypsyny, XI fosfatazy kwaśnej, XII naftolu-as-bi-fosfohydrolazy, XIII α-galaktozydazy, XIV β-galaktozydazy, XV β-glukuronidazy, XVI α-glukozydazy, XVII β-glukozydazy, XVIII N-acetylo-β-glukozyloamidazy, XIX α-mannozydazy oraz XX α-fukozydazy. Przy ich oznaczaniu postępowano ściśle z zaleceniami producenta. Z 24-godzinnych hodowli szczepów przy użyciu densytometru (biomérieux) przygotowywano w wodzie destylowanej zawiesinę gęstości 5 stopni w skali McFarlanda. Odpowiednią ilość tej zawiesiny (65 μl) przenoszono do kapsułek pasków API ZYM, które inkubowano przez 4 godz. w temp. 37 C. Po inkubacji dodawano po 1 kropli odczynnika ZYM A oraz ZYM B i pozostawiano na kilka minut w temperaturze pokojowej. Aktywność enzymów określano w nanomolach hydrolizowanego substratu wg intensywności reakcji barwnej. Zgodnie z zaleceniem producenta stosowano skalę 6-stopniową (od 0 do 5 punktów): 0 0 nanomoli, 1 5 nanomoli, 2 10 nanomoli, 3 20 nanomoli, 4 30 nanomoli i 5 powyżej 40 nanomoli. Aktywność enzymatyczna grzybów wyizolowanych z gruczołu mlekowego krów, a oznaczonych w teście APIZYM (w skali punktowej) została przedstawiona w tabeli I. Wyniki Najwyższą aktywność enzymu fosfataza zasadowa wykazywały szczepy inconspicua (1,75), natomiast krusei/ inconspicua oraz rugosa nie wytwarzały tego enzymu. Najniższą aktywność enzymu esteraza wykazywały drożdżaki kefyr (3,0), natomiast najwyższą inconspicua i sp. (po 4,0). Enzym IV (lipaza esterazowa) najwyższą aktywność wykazywał u inconspicua oraz humicola (3,25; 3,22), natomiast najniższą aktywnością tego enzymu charakteryzowały się szczepy kefyr (2,41). Najwyższą aktywność lipazy C14 wykazywał szczepy inconspicua (1,75), zaś najniższą krusei/inconspicua (0,41). Arylamidaza leucynowa oznaczona w teście APIZYM jako enzym VI wykazywała bardzo wysokie wartości punktowe dla wszystkich badanych szczepów (od 5,0 dla kefyr, inconspicua i humicola do 4,7 dla lusitaniae i tropicalis). Najwyższą aktywność enzymu arylamidaza walinowa stwierdzono u szczepów inconspicua (3,0), zaś najniższą u gatunku krusei/inconspicua i tropicalis (2,0). Enzym VIII (arylamidaza cystynowa) najwyższą aktywność wykazywał u lusitaniae i inconspicua (2,5), natomiast najniższą aktywnością tego enzymu charakteryzowały się szczepy kefyr (1,33). Badane szczepy nie wykazały aktywności trypsyny (IX) i α-chymotrypsyny oznaczonej w teście APIZYM jako enzym X. Najwyższą aktywność enzymu fosfataza kwaśna wykazywały szczepy krusei/inconspicua oraz humicola (4,5-4,55), zaś najniższą rugosa (3,28). Szczepy kefyr posiadały najwyższą aktywność naftolu-as-bi-fosfohydrolazy (2,66), a szczepy rugosa najniższą (1,64). Enzym XIII (α-galaktozydaza) nie był produkowany przez badane. Najwyższą aktywność β-galaktozydazy wykazywały szczepy kefyr 3,86; zaś szczepy krusei/inconspicua oraz rugosa charakteryzowały sie brakiem zdolności do wytwarzania tego enzymu. Enzym XV β-glukuronidaza nie wykazywał aktywność u badanych szczepów. Najniższą aktywność α-glukozydazy wykazywały drożdżaki kefyr (0,66), natomiast najwyższą lusitaniae (5,0). krusei/inconspicua nie wytwarzał tej hydrolazy. Szczepy lusitaniae posiadały najwyższą aktywność β-glukozydazy (3,70), a szczepy krusei/inconspicua i inconspicua nie produkowały enzymu XVII. Enzym XVIII (N-acetylo-β-glukozyloamidaza) najwyższą aktywność wykazywał bardzo niska aktywność od 0,13 u kefyr do 1,77 u humicola. Szczepy nie wytwarzały enzymów α-mannozydaza (XIX) oraz α-fukozydaza (XX).

3 Krukowski H., Lisowski A., Wlazło Ł. i wsp. Aktywność enzymatyczna grzybów drożdżopodobnych z rodzaju wyizolowanych z wydzieliny zapalnej gruczołu mlekowego krów Tabela I: Table I: Aktywność enzymatyczna grzybów drożdżopodobnych z rodzaju wyizolowanych z gruczołu mlekowego krów The enzymatic activity of yeast-like fungi of the genus isolated from the mammary glands of cows Enzym Enzyme Gatunki grzybów z rodzaju (n) / Species of krusei/ incospicua (n=12) kefyr (n=15) inconspicua (n=4) humicola (n=9) lusitaniae (n=10) tropicalis (n=12) rugosa (n=14) sp. (n=17) X SD X SD X SD X SD X SD X SD X SD X SD I II 0,00 0,00 1,2 1,01 1,75 1,5 1,11 0,78 1,4 0,70 1,16 0,58 0,57 0,65 0,94 0,90 III 3,66 0,49 3,0 0,92 4,0 0,00 3,88 0,88 3,8 0,79 3,83 0,72 3,5 0,94 4,0 0,61 IV 2,41 0,79 2,06 0,53 3,25 0,50 3,22 0,67 2,9 0,32 3,08 0,79 2,87 0,53 2,88 0,63 V 0,00 0,00 0,93 0,45 1,75 1,5 0,88 0,33 0,62 0,52 0,91 0,29 1,14 0,66 0,59 0,58 VI 4,91 0,29 5,0 0,00 5,0 0,00 5,0 0,0 4,7 0,48 4,75 0,45 4,9 0,27 4,84 0,24 VII 2,0 0,69 2,6 0,74 3,0 1,41 2,55 0,88 2,5 0,53 2,0 0,86 2,40 0,75 2,23 0,75 VIII 2,0 0,81 1,33 0,62 2,5 1,29 2,22 0,97 2,5 0,97 1,75 0,96 1,64 1,17 2,05 0,83 IX 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 X 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 XI 4,5 0,80 3,8 1,32 4,25 0,90 4,55 0,53 4,0 0,82 4,33 0,49 3,28 1,07 4,11 0,78 XII 2,0 0,60 2,66 0,97 2,75 1,26 2,11 1,17 2,6 0,84 2,16 1,03 1,64 0,74 2,0 0,78 XIII 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 XIV 0,00 0,00 3,86 1,55 0,5 0,58 0,77 1,64 0,6 1,07 0,41 0,51 0,00 0,00 0,70 1,36 XV 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 XVI 0,00 0,00 0,66 1,23 1,25 2,5 4,66 0,71 5,0 0,00 4,08 1,93 1,42 2,24 3,5 2,41 XVII 0,00 0,00 2,0 1,14 0,00 0,00 2,66 0,5 3,7 1,25 1,41 1,24 0,78 1,48 1,58 1,42 XVIII 0,41 0,89 0,13 0,35 0,75 1,5 1,77 1,30 0,7 1,16 1,33 1,15 0,57 0,75 1,23 1,44 XIX 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 XX 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 Omówienie Do czynników ułatwiających grzybom patogennym inwazję do tkanek należy wydzielanie enzymów hydrolitycznych. Sugeruje się, że występowanie zmienności aktywności i charakteru uwalnianych enzymów hydrolitycznych zależy od podłoża izolacji [7]. Enzymy hydrolityczne przez chemiczne i fizyczne oddziaływanie na środowisko zapewniają przetrwanie grzybów w tkankach oraz uczestniczą bezpośrednio w trawieniu protein gospodarza. Pod wpływem uwalnianych hydrolaz dochodzi do keratynolizy warstwy rogowej naskórka, wykorzystywanej przez nie jako źródło azotu i węgla [7]. Aktywność enzymatyczna grzybów jest uznawana za ważny czynnik determinujący ich patogenność. Szybkim sposobem oceny aktywności enzymatycznej jest wykonanie testu API ZYM zawierającego panel 19 enzymów hydrolitycznych z grup: lipaz, proteaz i glikozydaz [10]. Większość prac dotyczy aktywności enzymatycznej hydrolaz grzybów wyizolowanych od ludzi [5-10]. Według naszej wiedzy jedynymi dostępnymi pracami dotyczącymi aktywności enzymatycznej grzybów wyizolowanych z mastitis u krów są prace Lassy i Malinowskiego [15], Malinowskiego i wsp. [16], Wawrona i wsp. [17] oraz autorów niniejszej pracy [18]. Z przeprowadzonych badań własnych wynika, że największą aktywność wykazywała arylamidaza leucynowa. Wysoką aktywnością charakteryzowały się też enzymy XI fosfataza kwaśna i XVI α-glukozydaza (ale tylko u 4 szczepów), średnią aktywność wykazywały esteraza, arylamidaza walinowa i lipaza esterazowa. Nie wykazywały aktywności α-fukozydaza, α-mannozydaza, β-glukuronidaza, α-galaktozydaza oraz α-chymotrypsyna i trypsyna. Uzyskane wyniki korespondują z wynikami wymienionych wcześniej autorów [15-17], a także z wynikami badań grzybów izolowanych od ludzi, u których także wykazano najwyższą aktywność lipazy esterazowej, arylamidazy esterazy i fosfatazy kwaśnej [7-8]. Jednakże uzyskane w niniejszej pracy aktywności enzymatyczne mierzone w skali 0-5 były wyższe niż u ludzi [7, 8], ale zbliżone do wyników badań dotyczących aktywności enzymatycznej grzybów izolowanych z wydzieliny zapalnej wymienia krów [15-17]. W literaturze znajduje się niewiele doniesień dotyczących aktywności hydrolitycznej grzybów patogennych. Wydaje się więc celowe prowadzenie dalszych prac związanych z oceną aktywności hydrolitycznej szczepów drożdżaków izolowanych z mastitis u krów. Wnioski 1. Najwyższą aktywność u grzybów drożdżoidalnych z rodzaju wyizolowanych od krów z zapaleniem wymienia wykazywał enzym arylamidaza leucynowa. 2. Enzymy: α-fukozydaza, α-mannozydaza, β-glukuronidaza, α-galaktozydaza, α-chymotrypsyna i trypsyna nie wykazywały aktywności enzymatycznej u badanych grzybów. 117

4 Krukowski H., Lisowski A., Wlazło Ł., et al. The enzymatic activity of yeast-like fungi of the genus isolated from mastitic bovine milk Piśmiennictwo 1. Szymankiewicz M, Kowalewski J. Zakażenia wywołane przez grzyby. Czynniki predysponujące. Mikol Lek. 2005;12: Santos RC, Marin JM. Isolation of spp. from mastitic bovine milk in Brazil. Mycopathol. 2005;159: Biegańska MJ. Drożdżaki z rodzaju, nie zawsze patogenne, ale... Mikol Lek. 2006;13: Passowicz-Muszyńska E, Jankowska R, Kosacka M. Inwazyjne zakażenia grzybicze. Mikol Lek. 2008:15; Krutkiewicz A. Czynniki chorobotwórczości albicans. Mikol Lek. 2010;17; Plomer-Niezgoda E, Baran E, Cisło M, i wsp. Badanie aktywności enzymów hydrolitycznych wybranych grzybów pleśniowych i drożdżaków przy użyciu testu API ZYM. Mikol Lek. 1998;5: Łukaszuk C, Krajewska-Kułak E, Niczyporuk W, Trybuła J. Aktywność hydrolityczna i wrażliwość na antymikotyki szczepów grzybów drożdżopodobnych izolowanych z ontocenozy cewki moczowej. Mikol Lek. 1999;6: Krajewska-Kułak E, Niczyporuk W, Karczewski J, Złotkowski W. Ocena aktywności wybranych enzymów hydrolitycznych u grzybów drożdżopodobnych z gatunku przy użyciu testu API ZYM. Mikol Lek. 1997;4: Anees MM, Reich A, Hirschberg L, i wsp. Comparison of enzymatic activity between albicans and krusei. Mikol Lek. 2010;17: Krzyściak P. Ocena aktywności enzymatycznej izolowanych od ludzi grzybów z rodzaju Rhodotorula wykonana testem API ZYM. Mikol Lek. 2011;18: Costa EO, Ribeiro AR, Watanabe ET, Melville PA. Infectious bovine mastitis caused by environmental organisms. J Vet Med B. 1998;45: Mikologia Lekarska 2012, 19 (3) 12. Costa EO, Gandra CR, Pires MF, i wsp. Survey of bovine mycotic mastitis in dairy herds in the State of São Paulo, Brazil. Mycopathol. 1993;124: Crawshaw W M, MacDonald N R, Duncan G. Outbreak of rugosa in a dairy herd after intramammary antibiotic treatment. Vet Rec. 2005;156: Staroniewicz Z, Włodarczak A, Florek M, Król J. Flora grzybicza w mastitis u krów i jej wrażliwość na antymikotyki. Mikol Lek. 2007;14: Lassa H, Malinowski E. Aktywność enzymatyczna drożdżaków i alg wyizolowanych z wydzieliny zapalnej gruczołu mlekowego krów. Medycyna Wet. 2005;61: Malinowski E, Lassa H, Kłossowka A, Kuźma K. Enzymatic activity of yeast species isolated from bovine mastitis. Bull Vet Inst Pulawy. 2001;45: Wawron W, Bochniarz M, Szczubiał M. Enzymatic activity of yeasts isolated from the inflamed mammary secretion in dairy cows. Pol J Vet Sci. 2011;14: Krukowski H, Lisowski A. Porównanie aktywności enzymatycznej grzybów Trichosporon i Geotrichum wyizolowanych z mastitis u krów. Mikol Lek. 2010;17: Praca wpłynęła do Redakcji: Zaakceptowano do druku: Konflikt interesów: nie zgłoszono ADRES DO KORESPONDENCJI: Dr hab. prof. UP Henryk Krukowski Katedra Higieny Zwierząt i Środowiska UP ul. Akademicka 13, Lublin tel henryk.krukowski@up.lublin.pl 118

5 Copyright of Medical Mycology / Mikologia is the property of Cornetis SP. Z.O.O. and its content may not be copied or ed to multiple sites or posted to a listserv without the copyright holder's express written permission. However, users may print, download, or articles for individual use.