Biotechnologia 4(1-2) 2005, 43-53

Transkrypt

1 Biotechnologia (1-) 5, 3-53 PRODUKCJA LIPAZ PRZEZ WYBRANE SZCZEPY GEOTRICHUM CANDIDUM W ZALEśNOŚCI OD ŹRÓDŁA WĘGLA W POśYWCE 1 Anita Rywińska, Michał Piegza, Danuta Witkowska Akademia Rolnicza we Wrocławiu Streszczenie. W pracy przebadano osiem szczepów Geotrichum candidum pod względem uzdolnień do biosyntezy zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych lipaz, ocenianych wobec dwóch substratów, tj. oliwy z oliwek (JL O ) i trimaślanu glicerolu, tj. tributyryny (JL T ). Jako źródło węgla w hodowlach stosowano zamiennie, w ilości 1%, dodatek oleju rzepakowego, glukozy i szlamu produktu odpadowego przemysłu tłuszczowego. Wśród badanych szczepów wykazano zróŝnicowanie w poziomie aktywności zarówno zewnątrz-, jak i wewnątrzkomórkowych lipaz w zaleŝności od stosowanego źródła węgla w poŝywce, rodzaju substratu w testach enzymatycznych i czasu hodowli. Najefektywniejszym źródłem węgla w produkcji lipaz okazał się olej rzepakowy, a szczep G. candidum X5 wyróŝniał się najwyŝszą aktywnością zewnątrzkomórkowych lipaz ( JL ZO ml -1 ) w tych warunkach. Słowa kluczowe: Geotrichum candidum, lipazy, źródło węgla WSTĘP Lipazy definiowane jako hydrolazy estrów glicerolowych EC to enzymy o ogromnym potencjale katalitycznym [Jaeger i in. 1997]. Katalizują reakcje wymagające nierozpuszczalnego substratu na granicy faz tłuszcz woda [Chałecki i Plenkiewicz 199]. Wytwarzane są przez rośliny, zwierzęta i mikroorganizmy [Veeraragavan i in.199], ale to te ostatnie, produkowane zarówno przez bakterie [Jaeger i in. 1997], grzyby, jak i droŝdŝe [Rapp i Backhaus 199] cieszą się największym zainteresowaniem. Wynika ono stąd, Ŝe enzymy te cechuje, w zaleŝności od gatunku drobnoustroju oraz warunków hodowli (tj. np. źródła azotu, napowietrzenia, ph podłoŝa, temperatury hodowli, obecności lipidów w podłoŝu), ogromna róŝnorodność, dotycząca aktywności Adres do korespondencji Corresponding author: Anita Rywińska, Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii śywności, Akademia Rolnicza we Wrocławiu, ul. C.K. Norwida 5, Wrocław, aryw@ozi.ar.wroc.pl

2 A. Rywińska i in. w środowisku rozpuszczalników organicznych oraz mikrowodnym [Adamczak i Bednarski 199]. Praktyczne wykorzystanie mikrobiologicznych preparatów lipolitycznych obejmuje m.in. ich udział w produkcji tłuszczów o modyfikowanych właściwościach, np. uzyskiwanie substytutów masła kakaowego z tańszych substratów, a takŝe zamienników tłuszczu w produktach mleczarskich [Sharma i in. 1] oraz związków zapachowych [Vulfson 199]. Ponadto ukazująca się literatura dostarcza coraz więcej prac dotyczących zastosowania lipaz do syntezy optycznie czynnych związków o znaczeniu biologicznym lub substratów do ich produkcji wykorzystywanych w wielu dziedzinach nauki, takich jak medycyna, biologia, chemia [Haliniarz i Lejczak 199, Sharma i in. 1]. Ogromne moŝliwości aplikacyjne mikrobiologicznych lipaz oraz ich zalety w zestawieniu z konwencjonalnymi metodami chemicznymi zachęcają do poszukiwań nowych szczepów, zdolnych do syntezy znacznych ilości enzymów o wysokich aktywnościach, z jak najtańszych substratów. W ostatnich latach szczególnie duŝo uwagi poświęca się droŝdŝom Geotrichum candidum. Jest to gatunek szeroko rozpowszechniony w środowisku człowieka [Białasiewicz 199]. Występuje w produktach mleczarskich, słodzie [Gąsiorowski i in. 1997] i w warzywach, spotkać go moŝna równieŝ w wodzie oraz glebie, na owadach, a takŝe w organizmie ludzi i zwierząt [Reppas i Snoeck 1999]. RóŜnorodność środowisk zasiedlonych przez te droŝdŝe, świadczy o ich rozbudowanym aparacie enzymatycznym, a zwłaszcza o wysokich uzdolnieniach celulo-, amylo-, proteo- i lipolitycznych. Stąd wynika duŝe zainteresowanie tym gatunkiem, co wiąŝe się z próbami wykorzystania go m.in. do neutralizacji związków fenolowych skaŝających glebę, bioakumulacji metali cięŝkich oraz do utylizacji odpadów tłuszczowych [Białasiewicz 1997]. Celem prezentowanej pracy była ocena uzdolnień do biosyntezy lipaz wewnątrzi zewnątrzkomórkowych ośmiu wybranych szczepów Geotrichum candidum w zaleŝności od źródła węgla w poŝywce. MATERIAŁY I METODY Mikroorganizmy. Przedmiotem badań było szczepów Geotrichum candidum (tab. 1). Szczepy przechowywano na skosach YM w temperaturze C i przeszczepiano raz w roku. PodłoŜa. Zastosowano podłoŝe mineralne o składzie: Tripticase %, NH Cl,1%, KH PO,15%, MgSO H O,1%, FeSO 7H O,1%, MnSO H O,1%, ZnSO 7H O,1%. Jako źródło węgla stosowano zamiennie: olej rzepakowy, szlam (produkt odpadowy przemysłu tłuszczowego) oraz glukozę w ilości 1%. PoŜywkę sterylizowano w temperaturze 11 C przez minut. Warunki prowadzenia hodowli. Hodowle prowadzono w 5 ml kolbach Erlenmayera zawierających 5 ml podłoŝa na wytrząsarce rotacyjnej typu Elpan przy 17 rpm, przez 7 dni, w temperaturze 3 o C. Inokulum stanowiły 3 ml,1% roztworu Tween zawierające zawiesinę droŝdŝy o gęstości 1 kom.ml -1. Próby do analiz (5 ml) pobierano po 3, 5 i 7 dniach hodowli i wirowano przez 1 min przy 5 rpm na wirówce typu MPW-3. W supernatancie oznaczano zewnątrzkomórkową aktywność lipolityczną i białko. Biomasę po dwukrotnym przemyciu i zawieszeniu w ml,5 M buforu Tris-HCl o ph poddano rozbiciu w dezintegrato- Acta Sci. Pol.

3 Produkcja lipaz 5 rze ultradźwiękowym, typ Bandelin Sonapuls HD7/MS7 przez 1 min (w cyklach 5 : 5). Uzyskaną zawiesinę wirowano na wirówce MPW-5 przez 1 min przy 1 g. W otrzymanym supernatancie oznaczano wewnątrzkomórkową aktywność lipolityczną i białko. Zawartość białka oznaczano metodą Lowry'ego [1951]. Tabela 1. Stosowane mikroorganizmy Table 1. Applied microorganisms Nazwa szczepu Name of strains Symbol Symbol Źródło Source Geotrichum candidum KB X Ser Brie Cheese Brie, Geotrichum candidum KB 5 X5 Ser Brie Cheese Brie, Geotrichum candidum Sc 1 Sc 1 Ser Cammembert Cheese Cammembert, Geotrichum candidum PH 1 PH Pióra Feathers, Geotrichum candidum 1 O1 Kolekcja własna KBiMś AR Laboratory collection Geotrichum candidum MSK 311 MSK Słód Malt Geotrichum candidum SS 7 D D Słód Malt Geotrichum candidum SS 3 B 1 B 1 Słód Malt Aktywności lipolityczne zarówno zewnątrz- (JL Z ), jak i wewnątrzkomórkowe (JL W ), oznaczano wobec substratów: syntetycznego trimaślanu glicerolu tributyryny (JL ZT, JL WT ) i oliwy z oliwek (JL ZO, JL WO ), przygotowanych w postaci emulsji (pięciokrotnie rozcieńczonej buforem Tris-HCl) otrzymanej poprzez zhomogenizowanie 5 ml substratu, 5 ml 5% roztworu gumy arabskiej, 1 ml,75m CaCl, 1 ml 1M NaCl. Reakcję enzymatyczną prowadzono w 1 ml kolbkach stoŝkowych w ciągu 1 h na wstrząsarce rotacyjnej przy 1 rpm w 37 C. Mieszanina reagująca zawierała: w próbach właściwych 1 ml substratu (oliwa z oliwek lub timaślan glicerolu),,5 ml buforu Tris-HCl i,5 ml badanego enzymu. Reakcję przerywano dodatkiem 1,5 ml 9% etanolu. W próbach kontrolnych enzym wprowadzano po etanolu. Ilość uwolnionych w reakcji kwasów tłuszczowych określana była przez miareczkowanie prób,5 M NaOH wobec % roztworu fenoloftaleiny jako róŝnica próby właściwej i kontrolnej. Aktywność lipolityczną wyraŝono w ilości µ moli,5 M NaOH potrzebnych do zobojętnienia kwasów tłuszczowych uwolnionych w wyniku działania na substrat lipaz zawartych w 1 ml płynu pohodowlanego w ciągu 1 godziny. Obliczenia wykonano według wzoru: 1 µ mol kwasów tłuszcz. 1 1 JLml = [ µ molml h ] mlh OMÓWIENIE I DYSKUSJA WYNIKÓW W prezentowanej pracy wykazano zróŝnicowanie w obrębie szczepów Geotrichum candidum w produkcji zarówno pozakomórkowych, jak i wewnątrzkomórkowych lipaz, w zaleŝności od źródła węgla w podłoŝu. W przypadku wszystkich szczepów najbardziej efektywnym źródłem węgla w biosyntezie zewnątrzkomórkowych lipaz okazał się olej rzepakowy (rys. 1A, rys. A). NajwyŜszą aktywność w tym podłoŝu JL ZO ml -1, odnotowano dla szczepu X5 (rys. 1A). Biotechnologia (1-) 5

4 A. Rywińska i in. Glukoza okazała się najmniej sprzyjającym źródłem węgla dla biosyntezy zewnątrzkomórkowych lipaz przez badane szczepy droŝdŝy (rys. 1B, rys. B), w jej obecności wartości aktywności, z wyjątkiem szczepu MSK, nie przekraczały 5 JL ZO ml -1 (rys. 1B). Uzyskane wyniki mogą świadczyć o indukowanym lipidami charakterze biosyntezy lipaz przez testowane szczepy. Podobne spostrzeŝenia odnotowali Jacobsen i in. [199], otrzymując niŝsze wartości aktywności lipaz w podstawowym podłoŝu (z peptonem) bez dodatkowego źródła węgla, w porównaniu do hodowli z dodatkiem oliwy z oliwek. Indukujący wpływ tłuszczu, w tym równieŝ oleju rzepakowego, na produkcję lipaz przez niektóre droŝdŝe i grzyby wykazali równieŝ Adamczak i Bednarski [199]. Otrzymane wyniki pozostają natomiast w sprzeczności z badaniami Chander i Klostermeyer [193], którzy stwierdzili hamujące działanie róŝnych tłuszczy na biosyntezę lipaz przez Geotrichum candidum. RozbieŜności te mogły być spowodowane wykorzystywaniem w w/w pracach poŝywek o zróŝnicowanym składzie oraz szczepów wykazujących większe bądź mniejsze uzdolnienia lipolityczne. Badane szczepy droŝdŝy maksimum aktywności lipolitycznej osiągały w róŝnym czasie. W przypadku podłoŝa uzupełnianego tłuszczem odpadowym szlamem zaobserwowano pewną tendencję. W obecności tego źródła węgla największe wartości aktywności lipaz przypadały na 3 dobę, w kolejnych stwierdzono znaczny jej spadek, a nawet całkowity zanik w 7 dobie hodowli, jak w przypadku szczepów X, X5, D i B 1 (rys. 1C) oraz D (rys. C). Wyniki takie wskazywały na wyczerpywanie się, utylizowanej przez testowane szczepy, tłuszczowej frakcji szlamu oraz na brak zdolności tych szczepów droŝdŝy do wykorzystywania pozostałych składników, zastosowanego jako źródło węgla, odpadu tłuszczowego. Dla większości badanych szczepów, równieŝ w podłoŝu z olejem rzepakowym, najwyŝsze aktywności zewnątrzkomórkowych lipaz przypadały w początkowym okresie hodowli. Jedynie w podłoŝu z glukozą nie stwierdzono wyraźnej regularności w dynamice biosyntezy lipaz. Aktywność lipaz w prezentowanej pracy oceniana była zarówno wobec oliwy z oliwek (rys. 1, rys. 3), zawierającej głównie acyloglicerole kwasu oleinowego, jak i wobec syntetycznego trimaślanu glicerolu tributyryny (rys., rys. ). Generalnie wyŝsze wartości aktywności lipaz otrzymano dla substratu oliwy z oliwek szczególnie w podłoŝach z olejem lub glukozą (rys. 1, rys. ). Wykazano w ten sposób większą preferencję lipaz badanych szczepów Geotrichum candidum do hydrolizy wiązań estrowych wytworzonych przez długołańcuchowe kwasy tłuszczowe, niŝ przez krótkołańcuchowy kwas masłowy w tributyrynie. Podobne, wybiórcze uwalnianie kwasu oleinowego z cząsteczki acyloglicerolu przez lipazę pochodzącą od Geotrichum candidum NRRL Y-553 odnotowano w pracy Baillargeon i Sonnet [1991]. Jednak niektóre szczepy w prezentowanej pracy (X, X5, O1 i B 1 ) wykazały wysokie aktywności zewnątrzkomórkowych lipaz, niezaleŝnie od zastosowanego substratu tłuszczowego w testach enzymatycznych, co sugeruje, iŝ te szczepy posiadają wyŝsze niŝ pozostałe uzdolnienia do biosyntezy aktywnych lipaz (rys. 1, rys. ). Wśród testowanych szczepów Geotrichum wykazano takŝe zróŝnicowanie w poziomie aktywności wewnątrzkomórkowych lipaz, które szczególnie dało się zauwaŝyć w zaleŝności od stosowanego źródła węgla w poŝywce. W celu porównania, aktywności lipaz wewnątrz- z zewnątrzkomórkowymi wyraŝono je jako aktywności właściwe, w JL WO mg -1 i JL WT mg -1.. Acta Sci. Pol.

5 Produkcja lipaz 7 Aktywność zewnątrzkomórkowych lipaz [JLZOmL -1 ] Activity of extracellular lipases [JLZOmL -1 ] A B C Czas [doby], Time [days] Rys. 1. Wpływ oleju rzepakowego (A), glukozy (B) i szlamu (C) na produkcję zewnątrzkomórkowych lipaz (oznaczanych wobec oliwy z oliwek jako substratu) przez szczepy Geotrichum candidum Fig. 1. Effect of rapeseed oil (A), glucose (B) and residues oil (C) on extracellular lipases (with olive oil as substrate) induction in strains Geotrichum candidum Biotechnologia (1-) 5

6 A. Rywińska i in. Aktywność zewnątrzkomórkowych lipaz [JLZTmL -1 ] Activity of extracellular lipases [JLZTmL -1 ] A B C Czas [doby], Time [days] Rys.. Wpływ oleju rzepakowego (A), glukozy (B) i szlamu (C) na produkcję zewnątrzkomórkowych lipaz (oznaczanych wobec tributyryny jako substratu) przez szczepy Geotrichum candidum Fig.. Effect of rapeseed oil (A), glucose (B) and residues oil (C) on extracellular lipases (with tributyrin as substrate) induction in strains Geotrichum candidum Acta Sci. Pol.

7 Produkcja lipaz 9 1 Aktywność właściwa zewnątrzkomórkowych lipaz [JLWOmg -1 ] Specific activity of extracellular lipases [JLWOmg -1 ] 1 1 A B C Aktywność właściwa wewnątrzkomórkowych lipaz [JLWOmg -1 ] Specific activity of intracellular lipases [JLWOmg -1 ] Czas [doby], Time [days] Rys. 3. Wpływ oleju rzepakowego (A), glukozy (B) i szlamu (C) na produkcję zewnątrzkomórkowych i wewnątrzkomórkowych lipaz (oznaczanych wobec oliwy z oliwek jako substratu) przez szczepy Geotrichum candidum Fig. 3. Effect of rapeseed oil (A), glucose (B) and residues oil (C) on extracellular and intracellular lipases (with olive oil as substrate) induction in strains Geotrichum candidum Biotechnologia (1-) 5

8 5 A. Rywińska i in. Aktywność właściwa zewnątrzkomórkowych lipaz [JLWTmg -1 ] Specific activity of extracellular lipases [JLWTmg -1 ] A B C Aktywność właściwa wewnątrzkomórkowych lipaz [JLWTmg -1 ] Specific activity of intracellular lipases [JLWTmg -1 ] Czas [doby], Time [days] Rys.. Wpływ oleju rzepakowego (A), glukozy (B) i szlamu (C) na produkcję zewnątrzkomórkowych i wewnątrzkomórkowych lipaz (oznaczanych wobec tributyryny jako substratu) przez szczepy Geotrichum candidum Fig.. Effect of rapeseed oil (A), glucose (B) and (C) on extracellular and intracellular lipases (with tributyrin as substrate) induction in strains Geotrichum candidum Acta Sci. Pol.

9 Produkcja lipaz 51 Podobnie jak w przypadku lipaz zewnątrzkomórkowych najefektywniejszym źródłem węgla w przypadku oznaczanych wobec oliwy z oliwek wewnątrzkomórkowych lipaz, okazał się olej rzepakowy, najwyŝszą wartość JA WO mg -1, 1,5, uzyskano dla szczepu MSK w 7 dobie hodowli (rys. 3A). Podobne spostrzeŝenia znalezione zostały w pracy Adamczaka i Bednarskiego [199], gdzie zdecydowanie najwyŝsze aktywności wewnątrzkomórkowych lipaz dla szczepu Galactomyces geotrichum 15 odnotowano w przypadku hodowli z olejem rzepakowym jako źródłem węgla. RównieŜ Jacobsen i in. [199] wykazali dla opisanego w swojej pracy szczepu Geotrichum candidum, wyŝsze aktywności lipaz związanych z komórką w obecności,1% roztworu oliwy z oliwek niŝ w hodowlach bez dodatkowego źródła węgla. W hodowlach z glukozą wszystkie testowane szczepy w prezentowanej pracy charakteryzowały się wyŝszymi wartościami aktywności wewnątrzkomórkowych lipaz w porównaniu do zewnątrzkomórkowych i to oznaczanych zarówno wobec oliwy jak i trimaślanu glicerolu (rys. 3b, rys. B), a szczep O1 osiągnął najwyŝszą wartość aktywności wewnątrzkomórkowych lipaz, tj. 1,33 JL WT mg -1 (rys. B). Wyniki takie moŝna tłumaczyć częściowo konstytutywnym charakterem biosyntezy wewnątrzkomórkowych lipaz. Natomiast w hodowlach w podłoŝu z olejem, aktywności wewnątrzkomórkowych lipaz zarówno wyraŝone jako JL WO mg -1, jak i JL WT mg -1 były na niŝszym poziomie w porównaniu z zewnątrzkomórkowymi, co wyraźnie zaznaczyło się w hodowlach szczepów X, X5, O1, B 1 (rys. 3a, rys. A). Wyjątek stanowi szczep MSK, w hodowli którego aktywność właściwa lipaz wewnątrzkomórkowych ośmiokrotnie przekroczyła aktywność lipaz zewnątrzkomórkowych w 7 dobie hodowli (rys. 3a, rys. A). Te wyniki mogą sugerować zewnątrzkomórkowy charakter produkowanych, w obecności tłuszczu, enzymów, co jest zbieŝne z badaniami Adamczaka i Bednarskiego [199]. Stwierdzili oni równieŝ, Ŝe dodatek tłuszczu do podłoŝa hodowlanego zwiększał na korzyść enzymów zewnątrzkomórkowych róŝnice pomiędzy zewnątrz- i wewnątrzkomórkowymi lipazami. Podobne róŝnice pomiędzy obu aktywnościami, które uwydatniały się zwłaszcza w hodowlach z dodatkiem tłuszczu, zaobserwowali równieŝ Jacobsen i in. [199]. Interesujące wydają się wyniki uzyskane dla szczepów X, X5, PH, O1 w hodowlach z tłuszczem odpadowym szlamem, gdzie dalsza optymalizacja podłoŝa na bazie tego odpadowego źródła węgla moŝe zwiększyć efektywność biosyntezy lipaz. Przewiduje się kontynuowanie badań w tym kierunku, co moŝe mieć znaczenie w zagospodarowaniu odpadów przemysłu tłuszczowego i w związku z tym w ochronie środowiska. WNIOSKI 1. Wszystkie badane szczepy Geotrichum candidum były zdolne do produkcji lipaz zarówno wewnątrz-, jak i zewnątrzkomórkowych, przy czym intensywność biosyntezy enzymów zaleŝała przede wszystkim od zastosowanego źródła węgla.. Produkcja lipaz zarówno zewnątrz-, jak i wewnątrzkomórkowych, najefektywniej przebiegała w podłoŝu z dodatkiem oleju rzepakowego, co moŝe świadczyć o indukowanym charakterze ich syntezy. 3. Dla większości badanych szczepów wyŝsze wartości aktywności lipaz zarówno zewnątrz-, jak i wewnątrzkomórkowych, otrzymano dla substratu oliwy z oliwek. Biotechnologia (1-) 5

10 5 A. Rywińska i in.. Szczepy X, X5, O1 i B1 wyróŝniały się spośród pozostałych szczepów większymi uzdolnieniami do biosyntezy aktywnych lipaz zewnątrzkomórkowych, niezaleŝnie od zastosowanego substratu tłuszczowego w testach enzymatycznych. Maksymalną wartość aktywności lipolitycznej w prezentowanej pracy odnotowano dla szczepu G. candidum X5 ( JL ZO ml -1 ) w podłoŝu z olejem. 5. Aktywności właściwe lipaz wewnątrzkomórkowych w hodowlach z glukozą przyjmowały wartości kilkakrotnie wyŝsze od lipaz zewnątrzkomórkowych, natomiast w hodowlach z olejem rzepakowym aktywności te dla większości badanych szczepów były niŝsze od zewnątrzkomórkowych.. Szczep Geotrichum candidum MSK w hodowlach z dodatkiem oleju rzepakowego wyróŝniał się, spośród innych szczepów, największymi uzdolnieniami do wytwarzania wewnątrzkomórkowych lipaz, na poziomie 1,5 JL WO mg -1. PIŚMIENNICTWO Adamczak M., Bednarski W., 199. Some factors affecting lipase production by yeasts and filamentous fungi Biotech. Lett., 1, 1, Baillargeon M.W., Sonnet P.F., Selective lipid hydrolysis by Geotrichum candidum NRRL Y-553 lipase. Biotech.Lett., 13, 1, Białasiewicz D., Wpływ obniŝenia temperatury na aktywność enzymów hydrolitycznych Geotrichum candidum. Przemysł SpoŜywczy, 11, 3-. Białasiewicz D., 199. Wpływ niskich temperatur na przeŝywalność komórek oraz na aktywność niektórych oksydoreduktaz Geotrichum candidum. Chłodnictwo, t. 31, 3, -3. Chałecki Z., Plenkiewicz J., 199. Zastosowanie lipaz w syntezie organicznej w środowisku bezwodnym. Wiadomości Chemiczne, 5. Chander H., Klostermeyer H., 193. Production of lipase by Geotrichum candidum under various growth conditions. Milchwissenschaft, 3, 7, 1-1. Gąsiorowski H., Kączkowski J., Kawka A., Kołodziejczyk P., Michniewicz J., Skład chemiczny ziarna jęczmienia, [w:] Jęczmień, chemia i technologia, red. H. Gąsiorowski, PWRiL, Poznań. Haliniarz E., Lejczak B., 199. Zastosowanie lipaz w syntezie organicznej. Wiadomości Chemiczne, 5. Jacobsen T., Jensen B., Olsen J., Allermann K., 199. Extracellular and cell-bound lipase activity in relation to growth of Geotrichum candidum. Appl. Microbiol. Biotechnol., 3, 5-1. Jacobsen T., Olsen J., Allermann K., 199. Production, partial purification, and immunochemical charcterization of multiple forms of lipase from Geotrichum candidum. Enzyme Microb.Technol., 11, Jaeger K.E., Schneidinger B., Rosenau F., Werner M., Lang D., Dijkstra B.W., Schimossek K., Zonta A., Reetz M.T., Bacterial lipases for biotechnological application. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 3, 3-1. Lowry O.H., Rosenbrough N. J., Farr A. L., Randall R. J., Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 193, Rapp P., Backhaus S., 199. Formation of extracellular lipases by filamentous fungi, yeasts and bacteria. Enzyme Microb. Technol., 1, Reppas G.P., Snoeck T.D., Cutaneous geotrichosis in a dog. Aust. Vet., 77, 9, Sharma R., Chisti Y., Banerjee U.Ch., 1. Production, purification, characterization, and applications of lipases. Biotechnology Advances, 19, 7-. Acta Sci. Pol.

11 Produkcja lipaz 53 Veeraragavan K., Colpitts T., Gibbs B. F., 199. Purification and characterization of two distinct lipases from Geotrichum candidum. Biochim. Biophys. Acta, 1, -33. Vulfson E.N., 199. Industrial applications of lipasese. [In:] Wooley P., Peterson S.B., editors. Lipases theirstructure, biochemistry and applicatios. Cambridge: Cambridge Univ. Press, 71-. LIPASES PRODUCTION BY DIFFERENT GEOTRICHUM CANDIDUM STRAINS IN DEPENDENCE ON CARBON SOURCE IN MEDIUM Abstract. In this paper we focus on the capability to biosynthesis extra and intracellular lipases by strains of Geotrichum candidum. We value activities against two different substrates: olive oil (JL O ) and glycerol tributyrate (JL T ). As a carbon source in the medium we used rapeseed oil, glucose, and residue oil waste from fatty industry (1% of each). All tested strains show differentiation in the volume of intra and extracellular lipase activity, according to carbon source in medium, but also kind of substrate in enzymatic tests and also incubation time. Rapeseed oil was the most effective carbon source in lipase synthesis and Geotrichum candidum X5 strain showed the highest extracellular activity of lipase ( JL O ml -1 ) in given conditions. Key words: Geotrichum candidum, lipases, carbon source Zaakceptowano do druku Accepted for print: Biotechnologia (1-) 5