ZA STO SO W A N IE M ETO D Y P C R DO RÓ ŻN IC O W A N IA DRO ŻDŻY PR ZEM Y SŁO W Y C H

Transkrypt

1 ŻYW NO ŚĆ 3(20)Supl 1999 JOANNA KAWA-RYGIELSKA ZA STO SO W A N IE M ETO D Y P C R DO RÓ ŻN IC O W A N IA DRO ŻDŻY PR ZEM Y SŁO W Y C H Streszczenie Metoda PCR została wykorzystana do identyfikacji hybrydów drożdży przemysłowych rodzaju Saccharomyces z amylolitycznym szczepem Schwanniomyces occidentalis ATCC Zastosowanie metody pozwoliło na identyfikację trzech fuzantów międzyrodzajowych posiadających fragmenty DNA wspólne dla obu szczepów wyjściowych. Wstęp Metoda PCR (Polimerase Chain Reaction) została opracowana przez Kary Mullis a w 1987 r. Polega ona na powielaniu wybranego odcinka DNA in vitro w łańcuchowej reakcji polimeryzacji przy użyciu polimerazy i specyficznych primerów [7], Metoda umożliwia milionowe zwielokrotnienie (amplifikację) w ciągu kilku godzin określonego fragmentu DNA lub RNA. Reakcję PCR przeprowadza się zwykle w 25 do 30 kolejno następujących po sobie jednakowych cyklach. W każdym cyklu wyodrębnić można trzy fazy, a mianowicie: denaturację, hybrydyzację i syntezę DNA. Denaturacja - rozdzielenie dwuniciowych cząsteczek DNA na dwie pojedyncze nici w temperaturze 95 C. Hybrydyzacja odcinków starterowych - przyłączenie primerów do miejsc homologicznych w badanym DNA zachodzące w temperaturze około 55 C do 80 C. Utworzona struktura jest sygnałem dla polimerazy DNA do powielenia tego regionu. Synteza DNA - powielanie wybranego odcinka DNA in vitro w łańcuchowej reakcji polimeryzacji w temperaturze 75 C. Kluczowe znaczenie dla całej reakcji ma termoopomy enzym polimeraza DNA izolowany z bakterii Thermus aquaticus. Enzym ten zachowuje aktywność i zdolność polimeryzacji po wielokrotnym ogrzaniu do temp. 95 C (temperatura denaturacji dwułańcuchowego DNA). Reakcje PCR prowadzone są w przepływowych łaźniach Mgr inż. J. Kawa-Rygielska, Katedra Technologii Rolnej i Przechowalnictwa Akademia Rolnicza we Wrocławiu,, ul. Norwida 25, Wrocław.

2 70 Joanna Kawa-Rygielska powietrznych (termocykleraeh), a uzyskane produkty są rozdzielane elektroforetycznie na żelach agarozowych z bromkiem etydyny. PCR jest metodą bardzo czułą. Teoretycznie możliwe jest wykazanie obecności nawet jednej cząsteczki DNA. W praktyce przyjmuje się jednak, że dolna granica czułości to kilkanaście cząsteczek w jednym mililitrze badanego roztworu. Dzięki zaletom (szybkość i czułość) PCR znajduje coraz szersze zastosowanie: w diagnostyce medycznej, weterynaryjnej, w badaniach kryminalistycznych [1] i w badaniach żywności [4] Cel pracy Celem pracy była identyfikacja hybrydów międzyrodzajowych szczepów drożdży przemysłowych rodzajów Saccharomyces z amylolitycznym szczepem Schwanniomyces occidentalis ATCC przy pomocy metody PCR. Materiał i metody badań Materiał badawczy stanowiły drożdże; Saccharomyces cerevisiae V30, Saccharomyces diastaticus ATCC 13006, Schwanniomyces occidentalis ATCC 48086, mieszańce z grupy S (Saccharomyces diastaticus ATCC x Schwanniomyces occidentalis ATCC 48086) oraz mieszańce z grupy R (Saccharomyces cerevisiae V30 x Schwanniomyces occidentalis ATCC 48086). Badanie genomu hybrydów międzyrodzaj owych metodą PCR Matrycę DNA stanowił chromosomalny DNA badanych szczepów wyjściowych i mieszańców. Izolację DNA z komórek drożdżowych przeprowadzono wg metody Rose i wsp. [7] w modyfikacji Skały [8]. Szczepy drożdży inkubowano w 10 cm3 pożywki YPG przez 12h w temp. 28 C z energicznym wytrząsaniem. Hodowlę wirowano (2000 obr./min. 4 min). Komórki zawieszono w 1 ml jałowej wody destylowanej i przeniesiono do probówki Eppendorfa. Zawiesinę wirowano (2000 obr./min. 1 min). Supernatant odrzucono, komórki zawieszono w 200 μΐ buforu do trawienia ściany komórkowej (β-merkaptoetanol - 1%, Tris-HCl-50 mm, EDTA (ph 7,5) - 25 mm, Zymolaza firmy Sigma - 5 mg/ml) i inkubowano przez 1 godzinę w temp. 37 C z okazyjnym wytrząsaniem. Dodano 200 μΐ roztworu do lizy (1% SDS; 0,2 M NaOH). Po wymieszaniu zawartość probówek inkubowano przez 30 min w temp. 65 C. Dodano 150 μΐ 5 M roztworu octanu potasu, roztwór inkubowano przez 30 min w lodzie po czym całość wirowano (14000 obr./min. 15 min, 4 C). Zebrano supernatant do nowej probówki i dodano 1 objętość zimnego (-20 C) izopropanolu, (obserwowano wytrącanie kwasów nukleinowych). Odwirowano wytrącone DNA (14000 obr./min. 5 do 10 min, 4 C), supernatant odrzucono. Osad przemyto 1 ml 70 % etanolu, wysuszono w suszarce

3 ZASTOSOWANIE METODY PCR DO RÓŻNICOWANIA DROŻDŻY PRZEMYSŁOWYCH 71 próżniowej z wirującym rotorem (Speedvac) firmy Savan i zawieszono w 50 μΐ wody. Przechowywano w temp -20 C. Amplifikację DNA przeprowadzono stosując primer mikrosatelitamy (GTG)s [6]. Syntezę primera wykonała na zamówienie niemiecka firma ARK. Profil termiczny - PCR program (GTG) 5 : 40 cykli: 93 C - 20 sek. (denaturacja dwuniciowego DNA), 50 C -1 min (przyłączanie primera (GTG)s), 72 C - 20 sek (powielanie homologicznych fragmentów DNA), 72 C - 6 min (powielanie DNA), 4 C - zakończenie reakcji PCR (chłodzenie). Reakcje PCR wykonano z udziałem termostabilnej Taq polimerazy PCR firmy Quiagen oraz przy użyciu termocyklera DNA Engine PTC Peltier Thermal Cycler firmy MJ Research. Elektroforeza DNA w żelu agarozowym Produkty reakcji PCR oznaczono elektroforetycznie, stosując 0,8% żel agarozowy z bromkiem ety dyny oraz markerem masy (100 bp DNA Ladder firmy Promega) o wielkości fragmentów 1500, 1000,900, 800,700,600, 500,400, 300,200,100 bp. Rozdział DNA na żelu agarozowym rejestrowano przy pomocy telewizyjnego zestawu do rejestracji obrazu firmy Sony. Wyniki i dyskusja Analizując rozdział fragmentów DNA szczepów Schwanniomyces occidentalis ATCC i Saccharomyces diastaticus ATCC oraz ich mieszańców SI, S3, S4 S6, S8 (Rys. 1) stwierdzono, że jedynie dwa szczepy S2 i S3 mogły być uznane za fuzanty. Hybryd S2 zawierał dwa fragmenty DNA (ponad 1500 bp i 675 bp) stwierdzone również w szczepie rodzicielskim Saccharomyces diastaticus ATCC oraz dwa inne fragmenty (1300 bp i 600 bp) typowe dla drugiego rodzica Schwanniomyces occidentalis ATCC W odróżnieniu od fiizanta S2 fiizant S3 zawierał tylko po jednym regionie typowym dla każdego szczepu rodzicielskiego (675 bp) odpowiadający Saccharomyces diastaticus i (1300 bp) typowy dla Schwanniomyces occidentalis ATCC Ponadto w obu hybrydach stwierdzono obecność jednego fragmentu DNA o wielkości 400 bp występującego u obu szczepów rodzicielskich. Jednoznaczne stwierdzenie, od którego z rodziców pochodzi ten fragment, wymagałoby dalszych analiz. Pozostałe produkty fuzji szczepów Saccharomyces diastaticus i Schwanniomyces occidentalis ATCC 48086, posiadały fragmenty DNA identyczne z

4 72 Joanna Kawa-Rygielska jednym z partnerów fuzji i tak mieszańce S8 i S6 z Schwanniomyces a SI i S4 z Saccharomyces, (Rys. 1). Rys. 1. Fig. 1. Produkty reakcji PCR uzyskane przy użyciu primera (GTG)5 dla szczepów rodzicielskich Saccharomyces diastaticus ATCC i Schwanniomyces occidentalis ATCC oraz produktów ich fuzji. Fingerprinting of PCR products obtained for parental strains (Saccharomyces distaticus ATCC and Schwanniomyces occidentalis ATCC 48086) and their fusants by use of (GTG)5 primer. Wśród mieszańców R (Saccharomyces cerevisiae V30 x Schwanniomyces occidentalis ATCC 48086) zidentyfikowano obecność tylko jednego fuzanta. Hybryd R1 posiadał dwa fragmenty DNA (ponad 1500 bp i 675 bp) typowe dla szczepu Saccharomyces cerevisiae rasy V30 oraz jeden region (1300 bp) identyczny z drugim partnerem fuzji (Rys. 2). Hybryd wyróżniał się przewagą fragmentów DNA typowych dla szczepu wyjściowego z rodzaju Saccharomyces. Podobnie jak we wcześniej omawianych przypadkach fuzant R1 posiadał 1 fragment o wielkości 400 bp, wspólny dla obu szczepów wyjściowych. Produkty amplifikacji genomowego DNA mieszańca R4 były

5 ZASTOSOWANIE METODY PCR DO RÓŻNICOWANIA DROŻDŻY PRZEMYSŁOWYCH 73 charakterystyczne tylko dla jednego szczepu wyjściowego, a mianowicie dla Saccharomyces cerevisiae rasy V30. Podsumowując należy stwierdzić, iż zastosowanie metody PCR i primera mikrosatelitamego (GTG)5, pozwoliło na zróżnicowanie partnerów fuzji w obrębie rodzaju Schwanniomyces i Saccharomyces oraz potwierdzono obecność 3 hybrydów międzyrodzajowych tych szczepów S2, S3, R l, posiadających fragmenty DNA typowe dla obu form rodzicielskich. Analiza wybranych regionów DNA pozostałych mieszańców nie potwierdziła przypuszczeń, że są one produktami fuzji szczepów Saccharomyces i Schwanniomyces. U mieszańców S8 i S6 znaleziono wyłącznie fragmenty charakterystyczne dla Schwanniomyces occidentalis ATCC 48086, a dla SI, S4, R4, wyłącznie fragmenty typowe dla rodzaju Saccharomyces. Istnieje możliwość, że do selektywnej Rys. 2. Fig. 2. Produkty reakcji PCR uzyskane przy użyciu primera (GTG)s dla szczepów rodzicielskich Saccharomyces cerevisiae V30 i Schwanniomyces occidentalis ATCC oraz produktów ich fuzji. Fingerprinting of PCR products obtained for parental strains (Saccharomyces cerevisiae V30 and Schwanniomyces occidentalis ATCC 48086) and their fusants by use of (GTG)5 primer.

6 74 Joanna Kawa-Rygielska amplifikacji nie udało się wybrać takich regionów DNA, które byłyby wspólne dla obu szczepów wyjściowych. Ponadto, w czasie łączenia protoplastów drożdży Saccharomyces i Schwanniomyces mogło dochodzić do tworzenia tzw. produktów ubocznych fuzji, których genom może składać się z kompletu chromosomów jednego ze szczepów wyjściowych oraz pojedynczego chromosomu drugiego rodzica [9], Użyteczność primerów mikrosatelitamych prezentowano we wcześniejszych pracach wielu badaczy. Couto i wsp., [2, 3] wykazali szczególną przydatność primera mikrosatelitamego (GTG)s umożliwiającego zróżnicowanie wewnątrzgatunkowe szczepów. Inni badacze z dużym powodzeniem stosowali primery mikrosatelitame do różnicowania szczepów w obrębie rodzajów Saccharomyces a Kluyveromyces [5] czy Debariomyces hansenii, Candida zeylanoides [6], Wnioski 1. Analiza elektroforetyczna produktów PCR, uzyskanych przy użyciu primera mikrosatelitamego (GTG)5, pozwoliła na zróżnicowanie szczepów rodzicielskich, w obrębie rodzaju Saccharomyces i Schwanniomyces occidentalis ATCC oraz na identyfikację trzech hybrydów międzyrodzaj owych tych szczepów. 2. Spośród potwierdzonych genetycznie fuzantów (S2, S3, R l) na szczególną uwagę zasługuje szczep S2 'wykazujący największą ilość fragmentów DNA pochodzących od obu szczepów rodzicielskich. LITERATURA [1] Chmiel A: Biotechnologia - podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne. Wyd. Nauk. PWN, Warszawa, 1998, [2] Couto M., Eijsma B., Hofstra H.: Evaluation of molecular Typing to assing genetic diversity among Saccharomyces cerevisiae strains, Appl. Envir. Microb., 1,1996, [3] Couto M., Hartog J., Hofstra H., van der Vossen J.: Identification of spoilage yeast in a food- production chain by microsatellite polymeraes chain reaction fingerpriting, Food Microb., 13,1996, [4] Kur J.: Szybka diagnostyka mikrobiologiczna zanieczyszczenia żywności, w: Postępy w technologii i chemii żywności, Mat. XXVIII Sesji Nauk. KTiChŻ PAN, 1997, 1. [5] Lieckfeldt E., Meyer W., Bomer T.: Rapid identification and differentiation of yeasts by DNA and PCR fingerprinting, J. Basic Microbal. 33 (6), 1993, [6] Romano A., Casaregola S., Torre P, Gaillardin C.: Use of RAPD and mitochondrial DNA RFLP for typing of Candida zeylanoides and Debariomyces hansenii yeast strains isolated from cheese, System. Appl. Microbiol., 1 9,1996, [7] Rose M.D., Winston F., Hieter P.: Methods in yeast genetics. A laboratory course manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, [8] Skala J.: Informacje personalne, [9] Tamaki H.: Genetic properties of abortive products resulting from the protoplast fusion in yeast, Mol. Gen. Genet, 187, 1982,

7 ZASTOSOWANIE METODY PCR DO RÓŻNICOWANIA DROŻDŻY PRZEMYSŁOWYCH 75 APPLICATION OF PCR METHOD TO DIFFERENTIATION OF INDUSTRIAL YEAST Summary PCR method was used for identification hybrids industrial yeast Saccharomyces with amylolytic strain Schwanniomyces occidentalis ATCC Application of this method afforded possibilities for identification of three intergeneric fusants containing DNA both parental strains.