Kliniczne znaczenie wczesnego całkowitego chimeryzmu hematopoetycznego po allogenicznej transplantacji komórek macierzystych hematopoezy

Transkrypt

1 WYDZIAŁ LEKARSKI AKADEMII MEDYCZNEJ W GDAŃSKU Joanna Balon Kliniczne znaczenie wczesnego całkowitego chimeryzmu hematopoetycznego po allogenicznej transplantacji komórek macierzystych hematopoezy Rozprawa na stopień doktora nauk medycznych Praca wykonana w Klinice Hematologii Instytutu Chorób Wewnętrznych Promotor: Prof. dr hab. Andrzej Hellmann Gdańsk, 2005

2 SPIS TREŚCI 1 WSTĘP Allogeniczna transplantacja komórek hematopoezy wprowadzenie Przewlekła choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi Klasyfikacja cgvhd Leczenie cgvhd Chimeryzm hematopoetyczny Metody określania i monitorowania chimeryzmu hematopoetycznego Kliniczne znaczenie chimeryzmu ZAŁOśENIA I CEL PRACY MATERIAŁ I METODY Badani chorzy Choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi Metody badań Izolacja leukocytów krwi obwodowej Ocena chimeryzmu Analiza statystyczna WYNIKI Chimeryzm hematopoetyczny w komórkach jądrzastych krwi obwodowej Charakterystyka chorych w zaleŝności od rodzaju chimeryzmu Późne powikłania poprzeszczepowe Przewlekła choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi cgvhd a rodzaj materiału przeszczepowego cgvhd a agvhd Charakterystyka stosowanego leczenia cgvhd Zgony w grupie z cgvhd Wznowa choroby zasadniczej Zgony późne ZaleŜność pomiędzy typem pełnego chimeryzmu a powikłaniami poprzeszczepowymi Typ pełnego chimeryzmu a cgvhd Częstość występowania cgvhd w zaleŝności od typu CC cgvhd a agvhd w zaleŝności od typu pełnego chimeryzmu Rodzaj CC a cięŝkość przebiegu cgvhd ZaleŜność pomiędzy czasem stwierdzenia pełnego chimeryzmu a wystąpieniem objawów cgvhd Typ CC a wznowa choroby zasadniczej Przyczyna zgonów późnych w zaleŝności od rodzaju CC Chimeryzm w poszczególnych subpopulacjach leukocytów krwi obwodowej OMÓWIENIE WYNIKÓW I DYSKUSJA Chimeryzm hematopoetyczny Choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi Wznowa choroby zasadniczej WNIOSKI STRESZCZENIE

3 8 SUMMARY PIŚMIENNICTWO

4 SPIS TABEL Tabela I Czynniki ryzyka cgvhd... 9 Tabela II Oryginalna i zmodyfikowana klasyfikacja cgvhd Tabela III Najczęściej stosowany model prognostyczny dla chorych z cgvhd Tabela IV Charakterystyka dawców i biorców Tabela V Stopniowanie ostrej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi Tabela VI Charakterystyka przeciwciał uŝytych w badaniu Tabela VII. Charakterystyka pacjentów oraz przeszczepu w zaleŝności od czasu uzyskania CC Tabela VIII Charakterystyka chorych bez i z cgvhd Tabela IX. Charakterystyka cgvhd w grupie chorych z wczesnym i późnym chimeryzmem Tabela X Charakterystyka wznowionych chorych w grupie z późnym CC Tabela XI Charakterystyka wznowionych chorych w grupie chorych z wczesnym chimeryzmem

5 SPIS RYCIN Rysunek 1 Grupy chorych w zaleŝności od rodzaju chimeryzmu Rysunek 2 Zmiana odsetkowego udziału CC w kolejnych dobach kontrolnych Rysunek 3 Zmienna wieku biorcy w zaleŝności od rodzaju osiągniętego chimeryzmu Rysunek 4 Zmienna wieku dawcy w zaleŝności od rodzaju osiągniętego chimeryzmu Rysunek 5 Częstość występowania cgvhd Rysunek 6 cgvhd w zaleŝności od rodzaju materiału przeszczepowego Rysunek 7 Występowanie ostrej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi w badanej grupie chorych Rysunek 8 Występowanie agvhd u chorych z rozległa postacią cgvhd w porównaniu do chorych bez cgvhd Rysunek 9 Występowanie cgvhd w zaleŝności od agvhd Rysunek 10 Ostra choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi w zaleŝności od rozległości cgvhd Rysunek 11 Typ cgvhd w zaleŝności od rodzaju początku Rysunek 12 Ilość leków stosowanych w terapii immunosupresyjnej Rysunek 13 Przyczyny zgonu w zaleŝności od występowania cgvhd Rysunek 14 Prawdopodobieństwo przeŝycia w grupie chorych z i bez cgvhd Rysunek 15 Wznowa choroby zasadniczej w zaleŝności od diagnozy Rysunek 16 Przyczyny zgonów późnych Rysunek 17 Krzywa przeŝycia w badanej grupie 51 chorych Rysunek 18 cgvhd w grupach chorych z wczesnym i późnym chimeryzmem Rysunek 19 Ostra choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi w zaleŝności od rodzaju pełnego chimeryzmu Rysunek 20 Częstość występowania cgvhd w zaleŝności od agvhd w grupie chorych z wczesnym chimeryzmem Rysunek 21 Częstość występowanie cgvhd w zaleŝności od stopnia agvhd w grupie chorych z późnym CC Rysunek 22 Typ początku cgvhd w zaleŝności od czasu uzyskania CC Rysunek 23 Rodzaj pełnego chimeryzmu a terapia cgvhd Rysunek 24 Rodzaj pełnego chimeryzmu a zgony z powodu cgvhd Rysunek 25 Korelacja między czasem uzyskania CC a róŝnicą czasu pomiędzy czasem do uzyskania CC a czasem wystąpienia cgvhd

6 Rysunek 26 Wznowa choroby zasadniczej w grupie chorych z wczesnym i późnym chimeryzmem Rysunek 27 Przyczyny zgonów późnych w zaleŝności od czasu uzyskania pełnego chimeryzmu Rysunek 28 Prawdopodobieństwo przeŝycia w zaleŝności od czasu uzyskania pełnego chimeryzmu Rysunek 29 Przykładowy przebieg chimeryzmu w poszczególnych populacjach krwi obwodowej u jednego z chorych Rysunek 30 Przykład mieszanego chimeryzmu w wysortowanych limfocytach CD3 wykazany metodą multiplex PCR w 2 loci (strzałki pionowe)

7 1 WSTĘP 1.1 Allogeniczna transplantacja komórek hematopoezy wprowadzenie Transplantacja komórek hematopoetycznych (Hematopoietic Stem Cell Transplantation HSCT) jest obecnie uznaną metodą leczenia chorób rozrostowych układu krwiotwórczego, wrodzonych zaburzeń metabolicznych i immunologicznych. Jej wprowadzaniu w latach 60tych towarzyszył duŝy sceptycyzm, obecnie na całym świecie zabiegowi przeszczepienia szpiku kaŝdego roku poddawanych jest tysiące chorych. Znaczny postęp zarówno w postępowaniu przedprzeszczepowym: kwalifikacji chorych, oznaczaniu antygenów HLA, a takŝe wprowadzenie profilaktyki choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi i postępy w terapii powikłań infekcyjnych w istotny sposób poprawiły wyniki transplantacji. Nadal ogromnym wyzwaniem pozostaje zmniejszenie śmiertelności związanej z przewlekłą chorobą przeszczep przeciwko gospodarzowi, a u chorych przeszczepionych z powodu chorób rozrostowych - wznową choroby zasadniczej (19;21;63;65;100;106). Allogeniczne przeszczepianie szpiku jest skomplikowaną procedurą, w której komórki hematopoetyczne biorcy zostają zastąpione komórkami dawcy. W przypadku chorób wrodzonych lub aplazji szpiku stanowi to istotę leczenia, natomiast w chorobach nowotworowych zabieg ten umoŝliwia eskalację dawek chemioterapii i napromieniania z pominięciem ograniczeń wynikających z mielotoksyczności. Dodatkowo, korzystny efekt przeciwnowotworowy wynika z reakcji immunologicznej powodowanej przez przeszczepiane limfocyty T dawcy (Graft versus Leukemia - GvL; Graft versus Tumor GvT)(18;19;22;31;96;105;115;130). Tradycyjnie postępowanie przygotowawcze do przeszczepu (kondycjonowanie) polegające na podaniu wysokodawkowanej (mieloablacyjnej) chemioterapii lub radiochemioterapii (w celu zniszczenia komórek nowotworowych, wytworzenia wolnej przestrzeni w szpiku oraz zapobieŝenia odrzuceniu przeszczepu) było uznawane za warunek konieczny do uzyskania wszczepienia. Obecnie przeprowadza się równieŝ procedury przeszczepienia poprzedzone zredukowanym, niemieloablacyjnym kondycjonowaniem. Postępowanie to nie prowadzi do nieodwracalnej aplazji szpiku - działanie mieloablacyjne zostało zastąpione uniemoŝliwiającą odrzucenie przeszczepu terapią immunoablacyjną. Proces zamiany hematopoezy biorcy na 6

8 komórki dawcy (pełny chimeryzm) uzyskiwany jest przez etap mieszanego chimeryzmu i niekiedy wymaga wspomoŝenia infuzją limfocytów dawcy (Donor Lymphocytes Infusion - DLI). Efekt przeciwnowotworowy wynika w tej sytuacji głownie z reakcji GvL. Zaletą postępowania niemieloablacyjnego jest uniknięcie cięŝkich powikłań związanych z wysokodawkową chemioterapią, co umoŝliwia kwalifikowanie do przeszczepu chorych w coraz starszym wieku, a takŝe obciąŝonych chorobami współistniejącymi (20;58;64;116;119;121;122;122;123). Głównym źródłem pozyskiwania komórek progenitorowych jest krew szpikowa oraz komórki progenitorowe pobrane z krwi obwodowej. Komórki progenitorowe krwi pępowinowej w przypadku przeszczepu osób dorosłych mają marginalne znaczenie (25;61;106). Zasadniczą przyczyną niepowodzeń we wczesnym okresie poprzeszczepowym (do 100 doby po przeszczepie) są powikłania wynikające z aplazji szpiku (krwawienia, powikłania infekcyjne), toksyczności wysokodawkowanej terapii oraz ostra choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi. Do najwaŝniejszych powikłań późnych (powyŝej 100 doby po przeszczepie) naleŝą przewlekła choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi, infekcje oportunistyczne, wznowa choroby zasadniczej, oraz wtórne nowotwory (5;65;101;126). 1.2 Przewlekła choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi Przewlekła choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi (chronic Graft versus Host Disease - cgvhd) jest najpowaŝniejszym i najczęstszym powikłaniem późnym transplantacji allogenicznej. Występuje u 30-70% pacjentów, którzy przeŝyli pierwsze 100 dni po transplantacji, a jej częstość w ostatnich latach znacząco się zwiększa (9;78;98). Spowodowane jest to wzrostem ilości transplantacji niemieloablacyjnych, wzrostem częstości stosowania infuzji limfocytów dawcy (leczenie wznowy choroby zasadniczej, uzupełnienie terapii niemieloablacyjnej), zwiększeniem ilości HSCT wykonywanych od dawców alternatywnych (w pełni zgodnych lub niezgodnych w układzie HLA niespokrewnionych, oraz rodzinnych przeszczepów haploidentycznych) (104). Nie bez znaczenia pozostaje równieŝ coraz częstsze wykorzystanie jako źródła materiału przeszczepowego komórek progenitorowych hematopoezy pobranych z krwi obwodowej (Peripheral Blood Stem Cell 7

9 Transplantation - PBSCT), gdzie zwiększone ryzyko cgvhd zostało potwierdzone w wielu badaniach (26;27;36;46;47;53;95;124;129). cgvhd obok wznowy choroby zasadniczej jest obecnie główną przyczyna śmiertelności późnej u chorych poddanych allogenicznemu przeszczepieniu szpiku (powoduje 25% zgonów późnych u chorych poddanych HSCT z powodu ostrej białaczki i ok. 60% u chorych przeszczepionych z powodu anemii aplastycznej). Przyczyną śmierci w przebiegu cgvhd moŝe być niewydolność zajętego narządu, ale przede wszystkim powikłania infekcyjne spowodowane zarówno eskalacją leczenia immunosupresyjnego jak i występującymi w tej chorobie zaburzeniami rekonstytucji immunologicznej. Pojawiają się równieŝ doniesienia, Ŝe u chorych z cgvhd częściej obserwuje się nowotwory wtórne, będące efektem przewlekłego procesu zapalnego, terapii immunosupresyjnej i zaburzeń immunologicznych (43;44). Wreszcie konsekwencją zajęcia narządowego cgvhd jest znaczące pogorszenie jakości Ŝycia chorego lub nawet kalectwo (26;27;46;47;53;66;77;78;85;101;103;126;129;151). Z drugiej strony jednak u chorych, u których obserwuje się cgvhd rzadziej dochodzi do wznowy choroby zasadniczej, co jest spowodowane faktem, Ŝe efekt przeszczep przeciwko białaczce częściowo wynika z reakcji przeszczep przeciwko gospodarzowi (78;107;141). Tradycyjnie chorobę przewlekłą rozpoznaje się jeŝeli jej objawy występują powyŝej doby 100, jednak u niektórych chorych objawy charakterystyczne dla cgvhd pojawiają się znacznie wcześniej i to typ morfologiczny zmian wystąpienie objawów charakterystycznych dla choroby przewlekłej powinno być podstawą rozpoznania, a nie arbitralnie wprowadzony podział czasowy (52). Zwykle pierwsze objawy pojawiają się pomiędzy 3 24 miesiącem po przeszczepieniu (mediana 4-5 miesięcy), bardzo rzadko przed doba 80 a tylko u 5% powyŝej 12 miesięcy (66;151). Patogeneza cgvhd pozostaje nadal niewyjaśniona. Istotą procesu wydaje się defekt zarówno centralnych jak i obwodowych mechanizmów tolerancji, co prowadzi do ekspansji alloreaktywnych limfocytów T. Nowopowstające limfocyty T niszczą tkanki docelowe w bezpośrednim ataku cytolitycznym, poprzez wydzielanie cytokin zapalnych powodujących włóknienie narządów. U chorych z cgvhd obserwuje się zaburzenia prowadzące do przewagi komórek Th2 co manifestuje się podwyŝszonym poziomem cytokin jak IL4 czy IL5. Efektem tego jest aktywacja komórek B z produkcją autoprzeciwciał. Mimo Ŝe cgvhd przypomina nakładanie się w róŝnym stopniu chorób tkanki łącznej, w których główną rolę odgrywa obecność autoprzeciwciał, nie udało się do tej pory jednoznacznie udowodnić ich udziału w patogenezie tej choroby. Wykazano 8

10 natomiast, Ŝe wydzielane cytokiny stymulują fibroblasty do produkcji kolagenu i jego odkładania w tkankach, co jest jednym z patomorfologicznych wykładników choroby (49;66;77;103;151). Brak zrozumienia patofizjologii cgvhd jest niewątpliwie jednym z czynników uniemoŝliwiających znaczący postęp w leczeniu tej choroby. Tym bardziej istotne wydają się działania prowadzące do zmniejszenia ryzyka wystąpienia klinicznie istotnej choroby poprzez celowe unikanie modyfikowalnych czynników wpływających na rozwój tego powikłania. Do działań takich naleŝy dobór najbardziej optymalnego dawcy, pod względem płci i wieku, wybór materiału przeszczepowego czy ograniczenie ilości komórek CD3 w przetaczanym materiale (66;77;103).Tabela I Tabela I Czynniki ryzyka cgvhd Biorca Powszechnie uznane Dawca oraz charakterystyka przeszczepu Starszy wiek Dawca kobieta dla męŝczyzny agvhd CML Anemia aplastyczna Przeszczep niezgodny w układzie HLA Przeszczep od dawcy niespokrewnionego PBSCT Przypuszczalne (dyskusyjne) Biorca CMV (+) Reaktywacja zakaŝenia CMV Splenektomia Infuzja limfocytów dawcy DuŜa ilość komórek T w materiale przeszczepowym RóŜnice etniczne między dawcą i biorcą Rzadziej u chorych po przeszczepie z krwi pępowinowej Przebieg poprzeszczepowy Glikokortykosteroidy w profilaktyce agvhd DuŜa ilość komórek CD34 w materiale przeszczepowym (PBSCT) Brak metotreksatu w profilaktyce agvhd (PBSCT) Klinicznie cgvhd przebiega jako pleomorficzny zespół i moŝe dotyczyć praktycznie kaŝdego układu. Do najczęściej zajętych narządów naleŝą: skóra (dwie postacie: z obecnością zmian lichenoidalnych lub sclerodermii) 65-80%, jama ustna 48-72%, wątroba 40-73%, oczy 18-47%. Rzadziej zmiany dotyczą przewodu 9

11 pokarmowego / utraty masy ciała 16-26%, płuc 10-15%, przełyku 6-8% i stawów 2-12% (66) Klasyfikacja cgvhd Obecna klasyfikacja cgvhd obejmuje określenie typu rozwoju choroby w zaleŝności od wcześniejszego wystąpienia ostrej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi, ocenę rozległości pod kątem wskazań do terapii immunosupresyjnej oraz ryzyka niekorzystnego przebiegu choroby. U większości pacjentów rozwój choroby przewlekłej poprzedzony jest wystąpieniem ostrej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (acute Graft versus Host Disease agvhd). JeŜeli objawy ostrej choroby płynnie przechodzą w chorobę przewlekłą typ ten nazywamy postępującym (progressive), jeŝeli pojawienie się choroby przewlekłej oddzielone jest okresem ustąpienia objawów agvhd typ ten nazywamy wyciszonym (quiscent lub interrrupted). Natomiast wystąpienie cgvhd bez poprzedzenia chorobą ostrą - de novo. Według IBMTR (International Bone Marrow Transplant Registry) typ postępujący stanowi 20-30%, wyciszony 30-40%, a de novo 35% cgvhd u chorych poddanych transplantacji od HLA zgodnego rodzeństwa (66) Określenia typu rozwoju choroby ma ogromne znaczenie prognostyczne. W najgorzej rokującym typie o rozwoju postępującym wg niektórych autorów śmiertelność moŝe sięgać nawet 50-60% i typ ten wyodrębnia grupę chorych wymagających szczególnie intensywnej terapii immunosupresyjnej (85). Pierwotna klasyfikacja Seattle definiująca rozległość w oparciu o podział choroby na postać ograniczoną lub rozległą ustalona została w latach 80-tych na podstawie badania histopatologicznego narządów 20 pacjentów (120). Ograniczone zajęcie skóry lub/i łagodne zajęcie wątroby zostało określone jako choroba ograniczona niewymagająca systemowego leczenia immunosupresyjnego. Natomiast uogólnione zmiany skórne lub zajęcie innych narządów oraz dysfunkcja wątroby było traktowane jako postać rozległa, wymagająca terapii systemowej. Obecnie obowiązująca, zmodyfikowana klasyfikacja w bardziej precyzyjny sposób określa stopień rozległości, wprowadzając między innymi ścisłe kryteria ilościowe rozpoznania (79) (Tabela II.) Minusem tej klasyfikacji pozostaje jej niskie znaczenie prognostyczne. 10

12 Tabela II Oryginalna i zmodyfikowana klasyfikacja cgvhd Oryginalna klasyfikacja Seattle (Shulman et al.,1980) Postać ograniczona 1. ograniczone zajęcie skóry 2.dysfunkcja wątroby spowodowana cgvhd Zmodyfikowana klasyfikacja Seattle (Lee et al., 2003) 1. Zmiany na śluzówkach jamy ustnej w przebiegu cgvhd, dodatnia biopsja skóry lub wargi bez innych objawów cgvhd 2. Zwiększona aktywność fosfatazy alkalicznej (FALK 2xnorma, AST, ALT 3xnorma, bilirubina całkowita 27,3µmol/l) z dodatnią biopsją skóry lub wargi bez innych objawów cgvhd 3. Niewielkie zmiany skórne: mniej niŝ 6 zmian grudkowo - łuskowych, rumień <20%powierzchni ciała (BSA), lub rumień <50% BSA, dodatnia biopsja skóry bez innych objawów cgvhd 4. Dodatni test Schirmera 5 mm bez innych zmian w narządzie wzroku, dodatnia biopsja skóry lub wargi bez innych objawów cgvhd 5. Zmiany w narządach płciowych potwierdzone biopsją bez innych objawów cgvhd Postać rozległa 1. uogólnione zajęcie skóry 2. Ograniczone zmiany skórne lub dysfunkcja wątroby w przebiegu cgvhd plus: a. w biopsji przewlekłe postępujęce zapalenie wątroby, martwica mostowa, marskość wątroby b. zmiany oczne (dodatni test Schirmera 5 mm) lub c. potwierdzone biopsją zmiany śluzówek jamy ustnej lub gruczołów ślinowych d. zajęcie jakiegokolwiek innego organu 1. Zajęcie 2 lub więcej narządów w przebiegu cgvhd, potwierdzone biopsją jednego z nich 2. Karnofsky<60%, utrata masy ciała 15%, nawracające infekcje bez innej przyczyny, potwierdzona biopsją cgvhd w jakimkolwiek innym narządzie 3. Potwierdzone biopsją zajęcie skóry o powierzchni większej niŝ w postaci ograniczonej 4. Twardzina 5. Onycholysis(oddzielanie się łoŝyska od paznokcia) lub onychodystrofia, potwierdzona biopsją cgvhd w jakimkolwiek narządzie 6. Zapalenie obturacyjne oskrzelików nie spowodowane inną przyczyną 7. Dodatnia biopsja wątroby lub (FALK) >2xnorma, AST, ALT > 3xnorma, bilirubina całkowita > 27,3µmol/l) z potwierdzeniem cgvhd w innym narządzie 8. Potwierdzone biopsją zmiany górnego lub dolnego odcinaka przewodu pokarmowego 9. Zapalenie powięzi lub błon surowiczych bez innej przyczyny; Przykurcze spowodowane przez cgvhd 11

13 W ostatnim okresie czasu coraz większe znaczenie w ocenie cgvhd mają róŝne modele prognostyczne oparte na obecności niekorzystnych klinicznych czynników ryzyka. Do potwierdzanych przez wszystkich badaczy złych czynników prognostycznych naleŝy zajęcie skóry, poziom płytek krwi poniŝej 100G/l i typ postępujący (2;66;85). Niektórzy autorzy zaliczają do tych czynników równieŝ zajęcie przewodu pokarmowego i niski wskaźnik oceny stanu ogólnego (Karnofsky). Jeden z częściej proponowanych modeli prognostycznych stworzony przez grupę z Baltimore przedstawia Tabela III (2). Tabela III Najczęściej stosowany model prognostyczny dla chorych z cgvhd Grupa ryzyka Niskie Umiarkowane Wysokie Bardzo wysokie Kryteria Bez czynników ryzyka 1 czynnik ryzyka 2 czynniki ryzyka 3 czynniki ryzyka Czynnik ryzyka: A Zajęcie >50% powierzchni skóry B poziom płytek krwi <100G/l C postępujący typ choroby Mimo wprowadzonych zmian w klasyfikacji i w ocenie zaawansowania cgvhd nadal podkreśla się ich ograniczenia. Chorzy z rozpoznaną postacią rozległa choroby stanowią bardzo heterogenną grupę, co w duŝej mierze utrudnia ocenę skuteczności leczenia i rokowania. Próby wprowadzenia podziału choroby rozległej na łagodną, umiarkowaną i cięŝką nie zyskały powszechnego uznania, ze względu na duŝy subiektywizm oceny wynikający z doświadczeń ośrodka i braku jednoznacznych kryteriów oceny. W ostatnim czasie wysunięto propozycję standaryzacji kryteriów rozpoznania oraz oceny zaawansowania cgvhd, poprzez wprowadzenie systemu oceny kaŝdego zajętego narządu punktacją od 0-3 (oceny cięŝkości oraz zaburzenia funkcji narządu)(52). 12

14 1.2.2 Leczenie cgvhd Podstawą włączenia systemowej terapii immunosupresyjnej jest rozpoznanie rozległej cgvhd. Najskuteczniejszym lekiem jest prednizon stosowany w dawce początkowej 1mg/kg masy ciała. Nie ma jednoznacznych opinii oceniających rolę inhibitorów kalcineuryny (cyklosporyna, tacrolimus) w leczeniu cgvhd. Większość badaczy uznaje, Ŝe w przypadku braku przeciwwskazań, inhibitory kalcineuryny powinny być podawane u chorych z nowo rozpoznaną cgvhd, aby zmniejszyć dawkę sterydów niezbędnych do kontroli objawów choroby. JeŜeli cgvhd zostanie rozpoznana w trakcie podawania cyklosporyny utrzymuje się podawanie tego leku po wprowadzeniu prednizonu. U chorych, u których objawy cgvhd pojawiają się w okresie, kiedy chory nie otrzymuje juŝ inhibitorów kalcineuryny moŝe być podejmowana próba monoterapii cyklosporyną po rozwaŝeniu czynników ryzyka cgvhd, jej rozległości oraz typu zmian narządowych (32;68;76;85;131;152). Większość chorych wymaga leczenia immunosupresyjnego przez okres 1 3 lat. Progresja cgvhd wyraŝająca się nasileniem objawów, zajęciem nowego narządu, lub niemoŝnością rozpoczęcia redukcji dawki prednizonu w ciągu 2 miesięcy od rozpoczęcia leczenia jest wskazaniem do wdroŝenia terapii drugiego rzutu. Nie ma obecnie schematu, który moŝna rekomendować jako standard leczenia drugorzutowego przy stwierdzeniu sterydooporności. Najbardziej korzystne wydaje się stosowanie mykofenolatu mofetilu, szczególnie w postaci wątrobowej cgvhd (23;24;30;94). Mniejsze znaczenie ze względu na nasilone działania niepoŝądane ma rapamycyna i talidomid (45;103). Zmiany skórne moŝna skutecznie leczyć fotochemioterapią (doustny 8- metoksy-psoralen z następowym promieniowaniem ultrafioletowym A ang.: psoralen plus ultraviolet irradiation PUVA) lub pozaustrojową fotochemioterapią (extracoporeal photochemotherapy ECP) która wykazuje równieŝ skuteczność w przypadku zajęcia wątroby (118). Z innych stosowanych sporadycznie metod naleŝy wymienić napromienianie węzłów chłonnych, stosowanie Rituximabu, Etanerceptu rozpuszczalnego receptora TNF-α i pentostatyny (77;103). Ze względu na zwiększone ryzyko powikłań infekcyjnych zalecane jest równoczesne stosowanie profilaktyki infekcji oportunistycznych (85;152). 13

15 1.3 Chimeryzm hematopoetyczny Allogeniczna transplantacja szpiku prowadzi do powstania w organizmie biorcy zjawiska zwanego chimeryzmem hematopoetycznym. Słowo chimeryzm wywodzi się od greckiego słowa chimera, którym w mitologii greckiej był stwór będący połączeniem lwa, kozy i węŝa (134). W transplantologii pojęcie to jest stosowane zarówno do określenia faktu, Ŝe komórki hematopoezy jak i pozostałe komórki somatyczne róŝnią się materiałem genetycznym jak i do określenia zjawiska występowania komórek o róŝnym genotypie w obrębie samej hematopoezy. ZaleŜności te stały się podstawą do wyodrębnienia pełnego chimeryzmu (Complete Chimerism CC), charakteryzującego się obecnością w obrębie hemopoezy jedynie komórek o genotypie dawcy oraz mieszanego chimeryzmu (Mixed Chimerism MC), który oznacza obecność zarówno komórek o genotypie dawcy jak i biorcy (7;75;134). Jako warunki uzyskania CC wymienia się zniszczenie hematopoezy biorcy przez zastosowanie chemio- lub radioterapii w trakcie postępowania przygotowawczego przed przeszczepem (mieloablacja) oraz reakcje immunologiczne zachodzące po uzyskaniu wszczepienia między komórkami dawcy a przetrwałymi komórkami biorcy, w tym równieŝ nowotworowymi (GvL). Zmiany wymienionych warunków np. poprzez zastosowanie materiału przeszczepowego po deplecji limfocytów T lub zmniejszenie dawki chemioterapii, jak ma to miejsce w transplantacjach o zredukowanym kondycjonowaniu, sprzyja przetrwaniu hematopoezy biorcy, a więc mieszanego chimeryzmu (7;17;89;110;111;113;114;133) Metody określania i monitorowania chimeryzmu hematopoetycznego Ocena chimeryzmu po allogenicznej transplantacji moŝliwa jest dzięki występowaniu w populacji zjawiska polimorfizmu. PoniewaŜ wszystkie odmiany polimorfizmu są wynikiem róŝnic w sekwencji DNA, mogą być one wykrywane metodami biologii molekularnej. Istnieje równieŝ moŝliwość identyfikacji produktów polimorficznych genów np. dziedzicznych wariantów enzymów lub antygenów. 14

16 PoniŜej przedstawiono moŝliwości oceny chimeryzmu na podstawie metod wykrywania polimorfizmu (55): 1. Identyfikacja przez bezpośrednie wykrycie sekwencji DNA a. polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych /RFLP Restriction Fragment Length Polimorfizm/ - warianty sekwencji DNA które polegają na braku lub obecności miejsc rozpoznawanych przez endonukleazy restrykcyjne b. Powtórzenia DNA - VNTR (mikro i minisatelitarne DNA) c. sekwencje charakterystyczne dla chromosomu Y 2. Wykorzystanie heteromorfizmu chromosomów a. badaniem cytogenetycznym rozróŝnienie chromosomów pochodzących od dawcy czy biorcy na podstawie: - róŝnic w budowie chromosomów np. zmienność wielkości heterochromatyny centromerowej czy zmienność wielkości i struktury satelitów - chromosomów płci - aberracji chromosomowych zarówno u dawcy jak i biorcy b. FISH /Fluorescence In Situ Hybridization/ - uŝycie sond specyficznych dla chromosomów płci - aberracje chromosomowe związane z chorobą podstawową np. bcr/abl 3. Identyfikacja produktów polimorficznych genów a. antygeny grupowe krwi oraz izoaglutyniny b. dziedziczne warianty enzymów czerwonokrwinkowych np. warianty elektroforetyczne kwaśnej fosfatazy, dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej, fosfoglukomutazy czy glioksalazy I c. immunoglobuliny d. antygeny HLA Początkowo oceniano chimeryzm hematopoetyczny opierając się na analizie specyficznych antygenów erytrocytarnych lub elektroforetycznie, analizując polimorfizm enzymów erytrocytów i leukocytów. Długa Ŝywotność erytrocytów, konieczność transfuzji masy erytrocytarnej, oraz niska czułość tych metod nie pozwalała jednak na 15

17 precyzyjną ocenę (17;134). Badanie antygenów HLA mogło mieć zastosowanie jedynie w przypadku przeszczepu niezgodnego w układzie HLA. Inne metody jak badanie izotypów immunoglobulinowych i konwencjonalna cytogenetyka cechują się stosunkowo niską czułością i ograniczonym stopniem polimorfizmu (72;75;134). Dość istotnym przełomem w ocenie chimeryzmu było wprowadzenie techniki fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ. W metodzie tej za pomocą odpowiednich sond molekularnych wykrywa się charakterystyczne dla choroby aberracje cytogenetyczne lub chromosom Y. Zaletą tej metody jest dość wysoka czułość, oraz moŝliwość oceny ilościowej Jej głównym ograniczeniem jest moŝliwość stosowania jedynie u chorych, u których między dawcą a biorcą występuje róŝnica płci lub jeŝeli u dawcy lub biorcy występuje znana wcześniej aberracja cytogenetyczna względem której występuje odpowiednia sonda (60;99). Obecnie największe zastosowanie w monitorowaniu chimeryzmu mają metody oparte na analizie minisatelitarnych i mikrosatelitarnych fragmentów DNA poddanych amplifikacji w procesie PCR (Polymerase Chain Reaction - PCR) (35;75;117;137;153). Około 20 % genomu człowieka stanowią sekwencje powtarzające się (zmienna liczba tandemowych powtórzeń - Variable Number of Tandem Repeats - VNTR). WyróŜnia się dwa główne rodzaje VNTR: sekwencje minisatelitarne, których powtarzający się fragment zawiera zwykle 7-50 nukleotydów oraz sekwencje mikrosatelitarne. Sekwencje mikrosatelitarne (Short Tandem Repeats - STR) to polimorficzne loci, zawierające sekwencje nukleotydowe (zazwyczaj powtórzeń motywu, na który składa się od 1-6 nukleotydów w danym locus). Do najczęściej występujących naleŝą powtórzenia mono-, di-, tri- i pentanukleotydowe. Wysoki polimorfizm tych sekwencji sprawił, Ŝe ich analiza została uznana za jedną z najbardziej uŝytecznych technik w badaniu zjawiska chimeryzmu komórkowego po HSCT (1;135). Produkt PCR moŝe być rozdzielony na Ŝelu agarozowym, hybrydyzowany z radioaktywnymi sondami uwidacznianymi następnie przez autoradiografię. Obecnie metoda oparta na wykorzystaniu znaczników fluorescencyjnych zdominowała wcześniejsze sposoby. Wyznakowane fluorescencyjnie produkty reakcji PCR analizowane są w automatycznym sekwenatorze DNA, przy zastosowaniu systemu opartego na elektroforezie kapilarnej (139). Metoda fluorescencyjnej PCR jest nie tylko bardziej czuła, ale pozwala takŝe na półilościowe monitorowanie dynamiki zmian chimeryzmu mieszanego, co jest kluczowym warunkiem wykorzystania chimeryzmu do oceny zagroŝenia wznową czy odrzuceniem przeszczepu (117;136). Zaletą tej metody jest równieŝ moŝliwość jednoczesnej analizy kilku loci mikrosatelitarnych dzięki 16

18 wykorzystaniu starterów wyznakowanych róŝnymi fluorochromami (kompleksowa reakcja PCR - multiplex PCR). Równoczesna amplifikacja wielu loci umoŝliwia w krótkim czasie zróŝnicowanie DNA biorcy i dawcy równieŝ u tych chorych, u których powszechnie stosowane w identyfikacji układy VNTR są identyczne. Zaletą tego zestawu jest równieŝ małą ilość DNA konieczna do analizy (1-2ng/20µl mieszaniny reakcyjnej). Limit detekcyjny tego zestawu wynosi 1% - 3% dla komponenty znajdującej się w próbce w mniejszości. Metoda ta jest wystandaryzowana, oraz cechuje się wysoką powtarzalnością, co umoŝliwia porównywanie wyników uzyskiwanych w róŝnych ośrodkach (134). Obecnie metoda ta została uznana jako najbardziej wartościowa dla oceny chimeryzmu hematopoetycznego i powinna być uŝywana standardowo (14;35;66;72;77;82;91;103;151). Ogromny postęp w ocenie chimeryzmu wynika nie tylko z wprowadzania nowych metod oceny DNA. W ostatnich latach nowe moŝliwości w diagnostyce u chorych poddanych HSCT wniosła ocena chimeryzmu w poszczególnych populacjach, zarówno krwi szpikowej jak i obwodowej. ChociaŜ pierwsze próby takiej oceny przeprowadzono juŝ w latach 70tych, dopiero rozwój metod umoŝliwiających pozyskanie odpowiedniej ilości materiału do badań, takich jak cytometria przepływowa czy izolacja immunomagnetyczna, a takŝe wprowadzenie techniki PCR ułatwiającej analizę nawet niewielkich ilości DNA, spowodowały wykorzystanie tych oznaczeń na szerszą skalę (59;143). Ocena chimeryzmu w populacjach z wykorzystaniem STR PCR zwiększa czułość metody nawet do 0,1 0,0001%. Wykrycie obecności DNA biorcy w populacji komórek posiadających na swojej powierzchni antygeny charakterystyczne dla rozpoznanej przed transplantacją choroby nowotworowej stało się jedną z najczulszych metod detekcji choroby resztkowej (Minimal Residual Disease - MRD). Ocena chimeryzmu w populacji limfocytów T umoŝliwia identyfikację chorych zagroŝonych odrzuceniem przeszczepu lub w przypadku transplantacji niemieloablacyjnych jest istotną informacją w ocenie wskazań do stosowania DLI (10;38;71;86;87). Ocena chimeryzmu w poszczególnych populacjach komórek nie jest jednak badaniem przeprowadzonym rutynowo, ze względu na czasochłonność, wysokie koszty a takŝe konieczność odpowiedniego wyposaŝenia laboratorium, moŝe być przeprowadzana jedynie w wybranej grupie chorych. 17

19 1.3.2 Kliniczne znaczenie chimeryzmu Ocena chimeryzmu hematopoetycznego u chorych poddanych allogenicznej transplantacji jest obecnie rutynowo wykorzystywanym badaniem diagnostycznym. UmoŜliwia ona potwierdzenie przyjęcia się przeszczepionych komórek w organizmie biorcy, a monitorowanie w regularnych odstępach czasowych umoŝliwia wczesne wykrycie odrzucania przeszczepu. Ocena chimeryzmu jest równieŝ najwaŝniejszym kryterium w ocenie wskazań do wykonania infuzji limfocytów dawcy u chorych poddanych transplantacji o zredukowanym kondycjonowaniu (14). Kolejnym waŝnym aspektem jest wykorzystanie oceny chimeryzmu w prognozowaniu wznowy choroby zasadniczej (11-13). Monitorując chimeryzm hematopoetyczny wyodrębniono dwie zasadnicze grupy chorych. Pierwsza, u której poprzez zanik własnej hematopoezy dochodzi do wytworzenia CC, oraz drugą z utrzymującym się przewlekle MC. Mimo dotychczasowych badań i obserwacji duŝych grup chorych po transplantacji szpiku nie ma jednoznacznej opinii, czy utrzymujący się długotrwale MC ma wpływ na powodzenie terapii, poprzez zwiększenie ryzyka wznowy. Publikowane w piśmiennictwie doniesienia róŝnią się skrajnie: od opinii, Ŝe w grupie chorych z MC ryzyko wznowy choroby jest istotnie większe, po stwierdzenie, Ŝe MC nie ma znaczenia w ocenie zagroŝenia wznową (11;12;57;67;69;72;113;142;143). Jednym z moŝliwych tłumaczeń jest fakt, Ŝe wykrywana, przetrwała hematopoeza biorcy moŝe mieć zarówno cechy hematopoezy prawidłowej jak i resztkowej, nowotworowej. Ostatnio pojawiły się pojedyncze doniesienia, Ŝe MC moŝe dotyczyć jedynie określonej populacji komórek hematopoezy. Wykrycie MC jedynie w populacji, z której wywodzi się klon nowotworowy moŝe być czasami jedyną wskazówką dotyczącą obecności choroby resztkowej, a mechanizm wznowy wydaje się być w tym przypadku stosunkowo jasny (87). Brak jest natomiast danych, jaką rolę moŝe odgrywać obecność jedynie wybranych populacji prawidłowej hematopoezy. Przetrwanie komórek biorcy moŝe wiązać się z wytworzeniem stanu tolerancji immunologicznej, co znajduje potwierdzenie w klinicznych obserwacjach, bowiem cięŝka postać GvHD rzadko dotyczy chorych z MC (132). Obserwacje te nie tłumaczą jednak występowania wznowy u chorych z utrzymującym się CC. Kluczowe znaczenie moŝe odgrywać metoda stosowana do oznaczenia chimeryzmu: na podstawie własnych doświadczeń wykazano, Ŝe znaczny odsetek chorych, u których metoda tradycyjną (elektroforezy na 18

20 Ŝelu) stwierdzono CC, wykazuje MC w badaniach metodą elektroforezy kapilarnej ze znakowaniem starterów barwnikiem fluorescencyjnym. Kolejnym aspektem w wykorzystaniu oceny chimeryzmu moŝe być jego znaczenie w ocenie ryzyka jednego z najwaŝniejszych powikłań immunologicznych chorobie przeszczep przeciwko gospodarzowi. Oprócz nielicznych doniesień potwierdzających rzadsze występowanie cgvhd u chorych z przetrwałym MC, w ostatnim czasie pojawiły się pojedyncze prace, w których sugeruje się, Ŝe szybkie osiągnięcie CC u chorych poddanych niemieloablacyjnemu przeszczepowi szpiku towarzyszy zwiększone ryzyko cgvhd. Nie ma natomiast doniesień potwierdzających te obserwacje w odniesieniu do chorych poddanych transplantacji mieloablacyjnej. 19

21 2 ZAŁOśENIA I CEL PRACY Celem podjętych badań było: 1. Określenie i monitorowanie rodzaju chimeryzmu hematopoetycznego w komórkach jądrzastych oraz w poszczególnych populacjach leukocytów krwi obwodowej u chorych poddanych allogenicznej transplantacji komórek progenitorowych hematopoezy od dawcy rodzinnego w pełni zgodnego w układzie HLA. 2. Określenie czy istnieje korelacja między rodzajem chimeryzmu stwierdzonym we krwi obwodowej lub poszczególnych populacjach leukocytów a wystąpieniem powikłań późnych: przewlekłej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi oraz wznowy choroby zasadniczej. 20

22 3 MATERIAŁ I METODY Badania chimeryzmu przeprowadzono u 54 chorych poddanych allogenicznej transplantacji szpiku od dawcy rodzinnego, w pełni zgodnego w układzie HLA. Transplantację u wszystkich chorych wykonano w Klinice Hematologii AMG między wrześniem 1999 a sierpniem Z oceny wyłączono chorych po allogenicznym przeszczepie od dawcy spokrewnionego, którzy otrzymali kondycjonowanie niemieloablacyjne, przeszczepianych wielokrotnie, oraz tych, którzy zmarli z powodu powikłań wczesnych przed 100 dobą po przeszczepie (u 6 chorych zgon przed uzyskaniem wszczepienia chimeryzm nie został oceniony, u 2 chorych chimeryzm oceniony w 30 dobie - MC). 3.1 Badani chorzy Wszyscy chorzy otrzymali kondycjonowanie mieloablacyjne. U 46 chorych źródłem materiału przeszczepowego były komórki progenitorowe krwi obwodowej (Peripheral Blood Stem Cell - PBSC), u 8 krew szpikowa (Bone Marrow BM). Pacjenci z ostrą białaczką limfoblastyczną oraz 1 chory z ostrą białaczką szpikową - AML (transformacja zespołu mielodysplastycznego MDS) otrzymali jako kondycjonowanie naświetlenie całego ciała (Total Body Irradiation TBI) w dawce 12Gy (w 6 frakcjach) oraz cyklofosfamid w łącznej dawce 120mg/kg masy ciała Pozostali chorzy otrzymali kondycjonowanie wg schematu Bu/Cy 120 (busulfan podawany doustnie w łącznej dawce 16mg/kg masy ciała oraz cyklofosfamid podawany doŝylnie w łącznej dawce 120mg/kg masy ciała; u chorych których waga odbiega o ponad 25% od tzw. idealnej masy ciała, leki dawkowano wg tzw. idealnej dostosowanej masy ciała)(8;62). Wszyscy dawcy komórek progenitorowych byli mobilizowani granulocytarnym czynnikiem wzrostu G-CSF w dawce 10µg/kg masy ciała /dobę. Kolekcję komórek progenitorowych za pomocą separatora Baxter Fenwall CS 3000 plus wykonywano w 12 godzin po 4 i 5 dawce G-CSF. Krew szpikową pobierano w warunkach sali operacyjnej w znieczuleniu ogólnym. Pacjenci poddani PBSCT otrzymali 6,3x10 6 CD34+ komórek / kg masy ciała (mediana); zakres 2,8-8,6 komórek / kg masy ciała. Natomiast biorcy krwi szpikowej otrzymali 21

23 3,2x10 6 CD34+ komórek / kg masy ciała (mediana) zakres 1,1-5,2 komórek / kg masy ciała. Charakterystykę dawców i biorców przedstawia Tabela IV. Wszyscy chorzy otrzymywali profilaktykę choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi zgodnie z protokołem Seattle (109;127) (CsA/Mtx). Cyklosporynę A (CsA) początkowo stosowano w dawce 3mg/kg masy ciała na dobę doŝylnie, następnie 5 mg/kg masy ciała doustnie; do doby 100 po przeszczepie dawki cyklosporyny były modyfikowane tak, aby stęŝenie leku we krwi pełnej wynosiło co najmniej µg/l. JeŜeli chory nie miał cgvhd od doby 101 do 180 stopniowo odstawiano lek. Metotreksat (Mtx) podawano doŝylnie w dniach: 1 (15mg/m 2 powierzchni ciała), 3, 6 i 11 po przeszczepie 1 (10mg/m 2 powierzchni ciała). Wszyscy chorzy spełnili kryteria wszczepienia, określone jako wzrost bezwzględnej liczby neutrocytów >0,5G/l, przed dobą 30 po przeszczepie (mediana 17 dni zakres 10-29). Tabela IV Charakterystyka dawców i biorców Charakterystyka dawców i biorców Wiek w dniu transplantacji, mediana (zakres) Pacjenci 37 (18-53) Dawcy 36 (10-67) Płeć biorca/dawca kobieta/męŝczyzna 14 męŝczyzna / męŝczyzna 18 męŝczyzna / kobieta 11 kobieta / kobieta 11 Choroba zasadnicza AML* 18 ALL* 6 CML* 25 MDS* 3 Inne (CEL, PNH) 2 AML (Acute Myeloid Leukemia) - ostra białaczka szpikowa, ALL (Acute Lymphoblastic leukemia) - ostra białaczka limfoblastyczna, CML (Chronic Myeloid Leukemia) przewlekła białaczka szpikowa, MDS (Myelodysplastic Syndrome) zespól mielodysplastyczny. CEL (Chronic Eosinophilic Leukemia) - białaczka eozynofilowa, PNH (Paroxysmal Nocurnal Hemoglobinuria) - nocna napadowa hemoglobinuria Jako cezurę powikłań późnych przyjęto wg ogólnie uznanych kryteriów dobę

24 3.1.1 Choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi Ocenę ostrej oraz przewlekłej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi dokonywano zgodnie z kryteriami Seattle (Tabela II, Tabela V) (79;102;120). Tabela V Stopniowanie ostrej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi Stopień Skóra Wątroba Jelito + Rumień<25% powierzchni ciała Bilirubina 2-3 mg/dl Biegunka, ml/dobę lub nudności * ++ Rumień % powierzchni ciała Bilirubina 3-6 mg/dl Biegunka, ml/dobę +++ Uogólniona erytrodermia Bilirubina 6-15 mg/dl Biegunka >1500 ml/dobę ++++ Złuszczanie lub pęcherze Bilirubina >15 mg/dl Ból +/- niedroŝność *Rozpoznanie agvhd na podstawie utrzymujących się nudności wymaga potwierdzenia biopsją Ŝołądka lub dwunastnicy Stage Skóra Wątroba Jelito Zaburzenia funkcji I + do II + do III ++ do do do IV ++ do do do

25 3.2 Metody badań Izolacja leukocytów krwi obwodowej Izolację populacji leukocytów krwi obwodowej wykonywano w Pracowni Cytometru Przepływowego Kliniki Hematologii AMG przy uŝyciu cytometru przepływowego wyposaŝonego w przystawkę sortującą oraz koncentrator komórkowy (FACS - Calibur; Becton Dickinson). Znakowanie CD66b oraz sortowanie granulocytów przeprowadzano z krwi pełnej. W celu zwiększenia czystości oraz odzysku barwienie oraz sortowanie monocytów i poszczególnych populacji limfocytów wykonywano na jednojądrzastych komórkach krwi obwodowej. Izolacja jednojądrzastych komórek krwi obwodowej - (Peripheral Blood Mononuclear Cell - PBMC) Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej uzyskiwano drogą wirowania pobranej krwi Ŝylnej w gradiencie stęŝeń, przy uŝyciu Histopaq 1077 (Sigma). Krew pobraną na EDTA rozcieńczano w płynie CellWash w stosunku 1:1, następnie nawarstwiano na taką samą ilość Histopaq 1077 i wirowano przez 15 minut (RCF 1000). Po odwirowaniu uzyskiwano widoczne rozdzielenie faz z wyraźnie zaznaczonym pierścieniem komórek jednojądrzastych, które przenoszono do innej probówki. Po dwukrotnym płukaniu komórki zawieszano w roztworze CellWash. Sortowanie w cytometrze przepływowym W osobnych próbówkach 200 µl PBMC inkubowano z 20µl monoklonalnego przeciwciała anty CD3 sprzęŝonego z FITC, anty CD19 sprzęŝonego z PE, antycd3/cd16/cd56 FITC/PE, anty CD14 FITC (Tabela VI). Wszystkie przeciwciała pochodziły z firmy Becton Dickinson San Jose, CA, USA,. Dla kaŝdej próbki stosowano kontrolę izotypową γ1/γ2a. Komórki inkubowano przez 30 minut w ciemni, a następnie płukano w płynie CellWash. 24

26 Tabela VI Charakterystyka przeciwciał uŝytych w badaniu Przeciwciało Klon Pochodzenie Podklasa Immunoglobulin γ1/γ2a X39/X40 mysie IgG1 CD3 SK7 mysie IgG1,κ CD14 M5E2 mysie IgG2a, κ CD 19 4G7 mysie IgG1,κ CD3/CD16CD56 SK7/B73.1/MY31 mysie IgG1,κ CD66b G10F5 mysie IgG1, κ Znakowanie granulocytów: do 100 µl krwi pełnej dodawano 2 ml roztworu lizującego erytrocyty (FACS lysing solution, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA), po 10 min inkubacji próbki odwirowywano (5 minut, RCF 1000) i dodawano 2ml roztworu CellWash. Procedurę płukania powtarzano, odwirowany i odsączony osad komórek zawieszano w 200µl CellWash a następnie dodawano 20µl przeciwciała monoklonalnego CD66b FITC. Komórki inkubowano przez 30 minut a następnie powtarzano procedurę płukania w CellWash. Do analizy cytometrycznej komórki zawieszano w CellWash tak, aby uzyskać stęŝenie 2x10 5 /leukocytów. Tak przygotowane próbki poddawano dalszym procedurom. Sortowaną populację wyznaczano na podstawie dodatniego sygnału fluorescencji, powyŝej fluorescencji kontroli izotypowej, w odpowiedniej bramce: limfocytarnej dla komórek CD3, CD16/CD56 oraz CD19, monocytarnej dla komórek CD14, oraz granulocytarnej dla komórek CD66b. W celu uzyskania jak największej czystości uzyskanej populacji wszystkie komórki sortowano w trybie pojedynczej komórki (ang. mode single cell ), co znaczy Ŝe komórki sortowane były tylko w takiej sytuacji, gdy w strumieniu znajdowały się pojedynczo rozdzielone komórki Ŝądane. KaŜdorazowo sortowano 50 tysięcy komórek. Komórki zostały zatrzymywane na jałowym filtrze komórkowym koncentratora. PoniewaŜ limfocyty B stanowią poniŝej 1% populacji leukocytów aŝ do doby 180 nie udało uzyskać odpowiedniej ilości tej populacji do dalszych analiz. 25

27 KaŜdorazowo czystość uzyskanej populacji sprawdzano w cytometrze przepływowym. Analizie DNA poddawano próbki o czystości powyŝej 97% Ocena chimeryzmu Badania wykonywano w Pracowni Genetyki Sądowej Zakładu Medycyny Sądowej AMG (Kierownik Prof. R. Pawłowski). Chimeryzm oceniano w 30, 60, 100 i 180 dobie po przeszczepie, a następnie co 3 miesiące. Mediana okresu obserwacji wynosiła 32 miesiące (zakres 24-70). Izolacja DNA z krwi. Ekstrakcję DNA przeprowadzono z wykorzystaniem gotowego zestawu Blood DNA Prep Plus (A@A Biotechnology, Gdańsk). Do 100 µl świeŝej lub mroŝonej krwi dodawano 200 µl uniwersalnego buforu lizującego LT i 20µl proteinazy K (stęŝenie 20mg/ml). Całość mieszano i inkubowano w łaźni wodnej w temperaturze 37 C przez minimum 20 minut. Następnie próbkę intensywnie worteksowano przez 20s i nanoszono na minikolumnę do oczyszczania genomowego DNA. Po odwirowaniu (1min przy RPM) minikolumnę wraz z probówką wyjmowano i dodawano 500 µl roztworu płuczącego A1. Próbkę ponownie wirowano (1min przy RPM) Następnie minikolumnę przenoszono do nowej probówki 2ml i nanoszono na nią 400µl roztworu płuczącego A1. Próbkę wirowano przez 2 minuty przy 10-15tys RPM. Osuszoną minikolumnę umieszczano w nowej probówce 1,5ml i dodawano do niej 90µl buforu TRIS.HCl o ph 8.5. Próbkę inkubowano przez 5min w temperaturze pokojowej, po czym wirowano przez 1minutę przy tys RPM. Po usunięciu minikolumny oczyszczone DNA poddawano dalszym analizom. Izolacja DNA z filtra komórkowego Filtr z wysortowanymi populacjami leukocytów umieszczano w probówce i dodawano kolejno: 100 µl buforu Tris 200 µl uniwersalnego roztworu lizującego LT 20 µl Proteinazy K (20mg/ml) 26

28 Całość mieszano i inkubowano w temperaturze 37 C do czasu całkowitego wypłukania materiału biologicznego z podłoŝa (zwykle 2-3 godziny). Po inkubacji próbkę intensywnie worteksowano przez 20 s, a następnie wirowano przez 3 minuty, przy tys. RPM, celem oddzielenia roztworu od podłoŝa. Supernatant nanoszono na minikolumnę do oczyszczania DNA. Dalsza procedura przebiegała podobnie jak podczas izolacji DNA z krwi. StęŜenie DNA oznaczano metodą fluorymetryczną. Otrzymane próbki DNA poddawano amplifikacji metodą multiplex PCR uŝywając komercyjnie dostępnego zestawu Profiler Plus firmy Perkin Elmer (PE), zawierającego 9 loci typu STR (D3S1358, VWA, FGA, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317 i D7S820) i marker płci w postaci locus amelogeniny. Amplifikację DNA przeprowadzono zgodnie z warunkami podanymi przez producenta wykorzystując w tym celu termocykler 2400 firmy Perkin Elmer, USA. Do amplifikacji w przypadku kaŝdej próby uŝywano optymalnego stęŝenia DNA tj. 1,25ng/25 µl mieszaniny PCR. Wielkość produktów PCR znakowanych fluorescencyjnie analizowano metodą elektroforezy kapilarnej przy zastosowaniu automatycznego sekwenatora DNA ABI310 (Perkin Elmer, USA). Produkty rozdzielano w kapilarze o długości 47cm wypełnionej denaturującym nośnikiem POP4. Rozdział prowadzono przez 24min. Przy 15kV (constans), 9mW i ok. 8mA. Standardem wewnętrznym wielkości DNA był marker ILS 400 znakowany CXR (Promega, USA). Analizę wielkości fragmentów DNA przeprowadzono posługując się tzw. drabiną alleli zawierającą zsekwencjonowane allele wszystkich loci występujących w zestawie. Po ustaleniu profilu genetycznego z krwi pobranej przed przeszczepem dla kaŝdej pary dawca - biorca, określano locus lub loci, w których dla dawcy i biorcy określono róŝne allele. Najbardziej optymalnym było ustalenie takiego lotus, w którym zarówno dawca jak i biorca byli róŝnymi od siebie heterozygotami i Ŝaden z badanych alleli nie występował w pozycji stuttera (n-4) względem kolejnego. W takim przypadku oceny chimeryzmu, mierzonego odsetkiem DNA biorcy (%MC) dokonywano stosując następującą formułę: B1+ B2 %MC = x 100% B1+ B2+ D1+D2 27

29 gdzie B1 i B2 to pola powierzchni pod szczytami poszczególnych alleli biorcy, a D1 i D2 pola powierzchni pod pikami obu alleli pochodzących od dawcy. W przypadku, gdy w zakresie badanego locus heterozygotyczny dawca i biorca mieli jeden wspólny allel, oceny chimeryzmu dokonywano stosując następujący wzór: B1 %MC = x 100% D2 gdzie B1 to pole powierzchni pod pikiem biorcy a D2 pod pikiem dawcy. Wytypowane dla celów diagnostycznych loci lub locus poddawano badaniu przez cały czas monitorowania chimeryzmu. Jako CC określano jedynie sytuację, w której nie wykrywano nawet śladowych ilości DNA biorcy. Natomiast jako MC traktowano kaŝdą ilość wykrywanego DNA biorcy w badaniach kontrolnych. 28

30 3.3 Analiza statystyczna We wnioskowaniu statystycznym przyjęto próg istotności równy p= Porównanie rozkładów zmiennych jakościowych przeprowadzono z zastosowaniem testu χ 2. Hipotezę o normalnym rozkładzie wartości badanej zmiennej przeprowadzano z wykorzystaniem testu Shapiro-Wilka. Korelację pomiędzy zmiennymi wykazującymi cechy rozkładu normalnego badano przy pomocy korelacji Pearsona, w przypadku, gdy załoŝenie normalności rozkładu zmiennych nie było spełnione posługiwano się korelacją Spearmana. Wartości grupowe zmiennych ciągłych porównywano za pomocą testów parametrycznych (analiza wariancji) w przypadku, gdy zmienne miały rozkład normalny i odpowiednio testów nieparametrycznych (test Manna-Whitneya), gdy zmienne nie wykazywały cech rozkładu normalnego. Porównanie czasu przeŝycia chorych w badanych podgrupach przeprowadzono przy pomocy analizy Kaplana-Meyera. Obliczeń dokonywano przy pomocy programu STATISTICA (data analysis software system), wersja 7.1., StatSoft, Inc. (2005). 29

31 4 WYNIKI 4.1 Chimeryzm hematopoetyczny w komórkach jądrzastych krwi obwodowej Spośród 54 chorych, u których oceniono chimeryzm w leukocytach krwi obwodowej 51 chorych w trakcie obserwacji osiągnęło chimeryzm pełny (Complete Chimerism - CC) (Rysunek 1). U 25 pacjentów osiągnięcie pełnego chimeryzmu stwierdzono w czasie 100 dni po transplantacji (wczesny chimeryzm). Tylko u 9 chorych obserwowano pełny chimeryzm juŝ w 30 dobie. U 10 chorych pełny chimeryzm wykazano w dobie 60, a u 6 w dobie 100. Mediana czasu do osiągnięcia CC w tej grupie wynosiła 60 dni. U 26 pacjentów obserwowano osiągnięcie CC w trakcie redukcji lub po odstawieniu terapii immunosupresyjnej (późny chimeryzm osiągnięty po 100 dobie po przeszczepie). Mediana czasu uzyskania CC wynosiła 270 dni (zakres ). U wszystkich chorych w tej grupie odsetek własnego DNA w okresie pomiędzy 100 dobą a osiągnięciem CC nie przekraczał 2%. U trzech chorych wykazano utrzymywanie się MC przez cały okres obserwacji. Ze względu na cel pracy chorych tych wyłączono z dalszych analiz statystycznych zawęŝając badaną grupę do 51 chorych. Rysunek 1 Grupy chorych w zaleŝności od rodzaju chimeryzmu 30

32 Zmianę odsetkowego udziału CC w badanej grupie w poszczególnych dobach kontrolnych przedstawia (Rysunek 2). Rysunek 2 Zmiana odsetkowego udziału CC w kolejnych dobach kontrolnych Charakterystyka chorych w zaleŝności od rodzaju chimeryzmu W grupie chorych z wczesnym chimeryzmem mediana wieku wynosiła 33 lata (zakres wieku lata), natomiast w grupie chorych z późnym chimeryzmem mediana wieku wynosiła 43 lata (zakres wieku lata). W badanych grupach chorych, wyróŝnionych na podstawie czasu uzyskania pełnego chimeryzmu wykazano statystycznie istotną róŝnicę wieku biorcy (Test U Manna Whitneya p=0,037) (Rysunek 3). Chorzy, u których obserwowano wystąpienie wczesnego CC byli istotnie młodsi od chorych w grupie późnego chimeryzmu. PoniewaŜ w grupie chorych z wczesnym CC znaleźli się wszyscy chorzy, u których jako postępowanie przygotowawcze stosowano TBI dodatkowe analizy wieku biorcy przeprowadzono po wykluczeniu tych chorych z badanej grupy. Nie obserwowano róŝnic wieku biorcy w grupach chorych z wczesnym i późnym chimeryzmem, u których 31