PL B1. UNIWERSYTET GDAŃSKI, Gdańsk, PL BUP 02/16

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (51) Int.Cl. C07K 7/06 ( ) C07K 1/04 ( ) G01N 33/68 ( ) G01N 33/52 ( ) (54) Nowy związek, sposób jego otrzymywania, roztwór farmaceutyczny zawierający nowy związek, sposób określania obecności choroby nowotworowej, zestaw do wykrywania nowotworów oraz zastosowanie hydrolizy nowego związku do wykrywania nowotworów (73) Uprawniony z patentu: UNIWERSYTET GDAŃSKI, Gdańsk, PL (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 02/16 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 03/17 (72) Twórca(y) wynalazku: DAWID DĘBOWSKI, Gdańsk, PL NATALIA GRUBA, Gościcino, PL ADAM LESNER, Gdańsk, PL MAGDALENA WYSOCKA, Śliwice, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Małgorzata Matyka

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest nowy związek, sposób jego otrzymywania, roztwór farmaceutyczny zawierający nowy związek, sposób określania obecności choroby nowotworowej, zestaw do wykrywania nowotworów oraz zastosowanie hydrolizy nowego związku do wykrywania nowotworów. Nowy sposób analizy ludzkiego proteasomu 20S obecnego w moczu lub innych płynach biologicznych przy użyciu sondy fluorescencyjnej i jej zastosowanie do diagnostyki raka pęcherza. Synteza peptydów na fazie stałej (nośniku) została wprowadzona po raz pierwszy w latach 80 ubiegłego wieku przez Bruca Merfielda, który za to osiągnięcie otrzymał nagrodę Nobla. Proteasom jest multikatalitycznym kompleksem endopeptydazy (EC ) odpowiedzialnym za nielizosomalne usuwanie białek uszkodzonych i nieprawidłowo ukształtowanych w wyniku wystąpienia mutacji lub pod wpływem czynników zewnętrznych powodujących stres oksydacyjny [1,2]. Dotychczas opracowane związki umożliwiające oznaczanie aktywności proteasomu 20S lub 26S to krótkie peptydy zawierające 4 5 reszt aminokwasowych zawierające na C-końcu ugrupowanie fluorescencyjne. Związki te umożliwiają oznaczanie aktywności proteasomu w tym w obecności proteasomu lub innego enzymu proteolitycznego C-końcowa grupa fluorescencyjna ulega uwolnieniu wykazując wysoki stopień fluorescencji. Przykładowe sekwencje takich substratów fluorogenicznych opisano w pracy Ma [3], wykorzystując tego typu związki do oznaczania aktywności proteasomu w osoczu. Leu-Leu-Val-Tyr-AMC, AMC to aminokumaryna. Przegląd danych literaturowych wskazuje że głównym obiektem badań monitorujących p o- ziom aktywności proteasomu są nowotwory układu krwionośnego [4]. Zdecydowana większość p o- chodnych peptydowych będących substratami proteasomu została opracowana w laboratoriach komercyjnych takich jak Promega czy Molecular Probes [5]. Alternatywnie pomiar stężenia proteasomu przeprowadza się stosując techniki immunochemiczne (testy ELISA) [6] które wykorzystują rozpoznanie określonej podjednostki proteasomu przez określony typ przeciwciał. Jednak procedura ta jest czasochłonna i prowadzi do oznaczania całej populacji proteasomu a nie jego aktywnie e n- zymatycznej frakcji. Opracowany i otrzymany nowy związek znakowany peptyd charakteryzuje się wysoką wartością stałej specyficzności (rzędu 7,5 x 10 5 M -1 x s -1 ) oraz właściwym dla tego typu oznaczeń limitem oznaczalności i detekcji, wynoszącym odpowiednio 32 pm i 5 pm. Wartości te świadczą o tym że związek jest hydrolizowany przez proteasom z dużą wydajnością, a ponadto już w obecności 32 pm tego enzymu. Cała procedura oznaczania aktywności proteasomu wymaga niewiele czasu (60 minut), nieskomplikowana (wymaga zmieszania 2 roztworów oraz wymaga niewielkiej ilości łatwo dostępnego materiału biologicznego jakim jest ludzki mocz (minimalna objętość 50 l). Podstawową zaletą otrzymanego związku i związanej z nią metody jest możliwość diagnostyki nowotworu pęcherza moczowego poprzez opisaną poniżej procedurę. Wynik dodatni (wzrost fluorescencji w czasie) jest jednoznaczny z obecnością w moczu aktywnego proteasomu co z kolei silnie koreluje z obecnością nowotworu. Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie związku i sposobów, które mogłyby być zastosowane do wykrywania nowotworów, korzystnie nowotworu pęcherza. Nieoczekiwanie problem ten został rozwiązany w istotnym stopniu w niniejszym wynalazku. Przedmiotem wynalazku jest nowy związek o wzorze ogólnym: ABZ 1 -Val 2 -Val 3 -Ser 4 -Tyr 5 -Ala 6 -Met 7 -Gly 8 -(Tyr(3-NO 2 ) 9 -NH 2 gdzie: ABZ oznacza kwas 2-amino benzoesowy. Przedmiotem wynalazku jest również sposób otrzymywania nowego związku zdefiniowanego powyżej, gdzie w następujących etapach: a) osadzenie Fmoc-Tyr(3-NO 2 )-OH na żywicy TentaGel S RAM, poprzez przyłączenie pochodnej aminokwasowej Fmoc-Tyr(3-NO 2 ) do wolnych grup aminowych żywicy, b) żywicę przemyto DMF, a następnie usunięto osłony Fmoc z grupy aminowej, c) przyłączono resztę aminokwasową Fmoc-Gly-OH, d) w taki sam sposób wprowadzono kolejne chronione pochodne aminokwasowe: metioninę, alaninę, tyrozynę, serynę, dwukrotnie waliny i cząsteczkę kwasu 2-aminobenzoesowego (ABZ), e) otrzymano peptyd oznakowany fluorescencyjnie: ABZ 1 -Val 2 -Val 3 -Ser 4 -Tyr 5 -Ala 6 -Met 7 - Gly 8 -(Tyr(3-NO 2 ) 9 -NH 2, f) następnie amid peptydu usunięto z nośnika wraz z jednoczesnym usunięciem osłon bocznych za pomocą mieszaniny: TFA : fenol : woda : TIPS (88 : 5 : 5 : 2, v/v/v/v).

3 PL B1 3 Sposób gdzie ABZ jest donorem fluorescencji na N-końcu, a 3-nitro-L-tyrozyna jest wygaszaczem fluorescencji na C-końcu. Roztwór farmaceutyczny do wykrywania nowotworów zawierający substancję czynną i bufor gdzie jako substancję czynną zawiera nowy związek określony w zastrzeżeniu 1 oraz bufor o ph 8,1 8,5. Roztwór gdzie bufor ma ph korzystnie 8,3. Roztwór gdzie bufor jest wybrany z grupy zawierającej TRIS HCl, bufor fosforanowy, HEPES, BisTRIS, korzystnie TRIS-HCI. Roztwór, który wykrywa nowotwory, korzystnie nowotwór pęcherza moczowego. Sposób określania obecności choroby nowotworowej, który obejmuje analizowanie in vitro pobranej od człowieka próbki moczu, do której dodaje się nowy związek określony w zastrzeżeniu 1 i miesza się z buforem o ph 8,1 8,5. Sposób gdzie dokonuje się w czasie 0 min, 30 min, 60 min. Pomiaru intensywności fluorescencji powstałej na skutek uwolnienia fragmentu zawierającego znacznik fluorescencyjny ABZ 1 -Val 2 -Val 3 - Ser 4 -Tyr 5. Sposób gdzie bufor ma ph korzystnie 8,3. Sposób gdzie bufor jest wybrany z grupy TRIS HCl, bufor fosforanowy, HEPES, BisTRIS, korzystnie TRIS-HCI. Sposób, który wykrywa nowotwory, korzystnie nowotwór pęcherza moczowego. Zestaw do wykrywania nowotworów, korzystnie nowotworu pęcherza moczowego, który zawiera nowy związek określony w zastrzeżeniu 1 oraz bufor o ph 8,1 8,5. Zestaw gdzie bufor ma ph korzystnie 8,3. Zestaw gdzie bufor jest wybrany z grupy TRIS HCl, bufor fosforanowy, HEPES, BisTRIS, korzystnie TRIS-HCI. Zastosowanie hydrolizy in vitro nowego związku określonego powyżej gdzie w pozycji 5 poprzez proteasom 20S do wykrywania nowotworów, korzystnie nowotworu pęcherza. Określenia stosowane powyżej oraz w opisie i zastrzeżeniach patentowych, mają następujące znaczenie: Boc grupa tert-butyloksykarbonylowa Fmoc grupa 9-fluorenylometoksykarbonylowa DMF dimetyloformamid NMP N-metylopirolidon DCM dichlorometan TFA Trifluoroacetic acid TIPS Triisopropylsilan TRIS-HCI Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride ABZ kwas 2-amino benzoesowy Opis figur: Fig. 1 przedstawia wynik analizy chromatograficznej związku (A) w obecności ludzkiego proteasomu 20S (B) oraz w trakcie inkubacji z ludzkim moczem (C) po 5 minutach i (D) po 60 minutach. Fig. 2 Krzywa zależności intensywności fluorescencji od czasu dla próbek 42, 4, 16, 39 oraz H2 i H4. Fluorescencję monitorowano przy długości fali 450 nm. Fig. 3 przedstawia wyniki analizy próbek ludzkiego moczu osób zdrowych próbki H (39) oraz zdiagnozowanym rakiem pęcherza (69). Fig. 4 przedstawia Blot próbek moczu osób ze zdiagnozowanym rakiem pęcherza moczowego. Fig. 5 przedstawia wyniki Elisa human proteasome 20S detection kit dla 6 próbek osób zdrowych / 15 chorych. Tabela 1 przedstawia przykładowe wartości aktywności proteosomu zależności fluorescencji w czasie dla próbek 42, 18, 27, 37 oraz H1 i H11. Wynalazek ilustruje następujący przykład wykonania, nie stanowiący jego ograniczenia.

4 4 PL B1 Przykład I) Synteza nowego związku: a) Pierwszym etapem syntezy było otrzymanie peptydu oznakowanego fluorescencyjnie który otrzymano metodą syntezy w fazie stałej z wykorzystaniem chemii Fmoc/tBu Związek o sekwencji ABZ 1 -Val 2 -Val 3 -Ser 4 -Tyr 5 -Ala 6 -Met 7 -Gly 8 -(Tyr(3-NO 2 ) 9 -NH 2, gdzie ABZ oznacza kwas 2-amino benzoesowy, otrzymano na drodze syntezy chemicznej w fazie stałej z wykorzystaniem następujących pochodnych aminokwasowych. Boc-ABZ, Fmoc-Val, Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ala, Fmoc-Met, Fmoc-Gly, Fmoc-Tyr(3-NO 2 ). Syntezę substratów peptydowych prowadzono na dwóch rodzajach nośnika stałego: żywicy TentaGel S RAM firmy RAPP Polymere (Niemcy) o osadzeniu 0,23 mmol/g Syntezę wszystkich peptydów prowadzono w sposób manualny z zastosowaniem wytrząsarki laboratoryjnej. Przez większość etapów reaktorami była strzykawka zakończona spiekiem do syntezy w fazie stałej o pojemności 25 ml. Wszystkie syntezowane substraty zawierały w swojej sekwencji na N-końcu kwas 2-aminobenzoesowy (ABZ) i cząsteczkę 3-nitro-L-tyrozyny położoną na C-końcu. ABZ pełnił rolę donora fluorescencji, natomiast Tyr(3-NO 2 ) pełniła rolę wygaszacza fluorescencji. Peptydy w swojej sekwencji zawierały jedno miejsce reaktywne zlokalizowane pomiędzy resztami aminokwasowymi położonymi w pozycji P1-P1'. Osadzenie Fmoc-Tyr(3-NO 2 )-OH na żywicy TentaGel S RAM: Syntezę peptydów wykonano na żywicy TentaGel S RAM firmy Rapp Polymere o osadzeniu 0,23 mmol/g. W pierwszym etapie dokonano spulchnienia żywicy poprzez cykl przemywań. Kolejno przystąpiono do usunięcia z nośnika osłony grupy aminowej Fmoc za pomocą 20% roztworu piperydyny w NMP. Następnie przeprowadzono cykl przemywań rozpuszczalnikami. W celu potwierdzenia obecności wolnych grup aminowych wykonano test chloranilowy. Cykl przemywań rozpuszczalnikami: DMF 1 x 10 minut IsOH 1 x 10 minut DCM 1 x 10 minut Usunięcie osłony Fmoc: DMF 1 x 5 minut 20% piperydyna w NMP 1 x 3 minuty 20% piperydyna w NMP 1 x 8 minut Cykl przemywań rozpuszczalnikami: DMF 3 x 2 minuty IsOH 3 x 2 minuty DCM 3 x 2 minuty Test chloranilowy: Test chloranilowy polegał na przeniesieniu za pomocą łopatki, kilku ziaren żywicy z reaktora strzykawki do szklanej ampułki, do której następnie dodano 100 l nasyconego roztworu p-chloranilu w toluenie i 50 l świeżego aldehydu octowego. Po upływie 10 minut przeprowadzono kontrolę zabarwienia ziaren. Na tym etapie po przeprowadzeniu testu otrzymano zielone zabarwienie ziaren, które świadczyło o obecności wolnych grup aminowych. Po potwierdzeniu usunięcia osłon fluorenylometoksykarbonylowych z żywicy można było przystąpić do kolejnego etapu, przyłączania pochodnej aminokwasowej Fmoc-Tyr(3-NO 2 ). Przyłączanie Fmoc-Tyr(3-NO 2 )-OH do żywicy: Wszystkie przyłączania reszt aminokwasowych poprzedzono przemywaniem żywicy za pomocą DMF przez 5 minut. W kolejnych przyłączaniach stosowano diisopropylokarbodiimid jako środek sprzęgający. Procedurę powtarzano dwukrotnie.

5 PL B1 5 Po każdym z acylowań rozpoczynano cykl przemywań żywicy, a następnie wykonywano test chloranilowy, w celu monitorowania przyłączania pochodnej aminokwasowej Fmoc-Tyr(3-NO 2 ) do wolnych grup aminowych żywicy. Cykl przemywań rozpuszczalnikami: DMF 3 x 2 minuty IsOH 3 x 2 minuty DCM 3 x 2 minuty Test chloranilowy: W wyniku przeprowadzonych testów po dwóch pierwszych sprzęganiach zabarwienie ziaren najpierw było zielone, a następnie szare, więc konieczne było przeprowadzenie kolejnego acylowania, w wyniku którego ziarna żywicy badanej testem chloranilowym były bezbarwne. Świadczyło to przyłączeniu Fmoc-Tyr(3-NO 2 )-OH do żywicy TentaGel S RAM, co pozwoliło przejść do następnego etapu syntezy peptydu. Przyłączanie kolejnych chronionych reszt aminokwasowych: Żywicę wraz z przyłączoną resztą Fmoc-Tyr(3-NO 2 )-OH znajdującą się w reaktorku przemyto za pomocą DMF, a następnie przystąpiono do deprotekcji osłony Fmoc z grupy aminowej w celu przyłączenia chronionej pochodnej aminokwasowej glicyny. Usunięcie osłony Fmoc: DMF 1 x 5 minut 20% piperydyna w NMP 1 x 3 minuty 20% piperydyna w NMP 1 x 8 minut Cykl przemywań rozpuszczalnikami: DMF 3 x 2 minuty IsOH 3 x 2 minuty DCM 3 x 2 minuty Test chloranilowy: W wyniku przeprowadzenia testu chloranilowego otrzymano wynik pozytywny, o czym świadczyło zielone zabarwienie ziaren żywicy. Pozwoliło to na rozpoczęcie kolejnego etapu przyłączania reszty aminokwasowej Fmoc-Gly-OH. Przyłączanie pochodnej aminokwasowej: Wykonywane sprzęgania poprzedzono przemywaniem żywicy w DMF. Podczas przyłączania chronionej reszty glicyny skład mieszaniny sprzęgającej pozostawał bez zmian. Po zakończeniu każdego z acylowań stosowano cykl przemywań rozpuszczalnikami według podanej procedury, a następnie przeprowadzono test chloranilowy na obecność wolnych grup aminowych w roztworze. Cykl przemywań rozpuszczalnikami: DMF 3 x 2 minuty IsOH 3 x 2 minuty DCM 3 x 2 minuty Test chloranilowy: Ziarna żywicy testu przeprowadzonego po drugim acylowaniu były bezbarwne, co pozwoliło na przejście do kolejnego etapu syntezy, jakim było wprowadzenie kolejnych chronionych pochodnych aminokwasowych metioniny, alaniny, tyrozyny, seryny, dwukrotnie waliny i cząsteczki kwasu 2-aminobenzoesowego. Procesy sprzęgania odbyły się zgodnie z procedurą omówioną wcześniej. Testy przeprowadzone po przyłączeniu wyżej wymienionych reszt wykazały wyniki pozytywne, ziarna żywicy były bezbarwne. b) Usuwanie peptydu z nośnika Po zakończeniu syntezy amid peptydu usunięto z nośnika wraz z jednoczesnym usunięciem osłon bocznych za pomocą mieszaniny: TFA : fenol : woda : TIPS (88 : 5 : 5 : 2, v/v/v/v) w kolbie okrągłodennej na mieszadle magnetycznym.

6 6 PL B1 Po upływie 3 godzin zawartość kolby sączyło się pod zmniejszonym ciśnieniem na lejkach ze spiekiem Schotta przemywając eterem dietylowym. Powstały osad odwirowano na wirówce SIGMA 2K30 (Laboratory Centrifuges) w czasie 20 minut. Osad otrzymany po wirowaniu rozpuszcza się w wodzie przy pomocy ultradźwięków, a następnie poddano liofilizacji. c) Tożsamość/charakterystyka nowego związku analiza HPLC, MS oraz NMR HPLC warunki: kolumna RP Bio Wide Pore Supelco C8 250 mm 4 mm, układ faz A 0,1% TFA w wodzie, B: 80% acetonitrylu w A), przepływ 1 ml/min, detekcja UV przy 226 nm. t R MS MALDI TOF matryca kwas alfa cynamonowy masa cząsteczkowa 1054,23 Da obliczona 1053,1 H1 NMR 500 MHz s 8,50 (1H); m 8,00 (11 H); m 7,5-7,1 (11H); m 6,7-6,5 (5H); s 6,3 (2H); s 5,42 (2H); m 4,8 (3H); m 4,7-4,4 (4H); m 4,1 (4H); m 3,9-3,7 (2H); s 3,6 (1H); m 3,4-3,2 (4H); m 2,7 (2H); m 2,06 (2H); m 1,5 (3H); m 0,8 (12H) II) Badania potwierdzające a) Wyniki na modelach/walidacja Otrzymany nowy związek jest efektywnie hydrolizowany przez podjednostkę chymotrypsynopodobną ludzkiego proteasomu 20S. Ten wewnątrzkomórkowy kompleks enzymatyczny w określonych stanach patofizjologicznych wydostaje się z komórki i krąży w osoczu i innych płynach ustrojowych w tym moczu. W wyniku prowadzonej hydrolizy enzymatycznej powstają dwa fragmenty: ABZ-Val-Val-Ser-Tyr- OH silnie fluorescencyjny, którego wzrost stężenia w czasie jest podstawą testu oraz C-końcowy fragment Ala-Met-Gly-Tyr(3-NO 2 )-NH 2 pozbawiony właściwości fluorescencyjnych. (Fig. 1A, 1B). Wzrost fluorescencji w obecności proteasomu jest proporcjonalny do jego stężenia. Analiza HPLC i MS potwierdza obecność omawianych wyżej fragmentów związku ABZ-Val-Val- Ser-Tyr-OH oraz Ala-Met-Gly-Tyr(3-NO 2 )-NH 2 powstałych w wyniku trawienia przez podjednostkę chymotrypsynopodobną proteasomu 20S (rys. 1B). Zahamowanie jej aktywności poprzez użycie selektywnego inhibitora tej podjednostki powoduje brak hydrolizy związku. b) Wyniki w moczu Procedura oznaczania aktywności proteasomu w próbce przebiegała następująco. Badaną próbkę moczu (50 l) mieszano z buforem Tris HCl ph 8,3 w stosunku 1:1. Do tak przygotowanej mieszaniny dodano roztworu związku 100 l w podanym wyżej buforze. Tak otrzymaną mieszaninę inkubowano w temp 37 C. Pomiar fluorescencji układu wykonywano przy długości fali wzbudzenia 320 nm a emisji fluorescencji 450 nm. Pomiar prowadzono w sposób ciągły lub w wybranych odstępach czasu tj.: 0, 30 minut, 60 minut. Podobne wyniki uzyskano w buforze HEPES lecz buforze tym związek wykazywał słabą rozpuszczalność, w buforach fosforanowym i BisTris o analogicznej wartości ph szybkość wzrostu fluorescencji była niższa. Inkubacja otrzymanego nowego związku w moczu pochodzącego od osób chorych na raka pęcherza i analiza chromatograficzna takiej mieszaniny skutkuje powstaniem fragmentów związku tożsamych z opisanymi wyżej gdzie w systemie zastosowano izolowany proteasom 20S. Użycie selektywnych inhibitorów podjednostki chymotrypsynopodobnej powoduje brak rozpadu związku. Rozpadu związku nie obserwuje się w moczu pochodzących od zdrowych ochotników (Fig. 1C, 1D). Przebadano 108 próbek (69 pochodzących od osób chorych i 39 zdrowych) przy użyciu opracowanego nowego związku wykazała że większość próbek pochodzących od pacjentów chorych (61) wykazuje wzrost fluorescencji świadczący o rozpadzie peptydu pod wpływem proteasomu. Przykładowe krzywe zależności fluorescencji w czasie dla próbek 42, 18, 27, 37 oraz H1 i H11 przedstawiono na Fig. 2 oraz tabeli 1. Żadna z próbek zdrowych takiego wzrostu nie wykazała (Fig. 3). Test potwierdzający BLOT Analiza immunochemiczna tj. SDS PAGE próbek moczu zdrowych osób (ochotników) i chorych na raka pęcherza a następnie półsuchy transfer na membranę i inkubacja z przeciwciałem antyproteasome 20S ujawniła obecność prążków tylko w materiale pochodzącym od osób chorych (Fig. 4).

7 PL B1 7 Test potwierdzający ELISA Badane próbki analizowano zestawem ELISA wykrywającym proteasom 20S. Otrzymane wyniki silnie korelują z tymi otrzymanymi przy użyciu nowego związku będącego przedmiotem wynalazku (Fig. 5). Literatura: 1. Borissenko L., Groll M., Diversity of proteasomal missions: fine tuning of the immune response, Biol. Chem., 388, , Groll M., Bochtler M., Brandstetter H., Clausen T., Huber R., Molecular machines for protein degradation, ChemBioChem., 6, , Ma W, Kantarjian H, O'Brien S, Jilani I, Zhang X, Estrov Z, et al. Enzymatic activity of circulating proteasomes correlates with clinical behavior in patients with chronic lymphocytic leukemia. Cancer 2008; 112: Ostrowska H, Hempel D, Holub M, Sokolowski J, Kloczko J. Assessment of circulating proteasome chymotrypsin-like activity in plasma of patients with acute and chronic leukemias. Clin Biochem Nov; 41 (16 17): Ma W, Kantarjian H, O'Brien S, Jilani I, Zhang X, Estrov Z, et al. Enzymatic activity of circulating proteasomes correlates with clinical behavior in patients with chronic lymphocytic leukemia. Cancer 2008; 112: Zastrzeżenia patentowe 1. Nowy związek o wzorze ogólnym: ABZ 1 -Val 2 -Val 3 -Ser 4 -Tyr 5 -Ala 6 -Met 7 -Gly 8 -(Tyr(3-NO 2 ) 9 -NH 2 gdzie: ABZ oznacza kwas 2-amino benzoesowy. 2. Sposób otrzymywania nowego związku zdefiniowanego w zastrzeżeniu 1, znamienny tym, że w następujących etapach: g) osadzenie Fmoc-Tyr(3-NO 2 )-OH na żywicy TentaGel S RAM, poprzez przyłączenie pochodnej aminokwasowej Fmoc-Tyr(3-NO 2 ) do wolnych grup aminowych żywicy, h) żywicę przemyto DMF, a następnie usunięto osłony Fmoc z grupy aminowej, i) przyłączono resztę aminokwasową Fmoc-Gly-OH, j) W taki sam sposób wprowadzono kolejne chronione pochodne aminokwasowe: metioninę, alaninę, tyrozynę, serynę, dwukrotnie waliny i cząsteczkę kwasu 2-aminobenzoesowego (ABZ), k) otrzymano peptyd oznakowany fluorescencyjnie: ABZ 1 -Val 2 -Val 3 -Ser 4 -Tyr 5 -Ala 6 -Met 7 - Gly 8 -(Tyr(3-NO 2 ) 9 -NH 2, l) następnie amid peptydu usunięto z nośnika wraz z jednoczesnym usunięciem osłon bocznych za pomocą mieszaniny: TFA : fenol : woda : TIPS (88 : 5 : 5 : 2, v/v/v/v). 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że ABZ jest donorem fluorescencji na N-końcu, a 3-nitro-L-tyrozyna jest wygaszaczem fluorescencji na C-końcu. 4. Roztwór farmaceutyczny do wykrywania nowotworów zawierający substancję czynną i bufor, znamienny tym, że jako substancję czynną zawiera nowy związek określony w zastrzeżeniu 1 oraz bufor o ph 8,1 8,5. 5. Roztwór według zastrz. 3, znamienny tym, że bufor ma ph korzystnie 8,3. 6. Roztwór według zastrz. 3, znamienny tym, że bufor jest wybrany z grupy zawierającej TRIS HCl, bufor fosforanowy, HEPES, BisTRIS, korzystnie TRIS-HCI. 7. Roztwór według zastrz. 3, znamienny tym, że wykrywa nowotwory, korzystnie nowotwór pęcherza moczowego. 8. Sposób określania obecności choroby nowotworowej, znamienny tym, że obejmuje analizowanie in vitro pobranej od człowieka próbki moczu, do której dodaje się nowy związek określony w zastrzeżeniu 1 i miesza się z buforem o ph 8,1 8,5.

8 8 PL B1 9. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że dokonuje się w czasie 0 min, 30 min, 60 min, pomiaru intensywności fluorescencji powstałej na skutek uwolnienia fragmentu zawierającego znacznik fluorescencyjny ABZ 1 -Val 2 -Val 3 -Ser 4 -Tyr Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że bufor ma ph korzystnie 8, Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że bufor jest wybrany z grupy TRIS HCl, bufor fosforanowy, HEPES, BisTRIS, korzystnie TRIS-HCI. 12. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że wykrywa nowotwory, korzystnie nowotwór pęcherza moczowego. 13. Zestaw do wykrywania nowotworów, korzystnie nowotworu pęcherza moczowego, znamienny tym, że zawiera nowy związek określony w zastrzeżeniu 1 oraz bufor o ph 8,1 8, Zestaw według zastrz. 13, znamienny tym, że bufor ma ph korzystnie 8, Zestaw według zastrz. 13, znamienny tym, że bufor jest wybrany z grupy TRIS HCl, bufor fosforanowy, HEPES, BisTRIS, korzystnie TRIS-HCI. 16. Zastosowanie hydrolizy in vitro nowego związku określonego w zastrzeżeniu 1 w pozycji 5 poprzez proteasom 20S do wykrywania nowotworów, korzystnie nowotworu pęcherza. Rysunki

9 PL B1 9

10 10 PL B1

11 PL B1 11

12 12 PL B1 Departament Wydawnictw UPRP Cena 4,92 zł (w tym 23% VAT)