BADANIA WSTĘPNE DOTYCZĄCE OBRAZU MIKROBIOLOGICZNEGO, MORFOLOGII ORAZ NIEKTÓRYCH PARAMETRÓW FERMENTACJI PRZEWODU POKARMOWEGO SZCZURÓW

Transkrypt

1 Acta Sci. Pol., Medicina Veterinaria 3(1) 2004, BADANIA WSTĘPNE DOTYCZĄCE OBRAZU MIKROBIOLOGICZNEGO, MORFOLOGII ORAZ NIEKTÓRYCH PARAMETRÓW FERMENTACJI PRZEWODU POKARMOWEGO SZCZURÓW Edyta Wincewicz, Wojciech Zawadzki, Albert Czerski, Katarzyna Płoneczka Akademia Rolnicza we Wrocławiu Streszczenie. Badania wykonano na 24 szczurach (12 samcach i 12 samicach) szczepu Bufflo. Zwierzęta Ŝywione były ad libitum granulatem LSM dla gryzoni. Dostęp do wody był nieograniczony. Po zakończeniu doświadczenia szczury poddawano lekkiej narkozie eterowej, pobierano wymazy z jamy ustnej i gardła oraz z prostnicy, a następnie krew z Ŝyły jarzmowej. Po uśpieniu wypreparowywano Ŝołądek i jelito ślepe i pobierano ich treść. Pobrany materiał posiewano na podłoŝa bakteriologiczne. W pełnej krwi oznaczano liczbę erytrocytów i leukocytów, stęŝenie hemoglobiny oraz hematokryt. W surowicy krwi oznaczano stęŝenie glukozy, białka całkowitego, cholesterolu całkowitego i trójglicerydów. Do treści Ŝołądka i jelit dodawano w równych ilościach sztuczną ślinę oraz wodę destylowaną. Inkubację treści prowadzono w specjalnych płuczkach umieszczonych w wytrząsarce z łaźnią wodną o temp. 39 ºC przez 8 godzin, pobierając próbki do analizy gazów, amoniaku i ph. Najczęściej izolowanym drobnoustrojem była pałeczka okręŝnicy Escherichia coli, którą stwierdzono u 95,8% badanych szczurów w wymazach z jelita prostego oraz u 83,3% w jelicie ślepym. Dość licznie izolowano z jelita ślepego (95,8%) laseczki Bacillus sp. Z przeprowadzonych badań wynika, Ŝe zawartość amoniaku jest znacznie większa w jelicie ślepym aniŝeli w Ŝołądku. ZauwaŜa się tu teŝ istotne róŝnice związane z płcią. Podobnie dotyczy to poziomu kwasu mlekowego. NiŜsze ph panuje w Ŝołądku od 3,8 do 4,1, natomiast w jelicie ślepym wynosi ono 6,8. Słowa kluczowe: szczur, bakterie, morfologia, fermentacja, przewód pokarmowy Adres do korespondencji Corresponding author: Edyta Wincewicz, Katedra Fizjologii Zwierząt Akademia Rolnicza we Wrocławiu, ul. C.K. Norwida 31, Wrocław, wince@ozi.ar.wroc.pl

2 62 E. Wincewicz i in. WSTĘP Dotychczasowe badania in vivo i in vitro prowadzone głównie na przeŝuwaczach, świniach, koniach i królikach dotyczyły wpływu róŝnorodnych dodatków paszowych bądź antybiotyków na przebieg fermentacji i obraz mikroflory przewodu pokarmowego. Najwięcej informacji o składzie gazów powstających podczas fermentacji w przewodzie pokarmowym zwierząt dotyczy w pierwszej kolejności Ŝwacza zwierząt przeŝuwających [Archew i in. 1986, Beijer 1952, Crutzen 1994], a następnie jelita ślepego u kur, kóz, królików [Archew in. 1986, Beijer 1952, Graeve 1988, Połozowski i in. 1998, Zawadzki i in. 1997]. Znaczną część prac poświęcono równieŝ analizie mikroflory przewodu pokarmowego tych zwierząt [Faruga i in. 1996, Jensen i in. 1994, Johnson 1963, Mead 1993]. Brak jest natomiast, w dostępnej literaturze, aktualnych danych odnośnie gryzoni. Szczur, mysz, chomik, szynszyla, czy świnka morska stanowią coraz większy odsetek pacjentów lekarzy weterynarii nieznających szczegółów dotyczących fizjologii przewodu pokarmowego. Kuracje antybiotykowe, gwałtowna zmiana diety prowadzą często do dysfunkcji układu. Poznanie prawidłowych mechanizmów fermentacji beztlenowej i składu mikrobiologicznego poszczególnych odcinków przewodu pokarmowego pozwoliłoby na dobór odpowiedniej diety pod względem wydajności fermentacji i obrazu mikroflory, a co za tym idzie, zapewniłoby prawidłowe przyrosty masy ciała i zdrowie zwierząt. CEL PRACY Celem pracy było określenie fizjologicznego poziomu wybranych parametrów morfologicznych, biochemicznych i fermentacji w przewodzie pokarmowym szczurów ze szczególnym uwzględnieniem poziomu gazów, a zwłaszcza CO 2, CH 4 i H 2 oraz obrazu mikroflory poszczególnych jego odcinków przy Ŝywieniu standardowym. MATERIAŁ I METODY Badania wykonano na 24 szczurach (12 samcach i 12 samicach) szczepu Bufflo o początkowej masie ciała: u samic g i u samców g. Zwierzęta Ŝywione były ad libitum granulatem LSM dla gryzoni o składzie: mieszanka zboŝowa, śruta pszenna, jęczmienna, owsiana i kukurydziana, mączka rybna i kostna, mleko chude w proszku, droŝdŝe paszowe, lucerna, kreda pastewna oraz dodatki witaminowe i mineralne. Dostęp do wody był nieograniczony. Po zakończeniu doświadczenia szczury poddawano lekkiej narkozie eterowej, pobierano wymazy z jamy ustnej i gardła oraz z prostnicy, a następnie krew z Ŝyły jarzmowej. Po uśpieniu wypreparowywano Ŝołądek i jelito ślepe i pobierano ich treść. Pobrany materiał posiewano na agar zwykły, agar z krwią, podłoŝe Mc Conkey a oraz na podłoŝe Sabourauda. Wyizolowane pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae identyfikowano przy uŝyciu szeregów biochemicznych. W pełnej krwi oznaczano liczbę erytrocytów i leukocytów, stęŝenie hemoglobiny metodą cyjanomethemoglobinową oraz wskaźnik hematokrytowy. Acta Sci. Pol.

3 Badania wstępne dotyczące obrazu W surowicy krwi oznaczano stęŝenie glukozy, białka całkowitego, cholesterolu całkowitego i trójglicerydów metodami enzymatyczno-spektrofotometrycznymi według testów firmy BioSystems. Do treści Ŝołądka i jelit dodawano w równych ilościach sztuczną ślinę oraz wodę destylowaną. Inkubację prowadzono w specjalnych płuczkach [Zawadzki i Połozowski 1997]. Atmosferę płuczek wysycano azotem w celu stworzenia warunków beztlenowych doświadczenia. Płuczki umieszczano w wytrząsarce z łaźnią wodną o temp. 39 ºC na 8 godzin, pobierając próbki co 2 godziny (0,5, 2, 4, 6 i 8 h inkubacji) do analizy CO 2, CH 4 i H 2, amoniaku (metodą Conwaya) i określenia ph. Ilość całkowitą gazu wytwarzanego w płuczkach oraz ilość metanu odczytywano na podłączonych bezpośrednio do płuczek manometrach. Ilość dwutlenku węgla produkowanego przez inkubowaną zawartość płuczek obliczano z róŝnicy pomiarów ilości gazu pomiędzy analogicznymi płuczkami bez i z dodatkiem roztworu wodorotlenku potasu w studzience. OMÓWIENIE WYNIKÓW I DYSKUSJA Przeprowadzone badania mają charakter wstępny i posłuŝą do dalszych eksperymentów z uŝyciem róŝnego rodzaju diet i dodatków paszowych. Badany będzie wówczas skład gazów, morfologia, biochemia krwi oraz skład mikroflory przewodu pokarmowego szczurów. Wyniki uzyskane w prezentowanym eksperymencie przedstawiono poniŝej. Zestawienie wyników posiewów narządów (jama ustna i gardło, Ŝołądek, jelito ślepe i prostnica) badanych szczurów przedstawiono szczegółowo w tabelach 1 2. Najczęściej izolowanym drobnoustrojem była pałeczka okręŝnicy Escherichia coli, którą stwierdzono u 95,8% badanych szczurów w wymazach z jelita prostego oraz u 83,3% szczurów z jelita ślepego. Dość licznie izolowano laseczki Bacillus sp. z jelita ślepego (95,8%) W jamie ustnej wyizolowano jedynie Streptococcus α-hemolityczny, u 16,6% osobników. Tabela 1. Wyniki badań bakteriologicznych wymazów z jamy ustnej i gardła, jelita prostego, Ŝołądka i jelita ślepego szczurów Table 1. The bacterial results of mouth, pharynx, ileum, stomach and smear tests Gatunek drobnoustroju Bacteria species jama ustna i gardło mouth and pharynx Badana grupa zwierząt The examined group of animals n = 24 Ŝołądek stomach jelito ślepe jelito proste ileum Bacillus sp Escherichia coli Enterobacter spp Staphylococcus albus Streptococcus α-hem Medicina Veterinaria 3(1) 2004

4 64 E. Wincewicz i in. Tabela 2. Częstotliwość (%) występowania bakterii w posiewach wymazów z jamy ustnej i gardła, jelita prostego, Ŝołądka i jelita ślepego szczurów Table 2. The frequency (%) of bacteria occurrance in mouth, pharynx, ileum, stomach and smear tests Gatunek drobnoustroju Bacteria species Badana grupa zwierząt The examined group of animals n = 24 Ŝołądek jelito ślepe stomach jama ustna i gardło mouth and pharynx Bacillus sp ,8 0 jelito proste ileum Escherichia coli ,3 95,8 Enterobacter spp ,6 Staphylococcus albus ,5 0 Streptococcus α-hem. 16,6 0 41,6 0 Proteus spp ,1 Dość licznie, szczególnie w izolatach z jelita ślepego, izolowano paciorkowce i gronkowce. Streptococcus spp. α-hem. stwierdzono w tym odcinku przewodu pokarmowego u 41,6 % badanych szczurów, a Staphylococcus albus u 62,5%. Natomiast w jelicie prostym licznie izolowano Proteus spp., u 79,1% badanych zwierząt a Enterobacter spp. u 41,6% szczurów. Większość wyizolowanych szczepów moŝna traktować jako fizjologiczny składnik flory bakteryjnej przewodu pokarmowego, co dotyczy zwłaszcza licznie stwierdzanych pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae. Podobne wyniki dotyczące mikroflory wybranych odcinków przewodu pokarmowego szczurów uzyskała równieŝ Wincewicz [2002]. Wyniki badań hematologicznych przedstawia tabela 3. Liczba erytrocytów, leukocytów, zawartość hemoglobiny i hematokryt są nieznacznie wyŝsze u badanych samców aniŝeli u samic. RóŜnice te nie są jednak istotne statystycznie. Podobne wyniki uzyskali teŝ Schalm i in. {1975] Tabela 3. Wskaźniki hematologiczne u szczurów doświadczalnych Table 3. The rat haematological results Grupa Group Samice Female Samce Male Erytrocyty Erythrocytes [x10 12 ] Leukocyty Leucocytes [x10 9 ] Hemoglobina Haemoglobin [g xl -1 ] Hematokryt Haemocrit [1x1-1 ] x SD x SD x SD x SD 7,60 0,79 8,16 1,81 147,66 14,72 0,047 0,009 8,13 1,88 8,68 1, ,62 0,42 0,40 x średnia; SD odchylenie standardowe x average; SD standard deflection StęŜenie cholesterolu całkowitego, trójglicerydów, glukozy i białka całkowitego przedstawiono w tabeli 4. U samic zauwaŝono wyŝszy poziom cholesterolu, trójglicerydów i białka. Natomiast niŝsza była zawartość glukozy. Acta Sci. Pol.

5 Badania wstępne dotyczące obrazu Tabela 4. StęŜenie cholesterolu całkowitego, trójglicerydów, glukozy i białka całkowitego w surowicy krwi szczurów Table 4. The concentration of total cholesterol, triglycerides, glucose and total protein in blood serum of rats Grupa Group Samice Female Samce Male Cholesterol całkowity Total cholesterol, mmol xl -1 Trójglicerydy Triglycerides, mmol xl -1 Glukoza Glucose, mmol xl -1 Białko całkowite Total protein, g xl -1 x SD x SD x SD x SD 3,87 5,08 1,44 0,37 5,07 1,42 67,96 1,20 3,82 5,08 1,34 0,17 5,71 0,87 66,23 2,1 x średnia; SD odchylenie standardowe x average; SD standard deflection Produktami procesów fermentacyjnych zachodzących w jelitach są między innymi gazy, do których zaliczyć naleŝy metan i dwutlenek węgla. NajwaŜniejsze znaczenie ma oznaczanie zawartości poszczególnych rodzajów gazów. U zwierząt przeŝuwających przede wszystkim metanu, bowiem jego produkcja przynosi tym zwierzętom ogromne straty energetyczne sięgające niemal 16% [Zawadzki 1993]. Podobnym do Ŝwacza systemem jest jelito grube u zwierząt monogastrycznych, a w szczególności jelito ślepe, gdzie dłuŝej zalegający pokarm stwarza dogodne warunki do rozwoju i namnaŝania się bakterii beztlenowych [Jensen 1996]. Najbardziej znaczącymi substratami w produkcji metanu są: wodór, dwutlenek węgla i kwas octowy. Substancje te powstają, obok lotnych kwasów tłuszczowych (LKT), w wyniku rozkładu białek, lipidów i polisacharydów. Średnie stęŝenie LKT w treści pokarmowej w poszczególnych odcinkach przewodu pokarmowego zwierząt przedstawiono zbiorczo w ksiąŝce Swensona [1993] opierając cytowane dane na pracy Elsdena i in. [1946] oraz Phillipsona [1947]. Prezentowane wartości poziomu LKT w Ŝołądku, jelicie cienkim, jelicie ślepym, okręŝnicy i prostnicy szczurów wynoszą odpowiednio 0,2; 0,4; 4,8; 3,0 i 1,3 (gram kwasu octowego/100 g suchej masy). Poziom amoniaku, kwasu mlekowego i ph treści Ŝołądka i jelit ślepych przedstawia tabela 5. Z przeprowadzonych badań wynika, Ŝe zawartość amoniaku jest znacznie większa w jelicie ślepym aniŝeli w Ŝołądku, co moŝe świadczyć o intensywności procesów fermentacyjnych zachodzących w jelicie ślepym, a nie w Ŝołądku. ZauwaŜa się tu teŝ istotne róŝnice związane z płcią. Podobnie dotyczy to poziomu kwasu mlekowego. NiŜsze ph panuje w Ŝołądku od 3,8 do 4,1, natomiast w jelicie ślepym wynosi ono 6,8. Odczyn (ph) wpływa na aktywność enzymatyczną, na tempo metabolizmu drobnoustrojów, które zasiedlają przewód pokarmowy. Ma wpływ takŝe na liczebność poszczególnych populacji, a to pociąga za sobą zmianę w ilości i rodzaju wytwarzanych związków [Lana 1988]. W badaniach własnych zaobserwowano istotne róŝnice w ph dwóch badanych odcinków przewodu pokarmowego. Medicina Veterinaria 3(1) 2004

6 66 E. Wincewicz i in. Tabela 5. Poziom amoniaku, kwasu mlekowego i ph u badanych szczurów Table 5. The ammonia, lactic acid and ph level in the examined rat Grupa Group Samice Female Ŝołądek stomach Amoniak Ammonia [%] j. ślepe Kwas mlekowy Lactic acid [mmol xl -1 ] Ŝołądek stomachg j. ślepe Ŝołądek stomach ph j. ślepe x 8,84 44,2 0,54 0,18 3,8 6,8 SD 0,02 5,9 0,004 0,005 0,062 0,003 Samce Male x 12,92 56,10 0,46 0,28 4,1 6,8 SD 3,52 14, ,006 0,04 0,03 x średnia; SD odchylenie standardowe x average; SD standard deflection Rycina 1 przedstawia zawartość gazów (CO 2, CH 4 i H 2 ) w jelicie ślepym u badanych szczurów w zaleŝności od czasu inkubacji i od płci. NajwyŜszy poziom CO 2 zanotowano po 8h inkubacji zawartości jelita ślepego, natomiast metanu i wodoru po 2h zarówno u samic, jak i u samców. Objętość produkowanych gazów oraz ich skład zaleŝy przede wszystkim od składu diety. Wzrost objętości gazów zauwaŝa się u szczurów po zastosowaniu diety bogatej w białko zwierzęce niŝ pochodzenia roślinnego. Znaczący wpływ ma równieŝ rodzaj diety na skład procentowy produkowanych gazów [Hedin 1962, Kodama 1949]. % w ogólnej zawartości gazów gazów The percentage The percentage of total gas of total concentent gas contents CO2 2 CH4 4 H 2 H2 CO2 2 CH4 4 H 2 H2 samice samce female male czas czas trwania inkubacji Incubation time 0,5h 2h 4h 6h 8h Ryc. 1. Zawartość gazów w jelicie ślepym u badanych szczurów Fig. 1. The gas contents in the examined rat Acta Sci. Pol.

7 Badania wstępne dotyczące obrazu Na rycinie 2 przedstawiono porównanie stosunku CO 2 : CH 4 w zaleŝności od czasu inkubacji oraz płci. W 2 h inkubacji następuje spadek poziomu badanych gazów, by potem wzrosnąć w 6 h zarówno u samców, jak i u samic. Większy wzrost stosunku gazów do siebie zaobserwowano u osobników Ŝeńskich % ,5h 2h 4h 6h 8h czas inkubacji Incubation time samice CO2/CH4 samce CO2/CH4 Ryc. 2. Porównanie stosunku dwutlenku węgla do metanu Fig. 2. The carbon dioxide and methane ratio comparison WNIOSKI 1. Najczęściej izolowanym drobnoustrojem z jamy ustnej i gardła u badanych szczurów był Staphylococcus alfa-hemolityczny. 2. W jelicie ślepym najczęściej izolowano pałeczki z rodzaju Bacillus spp., a w jelicie prostym z rodzaju Escherichia coli. 3. Liczba erytrocytów, leukocytów, zawartość hemoglobiny i hematokryt są nieznacznie wyŝsze u badanych samców aniŝeli u samic. 5. U samic stwierdzono wyŝszy poziom cholesterolu, trójglicerydów i białka. Natomiast niŝsza była zawartość glukozy. 6. Zawartość amoniaku i kwasu mlekowego jest znacznie większa w jelicie ślepym aniŝeli w Ŝołądku. 7. NajwyŜsze stęŝenie CO 2 odnotowano w 8 godzinie inkubacji w treści jelita ślepego. 8. StęŜenie CH 4 i H 2 osiąga maksymalne wartości w 2 godzinie inkubacji. PIŚMIENNICTWO Archew D.B., Harris J.E., Methanogenic bacteria and methane production in various habitats. Blackwell Sci. Publ., Oxford London Ed., Beijer W.H., Methane fermentation in the rumen of cattle. Nature 170, Crutzen P.J., The role of ruminants as a aource of methane: revelance to atmospheric chemistry. Proc. Soc. Nutr. Physiol., 3, 175. Medicina Veterinaria 3(1) 2004

8 68 E. Wincewicz i in. Elsden S.R., Hitchook M.S.W., Marshall R.A., Phillipson A.T., Volatile acids in the digestion of ruminants and other animals. J. Exp. Biol. 22, Faruga A., Jankowski J., Indyki hodowla i uŝytkowanie. PWRiL, Warszawa. Graeve de K., Demeyer D., Rumen and hindgut fermentation: differences for possible exploitation. Med. Fac. Landbouww. Rijksuniv. Gent. 53, Hedin P.A., Gastrointesinal gas product on in rats as influenced by some animal and vegetables diets, sulfating, and antibiotic supplementation. J. Nutrition 77, Jensen B.B., Jorgensen H., Effect of dietry fiber on microbial activity and microbial gas production in various regions of the gastrointestinal tract of pig. Appl. Environ. Microbiol. 60, Johnson R.R., Symposium on microbial digestion in ruminants: in vitro rumen fermentation techniques. J. Anim. Sci. 22, Kodama K., Miura Y.J., Relation between diet and intestinal gas formation. japan Soc. Food Nutrition 2, 149. Lana R.P., Russel J.B., Van Amburgh M.E., The role of ph in regulating ruminal and ammonia production. Anim. Sci., 76, Mead G., Microorganisms in the digestive tract of poultry. Proc. 9th Europ. Symp. Poultry Nutr., Jelenia Góra, Polska, p Phillipson A.T., The production of fatty acids in the alimentary tract of the dog. J. Exp. Biol. 23, Schalm O.W., Jain N.C and Carroll E.J., Veterinary Haematology 4th ed. Lea and Febiger Philadelphia. Swenson M.J., Duke s physiology of domestic animals. Cornell Univ. Press, Ithaca and London, Połozowski A., Stefaniak T., Zawadzki W., Graczyk S., Próba określenia profilu fermantacji w jelicie ślepym krowy, kury i królika. Mat. X Kongresu PTNW, Wrocław 1, 94. Wincewicz E., Microbiological examination of wild rats living in various environments in the epizootic aspect. EJPAU Serie Vet. Med. Vol. 5, Issue 1. Zawadzki W., Wpływ wybranych niekonwencjonalnych dodatków do paszy na przebieg procesów fermentacyjnych w Ŝwaczu owiec. Rozpr. hab. Nr 112, Zesz. Nauk. AR Wroc. Zawadzki W., Połozowski A., Model fermentacji w treści jelit ślepych królików in vitro. Zesz. Nauk. AR Wroc., Wet. 57, THE PRELIMINARY RESEARCH CONCERNING MICROBIOLOGICAL IMAGE, MORPHOLOGY AND SOME DIGESTIVE TRACT FERMENTATION PARAMETERS OF RATS Abstract. The experiments were carried out on 24 Bufflo rats (12 male and 12 female). The animals were fed ad libitum with LSM granules for rodents. Access to water was unlimited. After the end of the experiments the rats were put to ether narcosis, while smear tests from mouth and pharynx were done and then blood from jugular vein was taken. After putting to sleep stomach and were withdrawn and then their contents. The withdrawn contents were cultured on the bacteriological ground. The number of erythrocytes and leucocytes as well as haemoglobin and haemocrit were marked in blood. Glucose, total protein, total cholesterol and triglycerides were marked in blood serum. Artificial saliva and distilled water in equal amounts were added to the stomach contents. Eight-hour contents incubation was conducted in special vessels located in an automatic Acta Sci. Pol.

9 Badania wstępne dotyczące obrazu water bath with a temperature of 39 ºC, during which samples for gas, ammonia, ph analysis were taken. The most frequently isolated bacteria was Escherichia coli which was found in smear tests from ileum in 95,8% and from in 83,3% of the examined rats. Bacillus sp. was largely isolated from (95,8%) quantities. Bacillus sp. was largely isolated from (95,8%). The conducted experiments indicated that ammonia contents is higher in than in stomach. Substantial differences connected to sex are also exhibited. The same case is with the lactic acid level. The ph level is lower in stomach (3,8 to 4,1), and in it is 6,8. Key words: rat, bacteria, morphology, fermentation, digestive tract Zaakceptowano do druku Accepted for print: Medicina Veterinaria 3(1) 2004