(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) (1) T3 Int.Cl. G01N 11/16 (06.01) G01N 33/86 (06.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 1/19 EP B1 (4) Tytuł wynalazku: Protokół do monitorowania inhibicji płytek krwi () Pierwszeństwo: US (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 0/49 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 1/12 (73) Uprawniony z patentu: Cora Healthcare, Inc., Niles, US (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 ELI COHEN, Skokie, US IRENE A. NAVICKAS, Northbrook, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Katarzyna Naperty SULIMA GRABOWSKA SIERZPUTOWSKA BIURO PATENTÓW I ZNAKÓW TOWAROWYCH SKR. POCZT Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 SGS-6831/VAL EP B1 Opis Dziedzina wynalazku [0001] Wynalazek odnosi się do protokołu do monitorowania skuteczności środków przeciwpłytkowych. Tło wynalazku [0002] Krew jest krążącą tkanką organizmu, która przenosi tlen i substancje odżywcze do tkanek i usuwa dwutlenek węgla oraz różne produkty metaboliczne do wydalenia. Krew pełna składa się z bladożółtego lub szarożółtego płynu, osocza, w którym zawieszone są czerwone krwinki, białe krwinki i płytki krwi. [0003] Dokładny pomiar hemostazy, tj. zdolności krwi pacjenta do koagulacji i rozpuszczalności w sposób szybki i skuteczny, ma kluczowe znaczenie dla niektórych procedur chirurgicznych i medycznych. Przyspieszone (szybkie) i dokładne wykrywanie nieprawidłowej hemostazy jest także szczególnie ważne w odniesieniu do odpowiedniego leczenia, które należy podać pacjentom cierpiącym na zaburzenia hemostazy i takiemu któremu może być konieczne podawanie antykoagulantów, środków antyfibrynolitycznych, leków trombolitycznych, środków przeciwpłytkowych lub składników krwi w ilości, która musi być wyraźnie określona po uwzględnieniu nieprawidłowości pod kątem składników, komórek lub "czynników" krwi pacjenta, które mogą przyczyniać się do zaburzenia hemostazy. [0004] Hemostaza jest dynamicznym, niezwykle skomplikowanym procesem obejmującym wiele oddziałujących czynników, które obejmują białka krzepnięcia i fibrynolityczne, inhibitory, aktywatory i elementy komórkowe, takie jak cytoszkielet płytkowy, granule cytoplazmatyczne płytek i powierzchnie komórkowe płytek. W efekcie, w czasie aktywacji, żaden czynnik nie pozostaje statyczny lub działa w izolacji. Tak więc, aby był kompletny, konieczny jest pomiar ciągły wszystkich etapów hemostazy pacjenta, jako produktu netto składników krwi pełnej, w nieizolowany lub statyczny sposób. Aby dać przykład konsekwencji mierzenia wyizolowanej części hemostazy, załóżmy, że u pacjenta rozwinęła się fibrynoliza, którą spowodowała aktywacja plazminogenu zmiana w plazminę, enzym, który rozbija skrzep. W takim przypadku produktem ubocznym tego procesu jest produkt degradacji fibrynogenu (FDP), który zachowują się jak antykoagulant. Jeśli pacjent jest badany tylko pod kątem przeciwzakrzepowym i jest zgodnie z tym leczony, to pacjent może pozostać w zagrożeniu z powodu nie leczenia środkami antyfibrynolitycznymi. [000] Końcowym rezultatem procesu hemostazy jest trójwymiarowa sieć spolimeryzowanych włókien fibryny (fibrynogenu), które razem z wiążącym glikoproteinowym receptorem płytkowym IIb/IIIa (GPIIb/IIIa) tworzy końcowy skrzep (FIG. 1).Unikalną cechą tej struktury sieci jest to, że zachowuje się jak mocne elastyczne ciało stałe, odporne na deformujące naprężenie ścinające krwi krążącej. Wytrzymałość końcowego skrzepu na deformujące naprężenie ścinające jest określone przez strukturę i gęstość sieci włókien fibryny i siły wywierane przez uczestniczące płytki. [0006] Wykazano, że płytki krwi wpływają na wytrzymałość mechaniczną fibryny na co najmniej dwa sposoby. Po pierwsze, działając jako węzeł punktów rozgałęzienia, co znacznie zwiększa twardość struktury fibryny. Po drugie, przez zastosowanie siły "ciągnięcia" na włóknach spowodowanej kurczliwością aktomiozyny płytkowej, białka mięśniowego, które jest częścią aparatu kurczliwości mediowanego przez cytoszkielet. Siła tej kurczliwości dodatkowo zwiększa wytrzymałość struktury fibryny. Receptor płytkowy GPIIb/IIIa wydaje się kluczowym w kotwiczeniu polimeryzujących włókien do bazowego cytoszkieletowego aparatu kurczliwego w aktywowanych płytkach, tym samym pośrednicząc w przeniesieniu siły mechanicznej.

3 [0007] W ten sposób skrzep, który rozwija się i adheruje do uszkodzonego układu naczyniowego jako skutek aktywowanej hemostazy, i stawia opór deformującemu naprężeniu ścinającemu krwi krążącej, jest niezbędnym mechanicznym środkiem formowanym w celu zapewnienia "tymczasowego korka", który jest odporny na naprężenie ścinające krwi krążącej podczas gojenia naczynia. Kinetyka, wytrzymałość i stabilność skrzepu, które są jego własnościami fizycznymi, do oparcia się deformującemu naprężeniu ścinającemu krwi krążącej, określenie jego zdolności do wykonania pracy przy hemostazie, którą jest zatrzymanie krwotoku bez pozwalania na niestosowną zakrzepicę. To jest dokładnie ten pomiar, dla którego opisany poniżej system Thrombelastograph (TEG ) został zaprojektowany, którym jest czas potrzebny do wstępnego formowania fibryny, czas potrzebny skrzepowi do osiągnięcia maksymalnej wytrzymałości, rzeczywista maksymalna wytrzymałość i stabilność skrzepu. [0008] Narzędzia analizatora hemostazy są znane odkąd profesor Helmut Hartert opracował takie urządzenie w Niemczech w 19 roku. Jeden typ analizatora hemostazy opisano we wspólnym Patencie US nr,223,227. WO opisuje sposoby ustalania terapii przeciwpłytkowej stosując dwie próbki krwi. To narzędzie, analizator hemostazy TEG, monitoruje elastyczne właściwości krwi po zaindukowaniu krzepnięcia w środowisku o niskim ścinaniu przypominającym słaby przepływ krwi żylnej. Wzory zmian elastyczności ścinania rozwijającego się skrzepu umożliwiają ustalenie kinetyki powstawania skrzepów, jak również wytrzymałości i stabilności utworzonego skrzepu; krótko mówiąc, właściwości mechaniczne rozwijającego się skrzepu. Jak opisano powyżej, kinetyki, wytrzymałość i stabilność skrzepu dostarczają informacji na temat zdolności do wykonywania przez skrzep "pracy mechanicznej", tj. opierania się deformującemu naprężeniu ścinającemu krwi krążącej; zasadniczo, skrzep jest elementarnym aparatem hemostazy, a analizator TEG mierzy zdolność skrzepu do wykonywania pracy mechanicznej w czasie jego rozwoju strukturalnego. System TEG mierzy w sposób ciągły wszystkie etapy hemostazy pacjenta jako produktu netto składników krwi pełnej, w nieizolowany lub statyczny sposób od momentu inicjacji testu do początkowego utworzenia fibryny, przez szybkość wzmocnienia skrzepu i ostatecznie wytrzymałość skrzepu przez wiązanie fibryny płytek za pomocą receptorów płytkowych GPIIb/IIIa i lizę skrzepu. [0009] Płytki krwi odgrywają kluczową rolę w pośredniczeniu w prozakrzepowych powikłaniach niedokrwiennych (zakrzepicy) u pacjentów. Zastosowanie środków hamujących GPIIb/IIIa u pacjentów z zakrzepicą lub jako dodatek do przezskórnej angioplastyki wieńcowej (PTCA) szybko staje się standardem opieki. Hamowanie receptora GPIIb / IIIa jest bardzo silną formą terapii przeciwpłytkowej, która może przyczynić się do zmniejszenia ryzyka zgonu i zawału mięśnia sercowego, ale może również powodować dramatyczne ryzyko krwotoku. Powodem potencjalnego krwawienia lub braku osiągnięcia odpowiedniego poziomu terapeutycznej inhibicji płytek krwi jest algorytm dostosowany pod kątem wagi leczenia blokerem płytek krwi, który jest używany, pomimo tego, że istnieje znaczne zróżnicowanie dla poszczególnych osób. Jest to problem, po części ze względu na różnice w liczbie płytek krwi i zmienności w liczbie receptorów GPIIb/IIIa na płytkę krwi i ich funkcjach wiązania liganda. [00] Od klinicznego wprowadzenia chimerycznego fragmentu przeciwciała mysie/ ludzkie Fab c7e3 (abciximab, ReoPro ), kilka syntetycznych postaci antagonistów GPIIb / IIIa, takich jak Aggrastat (tirofibanu) i INTEGRILIN (eptifibatydu), także zostało zatwierdzonych skutkując powszechniejszym i zwiększonym wykorzystaniem leczenia inhibitorem GPIIb/IIIa w procedurach kardiologii interwencyjnej. [0011] Przed wprowadzeniem sposobu i aparatu opisanego w wyżej wspomnianym zgłoszeniu patentowym US nr 09/91,371, nie istniał szybki, niezawodny, ilościowy dostępny w punktach opieki test do monitorowania terapeutycznego blokowania płytek krwi. Mimo, że turbidymetryczny test agregacji stosowano do pomiaru poziomu blokowania płytkowego receptora GPIIb / IIIa w małych badaniach klinicznych i badaniach dawki, jego rutyno-

4 we zastosowanie kliniczne do ustalania dawki antagonistów receptora GPIIb / IIIa u indywidualnych pacjentów było niewykonalne. Agregacja jest czasochłonna (więcej niż godzina), droga do przeprowadzenia, wymagająca do jej wykonania wyspecjalizowanego personelu i nie łatwo dostępna przez całą dobę; w związku z tym nie może być wykorzystana w punktach opieki do rutynowego monitorowania pacjenta i indywidualizacji dawki. Aby być klinicznie przydatnym, test inhibicji płytek krwi musi zapewniać szybką i niezawodną informację o blokadzie receptora przy łóżku pacjenta, umożliwiając tym samym modyfikację dawki w celu osiągnięcia pożądanego efektu przeciwpłytkowego. [0012] Turbidymetryczny test agregacji, oparty na regule fotometrycznej, monitoruje zmiany gęstości optycznej próbki. Początkowo przez próbkę przechodzi minimalna ilość światła, a funkcjonalne płytki krwi są aktywowane przez turbidymetryczny test; agregacja płytek krwi występuje przez receptor płytkowy GPIIb / IIIa i fibryna (fibrynogen) wiąże się jak pokazano na Figurze 1, a tym samym wzrasta transmisja światła. Gdy płytki krwi są inhibowane przez blokowanie receptora GPIIb/IIIa proporcjonalnie wzrasta transmisja światła. [0013] Inny komercyjnie dostępny system mierzy wiązanie fibrynogen-płytki krwi wykorzystując kulki pokryte ustaloną ilością zewnętrznego źródła "normalnego" fibrynogenu. W związku z tym, system ten wykorzystuje źródło "normalnego" fibrynogenu nie pochodzące od człowieka i nie jest w stanie wykryć pacjenta w stanie prozakrzepicznym (nadkrzepliwość) ze względu na wyższy poziom fibrynogenu u pacjenta, lub wykryć stan krwotoczny (niska krzepliwości krwi) ze względu na niski poziom fibrynogenu u pacjenta. Dodatkowo system ten pokazuje tylko wiązanie bez wykrywania przerywania tego wiązania. Dlatego też w obecności trombolizy ocena blokowania płytkowego receptora GPIIb / IIIa przez system nie może być dokładna. [0014] Wiązanie fibrynogen-płytkowy GPIIb / IIIa jest początkowym etapem agregacji płytek krwi, lub pierwotnym hemostatycznym korkiem płytkowym, który przekształca się formując końcowe wiązanie fibryna-płytki krwi. Tak więc pomiar tylko początkowego etapu wiązania fibrynogen-płytki krwi nie jest to wystarczający, ponieważ może nie odzwierciedlać końcowego wiązania, za pośrednictwem receptora GPIIb/IIIa, fibrynogenpłytki krwi. Ponieważ turbidymetryczne i inne fotometryczne systemy wykrywają początkową agregację płytek krwi przez wiązanie fibrynogen-receptor płytkowy GPIIb / IIIa, może nie odzwierciedlać to końcowego wiązania fibryna-płytki krwi przez receptor GPIIb / IIIa. [001] Znaczącym spośród ograniczeń systemów wykorzystujących kulki pokryte "normalnym" fibrynogenem jest to, że "normalny" fibrynogen może nie odzwierciedlać zarówno ilość jak i funkcjonalności własnego fibrynogenu konkretnego pacjenta. Dlatego blokowanie fibrynogen-receptor płytkowy GPIIb/IIIa mierzone przez takie systemy jest jednak przybliżonym szacowaniem blokowania fibrynogen-płytkowy GPIIb/IIIa początkowej fazy agregacji płytek krwi indywidualnego pacjenta. [0016] Jest to znaczące ograniczenie w niektórych podgrupach pacjentów wysokiego ryzyka, którzy mogą wymagać leczenia z zastosowaniem środka hamującego agregację płytek krwi, mogą mieć wyższy lub niższy poziom fibrynogenu i dlatego potrzebowaliby dokładnej oceny płytek blokowania płytkowego receptora GPIIb/IIIa w celu zmniejszenia powikłań krwotocznych spowodowanych zbyt niskim oszacowaniem blokowania płytkowego receptora GPIIb/IIIa lub na skutek zdarzeń niedokrwiennych zbyt wysokim oszacowaniem blokowania płytkowego receptora GPIIb/IIIa. Dodatkowo, poziom fibrynogenu i funkcjonalność mogą ulec zmianie podczas urazu związanego z procedurami interwencyjnymi. W tym czasie konieczne jest dokonanie dokładnej oceny blokowania płytkowego receptora GP IIb / III w czasie rzeczywistym, w trakcie i po procedurze. [0017] Tak więc, istnieje potrzeba opracowania sposobu i aparatu do pomiaru skuteczności środków przeciwpłytkowych w sposób ciągły i w ciągu całego procesu hemostazy od początkowego tworzenia się skrzepu po lizę.

5 Krótki opis rysunków [0018] FIG. 1 jest graficzną ilustracją przedstawiającą mechanizm agregacji płytek krwi. FIG. 2 jest schematycznym diagramem analizatora hemostazy zgodnym z korzystnym przykładem wykonania wynalazku. FIG. 3 jest wykresem ilustrującym profil hemostatyczny generowany przez analizator hemostatyczny pokazany na Fig. 2. FIGs. 4- są schematycznymi ilustracjami przedstawiającymi aktywację płytek krwi w odpowiedzi na różne antagonistyczne środki. FIG. 11 ilustruje kilka profili hemostatycznych związanych z aktywacją płytek krwi opisanych w związku z Fig. 4- FIG. 12 jest schematycznym diagramem analizatora hemostazy według alternatywnego przykładu wykonania wynalazku. Szczegółowy opis korzystnych przykładów wykonania [0019] Zakres ochrony jest ograniczony jedynie przez zastrzeżenia. [00] Zgodnie z korzystnymi przykładami wykonania według wynalazku analizator hemostazy, taki jak analizator hemostazy Thrombelastograph (TEG ) dostępny od Haemoscope Corp., Skokie, Illinois, jest wykorzystywany do ciągłego pomiaru procesu hemostazy w czasie rzeczywistym, od początkowego formowania fibryny przez wiązanie GPIIb/IIIa płytki krwi-fibryna i lizę. Ponieważ kilka specyficznych środków przeciwpłytkowych jest tu omówionych w związku z korzystnymi przykładami wykonania wynalazku, należy rozumieć, że wynalazek ma zastosowanie w połączeniu z praktycznie każdym środkiem przeciwpłytkowym. Co więcej, będzie ponadto zrozumiałe, że wynalazek ma zastosowanie w mierzeniu skuteczności zwiększania krzepliwości lub środków aktywujących płytki krwi. [0021] Zgodnie z korzystnymi przykładami wykonania wynalazku wykorzystywanie analizatora hemostazy zgodnie z protokołem wynalazku pozwala na: potwierdzenie osiągnięcia terapeutycznego poziomu zablokowania receptora GPIIb / IIIa; zindywidualizowanie oszacowania dawkowania do oceny odpowiedniego zablokowania receptora GPIIb / IIIa; zindywidualizowanie oszacowania dawkowania jest niezbędne do osiągnięcia odpowiedniego zablokowania receptora GPIIb / IIIa; zobrazowanie tempa osłabienia inhibicji płytek krwi lub regeneracja po inhibicji po leczeniu lekami hamującymi płytki krwi; ocena efektu oddziaływania kombinacji środków trombolitycznych i hamujących płytki krwi przy hemostazie u pacjenta. [0022] Wynalazek może wykorzystywać analizator hemostazy, taki jak wymieniony powyżej analizator hemostazy Thrombelastograph (TEG ), w celu pomiaru właściwości fizycznych skrzepu. Przykładowy analizator hemostazy jest szczegółowo opisany w wyżej wspomnianym patencie US 6,22,126 i nie omówiono go tu w pełni. Jednak w odniesieniu do FIG. 2, aby pomóc w zrozumieniu wynalazku, przedstawiono krótki opis analizatora hemostazy. Analizator hemostazy wykorzystuje specjalny nieruchomy cylindryczny kubek 12,w który przechowuje się próbki krwi 13. Kubek 12 jest połączony z mechanizmem napędowym, który powoduje, że kubek oscyluje w zakresie kąta 0, korzystnie około 4 4'. Każdy cykl rotacji trwa sekund. Za pomocą przewodu skrętnego 1 w próbce krwi 13 jest zawieszona iglica 14 i monitoruje się ruch iglicy 14. Moment obrotowy obracającego kubka 12 jest przesyłany do zanurzonej iglicy 14 tylko gdy wiązanie fibrynapłytki krwi połączy kubek 12 i iglicę 14 razem. Siła tych wiązań fibryna-płytki krwi wpływa na nasilenie ruchu iglicy, tak że silne skrzepy przesuwają iglicę 14 bezpośrednio w fazie ruchu kubka. Dlatego moc sygnału jest bezpośrednio związana z wytrzymałością

6 1 utworzonego skrzepu. Gdy skrzep kurczy się lub ulega lizie wiązania te są zrywane i zmniejsza się przeniesienie ruchu na kubek. [0023] Ruch obrotowy iglicy 14 jest przetwarzany przez przetwornik 16 na sygnał elektryczny, który może być monitorowany przez komputer (nie pokazano na FIG. 2) włączając procesor i program sterujący. [0024] Komputer może pracować na sygnale elektrycznym w celu utworzenia profilu hemostazy odpowiadającego zmierzonemu procesowi krzepnięcia. Ponadto komputer może obejmować wyświetlacz lub może być połączony z drukarką, aby zapewnić wizualne przedstawienie profilu hemostazy. Taka konfiguracja komputera mieści się w zakresie umiejętności przeciętnego znawcy w dziedzinie. [002] Co również zostanie opisane, na podstawie oceny profilu hemostazy, komputer przez jego program kontrolny, może zostać dostosowany tak, aby dostarczać zalecenia dawkowania. Jak pokazano na FIG. 3, powstały profil hemostazy jest pomiarem czasu potrzebnego do uformowania pierwszego włókna fibryny, kinetyki tworzenia się skrzepu, wytrzymałości skrzepu (mierzonej w milimetrach (mm) i zostaje przekształcony w jednostki sprężystości poprzecznej dyn / cm 2 ) i rozpad skrzepu. Tabela I, poniżej, dostarcza definicji kilku z tych zmierzonych parametrów. Tabela I R α MA Czas R jest czasem utajenia od momentu gdy krew umieszczono w analizatorze TEG do początkowego formowania fibryny. miara szybkości gromadzenia się fibryny i sieciowania (wzmacnianie skrzepu) MA, lub maksymalna amplituda w mm, jest bezpośrednią funkcją maksymalnych właściwości dynamicznych wiązania przez GPIIb / IIIa fibryny i płytek krwi i oznacza końcową wytrzymałość skrzepu fibrynowego. LY LY mierzy szybkość redukcji amplitudy po minutach po MA i reprezentuje rozpad skrzepu lub lizę. 2 3 [0026] Klinicznie pomiary te zapewniają nośnik do monitorowania terapii przeciwzakrzepowej (np. heparyna lub warfaryna), terapii trombolitycznej (np tpa, streptokinaza, urokinaza), działania antyfibrynolityków (np. kwas ε-amino-kapronowy (Amicar ), trasylolu (aprotynina ), kwasu traneksamowego (TX)), działania leków przeciwpłytkowych (np. abciximab (ReoPro ), eptyfibatydu (INTEGRILIN ), tirofibanu (Aggrastat ), terapii transfuzji składnikami krwi, oceny ryzyka zakrzepu przy nowotworze i zakażeniu, operacji wysokiego ryzyka i innych stanów, które mogą prowadzić do nadmiernego krzepnięcia (warunki nadkrzepliwości) lub nadmiernego krwawienia (warunki niskiego krzepnięcia). Wówczas według wynalazku analizator hemostazy jest przydatny do testowania skuteczności klinicznej terapii lekowej w zatrzymywaniu fibrynolizy, lub skuteczności leków trombolitycznych do monitorowania trombolizy, skuteczności środków przeciwpłytkowych do monitorowania inhibicji płytek krwi, powikłań niedokrwiennych lub krwotocznych. [0027] Analizator hemostazy i związany z nimi komputerowy wykres wytrzymałości skrzepu w funkcji czasu, w którym ilościowo rejestruje się początek tworzenia się skrzepu, czas reakcji (R) (Fig. 3). Wykres ten pokazuje również maksymalną wytrzymałość skrzepu (lub sztywność) i MA próbki krwi. MA jest ogólnym oszacowaniem wiązania płytki krwifibryna GPIIb / IIIa, która jest stosowana, na przykład, do prowadzenia pooperacyjnej terapii zastępczej płytek krwi lub fibrynogenu. Pomiędzy samymi płytkami krwi i fibryną rażąco niska MA oznacza, że są nieprawidłowości w płytkach krwi (tj. wady ilościowe lub funkcjonalne) i / lub nieprawidłowości w zawartości fibrynogenu we krwi. Jednak przez utrzymywanie na stałym poziomie fibrynogenu i ilości płytek krwi wszystkie zmiany MA

7 będą odzwierciedlać zmiany w czynności płytek krwi. W związku z tym badanie tej samej próbki krwi dwoma sposobami, jeden ze środkiem przeciwpłytkowym i jeden bez, pokaże różnice pomiędzy dwoma MA co odzwierciedli wpływ czynnika przeciwpłytkowego na funkcję płytek. [0028] Płytki odgrywają kluczową rolę w mediowaniu komplikacji niedokrwiennych skutkujących udarem i zawałem mięśnia sercowego. Inhibicja czynności płytek krwi przez środki przeciwpłytkowe (leki blokujące płytki krwi), takie jak aspiryna, fragment przeciwciała c7e3 Fab, abciximab (ReoPro ) lub klopidogrel (Plavix ), może spowodować dramatyczne zmniejszenie ryzyka zgonu, zawału mięśnia sercowego lub reokluzji po przezskórnej śródnaczyniowej angioplastyce wieńcowej (PTCA) lub dotętniczej terapii trombolitycznej (IATT). Podawanie nadmiernej ilości środków przeciwpłytkowych może prowadzić do zagrażającego życiu krwotoku. Dlatego dokładne oszacowanie inhibicji funkcji płytek krwi u danego pacjenta jest bardzo ważne dla monitorowania leczenia farmakologicznego ze względu na wąskie ryzyko / stosunek terapeutyczny w tej klasie leków. [0029] Stosując powyższą strategię, która utrzymuje na stałym pozie fibrynogen i liczbę płytek krwi, możliwe jest odpowiednie podawanie i monitorowanie leków przeciwpłytkowych lub modyfikowanie ich dawek lub pomiar udziału fibryny w MA (MAFIB) i przez odejmowanie pomiar czystego udziału płytek krwi w MA (MAP) jako MAP = MA - MAFIB. [00] Dlatego też, według korzystnych przykładów wykonania wynalazku, aby prawidłowo monitorować środki przeciwpłytkowe, należy postępować według następującej procedury: 1. Analizator hemostazy, jak to jest powszechnie stosowane, mierzy funkcję płytek krwi (MA lub MAP), które są stymulowane przez trombinę, silny aktywator płytek krwi bezpośrednio aktywujący miejsce receptorowe GPIIb/IIIa. W celu uwrażliwienia MA lub MAP na małą inhibicję płytek krwi, funkcja płytek krwi powinna zostać aktywowana przez mniej silny, niż trombina, aktywator płytek, taki jak ADP, które pośrednio aktywuje miejsce receptorowe GPIIb / IIIa. W związku z tym, podczas badania próbek krwi w analizatorze hemostazy w takim przypadku, tworzenie trombiny jest hamowane, na przykład, cytrynianem sodu, heparyną, hirudyna, itp., a ADP i jest używany w celu aktywacji funkcji płytek. 2. Niestety trombina jest również zaangażowana w aktywację konwersji fibrynogenu do fibryny. Mając zahamowane powstawanie trombiny w etapie 1 konieczne jest zastosowanie innego enzymu do aktywacji fibrynogenu. Odpowiednim enzymem jest reptylaza, której jedyną funkcją jest aktywacja konwersji fibrynogenu do fibryny. Skrzep jest teraz stymulowany przez reptylazę (aktywacja fibrynogenu) i ADP (aktywacja płytek krwi). Wytrzymałość skrzepu mierzone jest przez MA, a udział funkcji płytek w wytrzymałości skrzepu mierzy MAP, jak opisano powyżej. 3. Skrzep, który jest utworzony przez aktywator fibrynogenu taki jak reptylaza i aktywator płytek krwi taki jak ADP jest zwykle słabszy niż wytworzony przez trombinę. Dlatego też można wybrać opisany powyżej przewód skrętny 1, który jest wrażliwszy na słabszy skrzep i jest w stanie zmierzyć zmiany MA i MAP pod kątem niewielkie wpływ środków przeciwpłytkowych takich jak ReoPro. Alternatywnie, można dodać aktywowany Czynnik XIII (Czynnik XIIIa). Czynnik XIIIa powoduje modyfikację wiązania fibryna-płytki krwi z wiązania wodorowego na silniejsze wiązanie kowalencyjne, zwiększając tym samym siłę skrzepu. [0031] W oparciu o powyższe, może zostać wdrożony następujący protokół: 1. Konieczna modyfikacja drutu skrętnego w analizatorze hemostazy : wytwarzanie drutów o różnej sile skrętu do różnych czułości w stosunku do siły ścinającej, odpowiednie do pomiarów wpływu środków przeciwpłytkowych o różnej sile, które mogą być poddawane pomiarom. Wrażliwość drutu skrętnego jest zasadniczo związana z je-

8 7 1 go przekrojem. W celu zwiększenia czułości przewody skrętne mające przekrój nadający czułość wykrywania skrzepu w zakresie od około do około 00 dyn / cm 2 są odpowiednie do dostosowania do analizatora hemostazy opisanego we wspomnianym powyżej patencie US 6,22, Wzbudzona reptylazą aktywowana agonistą próbka krwi: wykorzystany zostanie Batroxabin (reptylaza, Pentapharm) (1 µl przygotowanego reagenta reptylaz) i wstępnie dodany do kubka 12 w celu aktywacji fibrynogenu do fibryny. Oprócz Batroxabin, do kubka 12 zostanie wstępnie dodany ADP (stężenie końcowe µm) oraz µm Czynnika XIIIa. 3 µl pełnej krwi z zahamowaną trombiną (np. cytrynianem, heparynizowana, itd.) zostanie dodana do ogrzanego kubka 12 zawierającego Batroxabin ADP i Czynnik XIIIa i zostanie oszacowana maksymalna wytrzymałość skrzepu. Ponadto, próbka kontrolna, u której następuje całkowite zahamowanie wpływ płytek krwi w wytrzymałość skrzepu (MAFIB), zostanie również wystawiona na działanie Batroxabin oraz środka przeciwpłytkowego dodanych do kubka 12, zapewniając pomiar wpływu fibryny na wytrzymałość skrzepu krzepnięcie siły przy braku rozciągającego działania płytek krwi. [0032] MAPB mierzono przed leczeniem pacjenta środkiem przeciwpłytkowym oraz MAPA mierzono po zakończeniu leczenia. Inhibicja płytek krwi pod kątem działania leku będzie obliczana w następujący sposób: Inhibicja leku = MAPB + MAFIB [0033] Dla znawcy w dziedzinie będzie zrozumiałe, że do opisanego powyżej pomiaru wytrzymałości skrzepu może być wymagany przewód skrętny, który jest czuły na zwykle słabiej, w warunkach inhibicji trombiny, uformowany skrzep. Jednak różne protokoły badań mogą badać skrzepy o wytrzymałości w zakresie równym lub większym niż typowe bazujące na trombinie. W takich przypadkach przewód skrętny 1 zostanie wybrany aby być czułym na takie bardziej wytrzymałe skrzepy. Mogą wiec zostać wykorzystane druty skrętne o kilku przekrojach zapewniających szeroki zakres czułości od 0 dyn/cm 2 do 00 dyn/cm 2. [0034] Należy ponadto zauważyć, że wynalazek ma zastosowanie w pomiarach innych parametrów powstawania skrzepu. Na przykład, analizator hemostazy mierzy proces krzepnięcia krwi od czasu inicjacji testu, od wstępnego formowania fibryny, przez szybkość wzmacniania skrzepu i lizę skrzepu. Dlatego też, zgodnie z wynalazkiem, możliwe jest, aby zmierzyć wpływ obecności heparyny przez ocenę parametru R, który, jak opisano powyżej, pokazuje inhibicję wstępnego formowania fibryny. Jest również możliwe zmierzenie skuteczności terapii lekowej na aktywność trombolityczną przez obserwację parametru LY, który pokazuje szybkość lizy skrzepu. [003] Dobrze udokumentowane jest istnienie znacznej osobniczej zmienności liczby receptorów GPIIb / IIIa na płytkę krwi i jego funkcji wiązania liganda. Ponadto zmienna inhibicja funkcji GPIIb / IIIa, częściowo ze względu na różnice liczby płytek krwi, może wystąpić po podaniu dopasowanej na podstawie wagi dawki blokera płytek krwi. Podgrupy pacjentów wyższego ryzyka, tacy jak pacjenci z cukrzycą poddawani przezskórnej angioplastyce wieńcowej (PTCA), mogą wymagać większych dawek blokera płytek krwi niż jest obecnie osiągane po leczeniu blokerem dopasowanym na podstawie wagi, która w tym momencie nie jest zindywidualizowana w celu zapewnienia osiągnięcia odpowiedniej blokady receptora GPIIb/IIIa. Potencjalne zdarzenia krwotoczne lub niedokrwienne wskazują na potrzebę zindywidualizowania oszacowania i opracowania potrzebnej dawki w celu za-

9 pewnienia osiągnięcia terapeutycznego poziomu blokady receptorów w czasie rzeczywistym. Aparat i sposób według korzystnych wykonań wynalazku zapewnia taką możliwość. [0036] W przeciwieństwie do środków skierowanych bezpośrednio na inhibicję receptora GPIIb/IIIa płytek krwi, Plavix (klopidogrel) jest płytkowym antagonistą receptora dla adenozynodifosforanu (ADP) hamującym klasę receptorów ADP mediujących aktywację receptorów GPIIb/IIIa płytek krwi. Plavix jest przyjmowany doustnie, zazwyczaj w postaci nasycającej dawki czterech tabletek 7 mg, a następnie długoterminowym leczeniu jedną tabletką 7 mg na dobę przed i po PTCA lub pacjentów z wysokim ryzykiem zdarzeń niedokrwiennych. Algorytm Plavix dyktuje to samo dawkowanie niezależnie od masy ciała pacjenta lub profilu hemostatycznej. W związku z tym leczenie Plavix może spowodować zwiększenie krwawienia lub brak osiągnięcia odpowiedniego poziomu terapeutycznego inhibicji płytek krwi. W związku z tym istnieje potrzeba przepisywania i monitorowania zindywidualizowanego dawkowania środków hamujących zarówno receptor płytkowy GPIIb / IIIa jak i receptor ADP (PI). [0037] Innym agonistą płytek jest Tromboksanu A2 (TxA2), który aktywuje receptor tromboksanu A2. RKiedy receptory tromboksanu A2 zostaną aktywowane pośredniczą w aktywacji receptorów GPIIb / IIIa. Cyklooksygenaza jest enzymem niezbędnym w wytwarzania tromboksanu A2 i jest hamowana przez niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ). [0038] Rezultatem aktywowanego białka krzepnięcia jest włókno fibryny, który razem z aktywowanymi płytkami krwi na GPIIb / IIIa tworzy wiązanie fibryna(fibrynogen) płytki krwi w celu wytworzenia końcowego skrzepu. Dlatego w celu wystąpienia, lub mającego nastąpić wiązania fibryna(fibrynogen) płytki krwi, musza zostać aktywowane receptory GFIIb/IIIa. Dlatego agoniści płytek krwi są skonstruowani pod kątem aktywacji receptora GFIIb / IIIa bezpośrednio, przez trombinę, lub pośrednio przez ADP i tromboksanu A2. W związku z tym leki inhibitory płytkowe są specyficznie ukierunkowane na hamowanie tych agonistów jak zilustrowano na FIG. 4-. [0039] W odniesieniu do FIG. 4-, płytki krwi mają miejsce wiązania na receptorze GPIIb / IIIa 32, ADP ma miejsce wiązania receptora 34, a TxA2 ma miejsce wiązania receptora 36. Jak pokazano na FIG. 4, dodanie agonisty receptora ADP aktywuje miejsce wiązania receptora ADP 34 (pokazane przez strzałkę 38), które aktywuje miejsce wiązania receptora GPIIb / IIIa (pokazane przez strzałkę ). Agonista płytkowego receptora dla adenozynodifosforanu (ADP), taki jak Plavix, miejsce wiązania receptora ADP 34 (fantomowa strzałka 42 na FIG. ), a tym samym miejsce GPIIb / IIIa nie jest aktywowane w odpowiedzi na obecność agonisty ADP (fantomowa strzałka 44). Dlatego też w obecności antagonisty receptora ADP agonista ADP aktywuje tylko płytki krwi, które nie są zahamowane. Powoduje to zmniejszenie wytrzymałości skrzepu, pokazane jako podkreślone MApi na FIG. 11, w porównaniu do wytrzymałości skrzepu z pełną aktywacją płytkową pokazaną jako podkreślone MAkh na FIG. 11. [00] ReoPro, Integrilin i Aggrastat hamują receptor GPIIb / IIIa 32 bezpośrednio. Gdy dodany zostanie agonista ADP aktywuje on receptor ADP 34 (strzałka 46 na FIG. 6), ale zatrzymuje się na receptorze GPIIb / IIIa (fantomowa strzałka 48). Dlatego też w obecności inhibitorów GPIIb / IIIa tylko nieinhibitowane płytki krwi zostaną aktywowane przez agonistę ADP powodując odpowiednio zmniejszoną wytrzymałość skrzepu, np. MApi pokazany na FIG. 11. [0041] Tromboksan A2 aktywuje receptor płytkowy TxA2 36 (strzałka 0 na FIG. 7), co z kolei aktywuje receptor GPIIb / IIIa 32 (strzałka 2). Kwas arachidonowy (AA) jest prekursorem tromboksanu A2 i przekształca się tromboksan A2 w obecności cyklooksygenazy. Niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ) hamują cyklooksygenazę (fantomowa strzałka 4 na FIG. 8) i dlatego w obecności agonisty TxA2 (fantomowa strzałka 6miejsce GPIIb / IIIa również nie jest aktywowane powodując odpowiednie zmniejszenie wytrzymałości skrzepu, np. MApi na FIG. 11. W związku z tym agonista płytkowy AA może aktywować tylko miejsce GPIIb/IIIa, gdy nie zostały przyjęte NLPZ 32.

10 [0042] Trombina jest enzymem, który rozszczepia rozpuszczalny fibrynogen do postaci włókien fibryny. Jest to również najsilniejszy aktywator płytek krwi, silnie i bezpośrednio zwiększający ekspresję i aktywację receptorów płytkowych GPIIb/IIIa (strzałka 8 na FIG. 9). Środki ReoPro, Integrilin i Aggrastat hamują odpowiedź receptorów GPIIb/IIIa na agonistów ADP lub TxA2; jednakże trombina i tak spowoduje aktywację GPIIb / IIIa (strzałka 60 na FIG. ). Pewne testy hemostazy, takie jak wyżej opisany test TEG, mogą być przystosowane do wytwarzania trombiny w procesie tworzenia skrzepu. Zwiększona ekspresja i silna aktywacja płytkowego GPIIb / IIIa przez trombinę przezwycięża inhibitory GPIIb / IIIa w celu zapewnienia wytrzymałości skrzepu przy pełnej aktywacji płytkowej (MAkh na FIG. 11). [0043] Bazując na powyższej dyskusji, jest zatem możliwe dokładne określenie protokołu do monitorowania inhibitorów płytek krwi, takich jak inhibitory płytkowe GPIIb / IIIa, ADP i tromboksanu A2. Odnosząc się do FIG. 12, aparat ' może obejmować wiele aparatów do analizy hemostazy, takich jak analizator hemostazy pokazany na FIG. 2, i cztery pokazano jako urządzenia a, b, c i d, analizujące odpowiednie próbek krwi, odpowiednio, 13a, 13b, 13c i 13d. [0044] Pierwszą próbkę 13a heparynizowanej pełnej krwi przygotowano i załadowano do pierwszego analizatora hemostazy a. Do kubka na próbkę 12 dodano aktywator fibryny 17, taki jak kombinacja reptylazy i czynnika XIIIa. Aktywator 17 może być wcześniej dodany do kubka na próbkę 12 lub kubek 12 może być traktowany aktywatorem 17. Alternatywnie, aktywator 17 może być dodany do próbki krwi 13a po tym jak zostanie dodana do kubka 12. Około µl aktywatora 17 dodaje się do 3µl próbki krwi. Test jest zakończony i mierzy się wytrzymałość otrzymanego skrzepu. W związku z brakiem jakiegokolwiek agonisty płytek krwi ta wytrzymałość skrzepu może być określona jako MAf, gdyż stanowi jedynie udział fibryny zasadniczo bez aktywacji płytek krwi. [004] Drugą próbkę 13b heparynizowanej pełnej krwi przygotowano i załadowano do drugiego analizatora hemostazy b. Należy mieć na uwadze, że może zostać zastosowany analizator homeostazy z pojedynczą komorą kolejno dla każdego z testów, może zostać zastosowany analizator z więcej niż jedną komorą lub może zostać zastosowany analizator wielokomorowy. Na przykład, analizator hemostazy TEG w standardowej konfiguracji posiada dwie komory do badań, które mogą działać jednocześnie. Dwa analizatory hemostazy TEG mogą zostać zastosowane do wykonywania każdego z czterech testów zgodnie z tym przykładowym protokołem lub może zostać zastosowany jeden analizator hemostazy TEG. Co więcej, dwa analizatory hemostazy TEG może zostać połączone w sieć dając w istocie jedno urządzenie do testowania czterech komórek. [0046] Dla drugiej próbki 13b, do próbki zostaje dodany aktywator 17, a także, w odpowiedniej proporcji, do drugiej próbki 13b zostaje dodany agonista ADP 18. Na przykład, µm agonisty ADP może zostać dodane do 3µl drugiej heparynizowanej próbki pełnej krwi. Test jest zakończony i mierzy się wytrzymałość otrzymanego skrzepu. Ta wytrzymałość skrzepu może być określona jako MApi1, ponieważ przedstawia udział fibryny i płytek krwi niezahamowanych podaniem żadnego środka ADP hamującego płytki. W związku z brakiem jakiegokolwiek agonisty płytek krwi ta wytrzymałość skrzepu może być określona jako MAf, gdyż stanowi jedynie udział fibryny zasadniczo bez aktywacji płytek krwi. [0047] Trzecią próbkę 13c heparynizowanej pełnej krwi przygotowano i załadowano do trzeciego analizatora hemostazy c. Aktywator fibryny 17 dodano do próbki 13c, a także, w odpowiedniej proporcji, do trzeciej próbki 13c dodano agonistę tromboksanu A2 19. Na przykład, µl kwasu arachidonowego (AA) może zostać dodane do 3µl trzeciej heparynizowanej próbki pełnej krwi. Test jest zakończony i mierzy się wytrzymałość otrzymanego skrzepu. Ta wytrzymałość skrzepu może być określona jako MApi2, ponieważ przedstawia udział fibryny i płytek krwi niezahamowanych podaniem żadnego środka TxA2 hamującego płytki.

11 1 2 [0048] Czwartą próbkę 13d heparynizowanej pełnej krwi przygotowano i załadowano do czwartego analizatora hemostazy d. Dla czwartej próbki 13d, heparynazę 21 i kaolin 22 zastosowano w celu zneutralizowania działania heparyny w czwartej próbce 13d. Test jest zakończony i mierzy się wytrzymałość otrzymanego skrzepu. Ta wytrzymałość skrzepu może być określona jako MAkh, i mierzy ona maksimum MA aktywacji płytkowej ze względu na wykorzystanie heparynazy i kaolinu do neutralizacji heparyny w próbce 13d co umożliwia wytwarzanie trombiny, która aktywuje receptory GPIIb / IIIa. [0049] Wartość MApi-MAf mierzy unikalny udział niezahamowanych przez środki PI płytek krwi, gdzie hamowanie płytek krwi nastąpić przez Reopro, Aggrastat, Integrilin, ADP i NLPZ. Procentowe zmniejszenie MA w skutek hamowania płytek krwi jest następnie obliczane dla każdej z MApi1 i MApi2 według równania: Procent aktywacji płytkowej = [(MApi - MAf)( MAkh - MAf)] * 0 gdzie wartość MAkh-MAf mierzy unikalny udział w pełni aktywowanych płytek krwi. W ten sposób lekarz może obserwować efekt terapii zahamowania płytek, odizolowany od efektów składowych i zalecić odpowiednie dawkowania. Alternatywnie, można ustalić procent inhibicji płytkowej jako 0-[(MApij-MAf)/MAkh-MAf)] * 0. [000] Zrozumiałe będzie, że kubki na próbki 12 w powyższych testach mogą być przygotowane wcześniej i zawierać odpowiednie środki zgodnie z powyższym opisem protokołu. W tym względzie, kubki na próbki mogą zostać oznaczone kolorami, aby zidentyfikować poszczególne substancje znajdujące się we wnętrzu kubka. Zestawy kubków na próbki 12 mogą być paczkowane w celu ułatwienia testów. Ponadto, materiały będące środkami, na przykład, aktywator 17, mogą być rozpowszechniane w kolorowych fiolkach w celu ułatwienia identyfikacji i ładowania do kubków na próbki 12 albo przed albo po załadowaniu odpowiedniej próbki krwi do kubka na próbkę. [001] Wynalazek został opisany w odniesieniu do kilku korzystnych przykładów wykonania. Znawca w dziedzinie zrozumie, że wynalazek może być zrealizowany w inny sposób bez odchodzenia od jego prawdziwego zakresu, który jest przedstawiony w załączonych zastrzeżeniach. Zastrzeżenia patentowe Sposób obejmujący: pierwszą próbkę krwi z aktywatorem fibryny obejmującym co najmniej jeden z grupy reptylazy i czynnika XIIIa i badanie pierwszej próbki krwi w celu określenia charakterystyki pierwszej próbki krwi przy zasadniczej nieobecności aktywacji płytkowej, przy czym charakterystyka pierwszej próbki krwi reprezentuje udział fibryny w hemostazie; drugą próbkę krwi z aktywatorem miejsca ADP lub aktywatorem miejsca tromboksanu A2 i badanie drugiej próbki krwi w celu określenia charakterystyki drugiej próbki krwi przy obecności terapii przeciwpłytkowej, przy czym charakterystyka drugiej próbki krwi reprezentuje udział aktywowanych płytek krwi w hemostazie przy obecności terapii przeciwpłytkowej; trzecią próbkę krwi w celu zneutralizowania terapii przeciwzakrzepowej i określenia charakterystyki trzeciej próbki krwi przy obecności zasadniczo niezahamowanej aktywacji płytkowej, przy czym charakterystyka trzeciej próbki krwi reprezentuje udział zasadniczo pełnej aktywacji płytkowej w hemostazie; oraz określanie parametru wskazującego na skuteczność terapii przeciwpłytkowej opartej na charakterystykach pierwszej, drugiej i trzeciej próbki krwi. 2. Sposób według zastrzeżenia 1, przy czym parametr obejmuje procent aktywacji płytkowej.

12 11 3. Sposób według zastrzeżenia 1, przy czym aktywator ADP obejmuje agonistę ADP. 4. Sposób według zastrzeżenia 1, przy czym aktywator miejsca tromboksanu A2 obejmuje kwas arachidonowy.. Sposób według zastrzeżenia 1, przy czym etap przygotowania trzeciej próbki krwi w celu zneutralizowania leczenia przeciwzakrzepowego obejmuje podawanie co najmniej jednego z kaolinu i heparynazy. 6. Sposób według zastrzeżenia 1 obejmujący zasadniczo równoczesne badanie pierwszej, drugiej i trzeciej próbki krwi. 7. Sposób według zastrzeżenia 1 obejmujący dostarczenie pierwszego, drugiego i trzeciego analizatora hemostazy i równoczesne badanie pierwszej, drugiej i trzeciej próbki krwi. 8. Sposób według zastrzeżenia 7, przy czym pierwszy, drugi i trzeci analizator hemostazy obejmuje pierwszą, drugą i trzecią komorę testową pojedynczego analizatora hemostazy. Uprawniony: Pełnomocnik: Cora Healthcare, Inc. mgr Katarzyna Rudnicka Rzecznik patentowy

13 12

14 13

15 14

16 1