Możliwości diagnostyki i śledzenia skuteczności leczenia wybranych nowotworowych schorzeń hematologicznych przy pomocy markerów molekularnych

Transkrypt

1 PRACA POGLĄDOWA Review Article Acta Haematologica Polonica 2011, 42, Nr 1, str MAGDALENA ZAWADA, SYLWIA CZEKALSKA, IZABELA FLOREK, TOMASZ SACHA, KAJETANA FORYCIARZ, ELŻBIETA PĘCEK, ALEKSANDER B. SKOTNICKI Możliwości diagnostyki i śledzenia skuteczności leczenia wybranych nowotworowych schorzeń hematologicznych przy pomocy markerów molekularnych Molecular markers as a tool for diagnostics and treatment efficacy monitoring in selected neoplastic haematological disorders Katedra i Klinika Hematologii Uniwersytet Jagielloński Collegium Medium, Kraków Kierownik: Prof. dr hab. med. Aleksander B. Skotnicki Dwaj pierwsi współautorzy mają jednakowy udział w tworzeniu artykułu STRESZCZENIE W niniejszym opracowaniu przedstawiono aktualny stan wiedzy dotyczący aberracji molekularnych leżących u podłoża schorzeń hematologicznych (nowotwory mieloproliferacyjne, białaczki ostre i przewlekłe) znaczenia ich wykrywania w chwili diagnozy oraz podczas leczenia. Do aberracji tych zaliczane są translokacje, mutacje a także zmiany ekspresji genów prowadzące do zaburzeń proliferacji, różnicowania i apoptozy. Wykrycie jednych z nich stanowi podstawę do kwalifikacji chorego do określonego schorzenia oraz grupy ryzyka, co ma często przełożenie na wybór postępowania terapeutycznego, natomiast inne, służą jako markery do monitorowania minimalnej choroby resztkowej. Wykrycie mutacji w genie ABL u chorych na przewlekłą białaczkę szpikową opornych na standardowo stosowane leczenie inhibitorami kinaz tyrozynowych może stanowić podstawę do zmian w terapii. Ocena chimeryzmu hematopoetycznego metodami biologii molekularnej, wolnymi od ograniczenia jakim jest układ płci biorca dawca, jest niezbędnym narzędziem diagnostycznym służącym analizie procesu wszczepienia allogenicznych komórek hematopoetycznych. SŁOWA KLUCZOWE: Białaczka Chimeryzm hematopoetyczny Marker molekularny Minimalna choroba resztkowa SUMMARY In this paper, we described current knowledge of molecular aberrations in haematological disorders (myeloproliferative disorders, acute and chronic leukemia) its detection usefulness at diagnosis and during the therapy. These rearrangements such as translocations, mutations and changes in gene expression level, lead to disregulation of proliferation, differentiation and apoptosis pathways. Some of them are risk factors and have therapeutic significance and others are used in monitoring of minimal residual disease. Detection of ABL gene mutations in patients with chronic myeloid leukaemia resistant to standard therapy with tyrosine kinase inhibitors can result in treatment modification. Molecular methods used for haematopoietic chimerism analysis are important diagnostic tools used for engraftment assessment of both: sex - matched and mismatched allogeneic haematopoietic stem cells. KEY WORDS: Leukemia Haematopoietic chimerism Molecular marker Minimal residual disease WSTĘP Białaczki należą do bardzo heterogennej grupy schorzeń. Powstają w wyniku wielu różnych zaburzeń w hematopoetycznych komórkach progenitorowych, które są przyczyną nieprawidłowości występujących w procesach proliferacji, różnicowania i apoptozy. Wykrywanie tych zaburzeń na poziomie molekularnym ma bardzo istotne znaczenie, zarówno w chwili diagnozy dla ustalenia lub potwierdzenia rozpoznania, określenia profilu ryzyka, dla późniejszego monitorowania minimalnej choroby resztko-

2 18 M. ZAWADA i wsp. wej (MRD Minimal Residual Disease) oraz monitorowania skuteczności allogenicznej transplantacji komórek hematopetycznyh (allo-hsct allogeneic Haematopoietic Stem Cell Transplantation). Zastosowanie technik molekularnych, charakteryzujących się wysoką czułością i specyficznością, pozwala nie tylko na wykrycie podłoża schorzenia, niejednokrotnie niedostępnego w badaniu metodami klasycznej cytogenetyki (np. pacjenci z ostrą białaczką szpikową (AML Acute Myeloid Leukemia) o prawidłowym kariotypie), ale również daje szansę większej liczbie chorych na podjęcie skutecznego leczenia kwalifikując ich do określonych grup ryzyka. W niniejszym opracowaniu przedstawiono najczęstsze aberracje genetyczne występujące w przebiegu nowotworowych schorzeń układu krwiotwórczego (Tabela 1). Tabela 1. Najczęstsze aberracje molekularne występujące w schorzeniach hematologicznych u osób dorosłych [1,2,3, 4, 5, 6]. Table 1. The most often molecular aberration in haematological disorders appeared in adults [1,2,3, 4, 5, 6]. Schorzenie Aberracja molekularna* Zmiana Częstość Znaczenie rokownicze cytogenetyczna występowania (MRD/PF)** CML BCR-ABL t(9;22) 95% MRD CEL FIP1L1-PDGFRα Del 4q12 100% MRD MPN ETV6-PDGFRβ (t(5;12) <1% MRD JAK-2 Mutacja 95% pacjentów z PV 50% z ET i PMF PV PRV1 Podwyższona ekspresja ~95% ALL-B ALL-T BCR-ABL t(9;22) 30% PF neg, MRD MLL-AF4 t(4;11) 3-4% PF neg CALM-AF10 t(10;11) ~10% TCRγδALL: PF poz; ALL wywodząca się z niedojrzałych komórek T: PF neg SIL-TALI del TAL1 ~25% PF neg/poz? MRD? E2A-PBX1 t(1;19) 3-4% PF neg TEL-AML1 t(12;21) 1-3% PF poz AML AML-ETO t(8;21) ~7% PF poz, MRD PML-RARA (bcr1,2,3) t(15;17) 100% PF poz, MRD CBFβ-MYH11 Inv(16) 10% PF poz, MRD FLT3-ITD Mutacja 20-30% PF neg MLL-PTD Zaburzenia 11q23 7,7% PF neg EVI1 Zaburzenia 3q26 ~5% PF neg NPM1 Mutacja 50-60% PF poz CEBPα Mutacja 15-20% PF poz BAALC Podwyższona ekspresja 65,7% PF neg MN1 Podwyższona ekspresja 50% PF neg ERG Podwyższona ekspresja 25% PF neg WT-1 Podwyższona ekspresja ~90% PF neg * Szczegółowe objaśnienia w tekście ** MRD (Minimal Residual Disease) minimalna choroba resztkowa, PF (Prognostic Factor) czynnik prognostyczny (poz korzystny; neg niekorzystny)

3 Możliwości diagnostyki i śledzenia skuteczności leczenia 19 Zaburzenia hematopoezy, których efektem jest niedobór lub nadmiar komórek krwi mogą prowadzić do nowotworowej choroby układu krwiotwórczego [7]. W czasie leukemogenezy (transformacji białaczkowej) dochodzi do mutacji w obrębie genów odpowiedzialnych za proliferację, różnicowanie i apoptozę komórki. Aktualnie uważa się, że aby doszło do powstania ostrej białaczki szpikowej konieczne jest wystąpienie kombinacji dwóch klas mutacji (tzw. teoria dwóch uderzeń) [8]. Jedną z nich jest mutacja w obrębie genu regulującego różnicowanie komórki, której efektem jest zahamowanie tego procesu (m.in. CBF, MLL, RAR, EVI1, CEBPa, TEL), natomiast druga klasa mutacji dotyczy procesów regulujących proliferację [9] (tzw. uderzenie proliferacyjne) [8]. Może to być mutacja genu cytokiny, genu receptora cytokiny, genu białka przenoszącego sygnał od receptora do jądra komórkowego lub genu czynnika transkrypcyjnego odpowiedzialnego za uruchomienie w jądrze komórkowym transkrypcji innych genów (m.in. FLT3, JAK2) [7, 8, 10]. NOWOTWORY MIELOPROLIFERACYJNE Nowotwory mieloproliferacyjne (MPN Myeloproliferative Neoplasms) są grupą chorób hematologicznych charakteryzujących się wzmożoną proliferacją jednej lub wielu linii komórek szpiku. W najprostszy sposób można je podzielić na klasyczne MPN z wykrywanym genem BCR-ABL i bez niego oraz nietypowe MPN. W rozróżnieniu poszczególnych typów nowotworów mieloproliferacyjnych może pomóc określenie drogi aktywacji sygnału poprzez kinazę tyrozynową (PTK Protein Tyrosine Kinase) i jej cząsteczki efektorowe [11]. Przykłady mutacji w genach kodujących PTK przedstawiono w Tabeli 2. Tabela. 2. Przykłady mutacji w genie kodującym PTK [11]. Table 2. Examples of mutations in gene coding PTK [11]. Rodzaj mutacji *w genie kodującym PTK **mutacja efektora PTK *BCR-ABL *JAK2V617F *mutacja w eksonie 12 domeny JAK2 *FIP-PDGFRα *ETV6-PDGFRβ *ZNF198-FGFR1 *KITD816V **MPLW515L/K **Mutacje RAS, PTPN11 lub NF1 Schorzenie 100% CML 30% ALL dorosłych (Acute Lymphoblastic Leukemia) ~95% PV (Polycythemia Vera); ~50% ET (Essential Trombocythemia) ~50% PMF (Primary Mielofibrosis) 20% CNL (Chronic Neutrophilic Leukemia) 3% CMML (Chronic Myelomonocytic Leukemia) występująca w większości przypadków PV (Policythemia Vera) negatywnych w kierunku JAK2V617F 100% CEL (Chronic Eosynophilic Leukemia) Bardzo rzadko w MPN (Myeloproliferative Neoplasms) SCLL (Stem Cell Leukemia-Lymphoma Syndrome) 100% SM (Systemic Mastocytosis) 5% PMF (Primary Myelofibrosis) 1% ET (Essential Trombocythemia) Każda występuje w 15% - 30% JMML (Juvenile Myelomonocytic Leukemia) Przewlekła białaczka szpikowa U chorych na przewlekłą białaczkę szpikową (CML Chronic Myeloid Leukemia) występuje charakterystyczna aberracja chromosomowa tzw. chromosom Filadelfia (Ph Philadelphia), jego molekularnym ekwiwalentem jest gen fuzyjny BCR-ABL powstający z połączenia końca 5 genu BCR zlokalizowanego na chromosomie 22 (22q11) oraz prawie całą kodującą sekwencją protoonkogenu ABL

4 20 M. ZAWADA i wsp. z chromosomu 9 (t(9;22)). Gen BCR-ABL koduje białko enzymatyczne obdarzone patologicznie zwiększoną aktywnością PTK. W diagnostyce CML wykorzystywana jest m.in. metoda oparta na amplifikacji kwasów nukleinowych RT-PCR (Reverse Transcriptase Polimerase Chain Reaction polimerazowa reakcja łańcuchowa poprzedzona odwrotną transkrypcją) umożliwiająca wykrycie obecności produktu genu fuzyjnego BCR-ABL na poziomie RNA w jednej na komórek prawidłowych. RT-PCR pozwala na szybką, precyzyjną i specyficzną detekcję różnych typów translokacji BCR-ABL. Technika RQ-PCR (Real-time Quantitative PCR - ilościowa PCR w czasie rzeczywistym) [14, 15] pozwala na bardzo dokładny pomiar liczby kopii powielanego genu BCR-ABL odzwierciedlającego liczbę komórek białaczkowych. Dokładna i szybka informacja o poziomie MRD pozwala na: szybką decyzję o modyfikacji leczenia (zwiększenie dawki lub zmiana stosowanego leku, przeszczepienie allogeniczne, terapie innowacyjne), zmniejszenie toksycznych efektów leczenia poprzez redukcję jego intensywności u pacjentów dobrze odpowiadających na terapię, monitorowanie leczenia pacjentów przed i po przeszczepieniu komórek hematopoetycznych (Rycina 1). Pacjent SJ 1,0E+03 1,0E+02 1,0E+01 1,0E+00 1,0E-01 1,0E-02 1,0E-03 1,0E-04 1,0E Okres obserwacji (m-ce) BCR-ABL/ABL Czułość RQ-PCR Ryc. 1. Przykład kinetyki zmian ilości transkryptu u pacjenta po przeprowadzonej transplantacji szpiku kostnego i podaniu imatynibu w okresie nawrotu choroby (górna krzywa). Poniżej czułość poszczególnych testów RQ-PCR (dolna krzywa). Szara strzałka wskazuje moment podania imatynibu, czarne strzałki wskazują rozpoczęcie i zaprzestanie leczenia immunosupresyjnego. Fig. 1. The example of changes in BCR-ABL transcript level in patient after bone marrow transplantation and imatinib treatment during relapse (upper curve). The sensitivity of RQ-PCR tests - lover curve. Grey arrow indicates start of imatinib treatment, black arrows indicate start and stop of immunosupression therapy. U 40 60% pacjentów leczonych imatynibem selektywym inhibitorem kinazy BCR-ABL występuje oporność, która w części przypadków związana jest z wystąpieniem mutacji punktowej kinazy ABL. Dotychczas opisano ponad 80 rodzajów mutacji pojawiających się z różną częstością. Ponad połowa z nich występuje w siedmiu miejscach (G250, Y253, E255, T315, M351, F359, H396). Ich wystąpienie odpowiedzialne jest za częściową lub całkowitą oporność na stosowane leczenie zarejestrowanymi inhibitorami kinaz tyrozynowych (imatynib, dazatynib, nilotynib) i niejednokrotnie jest przyczyną trans-

5 Możliwości diagnostyki i śledzenia skuteczności leczenia 21 formacji i progresji CML. Testem przesiewowym służącym do wykrywania mutacji genu ABL jest metoda denaturującej chromatografii cieczowej wysokiej rozdzielczości (D-HPLC), której czułość wynosi ok. 0,1 1%. Produkty poddawane rozdziałowi tą metodą reprezentują często nieprawidłowy, bądź trudny do interpretacji profil elucji. Dlatego, złotym standardem w wykrywaniu mutacji w genie ABL jest metoda sekwencjonowania której czułość ocenia się na 15 25%. W jej wyniku otrzymuje się dokładną mapę badanego odcinka kinazy ABL [16]. Przewlekła białaczka eozynofilowa Przewlekła białaczka eozynofilowa (CEL Chronic Eosynophilic Leukemia) charakteryzuje się podobnie jak zespół hipereozynofilowy występowaniem zwiększonej liczby eozynofilów (stanowią zwykle 30 70% komórek w rozmazie białych krwinek). U pacjentów z CEL stwierdza się występowanie genu fuzyjnego FIP1L1-PDGFRα. Powstaje on w wyniku delecji części chromosomu 4q12 niewidocznej w standardowej prążkowej technice cytogenetycznej, dlatego u pacjentów chorych na CEL najczęściej występuje prawidłowy obraz kariotypu. Aberracja ta powoduje uszkodzenie genów FIP1L1 oraz PDGFRα i prowadzi do fuzji części 5 genu FIP1L1 z częścią 3 genu PDGFRα. Białko FIP1L1- PDGFRα jest kinazą tyrozynową ulegającą autofosforylacji, która powoduje niekontrolowaną aktywację czynnika transkrypcyjnego STAT5. Chorzy na CEL z genem FIP1L1-PDGFRα leczeni imatynibem uzyskują w ok. 98% przypadków remisję molekularną. FIP1L1-PDGFRα. wykrywany jest m.in. przy pomocy techniki gniazdowej RT-PCR (nested RT-PCR), która służy także do monitorowaniu MRD w grupie pacjentów FIP1L1-PDGFRα+ [17]. Nowotwór mieloproliferacyjny z towarzyszącym genem ETV6-PDGFRβ U niewielkiego odsetka chorych z MPN stwierdza się występowanie genu ETV6-PDGFRβ będącego następstwem fuzji chromosomowej t(5;12)(q33;p13). Do 2009 roku na całym świecie opisano wystąpienie tej zmiany u zaledwie kilkunastu pacjentów. Wykrycie tej aberracji pozwala na podjęcie terapii inhibitorem kinaz tyrozynowych. Gen ETV6-PDGFRβ wykrywa się przy pomocy techniki gniazdowej RT-PCR służącej także do monitorowania MRD w grupie pacjentów ETV6-PDGFRβ+ [18, 19]. Nowotwory mieloproliferacyjne z towarzyszącą mutacją w genie JAK2 (V617F) Czerwienica prawdziwa (PV Polycythemia Vera), nadpłytkowość samoistna (ET Essential Thrombocythemia) oraz samoistne włóknienie szpiku (PMF - Primary Myelofibrosis) należą do grupy schorzeń MPN bez genu BCR-ABL. U 95% pacjentów z PV oraz u około połowy pacjentów z ET i PMF stwierdzono obecność somatycznej mutacji w genie JAK2 (zamiana guanidyny na tymidynę w miejscu V617F). Mutacja ta doprowadza do powstania enzymu obdarzonego aktywnością kinazy tyrozynowej, który wywołuje konstytutywną aktywację ścieżki przekazu sygnału JAK-STAT i prowadzi do niezależnej od cytokin proliferacji komórek [12, 13]. PRZEWLEKŁA BIAŁACZKA LIMFATYCZNA Przewlekła białaczka limfatyczna (CLL Chronic Lymphocytic Leukemia) jest bardzo heterogennym schorzeniem, którego przebieg dzieli pacjentów na dwie grupy. Do pierwszej z nich należy 90% chorych, u których nie dochodzi do progresji choroby przez wiele lat, z długim czasem przeżycia, nie wymagających wdrożenia leczenia. U pozostałych 10% chorych na CLL stwierdza się progresję choroby pomimo wdrożenia intensywnej terapii [20, 21]. U podłoża heterogenności leży m.in. obecność lub brak somatycznej mutacji w zmiennym regionie łańcucha ciężkiego receptora na limfocytach B - IgVH

6 22 M. ZAWADA i wsp. (tzw. Ig-mutated CLL i Ig-unmutated CLL), która jest jednym z najważniejszych niezależnych czynników prognostycznych w CLL. Odpowiednią czułość wykrywania tej mutacji zapewnia wykonanie reakcji PCR typu multipleks, a następnie przeprowadzenie analizy techniką GeneScanning lub heterodupleksów w celu określenia klonalności schorzenia [20]. Kolejnym krokiem jest wykonanie sekwencjonowania monoklonalnych produktów PCR, które pozwala na ocenę stopnia zmutowania genów IgVH [21]. Sekwencje wykazujące 2% odchyleń od sekwencji zarodkowej uważane są za niezmutowane (unmutated CLL) i leżą u podłoża choroby o niekorzystnym przebiegu i rokowaniu [20, 21, 22, 23]. OSTRA BIAŁACZKA LIMFOBLASTYCZNA Wykrywanie genu BCR-ABL U około 30% dorosłych chorych na ostrą białaczkę limfoblastyczną (ALL Acute Lymphoblastic Leukemia) występuje gen fuzyjny BCR-ABL kodujący białko o aktywności kinazy tyrozynowej. W zdecydowanej większości przypadków jest to białko o wielkości 190 kda (podtyp genu e1a2), sporadycznie zdarza się również białko o wielkości 210 kda (podtyp genu b2a2 lub b3a2). Stanowi on wysoce niekorzystny czynnik rokowniczy w tej grupie chorych, jednak daje możliwość monitorowania MRD, które prowadzi się przy pomocy metod nested RT-PCR i RQ-PCR [1]. Wykrywanie genu E2A-PBX1 Aberracja E2A-PBX1 odpowiada translokacji chromosomowej t(1;19). Występuje przede wszystkim u pacjentów z podtypem pre-b-all z towarzyszącą cytoplazmatyczną ekspresją Igµ, jakkolwiek może ona sporadycznie pojawiać się u chorych na pro-b-all i common ALL (<1% przypadków). W większości przypadków w badaniu immunofenotypowym na komórkach wykrywa się ekspresję CD19, CD10, CD9, bez ekspresji CD34, antygen CD20 występuje na części komórek. Występowanie E2A-PBX1 koreluje z obecnością znanych niekorzystnych czynników klasyfikujących pacjentów do grupy wysokiego ryzyka, takich jak: podwyższona liczba leukocytów, podwyższone stężenie LDH i zajęcie chorobą centralnego systemu nerwowego [1]. Wykrywanie genu SIL-TAL Najczęściej występującą aberracją z udziałem genu TAL1 jest specyficzna co do miejsca wewnątrzchromosomowa mikrodelecja w pozycji 1p32, która zachodzi pomiędzy genami TAL1 i SIL. Delecja ta powoduje włączenie genu TAL1 pod kontrolę promotora genu SIL w procesie translacji, który ulega ekspresji w limfocytach T. Aberracja SIL-TAL1 występuje u około 16% dorosłych z T-ALL. Nie określono jednoznacznie wartości prognostycznej tego czynnika jak i możliwości jego wykorzystania do monitorowania MRD [1]. Wykrywanie genu TEL-AML1 Gen fuzyjny TEL-AML1 (znany również jako ETV6-CBFA2) występuje u mniej niż 2% dorosłych pacjentów z podtypem pre-b-all i common ALL. Jak dotąd nie wykryto tego genu fuzyjnego u pacjentów z T-ALL ani z AML. Pacjenci z tą aberracją mają niską wyjściową liczbę leukocytów, nie wykrywa się u nich hiperdiploidalnego DNA [1]. Występowanie genu fuzyjnego TEL-AML1 jest korzystnym czynnikiem prognostycznym i wiąże się z opóźnieniem wystąpienia nawrotu choroby [1].

7 Możliwości diagnostyki i śledzenia skuteczności leczenia 23 Wykrywanie genu CALM-AF10 CALM-AF10 powstaje w wyniku translokacji chromosomowej t(10;11). Znaczenie prognostyczne tego czynnika zależy od stadium rozwoju ostrej białaczki. Jest to korzystny czynnik prognostyczny w przypadku T-ALL wywodzącej się z dojrzałych limfocytów T o zrearanżowanych receptorach Tδγ. Jego wykrycie w ALL wywodzącej się z niedojrzałych komórek T, w których nie doszło do rearanżacji receptorów TCRδγ jest niekorzystnym czynnikiem rokowniczym. Odnaleziono kilka różnych odmian genu fuzyjnego CALM-AF10 jednak nie stwierdzono żadnej korelacji ich występowania z podtypem białaczki [5]. Wykrywanie genu MLL-AF4 Translokacja chromosomowa t(4;11)(q21:q23) obejmuje geny MLL (HRX) i AF4 (FEL) i jest wykrywana u około 5% pacjentów z ALL. Obecność tej aberracji jest związana z występowaniem fenotypu typowego dla tych przypadków pro-b-all, w których na komórkach limfoidalnych współistnieje ekspresja szpikowych antygenów różnicowania. Scharakteryzowano przynajmniej 10 różnych transkryptów fuzyjnych MLL-AF4 powstałych na skutek występowania punktów pęknięcia w różnych intronach a także alternatywnego składania genu (splicing). Występowanie MLL-AF4 wiąże się ze złą prognozą jakkolwiek wydaje się, że wprowadzenie do terapii indukującej wysokich dawek Ara-C przyczynia się do przełamania tego stanu [2]. Rearanżacje genów receptorów limfocytów T W przebiegu procesu dojrzewania limfocytów dochodzi do rearanżacji genów immunoglobulin oraz genów receptorów limfocytów T (TCR T Cell Receptor). Końcowe produkty tych rearanżacji mogą mieć nawet 10 9 kombinacji. Gwarantuje to możliwość odpowiedzi przez układ immunologiczny na różnorodne patogeny. Zmienność ta sprawia, że każdy powstający limfocyt posiada unikatowy receptor powierzchniowy [24]. Ocena sekwencji złącz zrearanżowanych genów Ig/TCR przy pomocy techniki RQ-PCR jest uniwersalną metodą pozwalającą na diagnozowanie i monitorowanie MRD z dużą precyzją u ponad 95% chorych na ALL. Do wskazań do wykonania badania należą: podejrzenie ostrej białaczki B- lub T komórkowej, limfoproliferacje u pacjentów z niedoborem odporności lub poddanych transplantacji, rozróżnienie pomiędzy nawrotem ALL a wtórnym nowotworem [20]. OSTRA BIAŁACZKA SZPIKOWA Wykrywanie genu AML1-ETO Gen fuzyjny AML1-ETO (RUNX1-RUNX1T1; AML1(CBFA2)-ETO(MTG8)) występuje u ok % pacjentów z AML-M2 (rozpoznaną de novo lub jako wtórna AML). Wykrywany jest u około 7% wszystkich rozpoznanych de novo AML i występuje częściej u młodszych pacjentów. Translokacja AML1-ETO wiąże się z relatywnie dobrym rokowaniem i dobrą odpowiedzią na chemioterapię. Stwierdzono także rzadkie przypadki występowania tej aberracji u pacjentów z AML-M1 i M4 oraz w przypadku białaczek wtórnych po uprzedniej chemio- lub radioterapii (therapy-related AML) [1].

8 24 M. ZAWADA i wsp. Wykrywanie genu PML-RARα Gen fuzyjny PML-RARα odpowiadający translokacji t(15;17) występuje u około 95% pacjentów z AML-M3. Gen RARα w formie niezmutowanej pełni w komórce funkcję receptora α kwasu retinowego niezbędnego czynnika w procesie różnicowania komórek hematopoetycznych. Gen fuzyjny występuje w 3 odmianach (bcr1 55%, bcr2 5% i bcr3 40%) powstających w zależności od miejsca pęknięcia w genie PML. Jego obecność jest korzystnym czynnikiem prognostycznym i stwarza szansę bardzo dobrej odpowiedzi na leczenie skojarzone z wykorzystaniem kwasu all-trans retinowego (ATRA) [1]. Wykrywanie genu CBFβ-MYH11 Gen fuzyjny CBFβ-MYH11 odpowiadający cytogenetycznie inv(16)(p13;q22) występuje u wszystkich chorych na ostrą białaczkę monoblastyczną w wariancie z eozynofilią (AML-M4Eo) i jest wykrywany u około 10% wszystkich rozpoznawanych de novo przypadków AML. CBFβ-MYH11 może występować także w AML-M4 bez eozynofili, w podtypach M2, M5 i rzadziej w M1, M6, i M7. Powyższa aberracja zaliczana jest do relatywnie korzystnych czynników prognostycznych. Występuje w kilku odmianach różniących się wielkością produktu otrzymywanego po reakcji PCR ze względu na różnorodność miejsc pęknięcia w genie MYH11. U ponad 85% pacjentów jest to forma A, u około 5% występuje forma D lub E, natomiast pozostałe stanowią pojedyncze przypadki [1]. Wykrywanie genu FLT3-ITD Jednym z powszechnie uznanych niekorzystnych czynników prognostycznych występującym u ok. 30% chorych z rozpoznaniem ostrej białaczki szpikowej (AML Acute Myeloid Leukemia) jest tandemowa duplikacja genu receptora kinazy tyrozynowej FLT3 (FLT3-ITD). W momencie wystąpienia duplikacji dochodzi do ciągłej, niezależnej od obecności ligandu, aktywacji receptora FLT3. Prowadzi to do niekontrolowanej proliferacji niedojrzałych komórek hematopoetycznych. Badanie mające na celu wykrycie tej zmiany prowadzi się przy pomocy reakcji PCR. Ze względu na zakres wielkości duplikacji FLT3-ITD można zwiększyć czułość detekcji przy pomocy techniki GeneScanning. Ma to szczególne znaczenie u chorych, u których klon komórek z duplikacją stanowi niewielki odsetek populacji komórek hematopoetycznych lub jeżeli duplikacji podlega najmniejszy możliwy fragment FLT3 [10]. Wykrywanie genu MLL Gen MLL ulega rearanżacji zarówno w przebiegu AML jak i ALL. MLL koduje metylotransferazę histonową, która odgrywa ważną rolę w hematopoezie poprzez regulację genów w rozwoju zarodkowym. Do tej pory wykryto ponad 30 różnych partnerów genowych, z którymi MLL tworzy fuzje. Do najczęstszych aberracji stwierdzanych w przebiegu AML należy częściowa tandemowa duplikacja (MLL-PTD) [2]. Wykrywa się ją u około 5% de novo rozpoznanych i wtórnych AML. Stanowi ona niekorzystny czynnik prognostyczny w tej grupie chorych [2, 4]. Wykrywanie genu EVI1 Gen EVI1 koduje białko wiążące DNA o strukturze palca cynkowego. Podwyższona ekspresja genu EVI1 wiąże się z patogenezą i/lub progresją ostrej białaczki szpikowej oraz zespołów mielodysplastycznych. Stanowi ona niezależny, niekorzystny czynnik rokowniczy u pacjentów z AML w grupie pośredniego i wysokiego ryzyka. Wysoką ekspresję genu EVI1 stwierdza się u ok. 5% chorych z nowo

9 Możliwości diagnostyki i śledzenia skuteczności leczenia 25 rozpoznaną AML. Dużo częściej natomiast, występuje u chorych z zespołami mielosplastycznymi (MDS Myelosplastic Syndroms) i wtórnymi AML [2, 4, 26]. Wykrywanie genu NPM1 Gen NPM1 koduje białko odpowiedzialne za stabilizację supresorowej ścieżki sygnałowej obejmującej aktywację białka p53. Mutacja genu NPM1 jest uznawana za korzystny czynnik rokowniczy w grupie chorych na AML z prawidłowym kariotypem, a szczególnie w grupie chorych bez tandemowej duplikacji w genie FLT3 (NPM1+/FLT3-ITD-) [2]. Dotychczas wykryto dwa rodzaje powyższej mutacji: insercję składającą się z 4 nukleotydów oraz delecję 5-nukleotydowego fragmentu genu, która zastępowana jest 9 innymi nukleotydami. Mutacja w genie NPM1 wykrywana jest u około 50 60% chorych na AML, częściej u kobiet niż u mężczyzn. Ze względu na częstość występowania mutacji w genie NPM1 oraz jego stabilność, może on stać się nowym narzędziem służącym monitorowaniu MRD u chorych z AML z prawidłowym kariotypem [2, 25]. Wykrywanie genu CEBPα CEBPα koduje czynnik transkrypcyjny biorący udział w różnicowaniu granulocytów. Mutacje w tym genie wykrywa się u około15 20% pacjentów z AML, a ich występowanie wiąże się z dobrym rokowaniem [2]. Obecność mutacji w genie CEBPα koreluje dodatnio z szansą na wejście w remisję (CR), czasem jej trwania, przeżyciem wolnym od choroby (DFS), przeżyciem wolnym od zdarzeń (EFS) oraz całkowitym przeżyciem (OS). Wykrycie ekspresji CEBPα jest niezależnym korzystnym czynnikiem prognostycznym dla OS [2]. Wykrywanie genu BAALC Gen BAALC ulega podwyższonej ekspresji w prawidłowych hematopoetycznych komórkach prekursorowych oraz w białaczkowych komórkach blastycznych. Wysoką ekspresję genu BAALC stwierdza się u około 66% pacjentów z AML z prawidłowym kariotypem. Jego funkcja biologiczna nie jest jeszcze poznana, wiadomo jednak, że w miarę różnicowania komórek hematopoetycznych jego ekspresja ulega stopniowemu obniżeniu. Jest on ważnym, niezależnym niekorzystnym czynnikiem rokowniczym obniżającym całkowite przeżycie OS oraz przeżycie wolne od choroby DFS w przebiegu AML [2]. Wykrywanie genu MN1 Białko MN1 jest onkoproteiną, która jest współaktywatorem procesu transkrypcji. W wyniku translokacji t(12;22)(p13;q11), powstaje gen fuzyjny MN1-TEL. Podwyższoną ekspresję genu MN1 stwierdza się u około 50% pacjentów z AML z prawidłowym kariotypem i jest to niezależny niekorzystny czynnik prognostyczny. Jego występowanie koreluje z brakiem mutacji w genie NPM1 co wiąże się ze słabą odpowiedzią na chemioterapię indukującą, wysokim odsetkiem nawrotów oraz zmniejszonym całkowitym przeżyciem [2]. Wykrywanie genu ERG ERG należy do rodziny czynników transkrypcyjnych i jest zaangażowany w regulację ekspresji genów związanych z proliferacją, różnicowaniem i apoptozą komórek hematopoetycznych. Jego wysoka

10 26 M. ZAWADA i wsp. ekspresja wykrywana jest u 25% pacjentów z AML z prawidłowym kariotypem i jest ona niezależnym niekorzystnym czynnikiem rokowniczym w tej grupie chorych [2, 4]. Wykrywanie genu WT1 Wysoka ekspresja genu WT1 jest niekorzystnym czynnikiem prognostycznym u pacjentów z ostrymi białaczkami (AL). Podwyższona ekspresja, wykrywana w momencie diagnozy, wiąże się z niekorzystnym rokowaniem. Wzrost ekspresji WT1 w badaniu RQ-PCR wyprzedza nawrót choroby podstawowej i pozwala na jego przewidzenie z kilkumiesięcznym wyprzedzeniem, co powoduje, że jest bardzo użytecznym markerem pozwalającym na śledzenie MRD na poziomie molekularnym [27, 28]. Wykrywanie genu PRAME PRAME jest jednym z ostatnio opisanych czynników rokowniczych. Jego funkcja pozostaje nieznana, jednak wiadomo, że jego podwyższona ekspresja wykrywana jest u 17-42% pacjentów z ALL, 30-64% pacjentów z AML oraz w 30% przewlekłych nowotworów mieloproliferacyjnych (także CML i CLL). Wstępne dane wskazują, że wysoki poziom ekspresji tego genu stanowi korzystny czynnik prognostyczny u dzieci i dorosłych z AML oraz u dzieci z ALL. Ponadto, koreluje on z obecnością korzystnych cytogenetycznych czynników rokowniczych: translokacjami t(8;21) oraz t(12;21). Niektórzy autorzy sugerują również, że badanie ekspresji genu PRAME może stanowić użyteczne narzędzie służące monitorowaniu MRD u pacjentów z ostrymi białaczkami [2, 4]. CHIMERYZM HEMATOPOETYCZNY W wyniku allogenicznej transplantacji macierzystych komórek hematopoetycznych u pacjenta po przeszczepieniu (biorcy) dochodzi do eliminacji patologicznego klonu komórek nowotworowych, zagnieżdżenia się macierzystych komórek hematopoetycznych dawcy i odtworzenia prawidłowego układu krwiotwórczego i immunologicznego o genotypie dawcy. Dochodzi do tego stopniowo poprzez fazę równowagi ilościowej populacji komórek biorcy i dawcy aż do całkowitego przejęcia funkcji krwiotworzenia przez komórki hematopoetyczne pochodzące od dawcy. Całość tego zjawiska nosi miano chimeryzmu hematopoetycznego [29]. Na rycinie 2 przedstawiono schemat przebiegu powstawania chimeryzmu. Zgodnie z terminologią stosowaną w literaturze wyróżnia się: mieszany chimeryzm hematopoetyczny (MC Mixed Chimerism), polegający na równoczesnej obecności w układzie immunologicznym i krwiotwórczym biorcy komórek pochodzących od dawcy i od biorcy. Utrzymuje się on dłużej u pacjentów poddanych allogenicznej transplantacji niemieloablacyjnej (allonmsct), co jest rezultatem mniejszej toksyczności chemioterapii kondycjonującej podanej przed wykonaniem przeszczepienia, całkowity chimeryzm hematopoetyczny (CC Complete Chimerism), polegający na obecności w układzie immunologicznym i krwiotwórczym biorcy komórek pochodzących wyłącznie od dawcy, chimeryzm rozszczepiony (SC Split Chimerism), gdy we wszystkich, za wyjątkiem jednej, liniach komórkowych układu krwiotwórczego i immunologicznego występują komórki pochodzące od dawcy [30, 31]. Wynik badania chimeryzmu hematopoetycznego służy do: oceny kinetyki procesu wszczepienia komórek hematopoetycznych, wczesnego przewidzenia nawrotu choroby podstawowej, oceny prawdopodobieństwa utraty przeszczepu, oceny ryzyka rozwoju choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (GvHD Graft versus Host Disease),

11 Możliwości diagnostyki i śledzenia skuteczności leczenia 27 monitorowania skuteczności addytywnej terapii immunologicznej jaką jest infuzja limfocytów dawcy (DLI Donor Lymphocyte Infusion) [29]. K I Zdrowe komórki biorcy Zdrowe komórki dawcy B B D Komórki białaczkowe CC MC N Ryc. 2. Schemat powstawania chimeryzmu hematopoetycznego Biorca (B) zakwalifikowany do transplantacji, w którego organizmie znajdują się jego zdrowe (kolor szary) i białaczkowe (kolor czarny) komórki jest poddawany kondycjonowaniu (K). Tak przygotowany biorca poddawany jest zabiegowi infuzji (I) komórek dawcy (D) (kolor biały). Po transplantacji (na dole schematu) organizm biorcy staje się mieszaną chimerą (MC), czyli wykazuje równoczesną obecność powstałych de novo komórek dawcy (D) i własnych resztkowych komórek. Ten stan równowagi może przechylić się w stronę przyjęcia się przeszczepu, najczęściej z towarzyszącym GvL i/lub GvHD, i wówczas organizm biorcy staje się całkowitą chimerą (CC) lub dochodzi do odrzucenia przeszczepu i do nawrotu choroby podstawowej (N). Fig. 2. The schematic way of haematopoietic chimerism formation In recipient`s (B) hematopoietic system before transplantation simultaneously exist normal cells (grey balls) and leukemic cells (black balls). After conditioning therapy (K), the infusion (I) of donor cells (D) (white balls) to recipient is performed (upper part of the scheme). After transplantation, recipient become mixed chimera (MC) that means simultaneous presence of de novo arising donor cells (D) and persistent residual recipient s cells. This balance can change into total engraftment often with GvL and/or GvHD recipient is complete chimera (CC) or into rejection of graft relapse (N) (lower part of the scheme). Najwyższą czułość oznaczeń chimeryzmu hematopoetycznego, a tym samym odzwierciedlenie stanu faktycznego hematopoezy, zapewnia wykorzystanie do badania szpiku kostnego biorcy. W pewnych przypadkach bardzo pomocne jest wykonanie analizy w subpopulacji limfocytów T (zwłaszcza u chorych z CML szczególnie po wykonaniu u nich infuzji limfocytów dawcy). Ocena chimeryzmu hematopoetycznego jest przeprowadzana przy pomocy techniki PCR i GeneScanning w oparciu o niekodujące sekwencje STR (Short Tandem Repeats) [32, 33]. Alternatywną metodą molekularną służącą ocenie chimeryzmu jest RQ-PCR wykorzystująca technologię TaqMan. Jest ona wykonywana w oparciu o zjawisko polimorfizmu dwuallelicznego wyrażającego się występowaniem krótkich insercji lub delecji pozwalających na rozróżnienie pomiędzy biorcą i dawcą [34]. Obie metody pozwalają na ocenę chimeryzmu niezależnie od układu płci. Monitorowanie chimeryzmu hematopoetycznego nie jest tożsame z oceną MRD jednak w większości przypadków pojawienie się MC po występującym CC jest równoznaczne z nawrotem choroby podstawowej (Rycina 3) [35].

12 M. ZAWADA i wsp Dawca 2. Biorca przed allonmsct 3. Biorca +30 doba po allonmsct CC 4. Biorca +138 doba po allonmsct MC 5. Biorca +150 po allonmsct R. RT-PCR dla fuzyjnego genu AML1-ETO R CC kontrola PCR. % Hematopoezy dawcy CC STR-PCR Czas po allonmsct [dni] Czas po allonmsct Ryc. 3. Korelacja wyników oceny chimeryzmu hematopoetycznego i monitorowania choroby resztkowej u pacjenta po allogenicznym przeszczepieniu szpiku z niemieloablacyjnym kondycjonowaniem (allonmsct). W okresie potransplantacyjnym do 120 doby obserwowano całkowity chimeryzm dawcy (CC Complete Chimerism). Pierwszy sygnał o załamaniu CC pojawił się w 138 dobie po allogenicznej transplantacji, kiedy zaobserwowano utratę chimeryzmu dawcy i pojawienie się mieszanego chimeryzmu (MC Mixed Chimerism) na poziomie 84,1% chimeryzmu dawcy. W 150 dobie doszło do gwałtownego obniżenia poziomu chimeryzmu dawcy do 8,8%. Równoległe monitorowanie choroby resztkowej metodą RT-PCR wykazało po okresie remisji molekularnej (doba 30), obecność transkryptu AML1-ETO (150 doba) (RRelapse). Po zastosowaniu chemioterapii reindukującej doszło do ponownego pojawienia się CC w 180 dobie. Jednocześnie badaniem RT-PCR stwierdzono remisję molekularną. Wynika z tego, że utrata CC i wzrost udziału krwiotworzenia biorcy występowały równolegle z utratą remisji molekularnej i na odwrót, wzrost chimeryzmu dawcy wskazywał na uzyskanie remisji molekularnej. Fig. 3. Correlation of the haematopoietic chimerism results and residual disease monitoring in patient after allogeneic transplantation with non-myeloablative conditioning (allonmsct). After transplantation up to 120 day complete chimerism (CC) was observed. In 138 day, the mixed chimerism (MC) has occurred 84,1%. In 150 day the level of chimerism dramatically decreased - 8,8%. In simultaneous monitoring of residual disease by RT-PCR method, after molecular remission (30 day), the AML1-ETO transcript was observed (150 day) (R). After chemotherapy, CC was occurred in 180 day of treatment. By RT-PCR method, molecular remission was observed. The correlation between results obtained by both methods was observed. PODSUMOWANIE W ostatnich latach nastąpił wzrost zainteresowania zastosowaniem metod molekularnych w badaniach diagnostycznych u chorych ze schorzeniami hematologicznymi. Mają one coraz większe znacze-

13 Możliwości diagnostyki i śledzenia skuteczności leczenia 29 nie nie tylko w momencie diagnozy, gdy stwierdzamy podłoże danej choroby oraz oceniamy czynniki rokownicze, ale także są szeroko stosowane w monitorowaniu choroby resztkowej, a tym samym postępów leczenia. Wysoka czułość technik molekularnych daje możliwość wczesnego wykrycia nawrotu choroby podstawowej i daje szansę na szybką reakcję terapeutyczną. PIŚMIENNICTWO 1. van Dongen J, Macintyre EA, Gabert JA i wsp.: Standardised RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome aberrations in acute leukaemia for detection of minimal residual disease. Report of the BIOMED-1 Concerted Action: investigation of minimal residual disease in acute leukaemia. Leukemia 1999;13(12): Gregory TK, Wald D, Chen Y i wsp.: Molecular prognostic markers for adult acute myeloid leukemia with normal cytogenetics. J Hemat Oncol 2009; 2; Szczepański T: Detection of minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia. Rozprawa habilitacyjna 2002, Rotterdam, The Netherlands. 4. Santamaria C, Chillon MC, Garcia-Sanz R i wsp.: The relevance of preferentially expressed antigen of melanoma (PRAME) as a marker of disease activity and prognosis in acute promyelocytic leukemia. Haematologica 2008; 93(12): Asnafi V, Radford-Weiss I, Dastugue N i wsp.: Calm-AF10 is a common fusion transcript in T-ALL and is specific to the TCRγδ lineage. Blood 2003; 102(3): Klippel S, Strunck E, Temerinac S i wsp.: Quantification of PRV-1 mrna distinguishes polycythemia vera from secondary erythrocytosis. Blood 2003; 102: Dmoszyńska A, Robak T Podstawy hematologii Wyd. CZELEJ Lublin Deguchi K, Gillialand DG: Cooperativity between mutations in tyrosine kinases and in hematopoietic transcription factors in AML. Leukemia 2002; 16: Larizza L, Magnani I, Beghini A: The Kasumi-1 cell line: a t(8;21)-kit mutant model for acute myeloid leukaemia. Leuk Lymphoma 2005; 46(2): Kelly LM, Liu Q, Kutok JL i wsp.: FLT3 internal tandem dupilcation mutations assosiated with human acute myeloid leukemias induce myeloproliferative disease in the murine bone marrow transplant model. Blood 2002; 99(1): Tefferi A, Gilliland DG: Oncogenes in Myeloproliferative Disorders. Cell Cycle 2007; 6 (5): Nagata K, Shimoda K: Myeloproliferative diseases caused by JAK2 mutation. Rinsho Byori 2009;57(4): Tefferi A, Vardiman JW: Classification and diagnosis of myeloproliferative neoplasms: The 2008 World Health Organization criteria and point-of-care diagnostic algorithms. Leukemia 2008; 22: Gabert J, Beillard E, van der Velden VH i wsp.: Standardisation and quality control studies of real-time quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukaemia a Europe against cancer Program. Leukemia 2003; 17(12): Faderl S, Hochhaus A, Hughes T i wsp.: Monitoring of minimal residual disease in chronic myeloid leukaemia. Hematol Oncol Clin North Am 2004; 18(3): Hughes T, Deininger M, Hochhaus A i wsp.: Monitoring CML patients responding to treatment with tyrosine kinase inhibitors: review and recommendations for harmonizing correct methodology for detecting BCR-ABL transcripts and kinase domain mutations and expressing results. Blood 2006; 108(1): Gotlib J, Cools J, Malone JM 3 rd i wsp.: The FIP1L1-PDGFR alpha fusion tyrosine kinase in hypereosinophilic syndrome and chronic eosinophilic leukemia: implications for diagnosis, classification, and management. Blood 2004; 15(103): Apperley JF, Gardembas M, Melo JV i wsp.: Response to imatinib mesylate in patients with chronic myeloproliferative diseases with rearrangements of the platelet-derived growth factor receptor beta. N Eng J Med 2002; 347(7): David M, Cross NCP, Burgstaller S i wsp.: Durable responses to imatinib in patients with PDGFRB fusion gene positive and BCR-ABL negative chronic myeloproliferative disorders. Blood 2007; 109 (1): van Dongen JJM, Langerac AW, Bruggemann M i wsp.: Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: Report of the BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT Leukemia 2003; 17: Wiestner A, Rosenwald A, Barry TS i wsp.: ZAP-70 expression identifies a chronic lymphocytic leukemia subtype with unmutated immunoglobulin genes, inferior clinical outcome, and distinct gene expression profile. Blood 2003; 101(12): Oscier DG, Gardiner AC, Mould SJ: Multivariate analysis of prognostic factors In CLL: clinical stage, IGVH gene mutational status, and loss or mutation of the p53 gene are independent prognostic factors. Blood 2002; 100:

14 30 M. ZAWADA i wsp. 23. Stamatopoulos B, Meuleman N, Haibe-Kains B i wsp.: Quantification of ZAP-70 mrna In B Cells by Real-Time PCR Is Powerful Prognostic Factor In Chronic Lymphocytic Leukemia. Clin. Chem. 2007; 53: Szczepański T, Kraszewska M, Derwich K, Dawidowska M. Biologia molekularna ostrej białaczki limfoblastycznej u dzieci Hematologia molekularna patogeneza, patomechanizmy i metody badawcze. Red. Wit M, Szczepański T; Dawidowska M. Ośrodek Wydawnictw Naukowych Instytut Chemii Bioorganicznej PAN Poznań 2009; Rau R, Brown P: Nucleophosmin (NPM1) mutations in adult and childhood acute myeloid leukaemia: towards definition of a new leukaemia entity. Leukemia 2009; 27: van Waalwijk B, van Doorn-Kahosrovani S, Erpelinck C i wsp.: High EVI1 expression predicts pure survival in acute myeloid leukemia.: a study of 319 de novo AML patients. Blood 2003; 101(3): Ogawa H, Tamaki H, Ikegame K i wsp.: The usefulness of monitoring WT1 gene transcripts for the prediction and management of relapse following allogeneic stem cell transplantation in acute type leukemia. Blood 2003; 101(5): Nowakowska-Kopera A, Sacha T, Florek I, Zawada M, Czekalska S, Skotnicki AB: Wilms tumor gene 1 expression analysis by real-time quantitative polymerase chain reaction for monitoring of minimal residual disease in acute leukaemia. Leukemia and Lymphoma 2009; 50 (8): Dubovsky J, Daxberger H, Fritsch G i wsp.: Kinetics of chimerism during the early post-transplant period in pediatric patients with malignant and non-malignant hematologic disorders: implications for timely detection of engraftment graft failure and rejection. Leukemia 1999; 26 (6): Antin JH, Childs R, Filipovich L i wsp.: Establishment of complete and mixed donor chimerism after allogeneic lymphohematopoietic transplantation: recommendation from a workshop at the 2001 tandem meetings. Biol Blood Marrow Transplant 2001; 7(19): Bacigalupo A: Hematopoietic stem cell transplants after reduced intensity conditioning regimen (RI-HSCT): report of a workshop of the European Group for Blood and Marrow Transplantation (EBMT). Bone Marrow Transplant 2000; 25: Lion T: Quantitative analysis of chimerism after allogeneic stem cell transplantation using multiplex PCR amplification of short tandem repeat markers and fluorescence detection. Leukemia 2001; 15: Nollet F, Billiet J, Selleslag D, Criel A: Standardization of multiplex fluorescent short tandem repeat analysis for chimerism testing. Bone Marrow Transplant 2001; 28: Alizadeh M, Bernard M, Danic B i wsp.: Quantitative assessment of henmatopoietic chimerism after bone marrow transplntation by real-time quantitative polymerase chain reaction. Blood 2002; 99: de Weger RA, Tilanus MG, Scheidel KC, van den Tweel JG, Verdonck LF: Monitoring of residual disease and guided donor leukocyte infusion after allogeneic bone marrow transplantation by chimerism analysis with short tandem repeats. Br J Haemat 2000; 110(3): Praca wpłynęła do Redakcji r. i została zakwalifikowana do druku r. Adres Autora: Katedra i Klinika Hematologii ul. Kopernika Kraków diagmol@cm-uj.krakow.pl