(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 14/1 EP B1 (13) (1) T3 Int.Cl. C12N 1/ (06.01) A23C 9/123 (06.01) A61P 37/08 (06.01) (4) Tytuł wynalazku: Sposób wytwarzania niealergizujących hodowli bakterii probiotycznych i ich zastosowanie () Pierwszeństwo: IT MI IT MI (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr /13 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 14/08 (73) Uprawniony z patentu: Probiotical S.p.a., Novara, IT (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 GIOVANNI MOGNA, Novara, IT GIAN PAOLO STROZZI, Novara, IT (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Marta Kawczyńska POLSERVICE KANCELARIA RZECZNIKÓW PATENTOWYCH SP. Z O.O. ul. Bluszczańska Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 1 17/P340PL00 EP B1 1 2 Opis [0001] Celem niniejszego wynalazku jest sposób wytwarzania niealergizujących hodowli bakterii probiotycznych. [0002] Wiadomo, że przewód żołądkowo-jelitowy człowieka (ang. gastrointestinal (GI)) zawiera złożone środowisko drobnoustrojów, nazywane mikrobiota, składające się głównie ze ściśle anaerobowych bakterii zdolnych do odgrywania różnych działań, których skutki dotykają miejscowy poziom żołądkowo-jelitowy i pośrednio ogólnie poziom układowy, obejmujący prawie wszystkie narządy i większość funkcji gospodarza. [0003] Mikroflora jelitowa, składająca się z wielu różnorodnych gatunków (400-00) zdolnych do kolonizowania zarówno błony śluzowej jelit, jak i cząstek spożytego pokarmu, jest następnie zdolna do silnego warunkowania zdrowia osobnika. [0004] Skład mikroflory jelitowej może ulegać zmianom ze względu na szereg czynników, takich jak wiek, stan fizjologiczny osobnika, obecność rożnych stanów patologicznych, stres i przede wszystkim dieta. [000] W konsekwencji negatywnych czynników endogennych i egzogennych powstaje spadek ilości użytecznych bakterii (zazwyczaj bakterii należących do grupy bakterii kwasu mlekowego w jelicie cienkim i bifidobakterii w jelicie grubym) i wzrost ilości patogennych enterobakterii, streptokoków i laseczek. [0006] Podawanie specyficznych probiotyków przez specjalne środki medyczne, dietetyczne, integratory, a przede wszystkim żywność (tak zwana żywność

3 2 1 2 funkcjonalna lub nutraceutyki ) pozwala na przywrócenie równowagi mikroflory gospodarza, poprzez przywrócenie optymalnej funkcji jelit. [0007] Termin "probiotyczny" powszechnie dotyczy żyjących drobnoustrojów, wyselekcjonowanych z mikroflory jelitowej zdrowych osobników, które po podaniu w odpowiednich ilościach i przez odpowiedni czas, zdolne są do kolonizacji, także tylko czasowo, różnych przewodów jelitowych oraz wywierania korzystnego wpływu na zdrowie organizmu gospodarza. [0008] Należące do probiotyków gatunki są głównie z rodzajów Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus, Pediococcus, Lactococcus, Propionibacterium, Leuconostoc i, w mniejszym stopniu, Saccharomyces, Bacillus i Enterococcus. [0009] Spośród zdrowotnych i korzystnych skutków, wykazanych poważnymi testami klinicznymi przeprowadzonymi na całym świecie i indukowanymi u konsumentów poprzez przyjmowanie probiotyków, wspomnieć można następujące: 1. Stymulacja układu immunologicznego; 2. Indukcja skutków antymutagennych i antygenotoksycznych; 3. Działanie przeciwnowotworowe i antymetastatyczne dotyczące, na przykład: o o o raka jelita grubego raka sutka raka pęcherza; 4. Poprawa absorpcji składników odżywczych;. Zmniejszanie objawów nietolerancji laktozy;

4 Poprawa ruchliwości jelit ze względu na obniżenie ph i zmniejszenie zapacia; 7. Zmniejszenie absorpcji cholesterolu i tłuszczy; 8. Aktywności przeciwbiegunkowe, przeciwnadciśnieniowe, przeciwcukrzycowe hamujące zakażenia żeńskiego układu moczowo-płciowego; 9. Aktywność zapobiegająca patologiom geriatrycznym. [00] Probiotyki do zastosowania doustnego muszą spełniać następujące wymogi ogólne i funkcjonalne: i) pochodzenie z ludzkich jelit; od osobników w dobrym stanie zdrowia; ii) bio-bezpieczeństwo; nie mogą one powodować skutków ubocznych zwłaszcza u osób osłabionych i z obniżoną odpornością; iii) Oporność i żywotność; muszą mieć one cechy oporności, aby być w stanie przeżyć w soku żołądkowym; wydzielinach trzustkowych i żółciowych, tak aby dotrzeć do jelita krętego i okrężnicy w nieuszkodzonym stanie i wciąż perfekcyjnie żywotne. [0011] Kompetycja, która rozpoczyna się pomiędzy drobnoustrojami probiotycznymi a mikroflorą patogenną może wystąpić jedynie wtedy, gdy po spożyciu, drobnoustroje probiotyczne zdolne są do dotarcia do przewodu jelitowego i dlatego do przeżycia kwasowości żołądka i wysokiego stężenia soli żółciowych. Generalnie, gdy dotrą one do przewodu jelitowego, mówi się, że rozpoczynają one poprzez mechanizmy adhezji, w których uczestniczą białka i/lub węglowodany ze specyficznymi grupami funkcyjnymi, adhezję do kosmków jelitowych.

5 4 1 2 [0012] Na poziomie przemysłowym probiotyki wytwarzane są w postaci liofilizowanej hodowli bakterii, mianowicie określany jest wzrost komórek w odpowiedniej pożywce (fermentacja), a następnie, po zatężeniu i oczyszczaniu biomasy, przeprowadzana jest ich dehydratacja przez liofilizację. Taki proces wymagany jest dla umożliwienia bakteriom reprodukcji w odpowiedniej liczbie (etap fermentacji) i zakonserwowania ich na długi czas (etap liofilizacji). [0013] W celu pomyślnego przeprowadzenia procesu fermentacji i uzyskania odpowiednich wydajności niezbędne jest dostarczenie komórkom źródeł węgla i azotu, oligoelementów i bioaktywatorów w odpowiednich ilościach. [0014] Tradycyjnie przy pracy z powszechnie nazywanymi bakteriami kwasu mlekowego wyselekcjonowanymi substratami stosowanymi jako źródło azotu są surowica, białka surowicy mleka, hydrolizaty i peptony kazeinowe, kazeiniany itp., podczas gdy jako źródło węgla zwykle wykorzystuje się laktozę i glukozę, ponieważ mogą być one łatwo metabolizowane przez prawie wszystkie organizmy żywe. [001] Hydrolizaty białkowe stosowano jako substraty na przykład w publikacjach opisów patentowych WO 06/07314, WO 0/0170 i w zgłoszeniu patentowym nr US 0/ [0016] W ostatnich latach, prawdopodobnie ze względu na zbyt mało zróżnicowaną dietę i zbyt bogatą w białka i lipidy, w Europie i krajach zachodnich zarejestrowano wzrost wrażliwości u dużej liczby osób cierpiących na stany patologiczne typu alergicznego.

6 1 2 [0017] Reakcje immunologiczne typu IV lub IgE-zależne nazywane są "alergicznymi", wtedy gdy po pierwszym uwrażliwiającym kontakcie (który może nastąpić w dowolnym okresie życia, także w okresie wewnątrzmacicznym) wytwarzane są specyficzne IgE w mechanizmie zależnym od histaminy. [0018] Takie reakcje mogą być również wywołane przez ekstremalnie zmniejszone dawki cząsteczek zwanych "alergenami", przy czym kliniczne konsekwencje mogą być różnić się od prostych lekkich reakcji skórnych do wstrząsu anafilaktycznego i śmierci. [0019] Ze względu na niebezpieczeństwo tych substancji dla niektórych ludzi, Wspólnota Europejska przyjęła zasadę, że na etykiecie produktów żywnościowych wyraźnie musi być wskazane zastosowanie w produkcji i obecności żywności należącej do następujących klas (Aneks III bis powyższej instrukcji) (art. 6 sub., wytycznych 00/13/EC zmodyfikowanych wytycznymi 03/89/EC): Zboża zawierające gluten (to znaczy pszenica, żyto, jęczmień, owies, orkisz, kamut, lub ich hybrydyzowane szczepy) i pochodne produkty; skorupiaki i produkty oparte na skorupiakach; jajka i produkty oparte na jajkach; ryby i produkty oparte na rybach, orzeszki ziemne i produkty oparte na orzeszkach ziemnych; soja i produkty oparte na soi; mleko i produkty oparte na mleku (zawierające laktozę); owoce z łupiną, to znaczy migdały (Amigdalus communis L.), orzechy laskowe (Corylus avellana), orzechy włoskie (Juglans regia), orzechy nerkowca (Western Anacardium), orzechy pecan [Carya illinoiesis (Wangenh) K. Koch], orzechy

7 6 1 2 brazylijskie (Bertholletia excelsa), orzeszki pistacjowe (Pistacia vera), orzechy macadamia (Macadamia ternifolia) i pochodne produkty; seler i produkty oparte na selerze; gorczyca i produkty oparte na gorczycy; nasiona sezamu i produkty oparte na sezamie; ditlenek siarki i siarczyny w stężeniach wyższych niż mg/kg lub mg/l wyrażonych jako SO 2. [00] Ze względu na to, że zazwyczaj do wytwarzania probiotyków jako substraty oparte na mleku (jako źródle azotu) i glukozie (jako źródle węgla), która często pochodzi ze skrobi (również skrobi pszenicznej), stosowane są pochodne, probiotyki mogą być uważane za niebezpieczne w przypadku podawania szczególnie wrażliwym podmiotom, nawet jeśli mogą zawierać, co najwyżej, niewielkie śladowe ilości alergenów (pochodzących zatem z mleka i/lub glutenu). [0021] W przypadku mleka można wyszczególnić dwie zindywidualizowane przyczyny reakcji niepożądanej na ten produkt żywnościowy, alergia na białka mleka krowiego (APLV) i nietolerancja laktozy. [0022] Mleko, wraz z jajkiem, jest najbardziej alergizującym produktem żywnościowym, przy czym ta jego cecha determinowana jest przez zawarte w nim substancje białkowe, to znaczy głównie alfa-laktoalbuminę, betalaktoglobulinę i kazeiny. [0023] Alergia na białka mleka krowiego jest względnie częstą patologią w pierwszym roku życia. Symptomatologia jest, w 0-70% przypadków, typu żołądkowo-jelitowego, w 0-70% przypadków występują jeszcze zaburzenia skórne, w -% zaburzenia oddechowe i w -9% zaburzenia układowe (anafilaksja).

8 7 1 2 APLV wykazuje tendencję do samoistnego stopniowego zanikania po pierwszym roku życia i znikania do roku życia, i rzadko występuje u dorosłych. [0024] Przeciwny przebieg ma nietolerancja laktozy, która bardzo rzadko występuje w pierwszym roku życia i bardzo często u dorosłych, w szczególności w pewnych populacjach (afrykańskiej, azjatyckiej i Indian amerykańskich). [002] Mleko jest fundamentalnym produktem żywnościowym od urodzenia i noworodek produkuje już enzym niezbędny do rozszczepiania cukru mleka, laktozy, na jego proste składowe glukozę i galaktozę. Po pierwszym roku życia mleko staje się mniej ważnym produktem żywnościowym i laktaza ulega spontanicznej redukcji, tak że u wielu dorosłych rozwija się nietolerancja mleka (nie alergia). Celiaklia jest enteropatyczną, przewlekłą, immuno-zależną chorobą zapalną powstającą w wyniku spożycia glutenu, białka magazynowego naturalne występującego w pewnych zbożach. [0026] Ta nietolerancja pokarmowa dotyka głównie osoby predysponowane genetycznie, posiadające układ immunologiczny, który odpowiada w nieprawidłowy sposób na spożycie typowych frakcji białkowych glutenu pszenicy, orkiszu (rodzaj pszenicy), kamutu i spella (rodzaj pszenicy), jęczmienia, żyta, pszenżyta (krzyżówka pomiędzy pszenicą i żytem) i ich pochodnych. U niektórych osobników występuje również nietolerancja białek owsa. [0027] Techniczny termin "gluten" dotyczy połączenia wspomnianych powyżej zbożowych białek prolaminowych

9 8 1 2 (bogatych w prolinę), nazywanych gliadynami, i gluteninowych (bogate w glutaminę), nazywanych "gluteninami". [0028] W kontekście celiakii termin "gluten" stosowany jest często w odniesieniu do wszystkich rodzajów białek zawartych w zbożach, nawet jeśli wśród różnych frakcji białkowych, które tworzą gluten, gliadyny wydają się być najbardziej szkodliwe. [0029] U ludzi dotkniętych celiaklią spożycie glutenu, nawet w małych ilościach, może spowodować nieprawidłową odpowiedź układu immunologicznego: transglutaminaza, enzym występujący w tkance błony śluzowej jelita, wiąże gliadynę i poprzez deamidację przekształca ją w cząsteczkę zdolną do aktywowania komórek T (komórki układu immunologicznego zdolne do wpływania na wszystkie odpowiedzi zapalne przeciwko antygenom białkowym), a następnie produkcji immunoglobulin IgG przeciwko transglutaminazie i IgA przeciwko endomizie (ang. endomise). [00] W pierwszym etapie następuje wzrost ilości aktywowanych śródnabłonkowych jelitowych komórek T, podczas gdy wraz z postępem choroby wzrost dotyczy zarówno limfocytów jak i infiltrowanych komórek osoczowych własnej blaszki, wraz z produkcją metaloproteinaz odpowiedzialnych za skracanie kosmków i w ten sposób uszkodzenie błony śluzowej jelit. [0031] Możliwość zapobiegania rozwojowi lub leczenia celiakli jak dotąd nie istnieje, dlatego dieta bezglutenowa, przestrzegana ściśle przez całe życie, jest jedyną terapią, która jest w stanie zapewnić ludziom dotkniętym celiaklią doskonałe zdrowie.

10 9 1 2 [0032] Osoby z celiaklią muszą wyeliminować nawet najmniejsze ślady mąki z niebezpiecznych zbóż, ponieważ spożycie glutenu, także w minimalnych ilościach, może wywołać reakcję autoimmunologiczną. [0033] Ze względu na to, że stosunek ilości spożytego glutenu do toksycznego wpływu indukowanego na poziome jelita jeszcze nie został zdefiniowany, termin śladowe ilości ma fundamentalne znaczenie praktyczne w leczeniu celiakii oraz implikacje dla planu legislacyjnego dotyczącego produktów żywnościowych, ponieważ wiąże się on z maksymalnym limitem dopuszczalnego glutenu (wartość progowa) w produktach odpowiednich w diecie osoby z celiakią. Wszyscy specjaliści w dziedzinie zgadzają się, że dawka 0 mg na dzień gliadyny, równoważna 0 mg glutenu, to znaczy około 3 g chleba, jest wystarczająca aby spowodować, u większości osób z celiakią, wzrost ilości limfocytów śródnabłonkowych w jelicie, wczesną oznakę trwałego zapalenia jelit. W odniesieniu do minimalnej wartości progowej kilka z przeprowadzonych dotąd badań naukowych wydaje się wykazywać, że spożycie do miligramów na dzień gliadyny (równoważne częściom na milion glutenu) nie jest w stanie w sposób wrażliwy uszkodzić błony śluzowej jelit, ale, w mniejszości przypadków, może warunkować wystąpienie objawów żołądkowojelitowych. [0034] Na międzynarodowym poziomie legislacyjnym stara norma Kodeks norm dla bezglutenowych produktów żywnościowych ("Codex Standard for Gluten-Free Foods"), wciąż pozostający w mocy, pokazuje jako maksymalną zawartość glutenu w produktach do terapii dietą 0,0

11 1 2 azotu na 0 g suchego produktu (w odniesieniu do skrobi z pszenicy), co odpowiada frakcji glutenu równoważnej około 00 ppm. [003] Jednakże, następuje obecnie weryfikacja wspomnianych powyżej wytycznych, która wydaje się przewidywać, że bezglutenowe produkty żywnościowe otrzymane z naturalnie bezglutenowych składników nie mogą zawierać więcej niż ppm glutenu, podczas gdy produkty żywnościowe otrzymane ze zbóż z glutenem, mogą zawierać maksymalny limit 0 ppm glutenu. We Francji, Wielkiej Brytanii i Holandii, w oczekiwaniu na weryfikację wspomnianych powyżej wytycznych, za maksymalny limit dla produktów bezglutenowych uważa się 0 ppm. [0036] Na poziomie krajowym, obecnie obowiązująca zasada wydaje się być bardziej zapobiegawcza niż wspólnotowa czy międzynarodowa, w istocie ustalono limit " części na milion", zarówno dla produktów żywnościowych otrzymanych z nieprzetworzonych materiałów naturalnie wolnych od glutenu, jak i produktów żywnościowych oczyszczonych z tej substancji. [0037] Zasada ta przewiduje, że "jeżeli, w składzie produktu żywnościowego, lub w składzie jednego lub więcej składników (środki smakowo-zapachowe, dodatki i ko-adiuwanty) go tworzących, występują zboża zawierające gluten lub substancje z niego pochodzące i/lub jeżeli w końcowym produkcie pewna ilość glutenu może pochodzić z procesu produkcyjnego, analitycznie określona jako wyższa niż części na milion, to na etykiecie takiego produktu muszą być pokazane, na końcu

12 listy składników, jak również w sposób widoczny, słowa produkt zawierający gluten. [0038] Całkowite wykluczenie glutenu z diety nie jest jednak łatwe do przeprowadzenia, ze względu na możliwość wystąpienia zjawiska zanieczyszczenia krzyżowego zbóż i pochodnych (skrobi, mąk, mąki skrobiowej itp.) naturalnie wolnych od glutenu, już na etapie mielenia przemysłowego. [0039] Takie produkty stosowane są następnie przez przemysł spożywczy do wytwarzania złożonych produktów żywnościowych opartych na złożonych składnikach technologicznych, dodatkach i ko-adiuwantach różnego pochodzenia i charakteru. Ostatnie badania pokazały, że do 6% "teoretycznie" bezglutenowych produktów, opartych na opisanych składnikach, w istocie zawiera ponad mg gliadyny na 0 g produktu końcowego, co jest równoważne 600 ppm glutenu. [0040] W celu wykluczenia możliwego zanieczyszczenia glutenem, jest zatem konieczne rozważenie, dla każdego produktu wprowadzanego do sprzedaży, nie tylko wszystkich składników stosowanych i poddawanych obróbce, ale również łańcucha produkcyjnego każdego poszczególnego składnika. [0041] Istnieje zatem zapotrzebowanie na możliwość wytwarzania hodowli bakterii probiotycznych wolnych od alergizujących substancji z powodu zastosowania substratów do fermentacji opartych na mleku lub zbożach, albo alternatywnie, z powodu zanieczyszczeń niezamierzonych lub krzyżowych. W istocie, pomimo tego jest jednak możliwe, że, z powodu niezamierzonych i przypadkowych zanieczyszczeń, pewne składniki stosowane

13 w procesie produkcyjnym zawierają śladowe ilości alergenów. [0042] Istnieje zatem zapotrzebowanie na możliwość dostarczenia sposobu wytwarzania hodowli bakterii probiotycznych, który przewiduje, w każdym etapie procesu produkcyjnego, w tym fermentacji, zastosowanie substancji niealergizujących. W szczególności, pożądane jest zlokalizowanie i wyselekcjonowanie substratów do fermentacji, innych niż mleko i jego pochodne oraz zboża zawierające gluten, które stanowią dobre źródło azotu i węgla. [0043] Zatem, wszyscy operatorzy tego sektora zgadzają się, jak dotąd, że istnieje bardzo silne zapotrzebowanie na dostarczenie sposobu do wytwarzania hodowli bakterii probiotycznych zdolnych do wykorzystywania alternatywnych substratów niż te stosowane dotąd, oraz jednocześnie zdolnych do zmniejszania niezamierzonych i krzyżowych zanieczyszczeń gdyby takie miały wystąpić. [0044] W szczególności, istnieje zapotrzebowanie na dostarczenie sposobu wytwarzania hodowli bakterii probiotycznych, który przewiduje podwójny poziom bezpieczeństwa dotyczącego braku substancji alergizujących. [004] Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie sposobu wytwarzania pożywek hodowlanych zdolnych do przezwyciężenia ograniczeń znanych ze stanu techniki. [0046] Innym celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie metodologii do wytwarzania hodowli bakterii probiotycznych bezpiecznych do podawania całej populacji, również ludziom dotkniętym alergiami.

14 [0047] Te i inne cele, które staną się widoczne z następującego szczegółowego opisu, zrealizowane zostały przez Zgłaszającego, który usprawnił metodologię, która obejmuje podwójny poziom bezpieczeństwa odnoszącego się do braku alergenów w procesie produkcyjnym hodowli bakterii probiotycznych. [0048] W szczególności, Zgłaszający opracował metodologię wytwarzania, w której stosowane są wyselekcjonowane niealergizujące substraty do fermentacji (niealergizujące surowce), zdolne do dostarczania hodowlom pro biotycznym odpowiedniego źródła azotu i węgla. [0049] Sposób wytwarzania niealergizujących hodowli bakterii probiotycznych, kompozycji zawierającej taką hodowlę i zastosowanie takiej hodowli do wytwarzania tak zwanej żywności funkcjonalnej lub nutraceutycznej stanowią przedmioty niniejszego wynalazku posiadające cechy jak zdefiniowano w dołączonych zastrzeżeniach. [000] W jednym wykonaniu wynalazku, szczepy wspomnianej hodowli bakteryjnej należą do rodzajów: Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus, Pediococcus, Lactococcus, Propionibacterium, Bacillus, Saccharomyces, Enterococcus, Leuconostoc. [001] Korzystnie z rodzaju Lactobacillus znalazły zastosowanie następujące gatunki: L. pentosus, L. plantarum, L. casei, L. casei ssp. paracasei, L. casei ssp. rhamnosus, L. acidophilus, L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. fermentum, L. gasseri. [002] Przykłady zastosowanych szczepów tych gatunków wymieniono w załączonej Tabeli 1. Korzystnie z rodzaju

15 Bifidobacterium znalazły zastosowanie następujące gatunki: B. longum. B. breve, B. lactis, B. adolescentis i B. pseudocatenulatum. [003] Przykłady zastosowanych szczepów tych gatunków wymieniono w załączonej Tabeli 1. Korzystnie z rodzaju Lactococcus znalazły zastosowanie następujące gatunki: L. lactis and L. lactis ssp. Lactis. [004] Przykłady zastosowanych szczepów tych gatunków wymieniono w załączonej Tabeli 1. Korzystnie z rodzaju Streptococcus znalazł zastosowanie następujący gatunek: S. thermophilus. [00] Przykłady zastosowanych szczepów wymienionych gatunków przedstawiono w załączonej Tabeli 1. [006] W szczególnie korzystnym wykonaniu wynalazku bakterie we wspomnianej hodowli bakteryjnej wybrane są z grupy zawierającej szczepy bakterii probiotycznych wymienione w Tabeli 1. [007] Zgłaszający stwierdził, że użyteczne jest wyselekcjonowanie i wykorzystanie szczególnych surowców niealergizujących. W szczególności Zgłaszający stwierdził, że jako źródło azotu stosowane mogą być peptony i/lub hydrolizaty białkowe pochodzenia roślinnego i/lub zwierzęcego, naturalnie wolne od glutenu i alergenów pochodzących z mleka (ang. milky origin), i jako źródło węgla, glukoza i/lub inne monolub disacharydy pochodzące z hydrolizy bardziej złożonych polisacharydów typowych dla gatunków roślinnych naturalnie wolnych od glutenu i alergenów pochodzących z mleka. [008] Peptony pochodzenia roślinnego wybrane są z grupy zawierającej: ryż, ziemniaka, kukurydzę,

16 1 1 2 kasztany, tapiokę, maniok, groch, bób i ich mieszaniny, zdolne jednakże do sprzyjania fermentacji wzrostu bakteryjnego, bez wytwarzania alergenów, ani typu pochodzącego z mleka ani z glutenu. [009] W pierwszej korzystnym wykonaniu sposób będący przedmiotem niniejszego wynalazku przewiduje zastosowanie, jako źródła azotu, jednego lub więcej peptonów i/lub niealergizujących hydrolizatów białkowych i, jako źródło węgla, glukozy i/lub innych mono- lub disacharydów pochodzących z hydrolizy złożonych polisacharydów (niealergizujące surowce). [0060] W drugiej korzystnym wykonaniu sposób będący przedmiotem niniejszego wynalazku przewiduje wstępną obróbkę surowców za pomocą enzymów odpowiednich do usuwania śladowych ilości, jeżeli występują jakiekolwiek, alergenów pochodzących z zanieczyszczenia krzyżowego, które nastąpiło w łańcuchu produkcyjnym i/lub dystrybucyjnym. [0061] W kontekście niniejszego wynalazku substrat hodowli stanowi niealergizujący substrat hodowli pochodzenia roślinnego i/lub zwierzęcego, naturalnie wolny od glutenu, alergenów pochodzących z mleka i wszystkich substancji wymienionych w liście w aneksie III bis wspomnianych powyżej wytycznych (niealergizujące surowce). Zastosowanie wspomnianych powyżej niealergizujących surowców pozwala na uzyskanie certyfikowalnych probiotyków do zastosowania u ludzi z alergią, ponieważ można zapewnić brak zastosowania substancji należących do listy z aneksu III bis wspomnianych powyżej wytycznych wspólnotowych i

17 zastosowanie składników posiadających certyfikat od dostawcy, że są one wolne od takich substancji. [0062] Następnie, ze względu na fakt, że brak jakiejkolwiek substancji chemicznej w danej próbce nie jest naukowo wykazywalny, jednak możliwe jest określenie po prostu, że ilość występująca, być może, jest niższa niż limit detekcji zastosowanej metody analitycznej (nawet w przypadku zastosowania bardziej czułej i udoskonalonej metody znanej w dziedzinie), źródłem dodatkowej gwarancji mogą być również wyniki zastosowanej wstępnej obróbki enzymatycznej. [0063] Jedynie na zasadzie przykładu poniżej przedstawiono pewne niealergizujące preparaty pożywki do wzrostu hodowli bakterii probiotycznych. [0064] Składniki pożywki hodowlanej muszą dostarczać źródeł azotu (w tym przypadku peptonów i/lub hydrolizatów białkowych), źródeł węgla (w tym przypadku glukozy i/lub innych mono- lub disacharydów pochodzących z hydrolizy złożonych polisacharydów), bioaktywatorów wzrostu i witamin (w tym przypadku z ekstraktu drożdżowego) i soli mineralnych. [006] Przykładowo pożywka hodowlana może zawierać: glukozę korzystnie wybraną spośród: skrobi kukurydzianej, ziemniaka, sacharozy z buraka lub sacharozy z trzciny; pepton korzystnie wybrany spośród: ryżu, kukurydzy, kasztana, tapioki, manioku, grochu, bobu, fasoli lub ogólnie roślin strączkowych i ich mieszanin; pepton korzystnie wybrany spośród: mięsnych;

18 17 ekstrakt drożdżowy; sole mineralne (takie jak, tylko dla przykładu, octany, węglany, fosforany, wodorofosforany, chlorki, cytryniany, siarczany i inne); wypełniacz (gdy to konieczne, taki jak Tween, lecytyny i inne) i wodę pitną. [0066] Jeden z preparatów odpowiednich do hodowli szczepów z rodzajów Lactobacillus i Bifidobacterium może korzystnie zawierać następujące składniki: Glukoza (ze źródeł wymienionych powyżej) Pepton ryżowy Pepton mięsny Ekstrakt drożdżowy Sole mineralne Wypełniacze Woda pitna -0 g/l -0 g/l -0 g/l 2- g/l 1- g/l 0- ml/l q.s. do pożądanej objętości [0067] Korzystny przykład pożywki dla niealergizujących hodowli bakterii probiotycznych mógłby być następujący: Glukoza (ze skrobi kukurydzianej) Pepton ryżowy Pepton mięsny Ekstrakt drożdżowy Octan sodu g/l g/l g/l g/l g/l

19 18 Cytrynian amonu Diwodorofosforan potasu Siarczan magnezu Siarczan manganu Tween 80 Woda pitna 2 g/l 2 g/l 0,1 g/l 0,0 g/l 1 ml/l q.s. do pożądanej objętości 1 [0068] Fermentację przeprowadza się zgodnie ze wskazówkami znanymi specjaliście w dziedzinie i w powszechnie stosowanych warunkach doświadczalnych. [0069] Zgłaszający zweryfikował występowanie, lub brak, śladowych ilości alergenów w hodowli probiotycznej hodowanej na surowcach będących przedmiotem niniejszego wynalazku. [0070] Przykładowo w przypadku alergenów pochodzących z mleka badanie analityczne β-laktoglobuliny i laktozy przeprowadzone na produktach końcowych za pomocą potwierdzonych swoistych i czułych metodologii (analiza z użyciem zestawu ELISA swoistego dla β-laktoglobuliny typu "Bovine β-lactoglubilins ELISA quantitation kit - Bethyl Laboratories", z limitem progowym wynoszącym 0,0 ppm i analiza z użyciem zestawu chemoenzymatycznego i detekcją w zakresie UV-widzialnym dla laktozy typu "Lactose/D-glucose ("Laktoza/Dglukoza") - Boehringer Mannheim, kod , z limitem progowym wynoszącym 7 ppm) daje wynik ujemny i, dlatego, te substancje, jeżeli występują, powinny być z pewnością poniżej wartości progowej detekcji.

20 [0071] W tym samym czasie badanie glutenu przeprowadzone z użyciem potwierdzonej bardziej udoskonalonej i jak dotąd bardziej czułej metodologii (ELISA RIDASCREEN Gliadin kit - R-Biopharm A, Darmstadt, Niemcy, z czułością wynoszącą 3 ppm) pozwala na wykazanie braku glutenu. Wynika z tego, że nawet jeśli gluten występowałby, jego stężenie w każdym przypadku powinno być poniżej wartości progowej detekcji, mianowicie powinno być niższe niż 3 ppm. [0072] Wstępna obróbka enzymatyczna przeprowadzana na surowcach, która ma być przeprowadzana lub nie w zależności od wymagań, jest w stanie zhydrolizować śladowe ilości mleka i jego pochodnych oraz glutenu i jego pochodnych przypadkowo występujących w pożywce hodowlanej. Taka obróbka zapewnia najwyższy standard bezpieczeństwa do zastosowania odpowiedniego również dla ludzi z alergią i szczególnie wrażliwych. [0073] Ta strategia produkcji jest odpowiednia do wytwarzania probiotyków o stopniu bezpieczeństwa niealergizującego, nazywanym DSS (System podwójnego bezpieczeństwa, ang. Double Safety System). [0074] Wstępna obróbka enzymatyczna przewiduje zastosowanie co najmniej enzymu proteolitycznego i/lub zastosowanie co najmniej enzymu glikozydazowego. [007] W kontekście niniejszego wynalazku enzym proteolityczny zdolny jest do przeprowadzania proteolizy. Enzym proteolityczny wybrany jest z grupy zawierającej proteazy i/lub peptydazy. Proteazy i peptydazy są wybrane z grupy zawierającej: trypsynę, chymotrypsynę, pankreatynę, pepsynę, papainę i bromelainę. Korzystnie proteazy i peptydazy wybrane są

21 1 2 spośród pepsyny i/lub bromelainy. W kontekście niniejszego wynalazku enzym glukozydazowy zdolny jest do przeprowadzania cięcia hydrolitycznego glikozydu. Enzym glikozydazowy wybrany jest z grupy zawierającej: alfa-glukozydazę i beta-glukozydazę, alfa-galaktozydazę i beta-galaktozydazę. [0076] Korzystnie, obróbkę enzymatyczną surowców tworzących brzeczkę wzrostową dla probiotyków przeprowadza się z użyciem proteaz (alkalaz i bromelainy) oraz z użyciem glikolizydaz. [0077] Glikozydazy wybrane są z grupy zawierającej: laktazę (lub β-galaktozydazę). W korzystnym wykonaniu obróbka wstępna surowców przewiduje zastosowanie w kolejności trzech enzymów: alkalazy, laktazy i bromelainy. [0078] W korzystnym wykonaniu selekcja enzymów i ich kolejność jest następująca: Alkalaza, która praktycznie hydrolizuje wszystkie białka a w szczególności białka mleka; Laktaza, kótra hydolizuje laktozę; Bromelaina, która hydrolizuje gluten. [0079] Pokazana kolejność jest funkcją optymalnego ph dla hydrolizy w gradiencie od zasadowego do kwasowego, w ten sposób, pożywka zachowuje właściwości odżywcze. Alkalaza, aktywna względem β-laktoglobuliny, α- laktoalbuminy i kazein, pozwala na eliminację alergizujących pozostałości, jeżeli występują, pochodzących z nieprzewidzianych i przypadkowych zanieczyszczeń krzyżowych z pochodnych mleka. [0080] Taka obróbka przewiduje zastosowanie dodatku do surowców rozpuszczonych w wodzie pewnej ilości enzymu w

22 zakresie pomiędzy 0,002 a 0,000 g/l, co odpowiada 0,001-0,0 AU/l (jednostek Ansona na litr, ang. Anson Units per Liter). Roztwór doprowadza się następnie do temperatury pomiędzy 4 a C na 1-60 minut, przy ph pomiędzy 7 a 8; korzystnie, kontrolowanym ph wynoszącym 7,0 ± 0,. [0081] Laktaza, znana również jako β-galaktozydaza, odpowiada za hydrolizę wiązania glikozydowego pomiędzy glukozą i galaktozą w disacharydzie laktozowym. [0082] Obróbka laktazą przeprowadzana jest po hydrolizie białek z użyciem alkalazy po doprowadzeniu ph brzeczki hodowlanej do wartości pomiędzy 6 a 7; korzystnie, wartości 6,0 ± 0, za pomocą kwasów organicznych (korzystnie kwasu mlekowego) poprzez dodanie -00 NLU/l (obojętnych jednostek laktazy na litr, ang. Neutral Lactase Units per Liter), co odpowiada 0,0 0,40 ml roztworu enzymu o mianie 000 NLU/g. [0083] Roztwór utrzymuje się w 37 ± C przez różne okresy czasu w zakresie 2-6 godzin. Ostatecznie, bromelaina jest enzymem proteolitycznym naturalnie występującym w ananasie, zdolnym do skutecznej hydrolizy gliadyny na fragmenty nierozpoznawane przez układ immunologiczny, a przez to niealergizujące. [0084] Obróbkę przeprowadza się poprzez dodanie do pożywki fermentacyjnej enzymu w ilości do 0,00-0,0 g/l (równoważne 1-2 GDU/l, jednostkom trawienia żelatyny na litr, ang. Gelatin Digesting Units per Liter), po korekcie ph do wartości,0-6,0 za pomocą kwasów organicznych (korzystnie kwasu mlekowego). Temperatura pracy musi być utrzymywana na poziomie 37 ±

23 C przez okres czasu pomiędzy 1 godziną a 6 godzinami. [008] Po trzech obróbkach enzymatycznych konieczne jest przywrócenie ph do wartości optymalnej do fermentacji poszczególnych szczepów (korzystnie za pomocą N NaOH w celu zalkalizowania, albo za pomocą kwasu mlekowego w celu zakwaszenia). [0086] Następnie przeprowadza się obróbkę termiczną w celu oczyszczania pożywki (przeprowadzaną w temperaturach pomiędzy 90 a 14 C przez różne okresy czasu w zakresie od kilku sekund do 4 minut), która zdenaturuje i zinaktywuje dodane enzymy, jednakże bez dalszych zagrożeń dla produktu końcowego i ludzi dla których jest on przeznaczony, pochodzących z pozostałości stosowanego enzymu. [0087] Typowy wzorzec produkcji przemysłowej przewiduje zatem następujące etapy: a. selekcji nielaergizujących surowców b. rozpuszczania surowców w wodzie c. korekty ph i temperatury do odpowiednich wartości dla zastosowania enzymu proteolitycznego, korzystnie alkalazy d. dodawania enzymu i jego działania przez wymagany czas e. korekty ph i temperatury do odpowiednich wartości dla zastosowania enzymu glikolitycznego, korzystnie laktazy f. dodawania enzymu i jego działania przez wymagany czas

24 g. korekty ph i temperatury do odpowiednich wartości dla zastosowania enzymu proteolitycznego, korzystnie bromelainy h. dodawania enzymu i jego działania przez wymagany czas i. korekty ph do wartości odpowiednich dla fermentacji j. oczyszczania przez pasteryzację i/lub sterylizację pożywki hodowlanej k. schładzania w temperaturze inokulum typowej dla szczepu probiotycznego w produkcji (37 ± 2 C). l. inokulum szczepu m. fermentacji n. oddzielania biomasy i krioprotekcji o. liofilizacji. [0088] Niniejszy wynalazek pozwala na wytwarzanie niealergizujących szczepów probiotycznych, a w szczególności z absolutnym brakiem alergenów, korzystniej pochodnych mleka i glutenu, o szerokim bezpieczeństwie zastosowania dla wszystkich klas populacji. [0089] Korzystnie niealergizujące hodowle probiotyczne wytworzone zgodnie ze wskazówkami niniejszego wynalazku mogą być skutecznie stosowane do wytwarzania preparatów farmaceutycznych. [0090] Ze względu na dużą liczbę osób dotkniętych alergią na mleko (3-% populacji w wieku poniżej 2 lat) i osób dotkniętych celiaklią (1% całej populacji) użyteczna jest próba opracowania bakterii probiotycznych, które mogą być podawane tym klasom populacji.

25 [0091] Niniejszy wynalazek jest zatem użyteczny: dla konsumentów, dla których fundamentalne znaczenie ma przejrzystość etykietowania; dla producentów, którzy w ten sposób mogą zapewnić produktowi całkowitą gwarancję właściwości niealergizujących, zatem możliwość zaproponowania go całej kupującej populacji. [0092] W korzystnym wykonaniu sposób wytwarzania niealergizującej hodowli bakterii probiotycznych cechuje się tym, że obejmuje co najmniej jeden etap w którym bakterie kontaktuje się z niealergizującą pożywką hodowlaną. [0093] Korzystnie wytwarzanie wspomnianej hodowli bakterii probiotycznych obejmuje co najmniej jeden etap, w którym bakterie we wspomnianej hodowli wybrane są z grupy obejmującej rodzaj Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus, Pediococcus, Lactococcus, Propionibacterium, Bacillus, Saccharomyces, Enterococcus, Leuconostoc, wytwarzane są poprzez opracowanie niealergizującej pożywki. [0094] Korzystnie bakterie we wspomnianej hodowli wybrane są z grupy obejmującej następujące gatunki bakterii: L. pentosus, L. plantarum, L. casei, L. casei ssp. paracasei, L. casei ssp. rhamnosus, L. acidophilus, L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. fermentum, L. gasseri, B. longum. B. breve, B. lactis, B. adolescentis i B. pseudocatenulatum, L. lactis and L. lactis ssp. Lactis, S. thermophilus. [009] Korzystnie, wspomniane bakterie wybrane są z grupy zawierającej następujące szczepy bakterii probiotycznych:

26 2 1 Streptococcus thermophilus LMG P Streptococcus thermophilus LMG P Lactobacillus pentosus LMG P Lactobacillus plantarum LMG P-2 Lactobacillus plantarum LMG P Lactobacillus plantarum LMG P Lactobacillus plantarum LMG P Lactobacillus casei ssp. Paracasei LMG P Lactobacillus acidophilus LMG P Bifidobacterium longum LMG P Bifidobacterium breve LMG P Bifidobacterium lactis LMG P Lactobacillus plantarum LMG P Lactococcus lactis ssp. lactis LMG P Lactococcus lactis ssp. lactis LMG P Lactobacillus plantarum LMG P Streptococcus thermophilus DSM Streptococcus thermophilus DSM Bifidobacterium longum DSM Bifidobacterium breve DSM Lactobacillus casei ssp. rhamnosus DSM Lactobacillus delbrueckii ssp. DSM 16606

27 26 bulgaricus 23 Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus DSM Streptococcus thermophilus DSM Streptococcus thermophilus DSM Streptococcus thermophilus DSM Streptococcus thermophilus DSM Bifidobacterium adolescentis DSM Bifidobacterium adolescentis DSM 169 Bifidobacterium breve DSM Bifidobacterium pseudocatenulatum 32 Bifidobacterium pseudocatenulatum DSM 1697 DSM Staphylococcus xylosus DSM Bifidobacterium adolescentis DSM Lactobacillus plantarum DSM Streptococcus thermophilus DSM Streptococcus thermophilus DSM Streptococcus thermophilus DSM Lactobacillus fermentum DSM Lactobacillus fermentum DSM Lactobacillus fermentum DSM Lactobacillus fermentum DSM Lactobacillus gasseri DSM 18299

28 27 44 Lactobacillus gasseri DSM Lactobacillus gasseri DSM Lactobacillus gasseri DSM Bifidobacterium adolescentis DSM Bifidobacterium adolescentis DSM Bifidobacterium adolescentis DSM Bifidobacterium catenulatum DSM [0096] Korzystnie, niealergizujący substrat hodowli zawiera co najmniej pepton i/lub hydrolizat białkowy. [0097] Korzystnie pepton i/lub hydrolizat białkowy wybrany jest z grupy zawierającej: pepton i/lub hydrolizat białkowy pochodzenia roślinnego i/lub zwierzęcego. [0098] Korzystnie, pepton pochodzenia roślinnego wybrany jest z grupy zawierającej: ryż, ziemniaka, kukurydzę, kasztany, tapiokę, maniok, groch, bób, rośliny strączkowe i/lub ich mieszaniny. [0099] Korzystnie, pepton pochodzenia zwierzęcego wybrany jest spośród peptonów mięsnych. [00] Korzystnie, niealergizujący substrat hodowli zawiera co najmniej substancję wybraną spośród: glukozy i/lub mono- lub disacharydu pochodzącego z hydroliz złożonych polisacharydów. [01] Korzystnie, glukoza pochodzi ze skrobi kukurydzianej, skrobi ziemniaczanej lub sacharozy z buraka lub trzciny. [02] Korzystnie, niealergizujący substrat hodowli zawiera: glukozę, jak ujawniono powyżej, co najmniej pepton mięsny jak ujawniono powyżej, i co najmniej

29 pepton pochodzenia roślinnego, jak ujawniono poniżej; korzystnie pepton ryżowy. Korzystnie, wspomniane bakterie, które są w kontakcie ze wspomnianym niealergizującym substratem hodowli są poddawane etapowi fermentacji i następnie liofilizacji. Wytworzone hodowle bakterii probiotycznych są niealergizującymi hodowlami bakterii probiotycznych zawierającymi antygeny w ilości poniżej limitu detekcji: 3 ppm dla glutenu, 7 ppm dla laktozy i 0,0 ppm dla laktoglobulin. [03] Inne korzystne wykonanie dotyczy hodowli bakterii probiotycznych, przy czym wspomniana hodowla bakteryjna jest wybrana z grupy szczepów bakterii probiotycznych jak ujawniono powyżej, którą otrzymuje się sposobem jak ujawniono powyżej. Inne korzystne wykonanie dotyczy zastosowania co najmniej jednej niealergizującej hodowli bakterii probiotycznych do wytwarzania produktu spożywczego lub preparatu farmaceutycznego przeznaczonego dla osób szczególnie wrażliwych na substancje alergizujące; korzystnie typu glutenu i/lub mleka. [04] Inne korzystne wykonanie dotyczy sposobu wytwarzania hodowli bakterii probiotycznych, przy czym wspomniana hodowla wybrana jest z grupy wspomnianych powyżej szczepów bakterii probiotycznych. [0] Sposób ten obejmuje co najmniej jeden etap, w którym bakterie wytwarzane są z użyciem niealergizującego substratu hodowli uprzednio poddanego wstępnej obróbce enzymatycznej w celu eliminacji śladowych ilości alergenów, jeżeli są, występujących poprzez zanieczyszczenie krzyżowe lub niezamierzone.

30 [06] Korzystnie, wstępna obróbka enzymatyczna przewiduje zastosowanie co najmniej enzymu proteolitycznego i/lub co najmniej enzymu glikozydazowego. [07] Korzystnie, enzym proteolityczny jest wybrany z grupy zawierającej: proteazy i/lub peptydazy. Korzystnie proteazy i/lub peptydazy są wybrane z grupy zawierającej: trypsynę, chymotrypsynę, pankreatynę, pepsynę, papainę i bromelainę. Korzystnie proteazy i/lub peptydazy wybrane są spośród pepsyny i/lub bromelainy. Korzystnie, enzym glikozydazowy wybrany jest z grupy zawierającej: alfa-glukozydazę i betaglukozydazę, alfa-galaktozydazę i beta-galaktozydazę. [08] Korzystnie, wstępna obróbka enzymatyczna obejmuje zastosowanie co najmniej proteazy i co najmniej glikozydazy. Korzystnie, proteaza wybrana jest spośród alkalazy i bromelainy a glikozydaza wybrana jest spośród laktazy lub beta-galaktozydazy. [09] Korzystnie, wstępna obróbka enzymatyczna zawiera zastosowanie w kolejności: alkalazy, laktazy i bromelainy. [01] Korzystnie, alkalaza i wspomniany niealergizujący substrat traktowane są w temperaturze pomiędzy 4 C a C, przez czas pomiędzy 1 a 60 minut w ph zawartym pomiędzy 7 a 8; w szczególności, 7, ± 0,; [0111] Korzystnie, laktaza i wspomniany niealergizujący substrat traktowane są w temperaturze pomiędzy C a 40 C, przez czas pomiędzy 2 a 6 godzin w ph zawartym pomiędzy 6 a 7; w szczególności, 6, ± 0,.

31 1 2 [0112] Korzystnie, bromelaina i wspomniany niealergizujący substrat hodowli traktowane są w temperaturze pomiędzy C a 40 C, przez czas pomiędzy 1 a 6 godzin w ph zawartym pomiędzy a 6. [0113] Korzystnie, na koniec wstępnej obróbki enzymatycznej przewidziany jest etap, w którym ph przywraca się do wartości odpowiednich dla fermentacji poszczególnych szczepów oraz etap obróbki termicznej w temperaturze zawartej pomiędzy 90 C a 14 C w celu denaturacji i inaktywacji enzymów stosowanych we wspomnianym etapie wstępnej obróbki enzymatycznej i etap fermentacji wspomnianych szczepów wybranych spośród szczepów opisanych w dowolnym z zastrzeżeń 1 do 4. Korzystnie, niealergizujący substrat hodowli zawiera co najmniej pepton i/lub hydrolizat białkowy. [0114] Korzystnie, pepton i/lub hydrolizat białkowy wybrany jest z grupy zawierającej: pepton i/lub hydrolizat białkowy pochodzenia roślinnego i/lub zwierzęcego. Korzystnie, pepton pochodzenia roślinnego wybrany jest z grupy zawierającej: ryż, ziemniaka, kukurydzę, kasztany, tapiokę, maniok, groch, bób, rośliny strączkowe i/lub ich mieszaniny. [011] Korzystnie, pepton pochodzenia zwierzęcego wybrany jest spośród peptonów mięsnych. [0116] Korzystnie, niealergizujący substrat hodowli zawiera co najmniej substancję wybraną spośród: glukozy i/lub mono- lub disacharydu pochodzącego z hydroliz złożonych polisacharydów.

32 [0117] Korzystnie, glukoza pochodzi ze skrobi kukurydzianej, skrobi ziemniaczanej, albo sacharozy z buraka lub trzciny. [0118] Korzystnie, niealergizujący substrat hodowli zawiera: glukozę, jak wspomniano powyżej; co najmniej pepton mięsny, jak wspomniano powyżej i co najmniej pepton pochodzenia roślinnego, jak wspomniano powyżej; korzystnie pepton ryżowy. [0119] Korzystnie, wspomniane bakterie będące w kontakcie ze wspomnianym niealergizującym substratem hodowli są poddawane etapom fermentacji i następnie liofilizacji. [01] Korzystnie, wytworzone hodowle bakterii probiotycznych są niealergizującymi hodowlami bakterii probiotycznych zawierającymi antygeny w ilości poniżej limitu detekcji: 3 ppm dla glutenu, 7 ppm dla laktozy i 0,0 ppm dla laktoglobulin. [0121] Inne korzystne wykonanie dotyczy niealergizującej hodowli bakterii probiotycznych, przy czym wspomniana hodowla bakteryjna jest wybrana z grupy wspomnianych powyżej szczepów bakterii probiotycznych, którą można otrzymać sposobem, który obejmuje obróbkę enzymatyczną. [0122] Inne korzystne wykonanie dotyczy co najmniej jednej niealergizującej hodowli komórek probiotycznych, którą można otrzymać sposobem obejmującym obróbkę enzymatyczną, do wytwarzania produktu spożywczego lub preparatu farmaceutycznego przeznaczonego dla osób szczególnie wrażliwych na substancje alergizujące; korzystnie typu glutenu i/lub typu mleka.

33 32

34 33

35 34

36 3

37 36

38 37 Probiotical S.p.a. Pełnomocnik:

39 38 Zastrzeżenia patentowe Sposób wytwarzania niealergizujących hodowli bakterii probiotycznych, znamienny tym, że obejmuje on co najmniej jeden etap, w którym bakterie są w kontakcie z niealergizującą pożywką hodowlaną. 2. Sposób wytwarzania niealergizującej hodowli bakterii probiotycznych według zastrzeżenia 1, w którym we wspomnianym co najmniej jednym etapie bakterie we wspomnianej hodowli, wybrane z grupy zawierającej rodzaj Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus, Pediococcus, Lactococcus, Propionibacterium, Bacillus, Saccharomyces, Enterococcus, Leuconostoc, wytwarza się poprzez namnażanie w pożywce niealergizującej. 3. Sposób według zastrzeżenia 2, w którym bakterie we wspomnianej hodowli są wybrane z grupy obejmującej następujące gatunki bakterii: L. pentosus, L. plantarum, L. casei, L. casei ssp. paracasei, L. casei sap. rhamnosus, L. acidophilus, L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. fermentum, L. gasseri, B. longum. B. breve, B. lactis, B. adolescentis i B. pseudocatenulatum, L. lactis i L. lactis ssp. lactis, S. thermophilus. 4. Sposób według dowolnego z zastrzeżeń 1 do 3, w którym wspomniane bakterie wybrane są z grupy zawierającej następujące szczepy bakterii probiotycznych: 1 Streptococcus thermophilus LMG P-18383

40 39 2 Streptococcus thermophilus LMG P Lactobacillus pentosus LMG P Lactobacillus plantarum LMG P-2 Lactobacillus plantarum LMG P Lactobacillus plantarum LMG P Lactobacillus plantarum LMG P Lactobacillus casei ssp. paracasei LMG P Lactobacillus acidophilus LMG P Bifidobacterium longum LMG B Bifidobacterium breve LMG P Bifidobacterium lactis LMG P Lactobacillus plantarum LMG P Lactococcus lactis ssp. lactic LMG P Lactococcus lactic ssp. lactis LMG P Lactobacillus plantarum LMG P Streptococcus thermophilus DSM Streptococcus thermophilus DSM Bifidobacterium longum DSM Bifidobacterium breve DSM Lactobacillus casei ssp. rhamnosus DSM Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus 23 Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus DSM DSM 16607

41 40 24 Streptococcus thermophilus DSM Streptococcus thermophilus DSM Streptococcus thermophilus DSM Streptococcus thermophilus DSM Bifidobacterium adolescentis DSM Bifidobacterium adolescents DSM 169 Bifidobacterium breve DSM Bifidobacterium pseudocatenulatum DSM Bifidobacterium pseudocatenulatum DSM Staphylococcus xylosus DSM Bifidobacterium adolescentis DSM Lactobacillus plantarum DSM Streptococcus thermophilus DSM Streptococcus thermophilus DSM Streptococcus thermophilus DSM Lactobacillus fermentum DSM Lactobacillus fermentum DSM Lactobacillus fermentum DSM Lactobacillus fermentum DSM Lactobacillus gasseri DSM Lactobacillus gasseri DSM Lactobacillus gasseri DSM Lactobacillus gasseri DSM Bifidobacterium adolescentis DSM 18

42 41 48 Bifidobacterium adolescentis DSM Bifidobacterium adolescentis DSM Bifidobacterium catenulatum DSM Sposób według dowolnego z zastrzeżeń od 1 do 4, w którym niealergizująca pożywka hodowlana zawiera co najmniej pepton i/lub hydrolizat białkowy. 6. Sposób według zastrzeżenia, w którym pepton i/lub hydrolizat białkowy wybrany jest z grupy zawierającej: pepton i/lub hydrolizat białkowy pochodzenia roślinnego i/lub zwierzęcego, przy czym korzystnie wspomniany pepton pochodzenia roślinnego wybrany jest z grupy zawierającej: ryż, ziemniaka, kukurydzę, kasztany, tapiokę, maniok, groch, bób, rośliny strączkowe i/lub ich mieszaniny, a wspomniany pepton pochodzenia zwierzęcego wybrany jest spośród peptonów mięsnych. 7. Sposób według dowolnego z zastrzeżeń 1-6, znamienny tym, że zawiera co najmniej jeden etap, w którym bakterie wytwarza się z zastosowaniem niealergizującego substratu hodowli poddanego uprzednio wstępnej obróbce enzymatycznej mającej na celu eliminację śladowych ilości alergenów, jeżeli są, występujących poprzez zanieczyszczenie krzyżowe lub niezamierzone. 8. Sposób według zastrzeżenia 7, w którym wspomniana wstępna obróbka enzymatyczna przewiduje zastosowanie co najmniej enzymu proteolitycznego i/lub co najmniej enzymu glikozydazowego, korzystnie wspomniany enzym proteolityczny wybrany jest z grupy

43 zawierającej: proteazy i/lub peptydazy; korzystnie wspomniane proteazy i/lub peptydazy wybrane są z grupy zawierającej: trypsynę, chymotrypsynę, pankreatynę, pepsynę, papainę i bromelainę. 9. Sposób według zastrzeżenia 8, w którym enzym glikozydazowy wybrany jest z grupy zawierającej: alfaglukozydazę i beta-glukozydazę, alfa-galaktozydazę i beta-galaktozydazę.. Sposób według jednego lub więcej spośród zastrzeżeń od 7 do 9, w którym wstępna obróbka enzymatyczna obejmuje zastosowanie co najmniej proteazy i co najmniej glikozydazy. 11. Sposób według jednego lub więcej spośród zastrzeżeń od 7 do, w którym przy wstępnej obróbce enzymatycznej proteaza wybrana jest spośród alkalazy i bromelainy, a glikozydaza wybrana jest spośród laktazy lub beta-galaktozydazy, i przy czym wstępna obróbka enzymatyczna zawiera zastosowanie w kolejności: alkalazy, laktazy i bromelainy. 12. Sposób według jednego lub więcej spośród zastrzeżeń od 7 do 11, w którym na koniec wstępnej obróbki enzymatycznej przewidziany jest etap, w którym ph przywraca się do wartości odpowiednich dla fermentacji poszczególnych szczepów oraz etap obróbki termicznej w temperaturze zawartej pomiędzy 90 C a 14 C w celu denaturacji i inaktywacji enzymów stosowanych we wspomnianym etapie wstępnej obróbki enzymatycznej i etap fermentacji wspomnianych szczepów wybranych spośród szczepów opisanych w dowolnym z zastrzeżeń 1 do 4.

44 Niealergizująca hodowla bakterii probiotycznych, którą można otrzymać sposobem według dowolnego z zastrzeżeń od 1 do 12, zawierająca: i) mniejszą niż 3 ppm ilość glutenu, jak oznaczono z zastosowaniem zestawu ELISA RIDASCREEN Gliadin, ii) mniejszą niż 7 ppm ilość laktozy, jak oznaczono poprzez analizę z zastosowaniem zestawu chemoenzymatycznego i wykrywania w zakresie UVwidzialnym dla laktozy z zastosowaniem zestawu typu "Laktoza/D-glukoza", iii) mniejszą niż 0,0 ppm ilość β-laktoglobuliny, jak oznaczono z zastosowaniem swoistego zestawu dla β- laktoglobuliny typu ELISA do oceny ilościowej β- laktoglobulin bydlęcych Zastosowanie co najmniej jednej niealergizującej hodowli bakterii probiotycznych według zastrzeżenia 13 do wytwarzania produktu spożywczego lub preparatu farmaceutycznego przeznaczonego dla ludzi szczególnie wrażliwych na substancje alergizujące typu glutenu i/lub nabiałowego. Probiotical S.p.a. Pełnomocnik: