(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) (51) T3 Int.Cl. C12Q 1/16 (06.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 14/25 EP B1 (54) Tytuł wynalazku: Sposoby określania ryzyka komplikacji prenatalnych (30) Pierwszeństwo: US P US P US P US P (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr /44 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego /03 (73) Uprawniony z patentu: PerkinElmer Health Sciences, Inc., Waltham, US WALLAC OY, Turku, FI The Fetal Medicine Foundation, London, GB (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 HOWARD CUCKLE, Harrogate, GB KYPROS NICOLAIDES, London, GB TARJA AHOLA, Turku, FI LEONA POON, London, GB (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Izabela Szychulska-Hawranek KANCELARIA PRAWNO-PATENTOWA BELLEPAT ul. Grunwaldzka 58/ Przemyśl Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 SPOSOBY OKREŚLANIA RYZYKA KOMPLIKACJI PRENATALNYCH TŁO Każdego roku co najmniej 126 milionów kobiet na świecie rodzi dzieci. Ponad milionów z nich doświadcza komplikacji lub choroby związanej z ciążą. Przykładowo, zaburzenia nadtętnicze takie jak stan przedrzucawkowy dotyka więcej niż % wszystkich ciąż i są głównym powodem śmierci matki. Adekwatna prenatalna opieka zdrowotna zmniejsza szanse iż takie komplikacje i choroby przejdą niezauważone. W wielu krajach, sposoby przesiewowe celem określenia ryzyka komplikacji prenatalnych i/lub nieprawidłowości u płodu stały się rutyną by pomóc w leczeniu i doradzaniu ciężarnym kobietom. Przykładowo, w Europie, USA i pewnych regionach Azji, dostawcy opieki zdrowotnej powszechnie przeprowadzają skrining pod kątem chromosomalnych nieprawidłowości u płodu przy użyciu biochemicznych markerów obecnych we krwi matki. Taki skrining jest pomocny dla identyfikowania kobiet, które posiadają dostatecznie wysokie ryzyko celem uzasadnienia dalszego badania diagnostycznego, które może być inwazyjne i nieść ryzyko dla płodu. Krew matki i inne płyny zawierają także biochemiczne markery, które mogą być zastosowane do wykrywania chorób kobiet związanych z ciążą. Nawet wtedy, obecnie żadne rutynowe badania przesiewowe nie zostały przyjęte dla wczesnego wykrywania stanu przedrzucawkowego przy użyciu próbek od matki. Zatem, występuje potrzeba na opracowanie dokładnych sposobów skriningu pod kątem prenatalnych komplikacji i/lub nieprawidłowości u płodu. WO02/371 ujawnia sposoby przewidywania stanu przedrzucawkowego, które obejmują określanie poziomów dwóch lub więcej spośród PlGF, PAI-1, i PAI-2. Nie ma ujawnienia określenia stosunku prawdopodobieństwa pod kątem ciśnienia krwi. WO07/ opisuje sposoby przewidywania stanu przedrzucawkowego, które obejmują określanie poziomów stnfαr1 i PlTF. Nie dostarczono ujawnienia dotyczącego określania stosunku prawdopodobieństwa pod kątem ciśnienia krwi. Bersinger i in., Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica, Tom 83 Numer 1, styczeń 04 strony ujawnia, że zmniejszone poziomy PAPP-A i PlGF w siedemnastym tygodniu są związane ze stanem przedrzucawkowym. Than i in., Placenta, Tom 29, grudzień 07, strony zauważa, że wczesna ocena ryzyka stanu przedrzucawkowego jest głównym wyzwaniem, i zasugerowano, że PAPP-A posiada znaczenie w ocenie ryzyka stanu przedrzucawkowego w pierwszym trymestrze. Bersinger i in., Immuno Analyse et Biologie Specialisé, Tom Numer 6, grudzień 05 strony ujawnia, że poziomy PAPP-A były podwyższone i poziomy PlGF były obniżone u pacjentek, u których zdiagnozowano stan przedrzucawkowy w próbkach pobranych w tygodniu ciąży. Bersinger i in., Immuno Analyse et Biologie Specialisé, Tom 22 Numer 1, marzec 07 strony opisuje, że zmniejszone poziomy PlGF w drugim trymestrze były związane ze stanem przedrzucawkowym. Bersinger i in., European Journal of Endocrinology, Tom 147, Numer 6, grudzień 02 strony ujawnia, że podwyższone poziomy PAPP-A i zmniejszone poziomy PlGF zaobserwowano w surowicy u pacjentek z występującym stanem przedrzucawkowym. Konijnenberg i in., American Journal of Obstetrics and Gynecology, Tom 177, Numer 2, sierpień 1997 strony opisuje, że ekspresja CD63 w pierwszym trymestrze może być przydatna do identyfikacji podgrupy pacjentek o wysokim ryzyku rozwinięcia stanu przedrzucawkowego zwłaszcza w połączeniu z pierwszotrymestrowym przedporodowym ciśnieniem krwi. 45 1

3 PODSUMOWANIE Niniejsze ujawnienie dostarcza sposób określania ryzyka stanu przedrzucawkowego u ciężarnej zgodnie z zastrzeżeniem 1. Dalsze aspekty wynalazku są zdefiniowane w zastrzeżeniach zależnych. Wynalazek dostarcza także urządzenie do określania ryzyka stanu przedrzucawkowego u ciężarnej, jak podano w zastrzeżeniu 14. Sposób obejmuje określanie ilości jednego lub więcej biochemicznych markerów wybranych z łożyskowego czynnika wzrostu (PlGF) i ciążowego białka osoczowego A (PAPP-A) w jednej lub więcej próbkach krwi od osoby; określanie ciśnienia krwi u osoby; oraz określanie ryzyka stanu przedrzucawkowego przy użyciu ilości każdego z wybranego jednego lub więcej markerów biochemicznych i ciśnienia krwi osoby. W jednym przykładzie wykonania, sposób obejmuje także określanie indeksu pulsacji w tętnicach macicznych (PI) u osoby; oraz określanie ryzyka stanu przedrzucawkowego przy użyciu ilości każdego z wybranego jednego lub więcej markerów biochemicznych i ciśnienia krwi osoby i PI. W przykładzie wykonania, rodzaj stanu przedrzucawkowego może być wczesnym stanem przedrzucawkowym. Późny stan przedrzucawkowy może być także wykryty przy użyciu sposobów. W przykładzie wykonania, marker biochemiczny może być, przykładowo, PlGF. W innym przykładzie wykonania, może on być PAPP-A. W kolejnym przykładzie wykonania, sposób może obejmować zarówno PlGF jak i PAPP-A. W przykładzie wykonania, sposób może także obejmować określanie ilości białka łożyskowego 13 (PP13) i określanie ryzyka stanu przedrzucawkowego przy użyciu ilości każdego z wybranego jednego lub więcej markerów biochemicznych, ciśnienia krwi osoby i ilości PP13. Ciśnienie krwi może być, przykładowo, średnim ciśnieniem tętniczym krwi. Określanie ryzyka obejmuje określanie stosunku prawdopodobieństwa dla ilości jednego lub więcej markerów biochemicznych i ciśnienia krwi. W przykładzie wykonania, wykonywana jest wieloczynnikowa analiza Gaussa dla określenia stosunków prawdopodobieństwa. W przykładzie wykonania, sposób może także obejmować stosowanie stosunków prawdopodobieństwa dla jednego lub więcej parametrów historii matki wybranych z rasy, palenia, liczby porodów, BMI, nadciśnienia, uprzedniego stanu przedrzucawkowego, oraz matki/siostry z uprzednim stanem przedrzucawkowym. W przykładzie wykonania, ryzyko stanu przedrzucawkowego u osoby posiada stopień detekcji co najmniej 65% i stopień wyniku fałszywie dodatniego %. W innym przykładzie wykonania, ryzyko stanu przedrzucawkowego u osoby posiada stopień detekcji co najmniej 75% i stopień wyniku fałszywie dodatniego %. W dalszym przykładzie wykonania, ryzyko stanu przedrzucawkowego u osoby posiada stopień detekcji co najmniej 90% i stopień wyniku fałszywie dodatniego %. W jeszcze innym przykładzie wykonania, sposób określania ryzyka stanu przedrzucawkowego u osoby posiada stopień detekcji co najmniej 95% i stopień wyniku fałszywie dodatniego %. Dodatkowo zapewnione jest urządzenie do określania ryzyka stanu przedrzucawkowego u ciężarnej. Urządzenie zawiera element do wprowadzania danych przystosowany do wprowadzania ilości jednego lub więcej biochemicznych markerów wybranych z łożyskowego czynnika wzrostu (PlGF) i ciążowego białka osoczowego A (PAPP-A) w jednej lub więcej próbkach krwi od osoby, i ciśnienia krwi osoby; oraz element obliczający przystosowany do określania ryzyka rozwoju stanu przedrzucawkowego przy użyciu wejściowych ilości biochemicznych markerów i ciśnienia krwi. W przykładzie wykonania, urządzenie może także zawierać element do wprowadzania danych do wprowadzania jednego lub więcej parametrów wybranych z wieku, rasy, palenia, ilości porodów, BMI, nadciśnienia, uprzedniego stanu przedrzucawkowego, i matki/siostry z uprzednim stanem przedrzucawkowym, oraz PI, oraz element obliczający dostosowany do określania ryzyka rozwoju stanu przedrzucawkowego przy użyciu wejściowych ilości biochemicznych markerów, ciśnienia krwi oraz jednego lub więcej wybranych parametrów. 45 2

4 KRÓTKI OPIS RYSUNKÓW 5 Figura 1 jest wykresem pudełkowym wielokrotności mediany (MoM) łożyskowego czynnika wzrostu (PlGF) u czterech ciążowych grup wyniku: kontrolnej, z wczesnym stanem przedrzucawkowym (PE), późnym PE, nadciśnieniem ciążowym (GH), który pokazuje, że ilość PlGF w próbkach biologicznych od ciężarnych jest niższa gdy osoba posiada wczesny stan przedrzucawkowy i późny stan przedrzucawkowy, i poniekąd niższe gdy osoba posiada nadciśnienie ciążowe. Figura 2 jest parą wykresów punktowych obrazujących zależność pomiędzy log MoM łożyskowego czynnika wzrostu (PlGF) i log MoM PAPP-A w grupie kontrolnej (A) i grupie ze stanem przedrzucawkowym (B), która pokazuje niewielką korelację pomiędzy ilościami PlGF i PAPP-A zarówno u niedotkniętych ciężarnych jak i tych ze stanem przedrzucawkowym. Figura 3 jest parą wykresów punktowych obrazujących zależność pomiędzy log MoM łożyskowego czynnika wzrostu (PlGF) i log MoM pulsacji w tętnicach macicznych PI w grupie kontrolnej (A) i grupie ze stanem przedrzucawkowym (B), która pokazuje ujemną korelację pomiędzy PlGF i PI. Figura 4 jest wykresem punktowym obrazującym korelację pomiędzy PP13 zmierzonym przy użyciu immunotestu ELISA i immunotestu DELFIA PerkinElmer w grupach ze stanem rzucawkowym i grupach niedotkniętych. 25 Figura 5 jest wykresem punktowym obrazującym korelację pomiędzy PlGF i PP 13 we wczesnym stanie przedrzucawkowym u kobiety rasy kaukaskiej i kobiety rasy niekaukaskiej. Figura 6 jest wykresem punktowym pokazującym zależność pomiędzy log MoM łożyskowego czynnika wzrostu (PlGF) i log MoM ciążowego białka osoczowego A (PAPP-A) w ciążach euploidalnych (pełne kropki i przerywana linia regresji) i z trisomią 21 (otwarte koła i ciągła linia regresji), która pokazuje korelację pomiędzy PlGF i PAPP-A zarówno u niedotkniętych ciężarnych jak i tych ze stanem przedrzucawkowym. Figura 7 jest wykresem pudełkowym obrazującym niższą ilość łożyskowego czynnika wzrostu (PlGF) w biologicznych próbkach ciężarnych noszących płody posiadające trisomię 21, trisomię 18, trisomię 13, zespół Turner a i triploidię, względem niedotkniętych płodów. SZCZEGÓŁOWY OPIS Sposoby, urządzenie, profile medyczne oraz zestawy tu opisane są przydatne do określania ryzyka, że u ciężarnej rozwinie się stan przedrzucawkowy (PE) i powiązane zaburzenia dotyczące łożyska. Jak opisano, to ryzyko może być określane na podstawie ilości markerów biochemicznych takich jak łożyskowy czynnik wzrostu (PlGF) i ciążowe białko osoczowe A (PAPP-A) obecne w próbce biologicznej pobranej od ciężarnej, w połączeniu z ciśnieniem krwi ciężarnej. Dodatkowe markery biochemiczne, takie jak PP13, i markery biofizyczne, takie jak indeks pulsacji w tętnicach macicznych, jak również parametry historii matki, mogą być także zastosowane przy określaniu ryzyka stanu przedrzucawkowego zgodnie z opisanymi tu sposobami. Opisane są tu także sposoby, urządzenie, profile medyczne i zestawy przydatne do określania ryzyka, że ciężarna nosi płód posiadający nieprawidłowość chromosomalneą (CA), taką jak zespół Down a. Jak opisano, ryzyko może być określone na podstawie ilości PlGF, PAPP-A, oraz wolnej ludzkiej gonatropiny kosmówkowej (wolny beta hcg) obecnych w próbce biologicznej pobranej od ciężarnej. Dodatkowe markery biochemiczne i markery biofizyczne (takie jak markery ultradźwiękowe dla płodu), jak również parametry historii matki, mogą być także zastosowane przy określaniu ryzyka nieprawidłowości chromosomalnych zgodnie z opisanymi tu sposobami. 3

5 Jak opisano w Przykładzie 1, statystyczna analiza populacji klinicznej została wykonana, ujawniając, że kombinacje markerów biochemicznych, w tym PAPP-A, PlGF i PP13, oraz markerów biofizycznych, w tym ciśnienie krwi i indeks pulsacji Dopplerowskiej w tętnicach macicznych, były zadziwiająco skuteczne do określania ryzyka stanu przedrzucawkowego z kliniczne akceptowalnymi stopniami detekcji i wyników fałszywie dodatnich. Przykładowo, PlGF i ciśnienie krwi, z lub bez uwzględniania czynników dotyczących matki, zapewniły 68% detekcję z % stopniem wyniku fałszywie dodatniego. Dodatkowe określone nieograniczające przykłady określania ryzyka wczesnego i późnego stanu przedrzucawkowego obejmują: PAPP-A i ciśnienie krwi; PlGF i PAPP-A i ciśnienie krwi; PlGF, PAPP- A, PP 13 i ciśnienie krwi; PlGF i PP 13 i ciśnienie krwi; PAPP-A i PP13 i ciśnienie krwi, (dla stopni detekcji, zob., przykładowo, Tabele 4, 6 i dla wczesnego stanu przedrzucawkowego oraz Tabele 7 i dla późnego stanu przedrzucawkowego). Zastosowana tu "% detekcja" jest wyrażonym w procentach stosunkiem dotkniętych (przykładowo, ze stanem przedrzucawkowym) osób z wynikiem dodatnim. "% wynik fałszywie dodatni" jest wyrażonym w procentach stosunkiem niedotkniętych osób z wynikiem dodatnim. Siła predykcyjna markera lub ich kombinacji jest powszechnie wyrażana jako stopień detekcji dla danego stopnia wyniku fałszywie dodatniego. Wybór konkretnego połączenia markerów biochemicznych i biofizycznych, z tych tu opisanych, do stosowania w klinicznych lub innych ustawieniach laboratoryjnych może zależeć od wielu praktycznych względów, w tym dostępnego sprzętu medycznego i reagentów do testowania markerów biochemicznych w konkretnym ustawieniu. Przykładowo, w ustawieniach, gdzie dostępne są ultradźwięki z efektem Dopplera, dostawca opieki zdrowotnej najpewniej włączy PI przy określaniu ryzyka stanu przedrzucawkowego. W środowiskach medycznych nie wyposażonych w zaawansowany sprzęt (taki jak ultradźwięki z efektem Dopplera), klinicznie akceptowalna ocena ryzyka może być wykonana przy użyciu ciśnienia krwi i poziomów markerów biochemicznych, jak tu opisano. Opisano tu także odkrycie, że ilość biochemicznego markera PlGF we krwi matki posiada siłę predykcyjną dla określania ryzyka nieprawidłowości chromosomalnych płodu. Jako takie, gdy test przesiewowy pod kątem nieprawidłowości chromosomalnych obejmuje testowanie PlGF, możiwe jest także określenie ryzyka stanu przedrzucawkowego. By to osiągnąć, jedyne co potrzeba to odczyt ciśnienia krwi matki. Dodatkowe parametry, które normalnie byłyby zebrane w trakcie skriningu prenatalnego i stosowane rutynowo przy określaniu ryzyka nieprawidłowości chromosomalnych u płodu, mogą być także zastosowane przy określaniu ryzyka stanu przedrzucawkowego. Jak opisano w Przykładzie 3, przy stosowaniu sposobów określania ryzyka stanu przedrzucawkowego, można także określić ryzyko powiązanych zaburzeń, takich jak zahamowanie wzrostu płodu, przedwczesny poród i nadciśnienie ciążowe. Zastosowany tu termin "stan przedrzucawkowy" oznacza zaburzenie ciąży cechujące się częściowo przez nadciśnienie ciążowe i białkomocz. Dla kobiet z uprzednio prawidłowym ciśnieniem krwi, PE jest zazwyczaj definiowane jako nadciśnienie ciążowe z białkomoczem oraz ciężkie PE jako ciężkie nadciśnienie ciążowe z białkomoczem. Dla kobiet z przewlekłym nadciśnieniem, nałożony PE jest zazwyczaj definiowany jako noworozwinięty białkomocz. Aspekty PE przydatne dla sporządzania diagnozy PE mogą być sklasyfikowane zgodnie ze wskazówkami podawanymi przez różne organizacje medyczne. Przykładowo, nadciśnienie ciążowe, zgodnie ze wskazówkami International Society for the Study of Hypertension in Pregnancy (Davey i in, Am. J. Obstet Gynecol; 8; 8998, 1988), jest opisane jako dwa zapisy diastolicznego ciśnienia krwi wynoszącego 90 mm Hg lub wyżej oddalonych od siebie o co najmniej 4 h, a ciężkie nadciśnienie jako ciśnienie wynoszące co najmniej 1 mm Hg lub więcej oddalonych od siebie o co najmniej 4 h lub jeden zapis diastolicznego ciśnienia krwi wynoszącego co najmniej 1 mm Hg. Białkomocz jest definiowany jako wydzielanie 300 mg lub więcej w 24 h lub dwa odczyty 2+ lub więcej na analizie paskowej próbek środkowego strumienia moczu lub z cewnika jeśli nie było możliwe zebranie w okresie 24 h. Kobiety są klasyfikowane jako posiadające uprzednio prawidłowe ciśnienie lub z przewlekłym nadciśnieniem zazwyczaj przed tygodniem ciąży. Stan przedrzucawkowy jest rozumiany jako zaburzenie w spektrum powiązanych zaburzeń, w tym opóźnienie wewnątrzmacicznego wzrostu, 4

6 wczesne poronienie, przedwczesny poród i śmierć wewnątrzmaciczna płodu. Nie chcąc być związanym przez teorię, zaproponowano, że opóźnienie wewnątrzmacicznego wzrostu odzwierciedla adaptację ciała ciężarnej kobiety do poradzenia sobie z sytuacją stanu przedrzucawkowego, co pozwala płodowi na przeżycie. Wczesne poronienie i przedwczesny poród, z drugiej strony, mogą odzwierciedlać adaptację ciała ciężarnej kobiety do poradzenia sobie z sytuacją stanu przedrzucawkowego, co pozwala kobiecie na przeżycie. W tym kontekście, wewnątrzmaciczna śmierć płodu byłaby niepowodzeniem tej adaptacji. Zatem, opisane tu sposoby określania ryzyka stanu przedrzucawkowego mogą być także stosowane do określania ryzyka zaburzeń związanych ze stanem przedrzucawkowym w spektrum stanu przedrzucawkowego. W przypadkach, gdzie u ciężarnej określono posiadanie podwyższonego ryzyka rozwoju stanu przedrzucawkowego z użyciem opisanego tu sposobu, osoba może otrzymać terapię lub radę dotyczącą stylu życia od dostawcy opieki zdrowotnej. Chociaż nie ma szeroko stosowanego leczenia stanu przedrzucawkowego, różne badania wykazały korzyść terapii takich jak leki przeciw nadciśnieniu, takich jak siarczan magnezu, aspiryna, diazepam, i fenytoina; oraz suplementy diety, takie jak witamina D, wapń, i selen. Stan przedrzucawkowy może rozwinąć się już w tygodniu ciąży i jest ogólnie uważany za "wczesny stan przedrzucawkowy" gdy rozwinie się przed około tygodniem ciąży, i "późny stan przedrzucawkowy" gdy rozwinie się po około tygodniu ciąży. Wczesny stan przedrzucawkowy jest związany ze zwiększoną śmiertelnością i stąd jest uważany za bardziej ciężką formę stanu przedrzucawkowego. Sposoby określania ryzyka PE tu opisane są przydatne do skriningu pod kątem "wczesnego stanu przedrzucawkowego" i "późnego stanu przedrzucawkowego." Jak tu opisano, przykładowo w Przykładzie 1, sposoby określania ryzyka stanu przedrzucawkowego są skuteczne podczas mniej niż 34 tygodni ciąży włącznie; mniej niż 36 tygodni ciąży włącznie, jak 34 do 36 tygodni ciąży włącznie, mniej niż 37 tygodni ciąży włącznie oraz więcej niż 37 tygodni ciąży włącznie. Przykłady 1 do 3 opisują, że ryzyko wczesnego i późnego stanu przedrzucawkowego (<34 tygodni, tygodni oraz 37+ tygodni) może być określone przy użyciu określonych biochemicznych i biofizycznych markerów, przy użyciu próbek krwi, które pobrano pomiędzy 11 i 19 tygodniem ciąży. Zatem, do zastosowania w sposobach wykrywania stanu przedrzucawkowego, próbka może być pobrana pomiędzy około 11 i 37 tygodniem ciąży włącznie, w tym pomiędzy około 11 i tygodniem włącznie, pomiędzy około 11 i 34 tygodniem, pomiędzy około i 34 tygodniem, i bardziej ogólnie, przed około tygodniem, w pierwszym trymestrze po około tygodniu, w drugim trymestrze oraz w trzecim trymestrze. Chociaż wcześniejsze testowanie jest często korzystną polityką z punktu widzenia zdrowia publicznego, zrozumiałe jest, że na pobieranie próbek mogą czasami wpływać względy praktyczne takie jak spóźnienie kobiety na wizytę u dostawcy opieki zdrowotnej aż do relatywnie późnych tygodni ciąży. W pewnych okolicznościach, próbki biologiczne mogą być pobierane więcej niż raz od ciężarnej, przykładowo gdy jej stan nadciśnienia i/lub łożyska wymaga monitorowania pod kątem rozwoju stanu przedrzucawkowego z powodu wcześniejszego ryzyka, wykazywania objawów i/lub innych czynników. Sposoby określania ryzyka stanu przedrzucawkowego tu opisane mogą być także zastosowane do monitorowania ciężarnej, która podlega terapii lub leczeniu na stan nadciśnienia i/lub łożyska. Jeśli to pożądane, testowanie markerów biochemicznych i/lub biofizycznych może być wykonane w domu, jak przez zastosowanie paskowych formatów testów biochemicznych i automatycznych urządzeń pomiaru ciśnienia krwi do użytku domowego. Sposoby określania ryzyka stanu przedrzucawkowego u ciężarnej obejmują określanie ilości jednego lub więcej biochemicznych markerów wybranych z PlGF i PAPP-A. Ilości dodatkowych markerów biochemicznych, takich jak PP 13, mogą być także stosowane w sposobach. Zastosowany tu termin "PlGF" oznacza czynnik wzrostu ssaka posiadający sekwencję aminokwasów homologiczną do numeru akcesji GenBank P Zastosowany tu termin "PAPP-A" oznacza metaloproteinazę metzyncynę znaną jako Ciążowe białko osoczowe A i posiadającą sekwencję aminokwasów homologiczną do numeru akcesji GenBank AAH Zastosowany tu termin "PP13" oznacza białko łożyskowe 13, znane także jako 5

7 galektyna-13 posiadająca sekwencję aminokwasów homologiczną do numeru akcesji GenBank NP_ Sposoby tu opisane obejmują określanie ciśnienia krwi u osoby. Można zastosować jedno lub więcej spośród systolicznego ciśnienia krwi, diastolicznego ciśnienia krwi oraz średniego ciśnienia tętniczego ciężarnej. Średnie ciśnienie tętnicze (MAP) dotyczy uśrednionego ciśnienia tętniczego w cyklu sercowym i jest określane przez pojemność minutową serca (CO), obwodowy opór naczyniowy (SVR), i ośrodkowe ciśnienie żylne (CVP), przy użyciu ustanowionych procedur. Dostawca usług zdrowotnych może zastosować dowolny sposób do pomiaru ciśnienia krwi u ciężarnej, w tym, przykładowo, sposoby palpacyjne, sposoby osłuchowe oraz oscylometryczne. Może być także stosowany automatyczny sprzęt pomiarowy ciśnienia krwi. Opisane tu sposoby mogą także obejmować określanie indeksu pulsacyjnego w tętnicach macicznych (PI), który jest indeksem kształtu fali prędkości przepływu krwi w tętnicach do kwantyfikacji pulsacji lub oscylacji kształtu fali. PI ciężarnej może być mierzone przy użyciu dowolnego znanego sposobu. Przykładowo, ultrasonografia tętnic macicznych z efektem Dopplera może być wykonana poprzez ścieżkę przezpochwową lub przez brzuch. Tętnica maciczna jest najpierw identyfikowana z użyciem barwnej ultrasonografii z efektem Dopplera. Następnie może być zastosowana pulsacyjna ultrasonografia z efektem Dopplera by uzyskać kształty fali. Różne indeksy mogą być następnie obliczone. Przykładowo, PI może być obliczone jako szczytowy przepływ systoliczny minus końcowy przepływ diastoliczny podzielony przez średni przepływ. Sposoby określania ryzyka stanu przedrzucawkowego u ciężarnej obejmują stosowanie próbki biologicznej od ciężarnej. Próbka biologiczna może być próbką dowolnego płynu lub tkanki, która zawiera wybrane markery biochemiczne. Przykłady 1 do 3 opisują zastosowanie krwi matki w postaci surowicy. Wybór biologicznej próbki może często zależeć od formatów testów dostępnych w konkretnym laboratorium klinicznym do testowania ilości markerów. Przykładowo, niektóre formaty testów nie posiadają czułości potrzebnej do testowania całej krwi, tak że laboratorium kliniczne wybiera testowanie frakcji krwi, takiej jak surowica, lub stosowanie krwi suchej. Przykładowe próbki biologiczne przydatne dla sposobów tu opisanych obejmują krew, produkty oczyszczonej krwi (takie jak surowica, osocze, itd.), mocz, płyn owodniowy, biopsja kosmówkowych kosmków, biopsja łożyska oraz płyn z szyjki macicy. Ilości markerów biochemicznych obecnych w próbce biologicznej mogą być określone przy użyciu dowolnego formatu testu odpowiedniego do pomiaru białek w próbkach biologicznych. Powszechnym formatem testu dla tego celu jest immunotest, w tym przykładowo, test immunoenzymatyczny (EIA) taki jak technika immunooznaczenia ze zwielokrotnioną reakcją enzymatyczną (EMIT), test immunoenzymosorpcyjny (ELISA), ELISA z wychwytywaniem przeciwciała IgM (MAC ELISA), oraz test immunoenzymatyczny z zastosowaniem mikrocząstek (MEIA); immunotesty z elektroferezą kapilarną (CEIA); radioimmunotesty (RIA); testy immunoradiometryczne (IRMA); immunotesty z polaryzacją fluorescencyjną (FPIA); immunotest z fluorescencją lantanowców ze wspomaganą dysocjacją (DELFIA) oraz testy chemiluminescencyjne (CL). Dla określenia czy ilość markerów biochemicznych jest większa niż lub mniejsza niż normalna, określana jest normalna ilość markera biochemicznego obecnego w próbce biologicznej od matki z relewantnej populacji. Relewantna populacja może być określona na podstawie dowolnej cechy, która może wpływać na normalne (niedotknięte) ilości markerów. Dla określenia ryzyka stanu przedrzucawkowego, relewantna populacja może być ustalona na podstawie niskiego ryzyka stanu przedrzucawkowego. Gdy znane są normalne ilości markerów, to określone ilości markerów mogą być porównane i znaczenie różnicy określone przy użyciu standardowych metod statystycznych. Gdy występuje znaczna różnica pomiędzy określoną ilością markera i normalną ilością, to istnieje znaczne ryzyko, że u badanej osoby rozwinie się stan przedrzucawkowy. Ryzyko, że u ciężarnej rozwinie się stan przedrzucawkowy lub ciężarna nosi płód posiadający nieprawidłowość chromosomalną może być określone z ilości markerów biochemicznych przy użyciu statystycznej analizy na podstawie danych klinicznych zebranych w badaniu populacji pacjentów. Przykłady 1 do 3 pokazują wyniki z tych badań. Istnieje wiele statystycznych sposobów do łączenia 6

8 parametrów, które charakteryzują ciężarną, takie jak ilości markerów biochemicznych, dla uzyskania szacunku ryzyka. Metoda prawdopodobieństwa (Palomaki i Haddow, 1987) oraz metoda liniowej funkcji dyskryminacyjnej (Norgarrd-Pedersen i in. Clin. Genet. 37, (1990)) są powszechnie stosowane w tym celu. Główną zasadą metody prawdopodobieństwa jest to, że rozkłady populacji pod względem parametru (takiego jak ilość markera biochemicznego) są znane z grup 'niedotkniętych' i 'dotkniętych'. Zatem, dla dowolnego danego parametru (takiego jak ilość markera i odczyt ciśnienia krwi), prawdopodobieństwo udziału grup 'niedotkniętych' i 'dotkniętych' może być obliczone. Prawdopodobieństwo jest obliczane jako wysokość Gaussa dla parametru na podstawie średniego i standardowego odchylenia populacji. 'Stosunek prawdopodobieństwa' to stosunek wysokości obliczonych przy użyciu parametrów populacji 'niedotkniętej' i 'dotkniętej', i jest wyrażeniem podwyższonego ryzyka posiadania zaburzenia, w stosunku do wcześniejszego ryzyka. Wcześniejsze szanse kobiety (co jest statystycznym wyrażeniem dotyczącym wcześniejszego ryzyka, jak opisano poniżej) na posiadanie stanu przedrzucawkowego lub noszenia płodu z nieprawidłowością chromosomalną mogą być obliczone przy użyciu wzoru wyprowadzonego z badań klinicznych populacji (Cuckle i in. 1987). Te wcześniejsze szanse mogą być zmodyfikowane przy użyciu stosunku prawdopodobieństwa dla wyprowadzenia późniejszych szans, które mogą być zastosowane do oszacowania ryzyka stanu przedrzucawkowego lub nieprawidłowości chromosomalnej. Szczegółowy opis zastosowania metody prawdopodobieństwa do przewidywania ryzyka, że płód posiada nieprawidłowość chromosomalną jest wyszczególniony, przykładowo, w "Screening for Down's Syndrome," red. J.G. Grudzinskas, T. Chard, M. Chapman i H. Cuckle; Opublikowany przez Cambridge University Press, 1994). Jest także możliwe zastosowanie zaobserwowanych rozkładów stosunków prawdopodobieństwa dla określania ryzyka przy użyciu sposobów tu opisanych (zob., przykładowo, Spencer i in. Ann. Clin. Biochem., 29, (1992)). Przegląd określania ryzyka zgodnie ze sposobami tu opisanymi jest następujący: Przykładowym punktem wyjściowym jest określenie wcześniejszych szans. W przypadku ryzyka nieprawidłowości chromosomalnych, wcześniejsze szanse są zazwyczaj wyprowadzane z wieku matki przy użyciu wzoru ryzyka związanego z wiekiem. W przypadku ryzyka stanu przedrzucawkowego wcześniejsze szanse są zazwyczaj wyprowadzane z ogólnego ryzyka populacji. W bieżącej praktyce skriningu pod kątem chromosomalnych nieprawidłowości, wartości markerów biochemicznych są odnoszone do równych wartości mediany dla utworzenia skorygowanych wartości wielokrotności mediany (MoM) celem standaryzacji dla czynników takich jak test, wiek ciąży, waga matki, status palenia, i tym podobne. Wykonuje się to, przykładowo, ponieważ ilości markerów biochemicznych w ciele osoby zmieniają się z ciążą, celem obliczenia ryzyka, wartość markera biochemicznego jest ustawiana aby była niedotknięta przez wiek ciąży. Wartość MoM dla próbki jest stosunkiem wartości markera biochemicznego do wartości mediany populacji w tym samym wieku ciąży (lub innym parametrze). Wysokości Gaussa dla wyników markera biochemicznego są określane dla parametrów 'niedotkniętej' i 'dotkniętej' populacji. Stosunek wysokości na krzywej 'niedotkniętej' i wysokość na krzywej 'dotkniętej' jest określany. Wcześniejsze szanse są mnożone przez ten stosunek. Pojęciowo, obliczenie ryzyka przy użyciu trzech biochemicznych markerów wymaga po pierwsze, aby poszczególne stosunki prawdopodobieństwa były zdefiniowane dla każdego z markerów (pierwszy skorygowany ze względu na wiek matki) i następnie razem mnożone. Dodatkowy czynnik jest potrzebny w obliczaniu, jednakże, dla uwzględnienia stopnia pokrywania się informacji (korelacja) trzech poszczególnych markerów biochemicznych. Zazwyczaj r-wartości są stosowane do wyrażenia korelacji pomiędzy parametrami, jak w naszym przykładzie trzema indywidualnymi biochemicznymi markerami. Przykład 1 dostarcza r-wartości odpowiadające korelacjom pomiędzy różnymi parametrami relewantnymi dla obliczenia ryzyka stanu przedrzucawkowego. Przykład 4 dostarcza r-wartości odpowiadające korelacjom pomiędzy różnymi parametrami relewantnymi dla obliczania ryzyka nieprawidłowości chromosomalnych u płodu. Stwierdzono, że inne zmienne wpływają na poziomy poszczególnych 7

9 markerów we krwi matki, i te zmienne mogą być regulowane, i regulacje włączone w końcowe wyrażenie wartości jako MoM. Jak opisano w Przykładzie 1, analizy statystyczne danych klinicznych, w tym ilości markerów biochemicznych takich jak PlGF, PAPP-A, PP13 oraz markerów biofizycznych takich jak ciśnienie krwi i PI, wykonano dla określenia ryzyka, że u ciężarnej rozwinie się stan przedrzucawkowy. Co godne odnotowania, obecnie opisywane sposoby wyrażają ciśnienie krwi jako stosunek prawdopodobieństwa. Jest to unikalne podejście do określania ryzyka stanu przedrzucawkowego. Choć we wcześniejszej praktyce klinicznej, powszechne jest, że dostawca opieki zdrowotnej wykonuje odczyty ciśnienia krwi podczas wizyty ciężarnej, zastosowanie ciśnienia krwi w algorytmie do określania ryzyka stanu przedrzucawkowego do chwili obecnej było przeoczane. W przykładzie wykonania, proces statystyczny do wykonywania szacunku ryzyka może być podsumowany jak przedstawiono poniżej. Dla każdego biochemicznego i biofizycznego markera, obliczane jest MoM. MoM(y) są następnie regulowane w oparciu o parametry historii matki takie jak rasa, palenie, ilość porodów, BMI, nadciśnienie, uprzedni stan przedrzucawkowy, oraz matka/siostra z uprzednim stanem przedrzucawkowym. Wieloczynnikowa analiza Gaussa jest następnie wykonywana dla określenia stosunków prawdopodobieństwa. Dla określenia ryzyka stanu przedrzucawkowego, wcześniejsze ryzyko było oparte na ogólnym ryzyku populacji. 1. wcześniejsze ryzyko =1 w x 2. Stosunek Prawdopodobieństwa (LR)-rasa=2.18 jeśli czarna, 0.57 inna 3. LR-palenie=0.56 jeśli paląca, 1.04 inna 4. LR-rodząca kolejny raz=1.34 jest rodząca kolejny raz 0, 0.66, 0.63 & 1.14 dla 1, 2 i LR-BMI=0.65 jeśli <25, 1.23 & 3.05 dla i LR-nadciśnienie=.24 jeśli jest choroba, 0.94 inna 7. LR-historia=7.87 jeśli uprzednia ciąża z PE, 0.64 jeśli nie, 1 jeśli rodząca po raz kolejny 0 8. LR-rodzina=2.89 jeśli matka miała ciążę z PE, 0.92 inaczej 9. LR-profil biochemicznego markera (PlGF, PAPP-A, PP13, itd.) i fizycznego markera (ciśnienie krwi lub PI) =stosunek wysokości rozkładów częstotliwości wieloczynnikowej Gaussa w ciążach ze wczesnym PE i niedotkniętych. Parametry rozkładów są dla każdego markera, średnich i SD, i dla pary markerów, r-wartościami.. Końcowe ryzyko obliczone przez wyrażenie wcześniejszego ryzyka jako szanse (1:x-1), przemnożenie lewej strony przez wszystkie LR i reformowanie jako 1 w y. Dla obliczenia późniejszego ryzyka wcześniejsze ryzyko jest najpierw wyrażone jako szanse. Zatem 1 w x staje się 1:(x-1). Wcześniejsze szanse są mnożone przez LR dla uzyskania LR:(x-1), który jest nadal dodanymi szansami. Można przepisać to jako szanse 1:(x-1)/LR i przekształcić w ryzyko 1 w [(1:(x- 1)/LR]+1. W innych przykładach wykonania, ryzyko stanu przedrzucawkowego może być określone z mniejszym lub żadnych włączeniem czynników wcześniejszego ryzyka (zob., przykładowo, Tabele 4 i 6). Zrozumiałe jest, że wartości liczbowe mogą się różnić dla różnych populacji badań, chociaż te pokazane poniżej zapewniają akceptowalny punkt wyjścia dla obliczeń ryzyka. Przykładowo, zaobserwowano, że dla określonego centrum klinicznego wykonującego analizę ryzyka pacjentów, wartości liczbowe w algorytmie ryzyka mogą przesuwać się w czasie, gdy populacja w obsługiwanym regionie zmienia się w czasie. Zatem, niniejsze ujawnienie dostarcza sposób określania ryzyka stanu przedrzucawkowego u ciężarnej. Sposób obejmuje określanie ilości jednego lub więcej biochemicznych markerów wybranych spośród łożyskowego czynnika wzrostu (PlGF), ciążowego białka osoczowego A (PAPP-A) w jednej lub więcej próbkach biologicznych od osoby; określanie ciśnienia krwi osoby; oraz określanie ryzyka stanu przedrzucawkowego przy użyciu ilości każdego z wybranego jednego lub więcej biochemicznych markerów i ciśnienia krwi osoby. W przykładzie wykonania, sposób obejmuje także określanie indeksu 8

10 pulsacji w tętnicach macicznych (PI) osoby; oraz określanie ryzyka stanu przedrzucawkowego przy użyciu ilości każdego z wybranego jednego lub więcej biochemicznych markerów i ciśnienia krwi osoby, oraz PI. W przykładzie wykonania, typem stanu przedrzucawkowego może być wczesny stan przedrzucawkowy. Późny stan przedrzucawkowy może być także wykryty przy użyciu sposobów. Marker biochemiczny może być, przykładowo, PlGF. W innym przykładzie wykonania, może on być PAPP-A. W innym przykładzie wykonania, sposób może obejmować PlGF i PAPP-A. W przykładzie wykonania, sposób może obejmować także określanie ilości białka łożyskowego 13 (PP13) oraz określanie ryzyka stanu przedrzucawkowego przy użyciu ilości każdego z wybranego jednego lub więcej markerów biochemicznych, ciśnienia krwi osoby i ilości PP13. Ciśnienie krwi może być, przykładowo, średnim ciśnieniem tętniczym krwi. W przykładzie wykonania określanie ryzyka może obejmować określanie stosunku prawdopodobieństwa dla ciśnienia krwi. Określanie ryzyka może także obejmować obliczanie końcowego ryzyka na podstawie uprzedniego ryzyka rozwoju stanu przedrzucawkowego u osoby oraz zestawu stosunków prawdopodobieństwa na podstawie ilości jednego lub więcej biochemicznych markerów i ciśnienia krwi. W przykładzie wykonania, wykonywana jest wieloczynnikowa analiza Gaussa dla określenia stosunków prawdopodobieństwa. W przykładzie wykonania, sposób może także obejmować stosowanie stosunków prawdopodobieństwa dla jednego lub więcej parametrów historii matki wybranych spośród rasy, palenia, ilości porodów, BMI, nadciśnienia, uprzedniego stanu przedrzucawkowego, i matki/siostry z uprzednim stanem przedrzucawkowym. W przykładzie wykonania, ryzyko stanu przedrzucawkowego u osoby posiada stopień detekcji co najmniej około 65% i stopień wyniku fałszywie dodatniego około %. W innym przykładzie wykonania, ryzyko stanu przedrzucawkowego u osoby posiada stopień detekcji co najmniej około 75% i stopień wyniku fałszywie dodatniego około %. W dalszym przykładzie wykonania, ryzyko stanu przedrzucawkowego u osoby posiada stopień detekcji co najmniej około 90% i stopień wyniku fałszywie dodatniego około %. W jeszcze innym przykładzie wykonania, sposób określania ryzyka stanu przedrzucawkowego u osoby posiada stopień detekcji co najmniej około 95% i stopień wyniku fałszywie dodatniego około %. Dostarczony jest także przez niniejsze ujawnienie profil medyczny dla ciężarnej, który obejmuje informacje takie jak ilości jednego lub więcej markerów biochemicznych obecnych w jednej lub więcej próbkach biologicznych od osoby, markery biochemiczne wybrane spośród łożyskowego czynnika wzrostu (PlGF) i ciążowego białka osoczowego A (PAPP-A); oraz ciśnienia krwi osoby, gdzie profil medyczny jest przechowywany w medium odczytywanym przez komputer. Dodatkowo, dostarczone jest urządzenie do określania ryzyka stanu przedrzucawkowego u ciężarnej. Urządzenie zawiera element do wprowadzania danych przystosowany do wprowadzania ilości jednego lub więcej biochemicznych markerów wybranych z łożyskowego czynnika wzrostu (PlGF) i ciążowego białka osoczowego A (PAPP-A) w jednej lub więcej próbkach biologicznych od osoby, i ciśnienia krwi osoby; oraz element obliczający przystosowany do określania ryzyka rozwoju stanu przedrzucawkowego przy użyciu wejściowych ilości biochemicznych markerów i ciśnienia krwi. W przykładzie wykonania, urządzenie może także zawierać element do wprowadzania danych przystosowany do wprowadzania jednego lub więcej parametrów wybranych z wieku, rasy, palenia, ilości porodów, BMI, nadciśnienia, uprzedniego stanu przedrzucawkowego, i matki/siostry z uprzednim stanem przedrzucawkowym, oraz PI, oraz element obliczający dostosowany do określania ryzyka rozwoju stanu przedrzucawkowego przy użyciu wejściowych ilości biochemicznych markerów, ciśnienia krwi oraz jednego lub więcej wybranych parametrów. W innym aspekcie opisanych tu sposobów jest sposób określania ryzyka chromosomalnej nieprawidłowości u płodu. Określanie ryzyka nieprawidłowości chromosomalnej u płodu jak tu opisane obejmuje określanie ilości PlGF, PAPP-A, i wolnego beta hcg w jednej lub więcej próbkach biologicznych pobranych od ciężarnej i określanie ryzyka chromosomalnej nieprawidłowości u płodu na podstawie ilości PlGF, PAPP-A, i wolnego beta hcg. Sposób może także obejmować pomiar ilości ADAM 12 w biologicznej próbce pobranej od ciężarnej, i stosowanie zmierzonej ilości ADAM 12, wraz z parametrami opisanymi powyżej, dla określenia ryzyka chromosomalnej nieprawidłowości u płodu. 9

11 Jak opisano w Przykładzie 4, statystyczna analiza populacji klinicznej została wykonana, ujawniając, że kombinacje biochemicznych markerów, w tym PAPP-A, PlGF i wolnego beta hcg, i markerów biofizycznych, w tym przezierność fałdu karkowego (NT), były nadzwyczaj skuteczne do określania ryzyka chromosomalnej nieprawidłowości płodu z klinicznie akceptowalnymi stopniami detekcji i wyników fałszywie dodatnich. Przykładowo, wolny beta hcg, PAPPA i PlGF posiadały stopień detekcji około 70% z 5% stopniem wyniku fałszywie dodatniego. Przez włączenie wieku matki w określenie ryzyka przy użyciu tego samego zestawu markerów biochemicznych, osiągnięto stopień detekcji 80% z 5% stopień wyniku fałszywie dodatniego. Zastosowany te termin "chromosomalna nieprawidłowość" oznacza nietypową liczbę chromosomów lub strukturalną nieprawidłowość w jednym lub więcej chromosomach. Termin obejmuje aneuploidię taką jak trisomia 21 (Zespół Down a), trisomia 18 (Zespół Edwards a), i trisomia 13 (Zespół Patau a) jak również chromosomalną delecję taką jak zespół Turner a, które mogą być wykryte przez obecność nienormalnych ilości PlGF, PAPPA i wolnego beta hcg w próbce od matki. Stosowany tu termin "wolny beta hcg" oznacza podjednostkę beta hormonu glikoproteiny wytwarzanego podczas ciąży przez embrion tuż po poczęciu i później przez syncytiotrofoblast, i posiadającego sekwencję aminokwasów homologiczną do numeru akcesji GenBank NM_ Przykład 4 pokazuje, że kombinacja PlGF, PAPP- A i wolnego beta hcg jest przydatna do wykrywania trisomii 21, trisomii 18, trisomii 13, Zespołu Turner a i triploidii (zob. Figura 7). Sposoby tu opisane do określania ryzyka chromosomalnej nieprawidłowości u płodu mogą także obejmować określanie biofizycznego markera płodu. Biofizyczny marker może być, przykładowo, markerem ultradźwiękowym, takim jak przezierność fałdu karkowego (NT) płodu. Przezierność fałdu karkowego jest dobrze znanym biofizycznym markerem płodu i jest określana jako przestrzeń od tyłu karku płodu do skóry pokrywającej kark i dotyczy obserwacji, że nieprawidłowe płody mają tendencję do wykazywania gromadzenia płynu w tym regionie i posiadania podwyższonego ryzyka posiadania różnych nieprawidłowości chromosomowych, w tym powszechne wykrycie Zespołu Down a. Skan ultradźwiękowy NT jest normalnie wykonywany w pierwszym trymestrze. Sposoby tu opisane do wykrywania ryzyka nieprawidłowości chromosomalnej u płodu mogą być wykonywane w pierwszym trymestrze ciąży, i/lub w drugim trymestrze ciąży. Zatem, próbka biologiczna może być pobrana od ciężarnej w czasie pomiędzy około i tygodniem, pomiędzy około i 18 tygodniem, pomiędzy około i 16 tygodniem (włącznie) ciąży, jak pomiędzy około 11 i 13 tygodniem (włącznie) ciąży. Jak opisano w Przykładzie 4, statystyczne analizy danych klinicznych, w tym ilości biochemicznych markerów takich jak PlGF, PAPP-A, i wolnego beta hcg i markerów biofizycznych takich jak NT płodu, wykonano celem określenia ryzyka nieprawidłowości chromosomalnych płodu. Przykładowy statystyczny proces wykonywania szacunku ryzyka na podstawie PlGF, PAPP-A i wolnego beta hcg mogą być podsumowane jak przedstawiono poniżej. PlGF jest wyrażony w MoM i skorygowanej wadze. 1. Wcześniejsze ryzyko (wyrażone jako szanse) jest wywiedzione z prewalencji swoistej dla wieku matki (i historii zespołu Down a w rodzinie, jeśli stosowne). 2. Jest ono mnożone przez LR z log rozkładów Gaussa PlGF w zespole Down a i niedotkniętych ciąż. 3. Parametry rozkładu niedotkniętych są SD= Średnia dla zespołu Down a i SD są średnia=log (0.566)= i SD= Końcowe szanse są konwertowane z powrotem do ryzyka. 6. Dla kombinacji PlGF z PAPP-A i wolnym beta hcg, współczynniki korelacji pomiędzy wartościami log MoM w zespole Down a i niedotkniętych ciążach są niezbędne. Niedotknięte ciąże: z PAPP-A jest 0.278; z wolnym beta hcg jest Wartości zespołu Down a wynoszą: i Można założyć zerową korelację z NT. 8. Średnia=log (0.538)=-0.269; SD=0.226; korelacja z PAPP-A=0.056 i z wolnym beta hcg=-0.142

12 Algorytm i metodologia opisane powyżej mogą być zmienione dla dowolnej aneuploidii. Zrozumiałe jest, że wartości liczbowe mogą być różne dla różnych badanych populacji, choć te przedstawione poniżej dostarczają akceptowalny punkt wyjściowy dla obliczeń ryzyka. Przykladowo, zaobserwowano, że dla określonego centrum klinicznego wykonującego analizę ryzyka pacjenta, wartości liczbowe w algorytmie ryzyka mogą przemieszczać się w czasie, jako że populacja w obsługiwanym regionie zmienia się w czasie. Zatem, niniejsze zgłoszenie opisuje sposób określania ryzyka nieprawidłowości chromosomalnej u płodu. Sposób obejmuje określanie ilości łożyskowego czynnika wzrostu (PlGF), ciążowego białka osoczowego A (PAPP-A) i wolnej ludzkiej gonatropiny kosmówkowej (wolny beta hcg) w jednej lub więcej próbkach biologicznych pobranych od ciężarnej; oraz określanie ryzyka chromosomalnej nieprawidłowości u płodu przy użyciu zmierzonych ilości PlGF, PAPP-A, i wolnego beta hcg. W przykładzie wykonania, chromosomalna nieprawidłowość jest wybrana z grupy składającej się z trisomii 21, trisomii 18, trisomii 13, zespołu Turner s, i triploidii. W przykładzie wykonania, sposób może obejmować określanie jednego lub więcej ultradźwiękowych markerów płodu i określanie ryzyka chromosomalnej nieprawidłowości u płodu przy użyciu ilości PlGF, PAPP-A, wolnego beta hcg, oraz jednego lub więcej ultradźwiękowych markerów płodu. Marker ultradźwiękowy może być, przykładowo, przezierność fałdu karkowego. W przykładzie wykonania, sposób może także obejmować określanie ilości co najmniej jednego biochemicznego markera wybranego z białka łożyskowego 13 (PP13) i metaloproteazę 12 (ADAM12), oraz określanie ryzyka chromosomalnej nieprawidłowości u płodu przy użyciu ilości PlGF, PAPP-A, wolnego beta hcg, i co najmniej jednego biochemicznego markera. W przykładzie wykonania, jedna lub więcej próbek biologicznych jest pobieranych od ciężarnej w pierwszym trymestrze ciąży, przykładowo w okresie do 19 tygodnia ciąży, jak w okresie 11 do 13 tydzień ciąży. W przykładzie wykonania, określanie obejmuje obliczanie końcowego ryzyka na podstawie uprzedniego ryzyka rozwoju chromosomalnej nieprawidłowości i układu stosunków prawdopodobieństwa na podstawie ilości PlGF, PAPP-A, i wolnego beta hcg. Opcjonalnie, wieloczynnikowa analiza Gaussa jest wykonywana dla określenia stosunków prawdopodobieństwa. W przykładzie wykonania, stosunki prawdopodobieństwa są także stosowane dla jednego lub więcej parametrów historii matki. Dostarczony w niniejszym ujawnieniu jest profil medyczny dla ciężarnej, który zawiera informacje dla określania ryzyka chromosomalnej nieprawidłowości u płodu, gdzie informacja zawiera ilości PlGF, PAPP-A, i wolnego beta hcg w jednej lub więcej próbkach biologicznych od ciężarnej, i gdzie profil medyczny jest przechowywany w medium odczytywanym przez komputer. Profil medyczny może także zawierać dodatkowe informacje dla określania ryzyka rozwoju stanu przedrzucawkowego, gdzie dodatkowe informacje obejmują ciśnienie krwi ciężarnej. Opisane jest także urządzenie do określania ryzyka chromosomalnej nieprawidłowości u płodu. Urządzenie zawiera środek do wprowadzania danych dla wprowadzania ilości PlGF, PAPP-A, i wolnego beta hcg w jednej lub więcej próbkach biologicznych uzyskanych od ciężarnej; oraz środek do obliczania do określania ryzyka chromosomalnej nieprawidłowości u płodu przy użyciu ilości PlGF, PAPP-A, i wolnego beta hcg. W przykładzie wykonania, urządzenie także zawiera środek do wprowadzania co najmniej jednego z ilości ADAM12 i PP13 w jednej lub więcej próbkach biologicznych uzyskanych od ciężarnej; oraz określanie ryzyka chromosomalnej nieprawidłowości u płodu przy użyciu ilości co najmniej jednego z ilości ADAM12 i PP 13, oraz ilości PlGF, PAPP-A, i wolnego beta hcg. W przykładzie wykonania, urządzenie określa także ryzyko rozwoju stanu przedrzucawkowego, i zawiera środek do wprowadzania danych do wprowadzania ciśnienia krwi ciężarnej oraz środek do obliczania ryzyka stanu przedrzucawkowego przy użyciu wejściowych ilości jednego lub więcej z PlGF i PAPP-A, oraz ciśnienia krwi. Może być zapewniony środek dla dodatkowych danych do wprowadzania biofizycznych markerów, takich jak ultradźwiękowe markery w tym wartości NT, i informacja o historii matki, wraz z odpowiadającym środkiem do obliczania dla określania ryzyka chromosomalnej nieprawidłowości płodu i/lub stanu przedrzucawkowego. Niniejsze zgłoszenie opisuje także komercyjne pakiety, lub zestawy, do określania ryzyka, że u ciężarnej rozwinie się stan przedrzucawkowy. Takie zestawy mogą zawierać jeden lub więcej reagentów 11

13 do wykrywania ilości co najmniej jednego biochemicznego markera w próbce biologicznej od ciężarnej, gdzie co najmniej jeden z biochemicznych markerów jest wybrany z PlGF i PAPP-A; oraz opcjonalnie, instrukcję do wykonania testu. Zestaw może także zawierać reagenty do wykrywania innych biochemicznych markerów, takich jak PP13, MP3, TNFR1, ADAM12 i innych biochemicznych markerów. Przykładowe określone zestawy zawierają reagenty do wykrywania PlGF i PAPP-A; PlGF i PP13; PAPP-A i PP13; PlGF, PAPP-A i PP13; i kombinacji z innymi biochemicznymi markerami relewantnymi dla stanu przedrzucawkowego i powiązanych zaburzeń. Zestaw do określania ryzyka, że ciężarna nosi płód o chromosomalnej nieprawidłowości może zawierać reagenty do mierzenia ilości PlGF, PAPP-A, i wolnego beta hcg w próbce biologicznej pobranej od ciężarnej; oraz opcjonalnie, instrukcję do wykonania testu. Reagent do wykrywania ilości markera biochemicznego może być, przykładowo, wiążącym partnerem, który selektywnie rozpoznaje określony marker biochemiczny, taki jak przeciwciało, część przeciwciała, materiał podobny do przeciwciała, kwas peptydonukleinowy i tym podobne. Przykład 1. Badanie kliniczne roli PlGF, PAPP-A i biofizycznych markerów do wykrywania stanu przedrzucawkowego Ten przykład pokazuje przydatność różnych kombinacji biochemicznych i biofizycznych markerów, w tym ciśnienie krwi matki, indeks pulsacji w tętnicach macicznych z efektem Dopplera, PlGF, PAPP-A i PP 13, do określania ryzyka stanu przedrzucawkowego u ciężarnej. Podjęto badanie dla skriningu pod kątem niekorzystnych wyników w ciąży u kobiet przystępujących do rutynowej oceny ryzyka pod kątem chromosomalnych nieprawidłowości. Cechy dotyczące matki i historia medyczna zostały zarejestrowane i pobrana krew. Surowicę przechowywano w -80 C dla następnej analizy biochemicznej. Otrzymano pisemną zgodę od kobiet, które zgodziły się na uczestnictwo w badaniu, zaakceptowanym przez Komisję Etyki King's College Hospital. Dodatkowe informacje dotyczące populacji klinicznej i poboru próbek są zamieszczone w Przykładzie 3. Dla opisanych tu analiz, wszystkie biochemiczne i biologiczne markery zostały wyrażone w MoM i transformowane log. Wyrażenie ciśnienia krwi (MAP) jako MoM jest podejściem unikatowym dla niniejszego badania. Ilości biochemicznego markera i odczyty biofizyczne były wyrażone w MoM następująco, gdzie CRL jest odległością ciemieniowo-siedzeniową, BMI to indeks masy ciała, GA to ciąża w dniach zaś waga matki jest w Kg: PlGF/( GA GAxGA) PP13/70./( /waga) MAP (ciśnienie krwi)/ CRL / BMI BMIxBMI Doppler (PI)/ CRL / BMI Wartości średnie dla PlGF, PP13, PAPPA, MAP i Doppler PI, wartości wynosiły -0.0, , , & odpowiednio we wczesnym PE; oraz , 0.002, 0.009, & w niedotkniętych ciążach. W tej samej kolejności standardowe odchylenia (SD) wynosiły: 0.308, 0.0, 0.324, & 0.137; i 0.185, 0.184, 0.236, & 0.1. R-wartości były następujące: Wczesne PE: PlGF-PP , PlGF-PAPPA 0.365, PlGF-MAP , PIGF-Doppler 0.199, PP13-PAPPA 0.389, PP13-MAP 0.065, PP13-Doppler-0.332, PAPPA-MAP 0.364, PAPPA-Doppler , MAP-Doppler Niedotknięte: PlGF-PP , PlGF-PAPPA 0.278, PlGF-MAP , PlGF-Doppler , PP13- PAPPA 0.271, PP13-MAP , PP13-Doppler , PAPPA-MAP 0.000, PAPPA-Doppler , MAP- Doppler

14 Rozważanymi biochemicznymi markerami były PAPP-A, PlGF i PP13 (z użyciem immunotestu DELFIA z PerkinElmer). Parametry dla niedotkniętych dla PAPP-A były z całego zestawu danych w tym ciąże nie w serii kliniczno-kontrolnej. Wszystkie parametry dla PlGF i PP13 były z serii kliniczno-kontrolnej. Rozważane biofizyczne markery obejmują parametry dla MAP i PI w tętnicach macicznych z efektem Dopplera z całego zestawu danych, chociaż nie wszystkie kobiety miały obydwa pomiary. Zastosowano współczynniki korelacji z biochemicznymi markerami. Dla wyrażenia czynników wcześniejszego ryzyka dla stanu przedrzucawkowego, 1 stosunki (LR) zostały wywiedzione z całego zestawu danych. Zaobserwowane wartości są pokazane w Tabeli 1 i porównane z tymi zaobserwowanymi w poprzednim badaniu z tego samego ośrodka. Rozkład czynników ryzyka był niepowiązany z ciężkością stanu przedrzucawkowego (Tabela 2), więc te same LR mogą być zastosowane dla wszystkich podgrup. Dla modelowych predykcji dla biochemicznych i fizycznych markerów, przyjęto wieloczynnikowy log dopasowania Gaussa. Tabela 3 pokazuje przewidziany stopień detekcji (DR) dla wczesnego stanu przedrzucawkowego (poród <34 tygodni), z 1%, 5% i % stopniem wyniku fałszywie dodatniego dla różnych kombinacji. DR był wyższy dla PlGF i PAPP-A niż dla każdego pojedynczo. Podobnie DR było wyższe dla MAP i PI niż dla każdego pojedynczo. Połączenie biochemicznych i biofizycznych markerów dalej zwiększyło detekcję. Dla bezpośrednio zaobserwowanego rozkładu ryzyka, obliczono stosunek przypadków wczesnego stanu przedrzucawkowego z oszacowanym ryzykiem wczesnego stanu przedrzucawkowego powyżej 99- go, 95-go i 90-go centylu w odpowiedniej populacji (wszystkie niedotknięte ciąże lub tylko kontrolne). Tabela 4 pokazuje stosunki dla ryzyka obliczone z różnych kombinacji biochemicznych i biofizycznych markerów, bez uwzględniania wcześniejszego ryzyka. Wyniki dla samych markerów biochemicznych są mniej predyktywne niż predykcje modelowe. Dla samych markerów biofizycznych oraz w kombinacji z markerami biochemicznymi, wyniki były zgodne z przewidywaniami. Tabela 5 pokazuje proporcje przypadków stanu przedrzucawkowego z wynikami wysokiego ryzyka na podstawie samych czynników wcześniejszego ryzyka. Tabela 6 pokazuje proporcje z wysokim ryzykiem wczesnego stanu przedrzucawkowego na podstawie czynników wcześniejszego ryzyka, jak również profilu markerów biochemicznych i fizycznych. Tabela 7 pokazuje proporcję przypadków późnego stanu przedrzucawkowego z wysokim ryzykiem późnego wyniku; jedynie wybrane kombinacje. Dla podsumowania pewnych aspektów, podstawowe ryzyko stanu przedrzucawkowego dla ciężarnej to częstość występowania stanu przedrzucawkowego w badanej populacji (przykładowo, częstość występowania stanu przedrzucawkowego u ciężarnych tego samego pochodzenia etnicznego co dana ciężarna). W pewnych przypadkach, MOM PlGF i/lub wartość mediany PlGF uzyskana z grupy ciężarnych kobiet z niedotkniętymi ciążami jest korygowana pod kątem wieku ciążowego płodu przy użyciu następującego wzoru: Skorygowany PlGF przez Wiek Ciąży (GA) = *GA *GA*GA, gdzie GA =wiek ciąży w dniach. W pewnych przypadkach, zmierzona MoM ilość PAPP- A i/lub wartość mediany PAPP-A uzyskana z grupy ciężarnych kobiet z niedotkniętymi ciążami jest korygowana pod kątem wagi ciężarnej matki przy użyciu następującego wzoru: Skorygowany PAPP-A przez Wagę Matki (WT) = /WT, gdzie WT = waga ciężarnej kobiety w kilogramach. Badano także markery biofizyczne. Łącznie 7658 z niedotkniętymi ciążami miało pomiary PI w tętnicach macicznych z efektem Doppler a i 6584 miało średnie tętnicze ciśnienia krwi (MAP). PI rosło stabilnie z wiekiem ciąży a MAP lekko się zmniejszało, choć osiągając statystyczne znaczenie. Po wyrażeniu wartości w MoM, PI lekko spadło ze wzrostem wagi podczas gdy MAP znacznie wzrosło. Oba efekty były silniejsze gdy zastosowano BMI zamiast wagi, choć nie tak bardzo. Mediany PI i MAP były podwyższone w stanie przedrzucawkowym (Tabele 21 & 22). Podczas gdy wzrost mediany MAP nie wyglądał na duży, standardowe odchylenie było o wiele mniejsze niż PI (wartości log w niedotkniętych ciążach i 0.12 odpowiednio), i efekty były porównywalne. 13

15 5 Przyjmując wieloczynnikowe dopasowanie Gaussa i stosując zaobserwowane parametry dla wczesnego stanu przedrzucawkowego i niedotkniętych ciąż, oszacowano modelowe stopnie przewidywanej detekcji dla ustalonych stopni wyników fałszywie dodatnich. Obliczono także ryzyko dla każdego przypadku i kontrolnego celem bezpośredniego oszacowania stopni detekcji i wyników fałszywie dodatnich. Stopnie oszacowano dla różnych kombinacji markerów biochemicznych, markerów biofizycznych oraz czynników ryzyka. Zatem, ten przykład pokazuje, że w skriningu pod kątem stanu przedrzucawkowego, występowały znaczące niezależne udziału czynników dotyczących matki, ciśnienia krwi (MAP), PlGF i PAPP-A krwi matki. Oszacowano, że skrining przez kombinacje PlGF i/lub PAPP-A z MAP zidentyfikował około 70% osób z rozwojem wczesnego stanu przedrzucawkowego ze stopniem wyniku fałszywie dodatniego %. Oszacowano, że dodanie PI w tętnicach macicznych do badania zidentyfikowało ponad 90% osób z rozwojem wczesnego stanu przedrzucawkowego ze stopniem wyniku fałszywie dodatniego %. Oszacowano, że skrining przez kombinację PlGF, PAPP-A i MAP zidentyfikował około 60% osób z rozwojem późnego stanu przedrzucawkowego ze stopniem wyniku fałszywie dodatniego %. Tabela 1. Porównanie bieżących LR z tymi w Papageorghiou i in. Czynnik Wartość Bieżąca Papageorghiou Rasa Czarna Osoba paląca Tak Nie Liczba porodów BMI < Nadcisnienie Tak Nie Hx PE (ilość porodów 1+) Tak Nie PE u matki/siostry PE* Tak Bieżący=matka; Papageorghiou=siostra Nie

16 Tabela 2. Rozkład czynników ryzyka, zgodnie z wiekiem ciąży przy porodzie Czynnik Wartość <34 tygodni tygodni 37+ tygodni Rasa Czarna 38% 45% 42% Inna 62% 55% 58% Osoba paląca Tak 0.0% 9.1% 5.2% Nie 0% 91% 95% Ilość porodów 0 52% 59% 66% 1 24% 32% 21% 2 % 5% 8% 3+ 14% 5% 5% BMI <25 38% 32% 36% % 55% 44% 35+ 3% 14% 19% Nadciśnienie Tak 14% 9% 3% Nie 86% 91% 97% Hx PE (ilość porodów 1+) Tak 50% 67% 65% Nie 50% 33% 35% PE u matki/siostry PE* Tak % 18% % Bieżący=matka; Papageorghiou=siostra Nie 90% 82% 90% Tabela 3. Wczesny stan przedrzucawkowy: modelowe stopnie przewidywanej detekcji dla ustalonych FPR Kombinacja 1% FPR 5% FPR % FPR PlGF 23% 37% 46% PAPP-A 19% 36% 46% PP13 4% 13% 22% MAP 26% 44% 55% PI 28% 50% 62% PlGF & PAPP-A (Podwójna) 30% 47% 57% PlGF, PAPP-A & PP13 (Potrójna) 30% 48% 57% MAP & PI 51% 77% 87% PlGF & MAP 38% 56% 66% PAPP-A & MAP 38% 63% 74% Podwójna & MAP 45% 67% 77% Potrójna & MAP 46% 67% 77% PlGF, MAP & PI 61% 84% 91% PAPP-A, MAP & PI 60% 84% 91% Podwójna, MAP & PI 67% 87% 93% Potrójna, MAP & PI 67% 87% 94%

17 Tabela 4. Ryzyko wczesnego stanu przedrzucawkowego (bez wcześniejszych czynników): proporcja przypadków powyżej ustalonych normalnych centyli Kombinacja 99-ty 95-ty 90-ty PlGF % 31% 41% PAPP-A 21% 24% 41% PP13 3% 17% 17% MAP 28% 44% 56% PI 14% 52% 69% PlGF & PAPP-A (Podwójna) 17% 38% 48% PlGF, PAPP-A & PP13 (Potrójna) 17% 41% 48% MAP & PI 28% 84% 88% PlGF & MAP 44% 48% 68% PAPP-A & MAP 44% 56% 68% Podwójna & MAP 48% 56% 64% Potrójna & MAP 48% 56% 68% PlGF, MAP & PI 52% 76% 92% PAPP-A, MAP & PI 36% 80% 92% Podwójna, MAP & PI 56% 72% 96% Potrójna, MAP & PI 52% 80% 96% Tabela 5. Ryzyko wczesnego stanu przedrzucawkowego (tylko wcześniejsze czynniki): proporcja przypadków powyżej ustalonych normalnych centyli Typ stanu przedrzucawkowego 99-ty 95-ty 90-ty Wczesny 21% 41% 59% Inny % 32% 57% Wszystkie 12% 34% 57% 5 Tabela 6. Ryzyko wczesnego stanu przedrzucawkowego (z wcześniejszymi czynnikami): proporcja wczesnych przypadków powyżej ustalonych normalnych centyli Kombinacja 99-ty 95-ty 90-ty PlGF 28% 45% 62% PAPP-A 34% 52% 62% PP13 24% 41% 45% MAP 36% 48% 68% PI 24% 66% 72% Podwójna 24% 59% 66% Potrójna 31% 59% 69% MAP & PI 44% 76% 88% PlGF & MAP 40% 64% 68% PAPP-A & MAP 40% 60% 76% Podwójna & MAP 48% 68% 72% Potrójna & MAP 48% 68% 72% PlGF, MAP & PI 56% 80% 92% PAPP-A, MAP & PI 52% 84% 92% Podwójna, MAP & PI 60% 88% 96% Potrójna, MAP & PI 60% 88% 96% 16

18 Tabela 7. Ryzyko późnego stanu przedrzucawkowego (z wcześniejszymi czynnikami): proporcja późnych przypadków powyżej ustalonych normalnych centyli Kombinacja 99-ty 95-ty 90-ty PlGF 7% 31% 45% PAPP-A 6% 27% 42% MAP 18% 37% 56% PI 6% 32% 44% Podwójna 9% 30% 42% MAP & PI 19% 40% 57% Podwójna & MAP 17% 34% 58% Podwójna, MAP & PI 19% 43% 52% Tabela 21. Mediana MoM (#) dla każdego markera biofizycznego zgodnie z wynikiem Marker Kontrolne FGR PET PIH Poród przed czasem PI 1.00 (7658) 1.08 (296) 1.31 (128) 1.07 (89) 1.06 (58) MAP 1.00 (6584) 1.14 (296) (1) 1.18 (82) 1.12 (56) Marker Tabela 22. Stan przedrzucawkowy: mediana MoM, zgodnie z wiekiem ciąży przy porodzie <34 tygodnie #= #=21 PI MAP #=74 5 Tabela 23. Korelacje z PI Marker Stan przedrzucawkowy Niedotknięte PlGF -0.25** PP13 (Delfia) -0.41** -0.09* PAPP-A -0.28** -0.17** MAP ** *znaczna; **bardzo znaczna Tabela 24. Korelacje z MAP Marker Stan przedrzucawkowy Niedotknięte PlGF PP 13 (Delfia) PAPP-A *znaczna; **bardzo znaczna Przykład 2: Badanie kliniczne roli wielu biochemicznych i biofizycznych markerów do wykrywania stanu przedrzucawkowego i powiązanych zaburzeń dotyczących łożyska Niniejszy przykład pokazuje przydatność różnych kombinacji biochemicznych markerów dla określania ryzyka stanu przedrzucawkowego i powiązanych zaburzeń u ciężarnej. W szczególności stwierdzono, że biochemiczne markery MMP3, PlGF, TNFR1 i PP13 (format testu DELFIA z PerkinElmer) posiadają statystyczne znaczenie dla przewidywania stanu przedrzucawkowego i powiązanych zaburzeń. Jeden lub więcej markerów wykazujących predykcyjną siłę do wykrywania stanu przedrzucawkowego może być zastosowanych w kombinacji z zestawami markerów tu opisanymi, jak PlGF i/lub PAPP-A i MAP. 17

19 Podjęto badanie dla skriningu pod kątem niekorzystnych wyników w ciąży u kobiet przystępujących do rutynowej oceny ryzyka pod kątem chromosomalnych nieprawidłowości. Cechy dotyczące matki i historia medyczna zostały zarejestrowane i pobrana krew. Surowicę przechowywano w -80 C dla następnej analizy biochemicznej. Otrzymano pisemną zgodę od kobiet, które zgodziły się na uczestnictwo w badaniu, zaakceptowanym przez Komisję Etyki King's College Hospital. Dodatkowe informacje dotyczące populacji klinicznej i poboru próbek są zamieszczone w Przykładzie 3. Najpierw, zidentyfikowano parametry, które wpływają na ilości markerów biochemicznych w próbce biologicznej od matki. Zaobserwowano, że (1) PlGF i ADAM12 rosły stromo wraz z wiekiem ciąży. Żaden z innych markerów nie był statystycznie znacząco powiązany z ciążą i całościową medianę zastosowano do wykonania MoM; (2) MoM TNFR1 rosną z wagą, (3) PP13 & ADAM12 spadły z wagą; (4) MMP3 & PlGF były niepowiązane z wagą. Równania odwrotnej regresji ważonej zastosowano dla regulacji; BMI nie było lepszą współzmienną niż waga. Dla wykrywania osób ze stanem przedrzucawkowym, wyniki były statystycznie znaczące (2- stronny) dla MMP3 (P<0.005), PlGF (P<0.0001), TNFR1 (P<0.05) i PP13 Delfia (P<0.02). Tabela 8 pokazuje wartości mediany MoM dla niedotkniętych ciąż (Kontrolna), zahamowania wzrostu płodu (FGR), stan przedrzucawkowy (PET), nadciśnienie spowodowane ciążą (PIH), oraz ciąże z przedwczesnym porodem. Tabela 9 pokazuje MoM dla -tego i 90-tego centyla u kontrolnych, oraz standardowe odchylenia. Dane pokazują, że TNFR1 miał bardzo ciasny normalny rozkład. Dla PP13, na podstawie dotychczasowych danych, immunotest ELISA miał więcej niż podwójnie SD z immunotestu DELFIA. Figura 4 pokazuje w parach MoM PP 13 z Delfia i ELISA dla ciąż ze stanem przedrzucawkowym i niedotkniętych. Pokazuje to, że immunotest DELFIA z PerkinElmer DELFIA miał mniejsze odchylenie w stosunku do technologii ELISA zastosowanej w tym eksperymencie. Stwierdzono, że PlGF był najsilniejszym markerem biochemicznym w grupie ze stanem przedrzucawkowym <34 tygodnia, następnie PP 13 (Stan przedrzucawkowy: mediana MoM zgodnie z ciężkością (Tabela ). Te i inne markery biochemiczne były także przydatne do wykrywania stanu przedrzucawkowego wśród grupy tygodni i grupy 37+ tygodni. Przebadano wpływ etniczności na MoM biochemicznych markerów (zob. Tabela 11). Wyniki pokazały, że najsilniejszy wpływ etniczności występował na MMP3, PlGF i możliwie PP13 ELISA. Dodatkowo, zbadano wpływ palenia na MoM markerów biochemicznych (zob. Tabela 12). Wyniki pokazały wpływ palenia na PlGF, PP13 i ADAM12. Wpływ ilości porodów i wiek matki został także zbadany. Żaden z markerów biochemicznych nie był znacząco związanych z ilością porodów lub wiekiem matki, choć wyglądało na mały stabilny wzrost w PP13. Było tylko 16 ciąż ART ale godne odnotowania jest, że mediana dla PlGF wynosiła 0.87 MoM. Relewantne centyle dla niedotkniętych ciąż są pokazane w Tabeli 13. Tabela 14 pokazuje centyle w przypadkach wczesnego stanu przedrzucawkowego. PlGF był najlepszym predykatorem na -tym percentylu, po nim PP13. Tabela pokazuje centyle w przypadkach stanu przedrzucawkowego z porodem w tygodniu. Nie było korelacji materiału pomiędzy PlGF i PP 13 (wykonanie z użyciem immunotestu DELFIA z PerkinElmer) w niedotkniętych ciążach (Tabela 16) ale wyglądało na małą korelację w stanie przedrzucawkowym (Tabela 17). Figura 5 pokazuje sparowane MoM dla 29 przypadków wczesnego stanu przedrzucawkowego. Ilość mediany (log SD) dla PAPP-A w ciążach ze stanem przedrzucawkowym i niedotkniętych kontrolnych wynosiła 0.79 MoM (0.22) i 1.08 MoM (0.22) odpowiednio. Była bardzo skorelowana zarówno z PlGF jak i PP13 (Tabela 18). Rozmiar zmniejszenia PAPP-A był większy w ciążach z wczesnym stanem przedrzucawkowym z medianą 0.54 MoM. Wolny beta hcg nie był markerem stanu przedrzucawkowego (mediany 1.16 i 1. w ciążach z stanem przedrzucawkowym i niedotkniętych) i wykazywał słabszą korelację z PlGF i PP13 (Tabela 19). Ilości mediany (log SD) badających markerów w całej serii 7413 niedotkniętych ciąż nie tylko kontrolnych wynosiła 1.02 MoM (0.24) dla PAPP-A i 1.09 MoM (0.26) dla wolnego beta hcg. Obniżenia w ilościach median PP13 ELISA, PP13 Delfia i ADAM12 (zob. Tabela 8) były statystycznie znaczące (wszystkie P<0.0001). Występował relatywnie wysoki stopień palenia w grupie z zahamowaniem 18

20 5 wzrostu, lecz efekt był nalej widoczny po stratyfikacji (zob. np., Tabela w porównaniu z Tabelą 12). Ilość mediany dla PAPP-A była także zmniejszona (0.80 MoM). Zatem, przykład ten pokazuje, że w wykrywaniu stanu przedrzucawkowego, PlGF, PP13, TNFR1 były najbardziej skutecznymi markerami; w wykrywaniu zahamowania wzrostu płodu,, PlGF, PP 13, ADAM 12 i MMP3 były najbardziej skutecznymi markerami; w wykrywaniu nadciśnienia spowodowanego ciążą (znanego także jako nadciśnienie ciążowe), PP13, PlGF i MMP3 były najbardziej skutecznymi markerami, oraz w wykrywaniu przedwczesnego porodu, PP 13, PlGF i MMP3 były najbardziej skutecznymi markerami. Pokazane jest także, że PlGF, PP 13 i inne markery są przydatne do wykrywania stanu przedrzucawkowego w całym okresie ciąży, w tym <34 tygodnia (włącznie) i później. Tabela 8. Mediana MoM (#) dla każdego markera biochemicznego zgodnie z wynikiem Marker Kontrolne FGR PET PIH Przedwczesny poród MMP (572) 1.07 (296) 1.17 (128) 1. (88) 1.18 (57) PlGF 1.00 (571) 0.96 (296) 0.84 (127) 0.89 (88) 1. (57) TNFR (572) 1.01 (296) 1.06 (128) 1.01 (88) 1.04 (57) PP13 (ELISA) 1.00 (312) 0.68 (170) 0.97 (77) 0.70 (48) 0.90 (21) PP13 (Delfia) 1.00 (570) 0.80 (296) 0.87 (128) 0.92 (88) 0.83 (58) ADAM (572) 0.84 (296) 0.98 (128) 0.99 (88) 1.02 (58) Tabela 9. MoM dla -tego & 90-tego centyla u kontrolnych, i SD zakładając log dopasowania Gaussa Marker -ty centyl 90-ty centyl SD MMP PlGF TNFR PP13 (ELISA) PP13 (Delfia) ADAM Tabela. Stan przedrzucawkowy: mediana MoM, zgodnie z wiekiem ciąży przy porodzie Marker < 34 tygodnie # = tygodnie # = tygodnie # =77 MMP PlGF ** 0.95 TNFR PP13 (ELISA)* PP13 (Delfia) ADAM *#=24, 12 & 41; **#=21 19

21 Tabela 11. Niedotknięte ciąże: mediana MoM zgodnie z etnicznością; proporcje w nawiasach Marker Kaukaska (72%) Afroamerykańska (17%) Indyjska (5%) Chińska (2%) Mieszana (4%) Niekaukaska MMP PlGF TNFR PP13 (ELISA) PP13 (Delfia) ADAM Tabela 12. Niedotknięte ciąże: mediana MoM zgodnie ze statusem palenia; proporcje w nawiasach Marker Osoba niepaląca (96%) Osoba paląca (4%) MMP PlGF TNFR PP13 ELISA PP13 Delfia ADAM Tabela 13. Niedotknięte ciąże: wybrane centyle (MoM) Marker <1-szego <5-tego <-tego >90-tego >95-tego >99-tego MMP Kaukaska Niekaukaska PlGF Osoba niepaląca Osoba paląca Kaukaska Niekaukaska TNFR PP13 (ELISA) Osoba niepaląca PP13 (Delfia) Osoba niepaląca Osoba paląca ADAM Osoba niepalaca Osoba paląca

22 Tabela 14. Wczesny stan przedrzucawkowy: przypadki w odniesieniu do wybranych centyli Marker # <1-tego <5-tego <-tego >90-tego >95-tego >99-tego MMP PlGF TNFR PP13 ELISA PP13 Delfia ADAM Tabela. Stan przedrzucawkowy z porodem w tygodniu: przypadki w odniesieniu do wybranych centyli Marker # <1-szego <5-tego <-tego >90-tego >95-tego >99-tego MMP PlGF TNFR PP13 (ELISA) PP13 (Delfia) ADAM Tabela 16. Korelacje w niedotkniętych ciążach (z wyłączeniem wartości izolowanych) Marker MMP3 PlGF TNFR1 PP13ELISA PP13Delfia PlGF TNFR1 0.47** 0.09* - PP13 (ELISA) -0.14* PP13 (Delfia) -0.** ** - ADAM ** ** 0.38** *znaczna; **bardzo znaczna 5 Tabela 17. Korelacje w stanie przedrzucawkowym (z wyłączeniem wartości izolowanych) Marker MMP3 PlGF TNFR1 PP13 (ELISA) PP13 (Delfia) PlGF TNFR1 0.51** PP13 (ELISA) PP13 (Delfia) * ** - ADAM * 0.44** 0.43** Tabela 18. Korelacje z PAPP-A (z wyłączeniem wartości izolowanych) Marker Stan przedrzucawkowy Niedotknięte MMP PlGF 0.34** 0.27** TNFR PP13 (ELISA) ** PP13 (Delfia) 0.38** 0.27** ADAM ** 0.42** *znaczna; **bardzo znaczna 21

23 Tabela 19. Korelacje z wolnym beta hcg (z wyłączeniem wartości izolowanych) Marker Stan przedrzucawkowy Niedotknięte MMP PlGF ** TNFR * PP13 (ELISA) 0.26** 0.* PP 13 (Delfia) 0.40** 0.32** ADAM ** 0.21** *znaczna; **bardzo znaczna Tabela. Zahamowanie wzrostu płodu: mediana MoM, zgodnie ze statusem palenia; proporcje w nawiasach Marker Osoba niepaląca (82%) Osoba paląca (18%) MMP PlGF TNFR PP13 ELISA PP13 Delfia ADAM Przykład 3. Badanie kliniczne roli biochemicznych markerów i biofizycznych markerów z efektem Dopplera do wykrywania zaburzeń nadciśnieniowych u matki Ten przykład pokazuje przydatność różnych kombinacji biochemicznych i biofizycznych markerów, w tym PlGF, PAPP-A, PI w tętnicach macicznych, do określania ryzyka, że ciężarna nosi płód posiadający nieprawidłowość chromosomalną. Podjęto badanie dla skriningu pod kątem niekorzystnych wyników w ciąży u kobiet przystępujących do rutynowej oceny ryzyka pod kątem chromosomalnych nieprawidłowości przez pomiar grubości przezierności fałdu karkowego oraz PAPP-A i wolnego beta-hcg w surowicy matki w tygodniach ciąży. Cechy dotyczące matki i historia medyczna zostały zarejestrowane i zmierzono PI w tętnicach macicznych kolorowym Dopplerem przez brzuch oraz surowicę przechowywano w -80 C dla następnej analizy biochemicznej. Otrzymano pisemną zgodę od kobiet, które zgodziły się na uczestnictwo w badaniu, zaakceptowanym przez Komisję Etyki King's College Hospital. Populacja badania kliniczno-kontrolnego obejmowała 127 ciąż, w których następnie rozwinął się PE, w tym 29, które wymagały porodu przed 34 tygodniem i 98 z późnym PE, 88 z nadciśnieniem ciążowym (GH), 296 przypadków, które dały poród małych noworodków dla wieku ciąży (SGA), 57 przypadków ze spontanicznym przedwczesnym porodem przed 34 tygodniem i 41 przypadków z trisomią 21. Każdy przypadek połączono z jednym przypadkiem kontrolnym, który miał krew pobraną i przechowywaną w tym samym dniu, w którym nie pojawiły się komplikacje ciążowe i skutkowały żywym porodem fenotypowo normalnych noworodków. Osoby poproszono o wypełnienie kwestionariusza o wieku matki, pochodzeniu rasowym (kaukaskie, afroamerykańskie, indyjskie, pakistańskie, chińskie lub japońskie oraz mieszane), paleniu papierosów w trakcie ciąży (tak lub nie), sposób poczęcia (spontaniczny, zastosowanie leków na owulację oraz zapłodnienie in vitro), historii medycznej (w tym przewlekłe nadciśnienie, cukrzyca, zespół antyfosfolipidowy, zakrzepica, infekcja wirusem HIV, oraz anemia sierpowata), leczeniu (w tym leki na nadciśnienie, antydepresanty, leki przeciwpadaczkowe, leki przeciwzapalne, leki przeciwtarczycowe, aspiryna, ß-mimetyki, insulina, steroidy, tyroksyna), ilości porodów (ródka lub pierworódka jeśli brak 22

24 porodów poza 23 tygodniem), historii położnicza (w tym poprzednia ciąża z PE) i historii rodzinnej PE (matka). Zmierzono wagę i wzrost matki oraz obliczono indeks masy ciała (BMI) w Kg/m2. Próbki surowicy w duplikacie 0 µl zastosowano do zmierzenia stężenia PlGF techniką kwantytatywnego testu immunoenzymatycznego (ELISA) z użyciem immunotestu dla ludzkiego PIGF Quantikine (R&D systems Europe Ltd., Abingdon, UK). Testy wykonano na automatycznym procesorze ELISA (Dade-Behring BEP 00, Liederbach, Germany). Odczyty absorbancji wykonano na czytniku płytek VICTOR (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Turku, Finlandia) a stężenia PlGF określono przy użyciu oprogramowania MultiCalc (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Turku, Finland). Niższa granica detekcji testu wynosiła 7 pg/ml a niedokładność pomiędzy partiami wynosiła 8.3% przy stężeniu PlGF 48 pg/ml, 5.6% przy 342 pg/ml oraz 5.1% przy 722 pg/ml. Próbki, których współczynnik wariancji duplikatów przekraczał % przeanalizowano ponownie. Zmierzone stężenie PlGF było transformowane logarytmicznie dla wykonania rozkładu Gaussa. Analiza regresji wielokrotnej została następnie zastosowana do określenia, które z czynników wśród cech matki oraz odległość ciemieniowo-siedzeniowa (CRL) były znaczącymi predykatorami log PlGF w grupie kontrolnej i z modelu regresji wartość w każdym przypadku i kontrolnym została wyrażona jako wielokrotność oczekiwanej mediany w grupie kontrolnej (MoM). Utworzono wykres pudełkowy MoM dla PlGF każdej grupy wyniku. Zastosowano test Mann-Whitney a do określenia znaczenia różnic w medianie MoM w każdej grupie wyniku do tego u kontrolnych. W każdym przypadku i kontrolnym, zmierzone PAPP-A i PI w tętnicach macicznych zostały przekształcone w MoM po regulacji pod kątem wieku ciąży, wieku matki, etniczności, BMI lub wagi, ilości porodów, uprzedniej historii PE oraz sposobu poczęcia (zob., przykładowo Kagen i in., Ultrasound Obstet Gynecol 31: (08)). Następnie zastosowano analizę regresji dla określenia znaczenia związku pomiędzy log MoM PIGF z log MoM PAPP-P, log MoM PI w tętnicach macicznych, percentylem wagi po porodzie oraz wiekiem ciąży przy porodzie w grupie każdego wyniku. Wykonano analizę regresji logistycznej dla określenia, który z czynników wśród cech matki, MoM log PlGF, MoM log PAPP-A oraz MoM log PI w tętnicach macicznych miał znaczący udział w przewidywanie PE. Działanie skriningu określono przez krzywe operacyjno-charakterystyczne (ROC). Do analizy wszystkich danych zastosowano pakiet oprogramowania statystycznego SPSS.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Cechy dotyczące matki dla każdej z grup wynikowych są porównane w Tabeli 30. Analiza regresji wielokrotnej w grupie kontrolnej wykazała, że dla log PlGF znaczące niezależne udziały były dostarczone przez CRL płodu, wagę matki, palenie papierosów i pochodzenie etniczne: log oczekiwanego PlGF = x CRL w mm x waga w Kg + (0.199 jeśli paląca, 0 jeśli niepaląca) + (0.177 jeśli czarna, 0.0 jeśli indyjska lub pakistańska, 0 jeśli inne etniczne pochodzenia); R 2 =0.237, p< Ten wzór zastosowano dla każdej osoby dla wyprowadzenia oczekiwanego log PlGF i następnie wyrażono zaobserwowaną wartość jako MoM oczekiwanego (Figura 1, Tabela 30). Występował znaczący związek pomiędzy log MoM PlGF i log MoM PAPP-A (r=0.264, p<0.0001; Figura 2), log MoM PI w tętnicach macicznych (r=0.2, p=0.012; Figura 3), percentylem wagi po porodzie (r=0.114, p=0.005) ale nie wiekiem ciąży przy porodzie (p=0.960). Zarówno w grupie wczesnego PE jak i późnego PE PIGF i PAPP-A były niższe a PI w tętnicach macicznych był wyższy niż w kontrolnych (Figura 1, Tabela 30). Występował znaczny związek pomiędzy log MoM PlGF i log MoM PAPP-A (r=0.325, p<0.0001; Figura 2), log MoM PI w tętnicach macicznych (r=0.279, p=0.001; Figura 3), wiekiem ciąży przy porodzie (r=0.256, p=0.004) i percentylem wagi po porodzie (r=0.338, p<0.0001). Analiza regresji logistycznej wykazała, że znaczące udziały w wykrywaniu wczesnego PE były zapewnione z czynników dotyczących matki, PlGF, PAPP-A i PI w tętnicach macicznych (R 2 =0.500, p<0.0001, Tabela 31). Analiza regresji logistycznej wykazała, że znaczące udziały w wykrywaniu późnego PE były zapewnione z czynników dotyczących matki, PlGF i PI w tętnicach macicznych (R 2 =0.290, p<0.0001; Tabela 3) ale nie PAPP-A (p=0.933). 23

25 5 Stopnie detekcji wczesnego stanu przedrzucawkowego i późnego stanu przedrzucawkowego dla różnych stopni wyników fałszywie dodatnich w skriningu przez czynniki dotyczące matki, PlGF surowicy, PAPP-A surowicy, PI w tętnicach macicznych i przez ich kombinacje są podane w Tabeli 33. Działanie różnych sposobów skriningowych jest także porównane przez obszary pod krzywymi operacyjno charakterystycznymi w Tabeli 33. W grupie GH, w porównaniu do kontrolnych, nie było znaczących różnic pomiędzy w PlGF, PAPP- A lub PI w tętnicach macicznych (Figura 1, Tabela 31). Stężenie PIGF w surowicy matki w tygodniu ciąży w normalnych ciążach rosło z CRL płodu i stąd wiekiem ciąży, malało z wagą matki i było wyższe u afroamerykańskiej kobiety niż u kaukaskiej oraz u palących niż u niepalących. W wyniku, jak w przypadku PAPP-A, zmierzone stężenie PIGF regulowano dla tych zmiennych przed porównaniem wyników z ciążami patologicznymi. Wspólnie z PlGF, stężenie PAPP-A w surowicy również rosło z CRL płodu, malało z MBI matki i było wyższe u kobiety afroamerykańskiej niż u kaukaskiej. Jednakże, u palących była ewidentna dysocjacja w stosunku między tymi dwoma produktami łożyska ze spadkiem PAPP-A w surowicy i wzrostem PlGF. W ciążach, w których rozwinął się stan przedrzucawkowy, stężenie PIGF w surowicy matki w tygodniu ciąży było niższe niż w ciążach z normalnym ciśnieniem. Dalej, występował znaczących związek pomiędzy PlGF i ciężkością PE określoną zarówno przez wiek ciąży, w którym wykonano poród jatrogenny oraz centylem wagi noworodków po porodzie. Zatem, ten przykład pokazuje, że PlGF, PAPP-A i PI, oraz ich kombinacje, są skutecznymi markerami do wykrywania wczesnego stanu przedrzucawkowego i, w mniejszym stopniu, do wykrywania późnego stanu przedrzucawkowego. Cechy matki Wiek matki w latach (mediana, zakres) Tabela 30. Cechy matki w czterech grupach wyniku Kontrolna (n=609) Wczesny stan przedrzucawkowy (n=29) 24 Późny stan przedrzucawkowy (n=98) Nadciśnienie ciążowe (n=88) 32.7 (16-45) 32.7 (17-49) 31.5 (18-44) 33.3 (18-46) Waga w Kg (mediana, zakres) 65.0 (42-143) 72.0 (54-5)* 69.5 (44-140) 71.0 (50-147) Odległość ciemieniowosiedzeniowa w mm (mediana, zakres) Etniczność 64.0 (45-84) 67.0 (52-84) 62.3 (46-84)* 62.5 (47-83) Kaukaska (n, %) 443 (72.7) 11 (37.9) 41 (41.8) 67(76.1) Afroamerykańska (n, %) 97 (.9) 14 (48.3) 41 (41.8) 16 (18.2) Indyjska lub pakistańska (n, %) 34 (5.6) 2 (6.9) 7(7.1) 0* Chińska lub japońska (n, %) 13 (2.1) 0 2 (2.0) 1(1.1) Mieszana (n, %) 22 (3.6) 2 (6.9) 7(7.1) 4 (4.5) Ilość porodów Pierworódka (n, %) 278 (45.6) (51.7) 64(65.3) 49 (55.7) Rodziła - bez uprzedniego EP (n, %) Rodziła uprzednie EP (n, %) 3(51.7) 7 (24.1)* 23 (23.5) 29(33.0) 16 (2.6) 7(24.1) 11(11.2) (11.4) Osoba paląca (n, %) 30 (4.9) 0 6 (6.1) 7(8.0) Historia EP w rodzinie matka (n, %) Poczęcie 22(3.6) 3(.3) 12(12.2) 9 (.2)* Spontaniczne (n, %) 594 (97.5) 25 (86.2)* 94 (95.9) 85 (96.6)

26 Cechy matki Kontrolna (n=609) Wczesny stan przedrzucawkowy (n=29) Późny stan przedrzucawkowy (n=98) Leki na owulację (n, %) (1.6) 3 (.3)* 3(3.1) 0 Zapłodnienie in vitro (n, %) 5(0.8) 1(3.4) 1(1.0) 3(3.4) Historia medyczna Nadciśnienie ciążowe (n=88) Brak (n, %) 599(98.4) 24(82.8) 93(94.9)* 85(96.6) Przewklekłe nadciśnienie (n, %) 1(0.2) 4(13.8) 4(4.1)* 0 Cukrzyca (n, %) 4(0.7) 0 0 2(2.3) Zespół antyfosfolipidowy (n, %) 3(0.5) 0 1 (1.0) 1(1.1) Zakrzepica (n, %) 0 1 (3.4)* 0 0 Anemia sierpowata (n, %) 1(0.2) 0 0 Infekcja HIV (n, %) 1(0.2) 0 0 Leczenie podczas ciąży Brak (n, %) 572(93.9) 25(86.2) 90(91.8) 76(86.4)* Leki na nadciśnienie (n, %) 0 2(6.9)* 2(2.0)* 0 Insulina (n, %) 3(0.5) 0 0 2(2.3) Steroidy (n, %) 1(0.2) 0 0 β-mimetyki (n, %) 5(0.8) 0 3(3.1) 1(1.1) Skojarzone leki na astmę (n, %) 6(1.0) 0 1(1.0) 3(3.4) Tyroksyna (n, %) 9(1.5) 1(3.4) 1(1.0) 2(2.3) Aspiryna (n, %) 3(0.5) 0 0 2(2.3) Leki przeciw padaczce (n, %) 2(0.3) 0 0 1(1.1) Lit (n, %) 6(1.0) 1(3.4) 0 1(1.1) Leki przeciwzapalne (n, %) 2(0.3) 0 1(1.0) 0 Porównanie z grupa niedotkniętą (test chi-kwadratu dla kategorycznych zmiennych zmiennych): * P < 0.05, P < 0.01, P < i ANOVA dla ciągłych Tabela 31. Mediana (zakres interkwartylowy) MoM łożyskowego czynnika wzrostu (PlGF), MoM PAPP-A oraz MoM indeksu pulsacji w tętnicach macicznych (PI), z surowicy matki w czterech grupach wyniku: kontrolna, wczesny stan przedrzucawkowy, późny stan przedrzucawkowy oraz nadciśnienie ciążowe Grupa wyniku MoM PlGF MoM PAPP-A MoM PI w tętnicach macicznych Kontrolna ( ) ( ) ( ) Wczesny stan przedrzucawkowy ( ) ( ) ( ) Późny stan przedrzucawkowy ( ) ( )* 1.2 ( ) Nadciśnienie ciążowe ( ) ( ) 1.0 ( ) Test Mann-Whitney a do porównania każdej grupy z kontrolnymi: * P < 0.05, P < 0.01, P <

27 Tabela 32. Analiza regresji logistycznej dla przewidywania wczesnego i późnego stanu przedrzucawkowego (PE) Niezależna zmienna Wczesny stan przedrzucawkowy Późny stan przedrzucawkowy OR 95% CI P OR 95% CI P Log MoM PlGF < Log MoM PI w tętnicach macicznych E+08 < Log MoM PAPP-A Indeks masy ciała w Kg/m < Przewlekłe nadciśnienie < Czarna rasa < Indyjska lub pakistańska Mieszana rasa Rodziła bez uprzedniego PE < Historia PE w rodzinie Tabela 33. Porównanie działania skriningu pod kątem stanu przedrzucawkowego przez czynniki dotyczące matki, łożyskowy czynnik wzrostu (PlGF), ciążowe białko osoczowe A (PAPP-A), indeks pulsacji w tętnicach macicznych (PI) i przez ich kombinacje Test skriningowy Wczesny stan przedrzucawkowy Obszar pod krzywą ROC Późny stan przedrzucawkowy Historia, średnia (95% CI) ( ) ( ) PlGF, średnia (95% CI) ( ) ( ) PAPP-A, średnia (95% CI) ( ) ( ) PI tętni macicznych, średnia (95% CI) ( ) ( ) Historia z PlGF, średnia (95% CI) ( ) ( ) Historia z PAPP-A, średnia (95% CI) ( ) ( ) Historia z PI w tętnicach macicznych, średnia (95% CI) Historia z PlGF i PI w tętnicach macicznych, średnia (95% CI) Historia z PlGF, PAPP-A i PI w tętnicach macicznych, średnia (95% CI) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) - Stopień detekcji (%) dla ustalonego stopnia wyników fałszywie dodatnich 5% % 5% % Historia, % PlGF, % PAPP-A, % PI w tętnicach macicznych, % Historia z PlGF, % Historia z PAPP-A, % Historia z PI w tętnicach macicznych, % Historia z PlGF i PI w tętnicach macicznych, % Historia z PlGF, PAPP-A i PI w tętnicach macicznych, %

28 Przykład 4. (Przykład porównawczy) Badanie kliniczne roli biochemicznych i biofizycznych markerów matki do wykrywania zaburzeń chromosomalnych płodu Ten przykład pokazuje przydatność różnych kombinacji markerów biochemicznych i biofizycznych, w tym PlGF, PAPP-A, wolnego beta hcg i markerów ultradźwiękowych do określania ryzyka, że ciężarna nosi płód posiadający chromosomalną nieprawidłowość. Wykonano skrining pod kątem chromosomalnych nieprawidłowości przez kombinację wieku matki, grubości przezierności fałdu karkowego (NT) oraz wolnego beta hcg i PAPP-A surowicy matki w tygodniu ciąży. Otrzymano pisemną zgodę od kobiet, które zgodziły się na uczestnictwo w badaniu do identyfikacji potencjalnych markerów komplikacji ciąży, zaakceptowanym przez Komisję Etyki King's College Hospital. Wykonano badania ultradźwękowe przez brzuch by zbadać główne wady płodu i dla pomiaru NT płodu i odległości ciemieniowo-siedzeniowej (CRL). Automatyczne urządzenia, które zapewniają powtarzalne wyniki w przeciągu 30 minut zastosowano do zmierzenia PAPP-A i wolnego beta hcg (DELFIA Xpress system, PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, USA). Cechy demograficzne dotyczące matki, pomiary ultrasonograficzne oraz wyniki biochemiczne zarejestrowano w komputerowej bazie danych. Wyniki kariotypu i szczegóły o wynikach ciąży dodano do bazy danych jak tylko stały się dostępne. Populacja badania kliniczno-kontrolnego obejmowała 175 przypadków z nieprawidłowościami chromosomalnymi płodu i 609 kontrolnych bez komplikacji ciąży skutkujących żywym porodem fenotypowo zdrowych noworodków. Te przypadki i kontrolne dopasowano pod kątem długości przechowywania ich próbek biologicznych. Próbki surowicy 0 µl w duplikacie zastosowano do zmierzenia stężenia PlGF kwantytatywną techniką testu immunoenzymatycznego (ELISA) przy użyciu immunotestu ludzkiego PIGF Quantikine (R&D systems Europe Ltd., Abingdon, UK). Testy wykonano na automatycznym procesorze ELISA (Dade- Behring BEP 00, Liederbach, Germany). Odczyty absorbancji pobrano na czytniku płytek VICTOR3 (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Turku, Finland) i określono stężenia PlGF przy uzyciu oprogramowania MultiCalc (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Turku, Finland). Dolna granica detekcji testu wynosiła 7 pg/ml i niedokładność pomiędzy partiami wynosiła 8.3% przy stężeniu PIGF 48 pg/ml, 5.6% przy 342 pg/ml i 5.1 % przy 722 pg/ml. Próbki, których współczynnik wariacji duplikatów przekraczał % zostały przeanalizowane ponownie. W każdym przypadku i kontrolnym zmierzone wolny beta hcg, PAPP-A i PlGF zostały przekształcone w MoM po regulacji ze względu na wiek ciąży, wiek matki, etniczność, wagę, ilość porodów i sposób poczęcia. Wykonano wykres pudełkowy MoM PIGF przypadków i kontrolnego. Zastosowano test Mann-Whitney a do określenia znaczenia różnic w medianie MoM pomiędzy każdą grupą nieprawidłową chromosomalnie i kontrolnymi. Następnie wykonano analizę regresji dla określenia znaczenia związku pomiędzy MoM PIGF z MoM wolnego beta hcg MoM i MoM PAPP-A. Podobnie, zmierzone NT zostało wyrażone jako różnica od oczekiwanej normalnej średniej dla ciąży (wartość delta) i następnie analizę regresji zastosowano do określenia znaczenia związku pomiędzy MoM PIGF i delta NT. Zmierzona MOM wartość PlGF, PAPP-A, i/lub wolnego beta hcg może być skorygowana ze względu na etniczność przez podzielenie MOM zmierzonej wartości markera biochemicznego (takiego jak PlGF, PAPP-A, lub wolnego beta hcg) przez odpowiednią wartość mediany uzyskaną z grupy ciężarnych kobiet z niedotkniętymi ciążami tej samej etniczności ciężarnej kobiety. Jeśli to pożądane, zmierzona MOM wartość PlGF, PAPP-A, i lub wolnego beta hcg jest korygowana ze względu na palenie przez podzielenie zmierzonej MOM wartości markera biochemicznego (takiego jak PlGF, PAPP-A, lub wolnego beta hcg) przez odpowiednią wartość mediany uzyskaną z grupy kobiet ciężarnych z niedotkniętymi ciążami, które palą. Analizę regresji logistycznej wykonano dla określenia czy znaczne udziały dla wykrycia trisomii 21 były zapewnione przez wiek matki, wolny beta hcg, PAPP-A i PlGF. Działanie skriningu było określone przez krzywe charakterystyczno-operacyjne (ROC). Do analizy wszystkich danych użyto pakiet oprogramowania statystycznego SPSS.0 (SPSS Inc.,Chicago, IL). 27

29 Występowało 90 pojedynczych ciąż z trisomią 21, 28 z trisomią 18, 19 z trisomią 13, 28 z zespołem Turnera i z triploidią. Wszystkie przypadków triploidii posiadało fenotyp triploidii typu digyni cechujący się cienkim lecz normalnie wyglądającym łożyskiem z ciężkim asymetrycznym zahamowaniem wzrostu płodu. Cechy matki przypadków i kontrolnych są porównane w Tabeli 35. W grupie euploidalnej, średni log MoM PlGF wynosił ze standardowym odchyleniem (SD) Występował znaczny związek pomiędzy log MoM PlGF i log Mom PAPP-A (r = 0.264, p < ; Figura 7) i log MoM wolnego beta hcg (r = 0.183, p < ) ale nie z delta NT (p = 0.054). W porównaniu do grupy euploidalnej w ciążach z trisomią 21 mediana wolnego beta hcg oraz NT płodu były znacznie wyższe a PAPP-A i PlGF były znacznie niższe (Figura 8, Tabela 37). W ciążach z trisomią 21, średni log MoM PlGF wynosił -0.0 z SD Występował znaczny związek pomiędzy log MoM PlGF i log MoM PAPP-A (r = 0.246, p = 0.0; Figura 7) ale nie z log MoM wolnego beta hcg (p = 0.652) lub delta NT (p = 0.055). Nie było znacznego związku pomiędzy log MoM PlGF z CRL płodu (p = 0.973). Analiza regresji logistycznej wykazała, że znaczne udziały w wykrywaniu trisomii 21 były dostarczone z wieku matki, wolnego beta hcg, PAPP-A i PlGF (R 2 =0. 662; p < ; Tabela 38). Obszary pod krzywymi operacyjno-charakterystycznymi i stopnie detekcji trisomii 21 dla różnych stopni wyniku fałszywie dodatniego w skriningu przez wiek matki, PAPP-A w surowicy, wolny beta hcg w surowicy, PlGF w surowicy i przez ich kombinacje są podane w Tabeli 38. Ilości mediany PlGF w trisomii 18, trisomii 13, zespole Turner a i triploidii były znacząco niższe niż w grupie euploidalnej (Figura 8, Tabela 37). Średni log MoM PlGF wynosił z SD Nie było znacząego związku ani w każdej indywidualnej chromosomalnej nieprawidłowości ani w połączonej grupie pomiędzy log MoM PlGF i log MoM PAPP-A (p = 0.119), log MoM wolnego beta hcg (p = 0.396) lub delta NT (p = 0.701). Stwierdzenia tych badań pokazują, że po pierwsze, w trisomii 21 jak również innych głównych nieprawidłowościach chromosomalnych stężenie PlGF w surowicy matki w tygodniu ciąży zmalało i po drugie, pomiar PlGF może ulepszyć działanie biochemicznego skriningu w pierwszym trymestrze pod kątem trisomii 21 zapewniony przez wolne beta hcg i PAPP-A surowicy matki. W ciążach euploidalnych PlGF w surowicy rośnie z CRL płodu i stąd wiekem ciąży, spada z wagą matki i jest wyższy u Afroamerykanki niż u kobiety kaukaskiej oraz u osób palących niż niepalących. W efekcie, jak w przypadku PAPP-A, zmierzone stężenie PlGF było regulowane ze względu na te zmienne przed porównaniem wyników z ciążami patologicznymi. Wyniki dla trisomii 21 przeciwne do tych z poprzednich mniejszych badań, które nie regulowały zmierzonych wartości dla zmiennych dotyczących matki i opisywały, że w dotkniętych ciążach ilości były albo zmniejszane albo nie różniły się znacząco od normalnych kontrolnych. Zarówno w ciążach euploidalnych i z trisomią 21 występował znaczący związek pomiędzy ilościami PlGF i PAPP-A w surowicy, co najpewniej odzwierciedla postulowane role tych peptydów w rozwoju łożyska i/lub ich wspólnego pochodzenia z cyto- i syncytiotrofoblastu. Jednakże, w ciążach z trisomią 21 nie było znaczącej zmiany PlGF w surowicy z CRL płodu wskazując, że odchylenie pomiędzy ciążami trisomicznymi i euploidalnymi były takie sam w 11 i 13 tygodniu. W odróżnieniu, odchylenie w PAPP-A w surowicy pomiędzy ciążami trisomicznymi i euploidalnymi było zasadniczo większe w 11 niż w 13 tygodniu. W biochemicznym skriningu w pierwszym trymesterze pod kątem trisomii 21 były znaczące niezależne udziały wieku matki i PlGF, PAPP-A w surowicy i wolnego beta hcg. Oszacowano, że skrining przez kombinację wieku matki i tych trzech markerów biochemicznych zidentyfikowałby około 70% i 80% dotkniętych ciąż na odpowiednich stopniach wyników fałszywie dodatnich 3% i 5%. Ilość PIGF w surowicy w trisomii 18, trisomii 13, zespole Turner a i triploidii jest niższa niż w ciążach z euploidalnymi płodami i niższe niż w tych z trisomią 21. Oczekuje się zatem, że korzystną konsekwencją włączenia PlGF w pierwszotrymestrowy połączony skrining pod kątem trisomii 21 będzie detekcja wysokiej propocji innych głównych aneuploidii. 28

30 Tabela 34. Badania opisujące ilości łożyskowego czynnika wzrostu w surowicy matki w ciążach euploidalnych i z trisomii 21 Autor Ciąża Trisomia 21 Euploidalne kontrolne (tyg.) n Mediana n Mediana wartość p Spencer i in MoM MoM < Debieve i in MoM MoM < Su i in MoM MoM < Lambert-Messerlian i in MoM MoM NS Tabela 35. Cechy matki w przypadkach i kontrolnych euploidalnych Cecha matki Wiek matki w latach, mediana (zakres) Waga matki w Kg, mediana (zakres) Odległość ciemieniowosiedzeniowa w mm, mediana (zakres) Etniczność Kontrolna (n=609) 32.7 ( ) 65.0 (42-143) 64.0 (45-84) Trisomia 21 (n=90) 37.9 ( ) 66.5 (42-9) 65 (47-84) Trisomia 18 (n=28) 37.9 ( ) 71.4 (52-90) 57.7 (47-71) Trisomia 13 (n=19) 34.8 ( ) 72.0 (52-85) 60.1 (51-73)* Zespół Turnera (n=28) 29.9 ( )* 66.9 (39-114) 64.6 (50-79) Triploidia (n=) 31.9 ( ) 65.7 (50-89) 58.4 (45-74)* Biała, n (%) 441 (72.4) 81(90.0) 19 (67.9) (78.9) 26(92.9)* 8(80.0) Czarna, n (%) 99 (16.3) 4(4.4) 4(14.3) 2(.5) 2(7.1) 2(.) Inyjska lub pakistańska, n (%) Chińska lub japońska, n (%) 34(5.6) 3 (3.3) 4(14.3) 1 (5.3) (2.1) 1(1.1) Mieszana, n (%) 22 (3.6) 1(1.1) 1 (3.6) 1(5.3) 0 0 Pierworódka, n (%) 277 (45.5) 28(31.1)* 12(42.9) 4(21.1)* 13 (46.4) 7(70.0) Osoba paląca, n (%) 31(5.1) 6(6.7) 1(3.6) 1(5.3) 2(7.1) 1(.0) Poczęcie Spontaniczne, n (%) 594(97.5) 64(71.1) 12(42.9) (78.9) 18(64.3) 8(80.0)* Leki na owulację, n (%) Zapłodnienie in vitro, n (%) (1.6) 25(27.8) 16(57.1) 2(21.1) (35.7) 2(.0)* 5(0.8) 1(1.1) Porównanie z grupa euploidalną (test chi-kwadratu dla kategorycznych zmiennych i ANOVA dla ciągłych zmiennych): * p < 0.05, p < 0.01, p <

31 Tabela 36. Mediana (zakres międzykwartylowy) MoM łożyskowego czynnik wzrostu (PIGF) z surowicy matki, MoM wolnego beta hcg, MoM ciążowego białka osoczowego A (PAPP-A) oraz przezierność fałdu karkowego (NT) w euploidalnych i chromosomowo nieprawidłowych ciążach Kariotyp MoM PlGF MoM wolnego beta hcg MoM PAPP-A Delta NT w mm Euploidalny ( ) ( ) ( ) 0.1 ( ) Trisomia ( ) ( ) ( ) 2.2 ( ) Trisomia ( ) ( ) ( ) 4.1 ( ) Trisomia ( ) ( ) ( ) 2.9 ( ) Zespół Turner a ( ) ( ) ( ) 8.1 (6.7-.8) Triploidia ( ) ( ) ( ) 0.1 ( ) Porównanie z euploidalnym (Mann-Whitney test) = * p < 0.05, p < 0.01, p < Tabela 37. Analiza regresji logistycznej dla przewidywania trisomii 21 przez kombinację wieku matki, ciążowego białka osoczowego A (PAPP-A), wolnego beta hcg I łożyskowego czynnika wzrostu (PlGF) Niezależna zmienna OR 95% CI p Wiek < Log MoM PAPP-A < Log MoM beta hcg < Log MoM PlGF < Tabela 38. Działanie wieku matki, MoM wolnego beta hcg, ciążowego białka osoczowego A (PAPP-A) i łożyskowego czynnika wzrostu (PlGF) w detekcji trisomii 21 Test skrinigowy Obszary pod krzywą ROC Wiek matki, średnia (95% CI) ( ) PlGF, średnia (95% CI) ( ) Wiek matki i PIGF, średnia (95% CI) ( ) Wolny beta hcg i PAPP-A, średnia (95% CI) ( ) Wiek matki, wolny beta hcg i PAPP-A, średnia (95% CI) ( ) Wolny beta hcg, PAPP-A i PlGF, średnia (95% CI) ( ) Wiek matki, wolny beta hcg, PAPP-A i PlGF, średnia (95% CI) ( ) Stopnie detekcji dla ustalonego stopnia wyniku fałszywie dodatniego (%) 3 5 Wiek matki, % PlGF, % Wiek matki i PlGF, % Wolny beta hcg i PAPP-A, % Wiek matki, wolny beta hcg i PAPP-A, % Wolny beta hcg, PAPP-A i PlGF, % Wiek matki, wolny beta hcg, PAPP-A i PlGF, %

32 Tabela 40. MoM PlGF, PP13, i ADAM12 dla zespołu Down a, innej aneuploidii, oraz niedotkniętych ciąż Wynik PlGF PP13 ADAM12 Zespół Down a (26) 0.56 (0.19)** 0.88 (0.18) 0.85 (0.17) Inna Aneuploidia (22) 0.54 (0.17)*** 0.55 (0.22)*** 0.69 (0.11) * Kontrolne (83) 0.94 (0.24) 0.99 (0.19) 1.00 (0.17) Znaczenie w porównaniu z kontrolnymi: *P<0.05; **P<0.0005; ***P< Tabela 41. Centyle dla markerów Marker <1-szy <5-ty <-ty >90-ty >95-ty >99-ty PlGF Osoba niepaląca Osoba paląca Kaukaska Niekaukaska Tabela 42. Stopnie detekcji przy użyciu różnych kombinacji markerów w ustalonych stopniach wyników fałszywie dodatnich, zakładając, że parametry dla PlGF są takie same w okienku -13 tygodni Kombinacje markerów DR sla ustalonego FPR 1% 3% 5% PAPP-A i wolny beta hcg PlGF, PAPP-A, i wolny beta hcg PAPP-A, wolny beta hcg, i NT PIGF, PAPP-A, wolny beta hcg, i NT Inne przykłady wykonania Podczas gdy wynalazek opisano w połączeniu ze szczegółowym jego opisem i przykładami, powyższy opis jest zamierzony jako ilustrujący i nie ograniczający zakresu wynalazku, który jest zdefiniowany przez zakres załączonych zastrzeżen. Inne aspekty, zalety, i modyfikacje mieszczą się w zakresie poniższych zastrzeżeń. Pełnomocnik: 31

33 ZASTRZEŻENIA PATENTOWE 1. Sposób określania ryzyka stanu przedrzucawkowego u ciężarnej, obejmujący: określanie ilości jednego lub więcej markerów biochemicznych wybranych z łożyskowego czynnika wzrostu (PlGF) i ciążowego białka osoczowego A (PAPP-A) w jednej lub więcej próbkach krwi od osoby; określanie ciśnienia krwi osoby; określanie stosunku prawdopodobieństwa dla jednego lub więcej markerów biochemicznych i ciśnienia krwi osoby; oraz określanie ryzyka stanu przedrzucawkowego przy użyciu stosunku prawdopodobieństwa dla jednego lub więcej markerów biochemicznych oraz ciśnienia krwi osoby. 2. Sposób według zastrz. 1, obejmujący także określanie indeksu pulsacji w tętnicach macicznych (PI) osoby; oraz określania ryzyka stanu przedrzucawkowego przy użyciu PI i stosunku prawdopodobieństwa dla jednego lub więcej markerów biochemicznych i ciśnienia krwi osoby. 3. Sposób według zastrz. 1, w którym jednym lub więcej markerami biochemicznymi jest PlGF. 4. Sposób według zastrz. 1, w którym jednym lub więcej markerami biochemicznymi jest PAPP-A. 5. Sposób według zastrz. 1, w którym jednym lub więcej markerami biochemicznymi są PlGF i PAPP-A. 6. Sposób według zastrz. 1, w którym ciśnienie krwi jest średnim tętniczym ciśnieniem krwi. 7. Sposób według zastrz. 1, obejmujący także określanie ilości białka łożyskowego 13 (PP 13) oraz określanie ryzyka stanu przedrzucawkowego przy użyciu ilości PP 13 i stosunku prawdopodobieństwa dla jednego lub więcej markerów biochemicznych i ciśnienia krwi osoby. 8. Sposób według zastrz. 1, w którym stan przedrzucawkowy jest wczesnym stanem przedrzucawkowym. 9. Sposób według zastrz. 1, w którym wieloczynnikowa analiza Gaussa jest wykonywana dla określenia stosunku prawdopodobieństwa.. Sposób według zastrz. 1, w której określanie ryzyka obejmuje także stosowanie stosunków prawdopodobieństwa dla jednego lub więcej parametrów historii matki wybranych spośród rasy, palenia, ilości porodów, BMI, nadciśnienia, uprzedniego stanu przedrzucawkowego, i matki/siostry z uprzednim stanem przedrzucawkowym. 11. Sposób według zastrz. 1, w którym jedną lub więcej próbek krwi pobrano między 11 i tygodniem ciąży. 12. Sposób według zastrz. 1, w którym sposób określania ryzyka stanu przedrzucawkowego u osoby posiada stopień detekcji co najmniej 65% i stopień wyniku fałszywie dodatniego %; korzystnie stopień detekcji co najmniej 75% i stopień wyniku fałszywie dodatniego %; korzystniej stopień detekcji co najmniej 90% i stopień wyniku fałszywie dodatniego %; i najkorzystniej stopień detekcji co najmniej 95% i stopień wyniku fałszywie dodatniego %. 13. Sposób według zastrz. 1, w którym określenie stosunku prawdopodobieństwa dla ciśnienia krwi obejmuje określenie wartości wielokrotności mediany dla ciśnienia krwi. 14. Urządzenie do określania ryzyka stanu przedrzucawkowego u ciężarnej, zawierające: element do wprowadzania danych przystosowany do wprowadzania ilości jednego lub więcej biochemicznych markerów wybranych z łożyskowego czynnika wzrostu (PlGF) i ciążowego białka osoczowego A (PAPP-A) w jednej lub więcej próbkach krwi od osoby, i ciśnienia krwi osoby; oraz 1

34 element obliczający przystosowany do określania stosunku prawdopodobieństwa dla jednego lub więcej biochemicznych markerów i ciśnienia krwi osoby oraz określania ryzyka rozwoju stanu przedrzucawkowego przy użyciu stosunku prawdopodobieństwa jednego lub więcej markerów biochemicznych i ciśnienia krwi. 5. Urządzenie według zastrz. 14, zawierające także element do wprowadzania danych przystosowany do wprowadzania jednego lub więcej parametrów wybranych z wieku, rasy, palenia, ilości porodów, BMI, nadciśnienia, uprzedniego stanu przedrzucawkowego, i matki/siostry z uprzednim stanem przedrzucawkowym, oraz PI, oraz element obliczający przystosowany do określania ryzyka rozwoju stanu przedrzucawkowego przy użyciu jednego lub więcej parametrów i stosunku prawdopodobieństwa jednego lub więcej markerów biochemicznych i ciśnienia krwi. 16. Urządzenie według zastrz. 14, zawierające także: element do wprowadzania danych przystosowany do wprowadzania ilości PlGF, PAPP-A, i wolnego beta CG w jednej lub więcej próbkach krwi uzyskanych od osoby; oraz element obliczający przystosowany do określania ryzyka chromosomalnej nieprawidłowości u płodu przy użyciu ilości PlGF, PAPP-A, i wolnego beta hcg. Pełnomocnik: 2