SPIS TREŚCI 7. MATERIAŁY POTRZEBNE ALE NIEDOSTARCZONE W ZESTAWIE 12. WALIDACJA WYNIKÓW DLA METODY JAKOŚCIOWEJ I ILOŚCIOWEJ

Transkrypt

1 Monolisa Anti-HBs PLUS 192 testy TEST IMMUNOENZYMATYCZNY DO WYKRYWANIA I OZNACZANIA POZIOMU PRZECIWCIAŁ PRZECIWKO ANTYGENOWI POWIERZCHNIOWEMU WIRUSA ZAPALENIA WĄTROBY TYPU B (anty-hbs) W LUDZKIEJ SUROWICY LUB OSOCZU Kontrola jakości producenta Wszystkie produkty wytwarzane i wprowadzane do obrotu przez Bio-Rad podlegają naszemu systemowi jakości poczynając od momentu otrzymania surowców aŝ do chwili wprowadzenia do obrotu ostatecznego produktu komercyjnego. KaŜda seria odczynników jest poddana kontroli jakości i jest dopuszczona do sprzedaŝy po spełnieniu określonych kryteriów jakości. Dane dotyczące procesu produkcji oraz kontroli jakości kaŝdej serii produkcyjnej są archiwizowane u producenta. 1

2 SPIS TREŚCI 1. PRZEZNACZENIE 2. ZNACZENIE KLINICZNE 3. ZASADA TESTU 4. SKŁAD ZESTAWU 5. ZALECENIA DLA UśYTKOWNIKA 6. BEZPIECZEŃSTWO I HIGIENA PRACY 7. MATERIAŁY POTRZEBNE ALE NIEDOSTARCZONE W ZESTAWIE 8. PRZYGOTOWANIE ODCZYNNIKÓW 9. PRZECHOWYWANIE I TRWAŁOŚĆ 10. PRÓBKI 11. PROCEDURA TESTU 12. WALIDACJA WYNIKÓW DLA METODY JAKOŚCIOWEJ I ILOŚCIOWEJ 13. OBLICZANIE I INTERPRETACJA WYNIKÓW 14. SPEKTROFOTOMETRYCZNA WERYFIKACJA PIPETOWANIA PRÓBEK I ODCZYNNIKA 15. OGRANICZENIA TESTU 16. CHARAKTERYSTYKA TESTU 17. LITERATURA 2

3 1. PRZEZNACZENIE Monolisa Anti-HBs PLUS jest immunoenzymatycznym testem przeznaczonym do jakościowego i ilościowego oznaczania całkowitego poziomu przeciwciał przeciw antygenowi powierzchniowemu wirusa zapalenia wątroby typu B (anty-hbs) w ludzkiej surowicy lub osoczu. 2. ZNACZENIE KLINICZNE Obecność przeciwciał przeciw antygenowi HBs jest waŝnym czynnikiem w diagnozowaniu i rokowaniu zakaŝenia wirusem zapalenia wątroby typu B (HBV). W ostrym zapaleniu wątroby typu B, przeciwciała anty-hbs pojawiają się u prawie 80% pacjentów w ciągu 1 do 3 miesięcy po pojawieniu się antygenu wirusowego zapalenia wątroby typu B (HBsAg). Przeciwciała anty-hbs są wykorzystywane w badaniach epidemiologicznych do oceny naraŝenia w przeszłości na zapalenie wątroby typu B u potencjalnych biorców szczepionek przeciwko zapaleniu wątroby typu B, do monitorowania skuteczności szczepień i do selekcji osocza o wysokim mianie przeciwciał, stosowanego do otrzymywania specyficznych immunoglobulin. Monolisa Anti-HBs PLUS jest bezpośrednim, kanapkowym testem immunoenzymatycznym, który wykorzystuje jako fazę stałą, polistyrenowe studzienki opłaszczone natywnym HBsAg (podtypy ad i ay) i koniugat zawierający antygen HBs znakowany peroksydazą chrzanową (ludzki, podtyp ad i ay). Oznaczanie poziomu przeciwciał anty-hbs zostało ujednolicone przez stosowanie WHO Anti-HBs Reference Preparation wyraŝane w mili-jednostkach międzynarodowych na mililitr (mlu/ml). Poziom wyŝszy lub równy 10 mlu/ml jest ogólnie uznawany jako poszczepienna ochrona przeciwko HBV. Stwierdzenie przynajmniej minimalnego miana anty-hbs 10mlU/ml, czyli progu ochronnego, ma zasadnicze znaczenie w postępowaniu z osobami szczepionymi, które mogą być naraŝone na kontakt z HBsAg dodatnimi płynami i próbkami. 3. ZASADA TESTU W teście, próbki pochodzące od pacjenta oraz kontrole są inkubowane z antygenem opłaszczonym w studzienkach Jeśli przeciwciała anty-hbs są obecne w próbce lub kontroli, zostaną one związane z antygenem. Nadmiar próbki jest usuwany w fazie płukania. Następnie do studzienek dodawany jest koniugat. Koniugat wiąŝe się z kompleksami antygen-przeciwciało obecnymi w studzienkach. Nadmiar koniugatu jest usuwany w fazie płukania, a następnie do studzienek dodaje się roztwór chromogen/substrat i inkubuje. Jeśli próbka zawiera przeciwciała anty-hbs, związany enzym (HRP) powoduje zabarwienie tetrametylobenzydyny (TMB), roztwór chromogenu zmienia barwę na niebieską. Po dodaniu roztworu zatrzymującego reakcję, zabarwienie niebieskie zmienia się na Ŝółte. Jeśli próbka nie zawiera przeciwciał anty-hbs, roztwór chromogen/substrat w dołku pozostaje bezbarwny podczas inkubacji substratu oraz po dodaniu roztworu zatrzymującego. Intensywność zabarwienia, mierzona spektrofotometrycznie, jest proporcjonalna do ilości anty-hbs w próbce. Odczyty wartości absorbancji dla próbek pacjentów porównuje się do wartości granicznej wyznaczonej za pomocą kalibratora 10mIU/ml. 3

4 4. SKŁAD ZESTAWU Wszystkie odczynniki są przeznaczone wyłącznie do uŝytku in vitro. ETYKIETA RODZAJ ODCZYNNIKA ILOŚĆ R1 R2 MIKROPŁYTKA : 12 pasków po 8 dołków, opłaszczonych mieszaniną HBsAg - podtypy ad i ay, pochodzenia ludzkiego BUFOR PŁUCZĄCY (20x) Bufor Tris NaCl, ph 7.4 Konserwant: Proclin 300 (0.04%) 2 mikropłytki 235 ml C0 ANTI-HBS NEGATIVE CONTROL : KONTROLA UJEMNA: Bufor z płodową surowicą cielęcą i stabilizatorami białek Środek konserwujący: ProClin 300 (0,5%) C1 10 miu/ml KALIBRATOR *: Bufor z przeciwciałami anty-hbs pochodzenia ludzkiego, płodowa surowica cielęca, stabilizatory białek i wskaźnik Środek konserwujący : ProClin 300 (0,5%) C2 100 miu/ml KALIBRATOR KONTROLA DODATNIA : Bufor z przeciwciałami anty-hbs pochodzenia ludzkiego, płodowa surowica cielęca, stabilizatory białek i wskaźnik barwny Środek konserwujący : ProClin 300 (0,5%) C3 400 miu/ml KALIBRATOR : Bufor z przeciwciałami anty-hbs pochodzenia ludzkiego, płodowa surowica cielęca, stabilizatory białek i wskaźnik barwny Środek konserwujący : ProClin 300 (0,5%) C miu/ml KALIBRATOR : Bufor z przeciwciałami anty-hbs pochodzenia ludzkiego, płodowa surowica cielęca, stabilizatory białek i wskaźnik barwny Środek konserwujący : ProClin 300 (0,5%) R6 ROZCIEŃCZALNIK PRÓBEK : Bufor z surowicą płodu cielęcego, stabilizatory białek i wskaźnik barwny Środek konserwujący: ProClin 300 (0,1%) R7a SKONCENTROWANY KONIUGAT (11 x) : Bufor z HBsAg (podtyp ad i ay) opłaszczony peroksydazą i stabilizatory białek. Środek konserwujący : ProClin 300 (0,5%) R7b R8 ROZCIEŃCZALNIK KONIUGATU: Bufor z surowicą płodu cielęcego i stabilizatorami białek Środek konserwujący: ProClin 300 (0.1%) BUFOR SUBSTRATU: Roztwór kwasu cytrynowego i octanu sodu, ph 4.0 Zawiera H 2O 2 (0,015 % ) i DMSO (4%) R9 CHROMOGEN : Roztwór zawierający tetrametylobenzydynę (TMB) (2,2 ml) (3 ml) 1fiolka (2,2 ml) (2,2 ml) 1fiolka (2,2 ml) (27 ml) (2,5 ml) (25 ml) (60 ml) (5 ml) R10 ROZTWÓR ZATRZYMUJĄCY REAKCJĘ: 1 N kwas siarkowy (28 ml) * Kontrole kalibrowane są z uŝyciem standardów wewnętrznych, skalibrowanych według 1st IRP WHO Zestaw naleŝy przechowywać w temperaturze 2-8 C. Odczynniki, z wyjątkiem skoncentrowanego koniugatu, przed uŝyciem naleŝy przenieść do temperatury pokojowej (18-30 C). Natychmiast po uŝyciu, odczynniki powinny być przeniesione do temperatury 2-8 C. Niewykorzystane paski/płytki naleŝy włoŝyć do pojemników i zamknąć szczelnie. Nie usuwać środka odwadniającego. Paski / płytki przechowywać w temperaturze 2-8 C. 4

5 5. ZALECENIA DLA UśYTKOWNIKA Uzyskanie prawidłowego wyniku zaleŝy od przestrzegania następujących zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej: Nazwa testu oraz specjalny numer identyfikacyjny danego testu są podane na obramowaniu kaŝdej mikropłytki. Ten sam numer identyfikacyjny znajduje się równieŝ na kaŝdym pasku. Monolisa Anti-HBs PLUS: Specific ID number = 63. Sprawdź specjalny numer identyfikacyjny przed kaŝdym uŝyciem testu, jeŝeli numeru identyfikacyjnego brak lub róŝni się od podanego powyŝej, paska nie naleŝy uŝywać. Nie uŝywać odczynników przeterminowanych. Podczas przeprowadzania testu nie mieszać odczynników pochodzących z róŝnych serii. UWAGA: Podczas danego oznaczenia moŝna uŝywać odczynników z innej ale identycznej serii w przypadku: roztworu płuczącego (R2, oznaczonego: 20x na zielono), buforu do peroksydazy (R8, oznaczonego: TMB buf na niebiesko), chromogenu (R9, oznaczonego: TMB 11x na purpurowo) oraz roztworu zatrzymującego reakcję (R10, oznaczonego: 1N na czerwono) Odczynników tych moŝna uŝywać w niektórych innych testach Bio-Rad. Ponadto, prawidłowo rekonstytuowany roztwór płuczący (R2, oznaczony: 20x na zielono) moŝe być uŝywany wymiennie z dwoma innymi roztworami płuczącymi obecnymi w zestawach testowych firmy Bio-Rad (R2, oznaczony: 10x na niebiesko lub 10x na pomarańczowo);pod warunkiem stosowania jednego rodzaju buforu w serii oznaczeń. Szczegółowych informacji udzieli serwis techniczny. Przed uŝyciem naleŝy odczekać 30 min, aby odczynniki osiągnęły temperaturę pokojową. Odczynniki rekonstytuować ostroŝnie, unikając zanieczyszczenia. Nie wykonywać testu w obecności reaktywnych par związków (zasadowych, kwasów i aldehydów) oraz kurzu mogących wpływać na aktywność enzymatyczną koniugatu. UŜywać dokładnie umytego szkła wypłukanego w wodzie destylowanej lub, co jest wskazane, sprzętu jednorazowego. Nie dopuszczać do wysuszenia mikropłytki pomiędzy etapem płukania a dodawaniem kolejnego odczynnika. Reakcje enzymatyczne są bardzo wraŝliwe na obecność metali lub jony metali. W związku z tym, nie naleŝy dopuszczać do kontaktu roztworów, które zawierają koniugat lub substrat z Ŝadnymi częściami metalowymi. Roztwór wywołujący (bufor substratu + chromogen) musi być róŝowy. Zmiana koloru w kilka minut po rekonstytucji wskazuje, Ŝe odczynnik nie moŝe być uŝyty i naleŝy go zastąpić innym. Roztwór wywołujący moŝna przygotować w czystej, plastikowej rynience jednorazowego uŝytku lub szklanym naczyniu, umytym uprzednio 1N HCl, starannie wypłukanym wodą destylowaną i wysuszonym. Odczynnik naleŝy przechowywać w ciemnym miejscu. Do kaŝdej badanej próbki zmieniać końcówkę pipety. Płukanie studzienek jest istotnym etapem oznaczenia; naleŝy przestrzegać przewidzianych cykli płukania, oraz zwracać uwagę, czy studzienki są prawidłowo napełniane i całkowicie opróŝniane. Niewłaściwe płukanie moŝe być przyczyną błędnych wyników. Nigdy nie uŝywać tego samego pojemnika na koniugat i roztwór substratu. 6. BEZPIECZEŃSTWO I HIGIENA PRACY a) Niektóre odczynniki zawierają ProClin 300 (0.04%, 0.1% lub 0.5%): Xi - draŝniący R43: MoŜe powodować uczulenie w kontakcie ze skórą S28-37: W razie kontaktu ze skórą natychmiast spłukać obficie wodą z mydłem. Stosować odpowiednie ubranie ochronne. b) Monolisa Anti-HBs PLUS zawiera składniki ludzkiej krwi, materiał ten został zbadany i był ujemny pod względem HBsAg, przeciwciał przeciwko wirusowi hepatitis C oraz przeciwciał przeciwko ludzkim wirusom niedoboru odporności (anty-hiv1 i anty-hiv2). PoniewaŜ nie ma metod absolutnie wykluczających obecność czynników zakaźnych, odczynniki oraz badane próbki powinny być traktowane jako materiał potencjalnie zakaźny. c) Materiały mające kontakt z próbkami lub odczynnikami pochodzenia ludzkiego, a takŝe zuŝyty roztwór płuczący, naleŝy traktować jako materiał zakaźny. 5

6 d) Unikać rozlania próbek i odczynników je zawierających. e) Podczas pracy z odczynnikami i próbkami naleŝy nosić rękawice jednorazowego uŝytku, po pracy naleŝy starannie umyć ręce. f) Nie pipetować ustami. g) Próbki, odczynniki zawierające materiał pochodzenia ludzkiego, jak równieŝ skaŝone materiały naleŝy wyrzucić po odkaŝeniu: - albo poprzez moczenie w wybielaczu o stęŝeniu końcowym 5% podchlorynu sodu (1 objętość wybielacza na 10 objętości skaŝonej cieczy lub wody) przez 30 minut, - lub przez autoklawowanie w 121 C przez minimum 2 godz. Autoklawowanie w 121 C przez minimum godzinę jest najlepszą metodą inaktywacji wirusów HIV i HBV. UWAGA: NIE WSTAWIAĆ ROZTWORÓW ZAWIERAJĄCYCH PODCHLORYN SODU DO AUTOKLAWU. Zanieczyszczone powierzchnie czyścić 10% roztworem podchlorynu. Jeśli nastąpiło zanieczyszczenie kwasem, naleŝy go najpierw zneutralizować dwuwęglanem sodu i osuszyć bibułą. Materiał uŝywany do czyszczenia wyrzucić do pojemnika na zanieczyszczone odpady. h) Nigdy nie zapominać o neutralizacji i/lub autoklawowaniu roztworów i innych płynów zawierających materiał biologiczny przed wylaniem do zlewu. i) Karta charakterystyki substancji jest dostępna na Ŝyczenie. 7. MATERIAŁY POTRZEBNE ALE NIEDOSTARCZONE W ZESTAWIE Woda destylowana lub całkowicie dejonizowana. Podchloryn sodu (wybielacz) i dwuwęglan sodu. Pipety ręczne lub półautomatyczne, z moŝliwością regulowania lub bez, pozwalające odmierzać i dozować od 10 µl do 200 µl, 1 ml, 5 ml i 10 ml. Cylindry miarowe: 25 ml, 100 ml i 1000 ml Pojemnik na materiał zakaźny. Łaźnia wodna lub suchy inkubator z termostatem ustawionym na 37 C ± 1 C. Automatyczne, półautomatyczne lub ręczne urządzenie do płukania mikropłytek. Czytnik mikropłytek (wyposaŝony w filtry 490, 450 i 620 nm ). Bibuła. Rękawice jednorazowego uŝytku. Czyste polipropylenowe pojemniki do przygotowywania TMB. 8. PRZYGOTOWANIE ODCZYNNIKÓW Przed uŝyciem, odczynniki zestawu Monolisa Anti-HBs PLUS naleŝy wystawić na 30 min, aby osiągnęły temperaturę pokojową. 1) Odczynniki gotowe do uŝycia Mikropłytka (R1) KaŜda ramka zawierająca 12 pasków zapakowana jest w torebkę z zamknięciem strunowym. Torebkę naleŝy przeciąć noŝyczkami lub skalpelem cm powyŝej zamknięcia. Otworzyć opakowanie, wyjąć potrzebną liczbę pasków. Pozostałe paski umieścić w torebce. Torebkę naleŝy szczelnie zamknąć i przechowywać w temperaturze +2- Rozcieńczalnik próbki (R6) Kontrola ujemna anty-hbs (C0) Kalibrator 10 miu/ml (C1) Kalibrator 100 miu/ml Kontrola dodatnia (C2) Kalibrator 400 miu/ml (C3) Kalibrator 1000 miu/ml (C4) Przed uŝyciem wymieszać odczynniki na vorteksie lub odwracając delikatnie pojemniki. 2) Odczynniki do rekonstytucji Skoncentrowany roztwór do płukania R2 (20x) Rozcieńcz roztwór do płukania R2 w stosunku 1:20 wodą destylowaną. Wymieszaj. Przygotować 800 ml na jedną płytkę zawierającą 12 pasków. Roztwór koniugatu (R7a + R7b) Przenieś rozcieńczalnik koniugatu (R7b) do temperatury pokojowej. Wymieszaj rozcieńczalnik koniugatu (R7b, bezbarwny lub jasnosłomkowy) i skoncentrowany koniugat (R7a, zielony) przed uŝyciem. 6

7 Przygotuj rozcieńczenie 1:11 dla kaŝdego uŝywanego paska (np.: dodaj 100 µl koncentratu koniugatu (R7a) do kaŝdego 1 ml rozcieńczalnika koniugatu (R7b) w czystej, polipropylenowej probówce). Rozcieńczenia wykonaj według poniŝszej tabeli. Wymieszaj dobrze, ale delikatnie aby uniknąć spienienia. Roboczy roztwór koniugatu naleŝy chronić od światła, zarówno w temperaturze pokojowej jak i w temperaturze 2-8 C. Roboczy roztwór koniugatu powinien mieć zabarwienie zielone. W pokojowej temperaturze jest on stabilny przez 8 godz., a przechowywany w temp C przez 2 tygodnie. Roztwór koniugatu moŝna przygotować poprzez odpipetowanie całej zawartości fiolki koncentratu koniugatu (R7a) do rozcieńczalnika koniugatu (R7b). Zawsze mieszaj przez odwracanie roboczy roztwór koniugatu tuŝ przed uŝyciem. Niewykorzystany koncentrat koniugatu (R7a) wstaw natychmiast do lodówki. Aby uniknąć zanieczyszczenia koniugatu, stosuj czyste rękawiczki i nie dotykaj końcówek pipet. Przygotowywanie roztworu koniugatu w przeliczeniu na paski Ilość uŝywanych pasków Objętość skoncentrowanego koniugatu R7a (µl) * 24** Objętość rozcieńczalnika koniugatu R7b (ml) * 1 Cała płytka ** 2 Całe płytki Roboczy roztwór substratu (R8 + R9) Przenieś chromogen (R9) i bufor substratu (R8) do temperatury pokojowej. Chromogen i bufor substratu (R8) wymieszaj przed uŝyciem. Rozcieńcz chromogen (R9) buforem substratu (R8) w stosunku 1:11 dla kaŝdego uŝywanego paska (np.: dodaj 1 ml odczynnika R9 do 10 ml odczynnika R8). Homogenizuj. Rozcieńczony roztwór substratu wymieszaj delikatnie przed uŝyciem. Odczekaj 5 min. Przed uŝyciem. Rozcieńczony roztwór substratu powinien być zuŝyty w ciągu 8 godz. po przygotowaniu i przechowywany w ciemnym miejscu w temperaturze pokojowej. Chromogen (R9) powinien mieć zabarwienie róŝowe. Inne zabarwienie wskazuje na zanieczyszczenie odczynnika: w takiej sytuacji chromogen nie moŝe być uŝywany. Przygotuj tylko taką ilość odczynników, która będzie zuŝyta w ciągu 6 godz., a objętość rozcieńczonych odczynników wystarczająca dla całego testu. Rozcieńczenia wykonaj według poniŝszej tabeli. Przygotowanie roztworu rozcieńczonego substratu w przeliczeniu paski. Ilość uŝywanych pasków * 24** Objętość chromogenu R9 (µl) Objętość buforu substratu R8 (µl) * 1 Cała płytka ** 2 Całe płytki PRZECHOWYWANIE I TRWAŁOŚĆ Zestaw przechowywać w temperaturze +2-8 C. KaŜdy z odczynników, przechowywany w tej temperaturze, moŝe być wykorzystywany do daty waŝności podanej na opakowaniu (z wyjątkiem specjalnych zaleceń). R1: Po otwarciu torby, paski mikropłytki przechowywane w szczelnie zamkniętej torbie, w temperaturze +2-8 C, mogą być wykorzystywane przez miesiąc. R2: Rozcieńczony bufor płuczący moŝe być przechowywany w temperaturze C przez dwa tygodnie. StęŜony bufor płuczący (R2) moŝe być przechowywany w temperaturze C. R7a +R7b : Roboczy roztwór koniugatu naleŝy chronić od światła, zarówno w temperaturze pokojowej jak i w temperaturze 2-8 C. Roztwór koniugatu w pokojowej temperaturze jest stabilny przez 8 godz. ( C), a przechowywany w temp. 2-8 C przez 2 tygodnie. R8+R9: Po rekonstytucji, odczynnik przechowywany w ciemności, w temperaturze pokojowej ( C) moŝe być uŝywany przez 6 godzin 7

8 10. PRÓBKI Pobrać krew zgodnie ze rutynową procedurą. Oznaczenie powinno być wykonywane na próbkach surowicy lub osocza. Tylko następujące próbki zostały przetestowane: surowica pobrana do standardowej probówki zawierającej Ŝel separujący, osocze pobrane na EDTA lub heparynę. W przypadku pobierania osocza na cytrynian lub ACD, wyniki w porównaniu z surowicą są niŝsze o 20%. Próbki zawierające agregaty naleŝy odwirować przed badaniem. Agregaty fibryny lub inne cząstki mogą prowadzić do uzyskanie wyników fałszywie dodatnich. Próbki przechowywać w +2-8 C jeŝeli badanie będzie przeprowadzane w ciągu 7 dni, lub zamroŝone w -20 C. Unikać wielokrotnego zamraŝania/rozmraŝania. Unikać powtarzającego się zamraŝania/rozmraŝania próbek. Do transportu próbki naleŝy zapakować zgodnie z przepisami określającymi zasady przewoŝenia materiałów zakaźnych, preferencyjnie zamrozić. UWAGA: Na oznaczenie nie wpływa do 90 g/l albuminy i 100 mg/l bilirubiny, poziom lipemii do zawartości równowaŝnika odpowiadającego 36 g/l trójglicerydów i hemoliza do 2,55 g/l hemoglobiny. Nie uŝywać próbek po obróbce w 56 C przez 30 minut. 11. PROCEDURA TESTU Przestrzegaj ściśle protokołu. Stosuj surowice kontrolne dodatnie i ujemne dla kaŝdej serii oznaczeń w celu walidacji jakości testu. Stosuj się do zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej. Metody 1. Przygotuj rozkład próbek i plan identyfikacji. 2. Przed wykonaniem oznaczenia, przenieś wszystkie odczynniki do temperatury pokojowej. 3. Przygotuj roztwór koniugatu (R7a + R7b), rozcieńczony roztwór substratu (R8 + R9) i rozcieńczony roztwór do płukania (rozcieńczony R2). 4. Wyjmij ramkę i paski (R1) z opakowania. Niewykorzystane paski zastąp oznakowanymi ślepymi paskami. 5. Rozcieńcz próbki, kalibratory i próby kontrolne w stosunku 3:4 rozcieńczalnikiem próbek R6, zgodnie z jedną z poniŝszych procedur: a. Próbki, kalibratory i kontrole mogą być rozcieńczane w dołkach (dodaj 25 µl rozcieńczalnika próbek R6 do kaŝdego dołka, a następnie w ciągu 15 min. 75 µl próbki lub kontroli, wymieszaj delikatnie, zasysając minimum 2 razy, unikając spienienia). b. Próbki, kalibratory i kontrole mogą być rozcieńczone w stosunku 3:4 rozcieńczalnikiem próbek R6 przed dodaniem ich do dołków (np. rozcieńcz 150 µl próbki w 50 µl rozcieńczalnika próbek R6, wymieszaj delikatnie unikając spienienia, a następnie przenieś 100 µl do dołka. UWAGA : Po dodaniu próbki, rozcieńczalnik zmieni barwę z purpurowej na niebieską. MoŜliwe jest potwierdzenie obecności próbek w dołkach poprzez spektrofotometryczny odczyt przy długości fali 620 nm (Patrz rozdział 14: SPEKTROFOTOMETRYCZNA WERYFIKACJA PIPETOWANIA PRÓBEK I ODCZYNNIKA). 6. Dodawaj bezpośrednio, bez wcześniejszego płukania płytki, w zaleŝności od wybranej metody: Oznaczenie jakościowe Anty-HBs kontrola ujemna (C0) do dołka A1, Kalibrator 10 miu/ml (C1) do dołka B1, C1 i D1, Kalibrator 100 miu/ml Kontrola dodatnia (C2) do dołka E1, Próbki do dołków F1, G1, itd. Oznaczenie ilościowe Anty-HBs kontrola ujemna (C0) do dołka A1, Kalibrator 10 miu/ml (C1) do dołków B1 i C1, Kalibrator 100 miu/ml Kontrola dodatnia (C2) do dołka D1, Kalibrator 400 miu/ml (C3) do dołka E1, Kalibrator 1000 miu/ml (C4) do dołka F1, Próbki do dołków G1, H1, itd. ZaleŜnie od wykorzystywanego systemu, moŝliwe jest modyfikowanie pozycji kontroli i rozkładu nanoszonych odczynników. 7. O ile to moŝliwe, zaklej szczelnie płytkę folią adhezyjną. 8. Inkubuj płytki przez 60 ± 5 min. w temp. 37 ± 2 C. 8

9 9. Usuń folię adhezyjną. Zaaspiruj zawartość dołków do pojemnika na odpady ciekłe i dodaj natychmiast min. 0,375 ml roztworu płuczącego do kaŝdego dołka. Namaczaj studzienki cyklami płukania przez 30 do 60 sek. Usuń zawartość dołków ponownie. Powtórz płukanie 4 razy (minimum 5 płukań). Pozostająca objętość płynu musi być mniejsza niŝ 10 µl (w razie potrzeby osuszyć odwróconą mikropłytkę na bibule). 10. Podczas płukania automatycznego stosuj tę samą procedurę. 11. Dodaj szybko 100 µl roztworu koniugatu (R7a + R7b) do kaŝdego dołka. O ile to moŝliwe, przykryj szczelnie dołki nową folią i inkubuj 60 ± 5 min. w temp. 37 C ± 1 C. UWAGA: Koniugat ma kolor zielony. MoŜliwe jest potwierdzenie obecności koniugatu w dołkach poprzez spektrofotometryczny odczyt przy długości fali 620 nm (Patrz rozdział 14 : SPEKTROFOTOMETRYCZNA WERYFIKACJA PIPETOWANIA PRÓBEK I ODCZYNNIKA). 12. Usuń folię adhezyjną. Zaaspiruj zawartość dołków do pojemnika na odpady ciekłe i dodaj natychmiast min. 0,375 ml roztworu płuczącego do kaŝdego dołka. Namaczaj studzienki cyklami płukania przez 30 do 60 sek. Usuń zawartość dołków ponownie. Powtórz płukanie 4 razy (minimum 5 płukań). Pozostająca objętość płynu musi być mniejsza niŝ 10 µl (w razie potrzeby osuszyć odwróconą mikropłytkę na bibule). 13. Podczas płukania automatycznego stosuj tę samą procedurę. 14. Dodaj szybko 100 µl rozcieńczonego roztworu substratu (R8 + R9) do kaŝdego dołka. Pozostaw na 30 ± 5 min. w temperaturze pokojowej (18-30 C) w ciemności. Nie uŝywaj folii adhezyjnej podczas tej inkubacji. UWAGA: Rozcieńczony roztwór substratu ma kolor róŝowy. MoŜliwe jest potwierdzenie obecności koniugatu w dołkach poprzez spektrofotometryczny odczyt przy długości fali 490 nm (Patrz rozdział 14: SPEKTROFOTOMETRYCZNA WERYFIKACJA PIPETOWANIA PRÓBKI I ODCZYNNIKA). 15. Dodaj 100µl roztworu zatrzymującego (R10) stosując tę samą kolejność i tempo dystrybucji jak dla rozcieńczonego roztworu substratu. Homogenizuj mieszaninę reakcyjną. 16. OstroŜnie wytrzyj spód płytki. Odczytywać gęstość optyczną przy długości fali 450/ nm oraz 405/ nm, stosując czytnik mikropłytek, co najmniej 4 minuty ale nie dłuŝej niŝ 30 minut po zatrzymaniu reakcji. Przed zapisaniem wyników, sprawdź zgodność pomiędzy odczytem, mikropłytką, rozkładem próbek i planem identyfikacyjnym. 12. WALIDACJA WYNIKÓW DLA METODY JAKOŚCIOWEJ I ILOŚCIOWEJ Średnia absorbancja Kalibratora 10 miu/ml (C1) jest wartością cut-off dla testu. Dla kontroli ujemnej Anti-HBs (C0) : Zmierzona wartość absorbancji musi być większa niŝ i mniejsza lub równa (0,000 < OD C0 0,070). Dla kontroli dodatniej (C2) : Zmierzona wartość absorbancji musi być większa lub równa 0,400 (OD C2 0,400). Jeśli dla kontroli ujemnej (C0) i kontroli dodatniej (C2), któryś z powyŝszych warunków dla metody jakościowej i ilościowej nie jest spełniony, test jest niewaŝny i musi być powtórzony. Dla Kalibratora 10 miu/ml (C1) : Zmierzona wartość absorbancji musi być większa lub równa 0,050 i mniejsza lub równa 0,200 (0,050 OD C1 0,200). KaŜda zmierzona wartość absorbancji musi być większa lub równa 1,5 OD wartości absorbancji dla negatywnej kontroli (C0) : OD C1 (1,5 x OD C0). W przypadku metody jakościowej : Jeśli jedna z wartości dla Kalibratora 10 miu/ml nie mieści się w podanym zakresie (zmierzona wartość absorbancji musi być większa lub równa 0,050 i mniejsza lub równa 0,200), wówczas średnia absorbancja powinna być obliczona z pozostałych wartości absorbancji. Test jest waŝny. Jeśli kilka zmierzonych wartości OD C1 nie mieści się w podanym zakresie, test jest niewaŝny i musi być powtórzony. W przypadku metody ilościowej : Jeśli jedna z dwóch zmierzonych wartości OD C1 nie mieści się w podanym zakresie (zmierzona wartość absorbancji musi być większa lub równa 0,050 i mniejsza lub równa 0,200), wówczas test jest niewaŝny i musi być powtórzony. 9

10 13. OBLICZANIE I INTERPRETACJA WYNIKÓW Dla kaŝdej próbki, porównanie zmierzonej wartości absorbancji z obliczoną wartością cut-off pozwala stwierdzić obecność lub brak przeciwciał anty-hbs. 1. Metoda jakościowa : Obliczyć wartość średnią zmierzonej absorbancji dla Kalibratora 10 miu/ml (C1). Przykład : Kalibrator 10 miu/ml (C1) B1 0,078 C1 0,079 D1 0,089 Średnia OD C1 = 0,246 / 3 = 0,082 Całkowita = 0,246 Jeśli jedna z wartości zmierzonej absorbancji nie mieści się w podanym zakresie, (zmierzona wartość absorbancji musi być większa lub równa 0,050 i mniejsza lub równa 0,200), wówczas średnia absorbancja powinna być obliczona z pozostałych dwóch wartości absorbancji. Obliczanie wartości cut-off (CO) Wartością graniczną dla tego testu jest średnia absorbancja 10 miu/ml Kalibratora (C1) : CO = Średnia OD C1 Interpretacja wyników Próbki o wartościach absorbancji większych lub równych wartości cut-off są uwaŝane za reaktywne. Próbki o wartościach absorbancji mniejszych od wartości cut-off są uwaŝane za niereaktywne. Próbki o wartościach większych niŝ górna granica liniowości powinny być raportowane jako reaktywne. UWAGA: Z powodu róŝnorodności przeciwciał i antygenów stosowanych w kaŝdym teście, wyniki mogą być róŝne dla poszczególnych testów. Strategie szczepień : zalecenia zróŝnicowane w zaleŝności od regionu i kraju. W przypadku zmiany metod analitycznych w trakcie oceny skuteczności szczepień, w okresie przejściowym, poziom przeciwciał anty-hbs musi być oznaczany obiema metodami. 2. Metoda ilościowa : Do oznaczenia poziomu przeciwciał anty-hbs w próbkach surowicy i osocza, naleŝy uŝyć następującego kalibratora anty-hbs : C0 (0 miu/ml), C1 (10 miu/ml), C2 (100 miu/ml), C3 (400 miu/ml) i C4 (1000 miu/ml). Kalibratory dodaje się bezpośrednio do kaŝdego dołka, bez wcześniejszego płukania i w kolejności opisanej w procedurze testu (Patrz rozdział 11 : PROCEDURA TESTU). Odczytaj gęstość optyczną przy 450/ nm stosując czytnik mikropłytek (A 450). Dla próbek o wartościach absorbancji (A 450) większych lub równych zmierzonej wartości absorbancji C3 : A 450 OD C3), odczytaj gęstość optyczną przy 405/ nm. A 450 dla kalibratorów C0, C1, C2 i C3 przedstawia się na wykresie względem ich przypisanego stęŝenia za pomocą regresji wielomianowej (kwadratowej). ZauwaŜ, Ŝe wartość A 450 dla Kalibratora 1000 miu/ml (C4) nie moŝe być umieszczona na tym wykresie, gdyŝ powinna znajdować się ona poza zakresem odczytu spektrofotometru, a więc istnieje konieczność zrobienia drugiego wykresu. Próbki o zmierzonych wartościach absorbancji niŝszych niŝ OD C3 interpretuje się za pomocą wykresu otrzymanego dla A 450 czterech kalibratorów. A 405 dla kalibratorów C3 (400 miu/ml) i C4 (1000 miu/ml) przedstawia się na wykresie względem ich przypisanego stęŝenia metodą punkt do punktu. Przez te punkty przeprowadza się linię prostą. Następnie, wartości stęŝeń anty-hbs (miu/ml) dla kaŝdej próbki odczytuje się na przecięciu odpowiednich wartości absorbancji. Krzywej A 405 uŝywa się do oznaczania stęŝeń w próbkach surowicy i osocza, których stęŝenia są wyŝsze niŝ 400 miu/ml i niŝsze lub równe 1000 miu/ml. Próbki o stęŝeniach anty-hbs wyŝszych niŝ 1000 miu/ml moŝna rozcieńczyć rozcieńczonym roztworem do płukania (rozcieńczony R2) i ponownie oznaczyć. 10

11 14. SPEKTROFOTOMETRYCZNA WERYFIKACJA PIPETOWANIA PRÓBKI I ODCZYNNIKA (NIEOBOWIĄZKOWE) WERYFIKACJA PIPETOWANIA ROZCIEŃCZALNIKA PRÓBEK (R6) I PRÓBKI Po dodaniu próbki, rozcieńczalnik próbek R6 zmienia barwę z purpurowej na niebieską. MoŜliwe jest potwierdzenie obecności próbki i rozcieńczalnika próbek (R6) w dołkach poprzez spektrofotometryczny odczyt przy długości fali 620 nm: wartość OD dla kaŝdego dołka zawierającego próbkę lub rozcieńczoną rozcieńczalnikiem próbek kontrolę musi być większa lub równa 0,150 (wartość niŝsza wskazuje na złe odpipetowanie próbki lub kontroli). WERYFIKACJA PIPETOWANIA ROZTWORU KONIUGATU (R7a + R7b) Roztwór koniugatu (R7a + R7b) ma kolor zielony. MoŜliwe jest potwierdzenie obecności roztworu koniugatu w dołku poprzez spektrofotometryczny odczyt przy długości fali 620 nm: wartość OD dla kaŝdego dołka musi być większa lub równa 0,070 (wartość niŝsza wskazuje na złe odpipetowanie roztworu koniugatu). WERYFIKACJA PIPETOWANIA ROZCIEŃCZONEGO ROZTWORU SUBSTRATU (R8+ R9) Rozcieńczony roztwór substratu (R8 + R9) ma kolor róŝowy. MoŜliwe jest potwierdzenie obecności róŝowego roztworu wywołującego w dołku poprzez automatyczny odczyt przy długości fali 490 nm: dołek z roztworem wywołującym musi mieć wartość gęstości optycznej większą niŝ 0,100 (niŝsza wartość OD wskazuje na złe odpipetowanie roztworu wywołującego). Po dodaniu rozcieńczonego roztworu substratu następuje wyraźna zmiana bezbarwnego, pustego dołka na kolor róŝowy. 15. OGRANICZENIA TESTU 1. Podczas badania i interpretacji wyników naleŝy przestrzegać procedury analizowania próbek surowicy i osocza na obecność przeciwciał przeciw HBs. UŜytkownik tego zestawu powinien przeczytać dokładnie załączone instrukcje przed przystąpieniem do testu. W szczególności musi być dokładnie przestrzegana procedura odnośnie pipetowania próbki i odczynnika, płukania płytki i czasów inkubacji. 2. Dodanie próbki lub odczynnika niezgodnie z procedurą moŝe prowadzić do wyników fałszywie ujemnych. W przypadku podejrzenia błędu związanego z procedurą, zaleca się powtórzenie testu. 3. Czynniki, które mogą wpływać na waŝność wyników to nieprawidłowe dodanie próbki do dołka, niedokładne wypłukanie mikropłytki, złe czasy i temperatury inkubacji, dodanie złych odczynników do dołków, obecność metali lub wybielacza w dołkach. 4. Z powodu zmiennej reakcji immunologicznej u róŝnych pacjentów, jak równieŝ po infekcji HBV w wyniku szczepienia lub terapeutycznej iniekcji immunoglobuliny, zaleca się ostroŝność podczas interpretacji wyników w zakresie niskich wartości. 16. CHARAKTERYSTYKA TESTU Wyniki własności analitycznych zamieszczone poniŝej otrzymano podczas ewaluacji testu Monolisa Anti-HBs PLUS. Wyniki otrzymane w laboratorium mogą róŝnić się od podanych poniŝej. 1. Powtarzalność wewnątrz-testowa: pięć próbek dodatnich i jedną próbkę ujemną badano 10 razy w tryplikacie w tej samej serii oznaczenia. Próbka Średnia stosunku SD CV% Anti-HBs ujemna 0,023 0,003 13,6 Anti-HBs dodatnia ~20 mlu/ml 0,143 0,005 3,4 Anti-HBs dodatnia ~50 mlu/ml 0,358 0,012 3,3 Anti-HBs dodatnia ~100 mlu/ml 0,715 0,019 2,6 Anti-HBs dodatnia ~150 mlu/ml 1,231 0,037 3,0 Anti-HBs dodatnia ~300 mlu/ml 1,982 0,048 2,4 2. Powtarzalność między-testowa: 3 próbki dodatnie i jedną próbkę ujemną badano przez 20 dni, 2 razy dziennie, w duplikacie, zgodnie z procedurą EP5 NCCLS (National Commitee for Clinical Laboratory Standards) 11

12 Próbka Średnia stosunku SD CV% Anti-HBs ujemna 0,023 0,004 15,5 Anti-HBs dodatnia ~20 mlu/ml 0,146 0,008 5,5 Anti-HBs dodatnia ~150 mlu/ml 1,284 0,060 4,9 Anti-HBs dodatnia ~300 mlu/ml 2,015 0,067 3,6 3. Dokładność: Wyniki ilościowe podano w miu/ml i skalibrowano z uŝyciem standardów wewnętrznych, według 1st IRP WHO Badania korelacji przeprowadzono testując próbki o stęŝeniach 0, 10, 100, 400 i 1000 miu/ml otrzymane ze standardu WHO względem kalibratorów z zestawu. Współczynnik korelacji i nachylenie otrzymanej krzywej korelacji są następujące: R2 = 0,99 i a = 0, Czułość analityczna była niŝsza niŝ 2 miu/ml zgodnie z procedurą NCCLS. UWAGA: Czułość analityczna odpowiada niŝszej granicy detekcji, która odpowiada niŝszemu mierzalnemu stęŝeniu róŝnemu od zera, obliczonemu ze średnich i odchyleń standardowych dla punktów 0 i 10 miu/ml. 5. Liniowość metody: 5 próbek silnie dodatnich w kierunku anty-hbs (924 miu/ml, 330 miu/ml, 326 miu/ml, 544 miu/ml i 857 miu/ml) rozcieńczono dwukrotnie do 1/32 lub 1/64. Zgodność wyników zawiera się między 92 % i 116%. 6. H 7. Hook effect Przebadano 4 nierozcieńczone próbki o wysokim stęŝeniu przeciwciał anty-hbs ( miu/ml, miu/ml, miu/ml i miu/ml). StęŜenie miu/ml miu/ml miu/ml miu/ml OD 450 Odczyt przy 405 nm Odczyt przy 405 nm Odczyt przy 405 nm Odczyt przy 405 nm OD 405 1,342 1,596 1,629 1,310 Wynik >1000 miu/ml >1000 miu/ml >1000 miu/ml >1000 miu/ml Podczas oceny wyników nie stwierdzono Hook effect. 12

13 8. Swoistość a) Za pomocą testu Monolisa Anti-HBs PLUS oznaczono 179 próbek pobranych od pacjentów wykazujących róŝne patologie (hepatitis A, hepatitis C, HIV 1, HIV 2, HTLV, HSV, EBV, róŝyczka, toksoplazmoza, mieloma (IgG, IgM), RF, ANA, HAMA, Ŝółtaczka i wielokrotne transfuzje). 21 próbek dało wynik dodatni w teście Monolisa Anti-HBs PLUS i dwóch innych testach ze znakiem CE na detekcję anty-hbs. 1 próbka ANA pozytywna dała wynik dodatni na anty-hbs Ab tylko w teście Monolisa Anti-HBs PLUS. 2 inne próbki (1 HIV 1 i 1 HIV 2) dały wynik pozytywny na anty-hbs Ab w teście Monolisa Anti-HBs PLUS oraz innym, konkurencyjnym teście. b) Swoistość testu Monolisa Anti-HBs PLUS została określona przez analizę próbek dawców krwi i losowo wybranych pacjentów klinicznych. Miejsce 1 Dawcy & hospitalizowani Miejsce 2 Dawcy Miejsce 3 Hospitalizowani Razem Próbki Dodatnie % Swoistości 99,4% 100% 98,7% 99,4% 9. Czułość Swoistość testu wynosi 99,4% (98,8% do 99,8% przy 95% przedziale ufności). 654 próbki od róŝnych populacji zaszczepionych lub naturalnie zainfekowanych pacjentów przebadano za pomocą testu Monolisa Anti-HBs PLUS i innego testu anty-hbs. Próbki o niezgodnych wynikach przebadano ponownie za pomocą trzeciego testu ze znakiem CE. Zgodność Monolisa Profil pacjenta N Test 1 ze znakiem CE Test 2 ze znakiem CE* Zaszczepieni ,8% 99,1% Z przebytym Hepatitis B 71 95,8% 100% Chroniczne Hepatitis B % Nie badano Pacjenci hospitalizowani ,6% Nie badano Razem ,5% 99,5% Wśród próbek 654 badanych pacjentów, 617 wykazało wynik dodatni w kierunku anty-hbs a 37 ujemny (pacjenci z chronicznym hepatitis) w teście 1. Dla tych 617 pacjentów zgodność wynosi 98,4% (97% do 99,2% przy 95% przedziale ufności). *Czułość testu Monolisa Anti-HBs PLUS po analizie niezgodnych próbek za pomocą testu 2 wynosi (98,1% do 99,7% przy 95% przedziale ufności).

14 17 - LITERATURA 1. Lai CL, Ratziu V, Yuen M-F, Poynard T: Viral hepatitis B. Lancet 362 : , Maddrey WC: Hepatitis B : an important public health issue. J Med Virol 61: , Delmonico FL, Snydman DR: Organ donor screening for infectious diseases. Transplantation 65 : , Centers for Disease Control : Recommendations for preventing transmission of infections among chronic hemodialysis patients. MMWR 50 (No. RR-5): 1-43, Tiollais P, Pourcel C, Dejean A : The hepatitis B virus. Nature 317: , Lee WM: Hepatitis B infection. New Engl J Med 337 : , Mushahwar IK, Dienstag JL, Polesky HF, McGrath LC, Decker RH, Overby LR Interpretation of various serological profiles of hepatitis B virus infection. Am J Clin Pathol 76: , McMahon BJ, Alward WLM, Hall DB, et al.: Acute hepatitis B infection: relation of age to the clinical expression of disease and subsequent development of the carrier state. J Infect Dis 151: , Hoofnagle JH, Di Bisceglie AM: Serologic diagnosis of acute and chronic viral hepatitis. Semin Liver Dis 11: 73-83, Centers for Disease Control: Hepatitis B vaccination United States, MMWR 51(No. 25): , Yu AS, Cheung RC, and Keefe EB : Hepatitis B vaccines. Clin Liver Dis 8: , Bos ES, van der Doelen AA, van Rooy N, Schuurs AHWM : 3,3',5,5' - tetramethylbenzidine as an ames test negative chromogen for horseradish peroxidase in enzyme immunoassay. J Immunoassay 2 : , Garner RC, Walpole AL, Rose FL : Testing of some benzidine analogues for microsomal activation to bacterial mutagens. Cancer Letters 1 : 39-42, Bond WW, Favero MS, Petersen NJ, Ebert JW : Inactivation of hepatitis B virus by intermediateto-high-level disinfectant chemicals. J Clin Microbiol 18: , U.S. Environmental Protection Agency, Office of Solid Waste : EPA Guide for Infectious Waste Management, Washington D.C., (USG PO 530-SW ). 16.Sehulster LM, Hollinger FB, Dreesman GR, Melnick JL : Immunological and biophysical alteration of hepatitis B virus antigens by sodium hypochlorite disinfection. Appl and Envi Microbiol 42 : ,

15 IVD (GB) - CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices) (FR) - Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnostic in vitro) (ES) - Marcado CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro) (IT) - Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro) (DE) - CE Konformitätskennzeichnung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika) (PT) - Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnóstico in vitro) (SE) - CE-märkning (Europeiskt direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter för in vitro-diagnostik) (DK) - CE-mærkningen (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik) (GR) - CE ( 98/79/CE in vitro ) (PL) - CE oznaczenie (Dyrektywa unijna 98/79/CE dotycząca produktów medycznych do badań in vitro) (LT) - CE ženklas (Europos sąjungos direktyva 98/79/CE dėl in vitro diagnostikos medicinos prietaisų) (HU) - CE jelzés (98/79/CE Európai Irányelv az in vitro orvosi diagnosztikai eszközökről) (EE) - CE märgistus (Euroopa direktiiv 98/79/CE in vitro diagnostikameditsiiniseadmete kohta) (SK) - CE označenie o zhode (Európska direktíva 98/79/CE pre in vitro diagnostické zdravotnícke postupy) (CZ) - CE značka (Evropská direktiva 98/79/CE o diagnostických zdravotnických prostředcích in vitro) (NO) - CE-merking (EU-direktiv 98/79/CE om medisinsk utstyr til in vitro-diagnostikk) (RO) - Marca CE (Directiva europeana 98/79/CE pentru dispozitive medicale de diagnostic in vitro) (BG) - СЕ маркировка (Европейска директива 98/79/CE за ин витро диагностичните медицински изделия) (GB) - For in vitro diagnostic use (GB) - Catalogue number (FR) - Pour diagnostic in vitro (FR) - Référence catalogue (ES) - Para diagnóstico in vitro (ES) - Número de catálogo (IT) - Per uso diagnostico in vitro (IT) - Numero di catalogo (DE) - In-vitro-Diagnostikum (DE) - Bestellnummer (PT) - Para uso em diagnóstico in vitro (PT) - Número de catálogo (SE) - In vitro-diagnostik (SE) - Katalognummer (DK) - In vitro diagnose (DK) - Katalognummer (GR) - in vitro (GR) - (PL) - Do stosowania in vitro (PL) - Numer katalogu (LT) - in vitro diagnostikai (LT) - Katalogo numeris (HU) - Csak in vitro diagnosztikai alkalmazásra (HU) - Cikkszám (EE) - In vitro diagnostiliseks kasutamiseks (EE) - Katalooginumber (SK) - Na diagnostiku in vitro (SK) - Katalógové číslo (CZ) - Pro diagnostiku in vitro (CZ) - Katalogové číslo (NO) - Til in vitro-diagnostikk (NO) - Katalognummer (RO) - Pentru diagnostic in vitro (RO) - Număr de catalog (BG) - За ин витро диагностика (BG) - Каталожен номер (GB) - Manufacturer (GB) - Authorised Representative (FR) - Fabricant (FR) - Représentant agréé (ES) - Fabricante (ES) - Representante autorizado (IT) - Produttore (IT) - Distributore autorizzato (DE) - Hersteller (DE) - Bevollmächtigter (PT) - Fabricante (PT) - Representante Autorizado (SE) - Tillverkad av (SE) - Auktoriserad representant (DK) - Fremstillet af (DK) - Autoriseret repræsentant (GR) - (GR) - (PL) - Producent (PL) - Upoważniony Przedstawiciel (LT) - Gamintojas (LT) - Įgaliotasis atstovas (HU) - Gyártó (HU) - Meghatalmazott Képviselő (EE) - Tootja (EE) - Volitatud esindaja (SK) - Výrobca (SK) - Autorizovaný zástupca (CZ) - Výrobce (CZ) - Zplnomocněný zástupce (NO) - Produsent (NO) - Autorisert representant (RO) - Producător (RO) - Reprezentant autorizat (BG) - Производител (BG) - Упълномощен представител (GB) - Batch code (GB) - Expiry date YYYY/MM/DD (FR) - Code du lot (FR) - Date de peremption AAAA/MM/JJ (ES) - Código de lote (ES) - Estable hasta AAAA/MM/DD (IT) - Codice del lotto (IT) - Da utilizzare prima del AAAA/MM/GG (DE) - Chargen-Bezeichnung (DE) - Verwendbar bis JJJJ/MM/TT (PT) - Código do lote (PT) - Data de expiração AAAA/MM/DD (SE) - Batchnr (SE) - Utgångsdatum ÅÅÅÅ/MM/DD (DK) - Batchkoden (DK) - Anvendes før ÅÅÅÅ/MM/DD (GR) - (GR) - YYYY/MM/DD (PL) - Numer serii (PL) - Data ważności YYYY/MM/DD (LT) - Serijos numeris (LT) - Galioja iki YYYY/MM/DD (HU) - Gyártási szám (HU) - Szavatossági idő ÉÉÉÉ/HH/NN (EE) - Partii kood (EE) - Aegumistähtaeg AAAA/KK/PP (SK) - Číslo šarže (SK) - Použiteľné do RRRR/MM/DD (CZ) - Číslo šarže (CZ) - Datum exspirace RRRR/MM/DD (NO) - Partikode (NO) - Utløpsdato ÅÅÅÅ/MM/DD (RO) - Număr de lot (RO) - Data expirarii AAAA/LL/ZZ (BG) - Партиден номер (BG) - Срок на годност година/месец/ден

16 (GB) - Storage temperature limitation (FR) - Limites de températures de stockage (ES) - Temperatura límite (IT) - Limiti di temperatura di conservazione (DE) - Lagertemperatur (PT) - Limites de temperatura de armazenamento (SE) - Temperaturbegränsning (DK) - Temperaturbegrænsning (GR) - (PL) - Temperatura przechowywania (LT) - Saugojimo temperatūriniai apribojimai (HU) - Tárolási hőmérsékleti határok (EE) - Piirangud säilitustemperatuurile (SK) - Skladovacia teplota od do (CZ) - Teplotní rozmezí od do (NO) - Oppbevaringstemperatur (RO) - Limitele de temperatură la stocare (BG) - Температурни граници на съхранение (GB) - Consult Instruction for use (FR) - Consulter le mode d'emploi (ES) - Consulte las instrucciones de uso (IT) - Consultare le istruzioni per uso (DE) - Siehe Gebrauchsanweisung (PT) - Consulte o folheto informativo (SE) - Se bruksanvisningen (DK) - Se instruktion før brug (GR) - (PL) - Sprawdź instrukcję (LT) - Ieškokite informacijos vartojimo instrukcijoje (HU) - Olvassa el a használati utasítást (EE) - Kasutamisel vaata instruktsiooni (SK) - Katalógové číslo (CZ) - Viz návod k použití (NO) - Se bruksanvisninger (RO) - Consultati prospectul de utilizare (BG) - Виж инструкцията за употреба

17 IVD (GB) - CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices) (FR) - Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnostic in vitro) (ES) - Marcado CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro) (IT) - Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro) (DE) - CE Konformitätskennzeichnung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika) (PT) - Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnóstico in vitro) (SE) - CE-märkning (Europeiskt direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter för in vitro-diagnostik) (DK) - CE-mærkningen (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik) (GR) - CE ( 98/79/CE in vitro ) (PL) - CE oznaczenie (Dyrektywa unijna 98/79/CE dotycząca produktów medycznych do badań in vitro) (LT) - CE ženklas (Europos sąjungos direktyva 98/79/CE dėl in vitro diagnostikos medicinos prietaisų) (HU) - CE jelzés (98/79/CE Európai Irányelv az in vitro orvosi diagnosztikai eszközökről) (EE) - CE märgistus (Euroopa direktiiv 98/79/CE in vitro diagnostikameditsiiniseadmete kohta) (SK) - CE označenie o zhode (Európska direktíva 98/79/CE pre in vitro diagnostické zdravotnícke postupy) (CZ) - CE značka (Evropská direktiva 98/79/CE o diagnostických zdravotnických prostředcích in vitro) (NO) - CE-merking (EU-direktiv 98/79/CE om medisinsk utstyr til in vitro-diagnostikk) (RO) - Marca CE (Directiva europeana 98/79/CE pentru dispozitive medicale de diagnostic in vitro) (BG) - СЕ маркировка (Европейска директива 98/79/CE за ин витро диагностичните медицински изделия) (GB) - For in vitro diagnostic use (GB) - Catalogue number (FR) - Pour diagnostic in vitro (FR) - Référence catalogue (ES) - Para diagnóstico in vitro (ES) - Número de catálogo (IT) - Per uso diagnostico in vitro (IT) - Numero di catalogo (DE) - In-vitro-Diagnostikum (DE) - Bestellnummer (PT) - Para uso em diagnóstico in vitro (PT) - Número de catálogo (SE) - In vitro-diagnostik (SE) - Katalognummer (DK) - In vitro diagnose (DK) - Katalognummer (GR) - in vitro (GR) - (PL) - Do stosowania in vitro (PL) - Numer katalogu (LT) - in vitro diagnostikai (LT) - Katalogo numeris (HU) - Csak in vitro diagnosztikai alkalmazásra (HU) - Cikkszám (EE) - In vitro diagnostiliseks kasutamiseks (EE) - Katalooginumber (SK) - Na diagnostiku in vitro (SK) - Katalógové číslo (CZ) - Pro diagnostiku in vitro (CZ) - Katalogové číslo (NO) - Til in vitro-diagnostikk (NO) - Katalognummer (RO) - Pentru diagnostic in vitro (RO) - Număr de catalog (BG) - За ин витро диагностика (BG) - Каталожен номер (GB) - Manufacturer (GB) - Authorised Representative (FR) - Fabricant (FR) - Représentant agréé (ES) - Fabricante (ES) - Representante autorizado (IT) - Produttore (IT) - Distributore autorizzato (DE) - Hersteller (DE) - Bevollmächtigter (PT) - Fabricante (PT) - Representante Autorizado (SE) - Tillverkad av (SE) - Auktoriserad representant (DK) - Fremstillet af (DK) - Autoriseret repræsentant (GR) - (GR) - (PL) - Producent (PL) - Upoważniony Przedstawiciel (LT) - Gamintojas (LT) - Įgaliotasis atstovas (HU) - Gyártó (HU) - Meghatalmazott Képviselő (EE) - Tootja (EE) - Volitatud esindaja (SK) - Výrobca (SK) - Autorizovaný zástupca (CZ) - Výrobce (CZ) - Zplnomocněný zástupce (NO) - Produsent (NO) - Autorisert representant (RO) - Producător (RO) - Reprezentant autorizat (BG) - Производител (BG) - Упълномощен представител (GB) - Batch code (GB) - Expiry date YYYY/MM/DD (FR) - Code du lot (FR) - Date de peremption AAAA/MM/JJ (ES) - Código de lote (ES) - Estable hasta AAAA/MM/DD (IT) - Codice del lotto (IT) - Da utilizzare prima del AAAA/MM/GG (DE) - Chargen-Bezeichnung (DE) - Verwendbar bis JJJJ/MM/TT (PT) - Código do lote (PT) - Data de expiração AAAA/MM/DD (SE) - Batchnr (SE) - Utgångsdatum ÅÅÅÅ/MM/DD (DK) - Batchkoden (DK) - Anvendes før ÅÅÅÅ/MM/DD (GR) - (GR) - YYYY/MM/DD (PL) - Numer serii (PL) - Data ważności YYYY/MM/DD (LT) - Serijos numeris (LT) - Galioja iki YYYY/MM/DD (HU) - Gyártási szám (HU) - Szavatossági idő ÉÉÉÉ/HH/NN (EE) - Partii kood (EE) - Aegumistähtaeg AAAA/KK/PP (SK) - Číslo šarže (SK) - Použiteľné do RRRR/MM/DD (CZ) - Číslo šarže (CZ) - Datum exspirace RRRR/MM/DD (NO) - Partikode (NO) - Utløpsdato ÅÅÅÅ/MM/DD (RO) - Număr de lot (RO) - Data expirarii AAAA/LL/ZZ (BG) - Партиден номер (BG) - Срок на годност година/месец/ден

18 (GB) - Storage temperature limitation (FR) - Limites de températures de stockage (ES) - Temperatura límite (IT) - Limiti di temperatura di conservazione (DE) - Lagertemperatur (PT) - Limites de temperatura de armazenamento (SE) - Temperaturbegränsning (DK) - Temperaturbegrænsning (GR) - (PL) - Temperatura przechowywania (LT) - Saugojimo temperatūriniai apribojimai (HU) - Tárolási hőmérsékleti határok (EE) - Piirangud säilitustemperatuurile (SK) - Skladovacia teplota od do (CZ) - Teplotní rozmezí od do (NO) - Oppbevaringstemperatur (RO) - Limitele de temperatură la stocare (BG) - Температурни граници на съхранение (GB) - Consult Instruction for use (FR) - Consulter le mode d'emploi (ES) - Consulte las instrucciones de uso (IT) - Consultare le istruzioni per uso (DE) - Siehe Gebrauchsanweisung (PT) - Consulte o folheto informativo (SE) - Se bruksanvisningen (DK) - Se instruktion før brug (GR) - (PL) - Sprawdź instrukcję (LT) - Ieškokite informacijos vartojimo instrukcijoje (HU) - Olvassa el a használati utasítást (EE) - Kasutamisel vaata instruktsiooni (SK) - Katalógové číslo (CZ) - Viz návod k použití (NO) - Se bruksanvisninger (RO) - Consultati prospectul de utilizare (BG) - Виж инструкцията за употреба

19 Bio-Rad 3, bd Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette - France Tél.: /2009 Fax.: Code: