Metaloproteinazy macierzy zewnątrzkomórkowej w rozwoju, fizjologii i procesach degeneracyjnych mięśni szkieletowych

Transkrypt

1 Metaloproteinazy macierzy zewnątrzkomórkowej w rozwoju, fizjologii i procesach degeneracyjnych mięśni szkieletowych STRESZCZENIE Metaloproteinazy macierzy zewnątrzkomórkowej (MMP) stanowią dużą rodzinę enzymów, zdolnych do selektywnej degradacji składników macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), aktywnych zarówno w stanach fizjologicznych, jak i patologicznych wielu tkanek. W mięśniach szkieletowych enzymy z rodziny MMP zaangażowane są w proces przebudowy tkanki, pełniąc kluczową rolę zarówno w procesie miogenezy jak i w przebudowie tkanki towarzyszącej wzrostowi mięśni czy procesowi regeneracji. W niniejszej pracy opisana została rola tej grupy enzymów w przekształcaniu środowiska zewnątrzkomórkowego w mięśniach szkieletowych zarówno w stanach fizjologicznych, jak i podczas regeneracji tej tkanki. METALOPROTEINAZY MACIERZY ZEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ Metaloproteinazy macierzy zewnątrzkomórkowej (MMP, ang. matrix metalloproteinase,) zaliczane są do rodziny endopeptydaz, które do swej aktywności wymagają związania jonów cynku. Enzymy te zostały opisane po raz pierwszy przez Gross a i współpracowników, którzy zaobserwowali ich aktywność w tkankach ogona kijanki podczas metamorfozy. Początkowo MMP opisywane były jako enzymy zdolne do degradowania jedynie kolagenu. Obecnie znanych jest wiele innych strukturalnych i pozastrukturalnych substratów MMP, a ze względu na podobieństwa ewolucyjne i aktywność substratową enzymy te podzielono na kilka grup. Wyróżniamy wśród nich kolagenazy (MMP-1, MMP- 8, MMP-13, MMP-18), żelatynazy (MMP-2, MMP-9), stromielizyny (MMP-3, MMP-10, MMP-11), matrylizyny (MMP-7, MMP-26), metaloproteinazy błonowe (MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17, MMP-24, MMP-25) oraz inne (MMP-12, MMP-19, MMP-20, MMP-21, MMP-23, MMP-27, MMP-28) [1-4]. BUDOWA MMP Enzymy z rodziny MMP charakteryzuje budowa domenowa. W ich cząsteczkach można wyróżnić elementy wspólne dla całej grupy takie jak: peptyd sygnałowy, prodomena z motywem cysteinowym oraz domena katalityczna. Prodomena odpowiedzialna jest za zablokowanie aktywności enzymatycznej, dzięki obecności reszty cysteinowej oddziałującej z atomem cynku w centrum aktywnym enzymu. Domena katalityczna zawiera trzy reszty histydynowe w obrębie wiążącego katalityczny jon cynku motywu HEXXGHXXGXXH. Reszta kwasu glutaminianowego w obrębie tej sekwencji aktywuje związaną z Zn 2+ cząsteczkę H 2 O, która jest niezbędna dla aktywności MMP. Oprócz katalitycznego jonu cynku w obrębie tej domeny znajduje się również dodatkowy atom cynku oraz od jednego do czterech atomów wapnia odpowiadające za stabilizację struktury enzymu. W budowie enzymów z rodziny MMP wyróżnia się także region zawiasowy, który łączy się z domeną hemopeksynową, związaną z procesem prawidłowego rozpoznawania substratu, wiązaniem enzymu do macierzy zewnątrzkomórkowej oraz oddziaływaniem z tkankowymi inhibitorami metaloproteinaz. Oprócz elementów wspólnych, w budowie niektórych MMP wyróżnić można także sekwencje dodatkowe oraz domeny związane ze specyficznością wybranych metaloproteinaz, na przykład MMP błonowe zawierają domenę odpowiedzialną za zakotwiczenie enzymu w błonie komórkowej, a żelatynazy charakteryzują się obecnością specyficznego obszaru w domenie katalitycznej, odpowiadającego za przyłączanie enzymów do kolagenu, żelatyny i lamininy [4-8] (Ryc. 1). Piotr Jung Małgorzata Zimowska Zakład Cytologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski Zakład Cytologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski, ul. Miecznikowa 1, Warszawa; tel.: (22) , mzimowska@biol.uw.edu.pl Artykuł otrzymano 27 listopada 2015 r. Artykuł zaakceptowano 2 lutego 2016 r. Słowa kluczowe: metaloproteinazy macierzy zewnątrzkomórkowej, mięśnie szkieletowe, regeneracja Wykaz skrótów: ECM macierz zewnątrzkomórkowa; MMP metaloproteinazy macierzy zewnątrzkomórkowej; MRF miogeniczne czynniki regulatorowe; TGFβ transformujący czynnik wzrostu typu beta; TIMP tkankowe inhibitory metaloproteinaz Podziękowania: Badania prowadzone przez autorów niniejszej pracy przeglądowej są finansowane ze środków na naukę przyznanych przez Narodowe Centrum Nauki na realizację w latach projektu 2012/05/B/ NZ4/ FUNKCJE MMP Metaloproteinazy macierzy zewnątrzkomórkowej zaangażowane są w wiele procesów biologicznych, podczas których dochodzi do przebudowy macierzy: od implantacji zarodka do śmierci organizmu. Aktywne w obojętnym ph, en- Postępy Biochemii 62 (1)

2 Rycina 1. Budowa domenowa enzymów z rodziny MMP. Enzymy wydzielane są jako zymogeny posiadające na końcu aminowym peptyd sygnałowy i prodomenę (~50 reszt aminokwasowych). Domena katalityczne (~ 170 reszt aminokwasowych) z centrum aktywnym zawiera sekwencję wiążąca jony cynku. Domena ta poprzez region zawiasowy połączona jest z domeną hemopeksynową na końcu karboksylowym, włączoną w specyficzność rozpoznawania substratów oraz wiązanie inhibitorów. Ta podstawowa budowa domenowa charakterystyczna jest dla MMP-1, MMP -3, MMP -8, MMP-10, MMP -12, MMP -13, MMP-19, MMP-20, MMP-27 (A). Żelatynazy (MMP- 9 i MMP-2) charakteryzują się natomiast obecnością dodatkowej domeny fibronektyno-podobnej w domenie katalitycznej (B). MMP-11, MMP-21, MMP-28 zawierają w swojej budowie sekwencję rozpoznawaną przez furynę, związaną z aktywacją enzymu w środowisku zewnątrzkomórkowym (C). MMP błonowe tj. MMP-14, MMP -15, MMP-16 i MMP-24, oprócz sekwencji rozpoznawanej przez furynę, charakteryzują się obecnością zakotwiczającej je domeny transbłonowej oraz domeny cytoplazmatycznej (D). MMP błonowe zakotwiczone mogą być również poprzez domenę wiążącą glikozylofosfatydyloinozytol tj. np. MMP-17 i MMP-25 (F). Natomiast MMP -7 i MMP-26 charakteryzują się brakiem domeny hemopeksynowej i wiążącego ją z domeną katalityczną regionu zawiasowego (E). zymy te katalizują degradację macierzy zewnątrzkomórkowej, towarzyszącą przebudowie środowiska komórkowego podczas rozwoju i wzrostu tkanek. Zachowanie równowagi pomiędzy procesami syntezy a degradacją składników macierzy jest elementem niezbędnym dla zachowania równowagi tkankowej [9-12]. Natomiast wzrost aktywności MMP związany jest na przykład z odpowiedzią na uszkodzenie tkanek [10,13-17]. Utrata kontroli ekspresji genów MMP lub aktywności samych enzymów towarzyszy również wielu stanom patologicznym: na przykład wzrost ekspresji genów MMP-1, MMP-2, MMP-7, MMP-9 czy MMP-11 obserwuje się podczas rozwoju różnych chorób nowotworowych [18-22]. Enzymy z rodziny MMP odpowiedzialne są za degradację strukturalnych składników macierzy zewnątrzkomórkowej, takich jak kolagen, laminina czy fibronektyna, tworząc przez to przestrzeń dla funkcjonowania komórek i ułatwiając im m.in. migrację poprzez macierz [3,4,8,9]. Zakres działania MMP jest jednak znacznie szerszy. Poprzez proteolizę elementów strukturalnych macierzy enzymy te przyczyniają się do powstawania cząsteczek sygnałowych działających parakrynnie lub autokrynnie. Przykładowo, degradacja jednego z łańcuchów kolagenu typu IV przez MMP-9 prowadzi do powstania peptydu, który poprzez wiązanie z integryną avb3 przeciwdziała procesowi formowania naczyń krwionośnych [23]. MMP mogą także wpływać na zahamowanie lub zmianę działania aktywnych cząsteczek sygnałowych w macierzy zewnątrzkomórkowej, na przykład żelatynaza MMP-2 degraduje SDF-1 (zrębowy czynnik wzrostu, ang. stromal derived factor) powodując jego inaktywację [24]. Modyfikując strukturę czy wiązanie czynników wzrostu i cytokin w przestrzeni zewnątrzkomórkowej enzymy z rodziny MMP przyczyniają się także do zmian w sygnalizacji komórkowej. Przykładowo, aktywność proteolityczna metaloproteinaz powoduje uwolnienie obecnego w macierzy zewnątrzkomórkowej FGF (czynnik wzrostu fibroblastów, ang. fibroblast growth factor) związanego z proteoglikanami. Podobnie, MMP-2 i MMP-9 poprzez odcięcie fragmentu LAP (ang. latency-associated peptide) uwalniają TGFβ z obecnego w macierzy zewnątrzkomórkowej nieaktywnego kompleksu. MMP pośredniczą także w interakcjach między komórkami, a także pomiędzy komórkami a błoną podstawną. Poprzez degradację białek, takich jak np. E-kadheryna czy CD44, przyczyniają się do modyfikacji zdolności migracyjnych komórek [6-9,11,25-27]. Wybrane sposoby działania enzymów z rodziny MMP przedstawia rycina 2. REGULACJA DZIAŁANIA MMP Ekspresja MMP w większości tkanek w stanie fizjologicznym pozostaje na bardzo niskim poziomie i jest indukowana dopiero w czasie przebudowy macierzy zewnątrzkomórkowej. Funkcjonowanie metaloproteinaz kontrolowane jest na wielu poziomach, począwszy od procesu transkrypcji, poprzez sekrecję, aktywację, aż po degradację enzymów [25,29,30,33]. Transkrypcja genów kodujących enzymy z rodziny MMP indukowana jest przez szereg cytokin i czynników wzrostu takich jak np. interleukiny, interferon, EGF (czynnik wzrostu naskórka, ang. epidermal growth factor), KGF (czynnik wzrostu keratocytów, ang. keratinocyte growth factor), HGF (czynnik wzrostu hepatocytów, ang. hepatocyte growth factor), bfgf (czynnik wzrostu fibrobla- 26

3 Rycina 2. Działanie MMP w macierzy zewnątrzkomórkowej. Enzymy z rodziny MMP degradują białka strukturalne macierzy ułatwiając komórkom migrację poprzez macierz zewnątrzkomórkową (A). Degradacja elementów strukturalnych powoduje uwolnienie cząsteczek sygnałowych działających parakrynnie lub autokrynnie (B). MMP zdolne są do degradacji połączeń pomiędzy komórkami (C) jak i degradacji białek budujących błonę podstawną (D), przyczyniając się do uwolnienia komórek wewnątrz tkanki. Enzymy te mogą aktywować nieaktywne czynniki wzrostu lub cytokiny przyczyniając się tym samym do wzrostu poziomu ich wiązania z receptorami. Mogą również modyfikować działanie aktywnych czynników wzrostu i cytokin np. poprzez uwalnianie z połączeń z macierzą. MMP mogą przyczynić także się do zahamowania sygnalizacji np. poprzez proteolizę poszczególnych czynników wzrostu i cytokin (E). stów, ang. fibriblast growth factor), VEGF (czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego, ang. vascular endothelial growth factor), TNFα (czynnik martwicy guza, z ang. tumor necrosis factor), TGFβ (transformujący czynnik wzrostu typu beta, ang. transforming growth factor beta) i inne [28-30]. Badania in vitro wykazały, że traktowanie mioblastów wyizolowanych z mięśni szkieletowych niektórymi czynnikami wzrostu na przykład PDGF-BB (płytkopochodny czynnik wzrostu-bb, ang. platelet-derived growth factor) czy IGF-I (insulinopodobny czynnik wzrostu 1, ang. insulin-like growth factor 1) nie wpływa na poziom ekspresji, podczas gdy inne, na przykład TNFα czy b-fgf, indukują wzrost ekspresji genu tego samego enzymu (na przykładzie MMP-9). Te same czynniki wzrostu nie wpływają równocześnie na poziom syntezy MMP-1 czy MMP-2 [28,32]. Transkrypcja genów może także się odbywać w sposób niezależny od cytokin czy czynników wzrostu. Przykładowo, ekspresja genu MMP-9 związana jest z obecnością licznych cytokin i czynników wzrostu, które wpływają na region promotorowy enzymu, natomiast metaloproteinaza MMP-2 syntetyzowana jest konstytutywnie [31]. Analiza sekwencji promotorowej genów metaloproteinaz, np. MMP-1, MMP-3, MMP-7, MMP-9, MMP-10, MMP- 12 i MMP-13 wykazała podobieństwo w poziomie ekspresji genów różnych przedstawicieli rodziny metaloproteinaz. Czynniki wzrostu czy cytokiny kontrolują proces transkrypcji poprzez oddziaływanie z białkowymi aktywatorami transkrypcji trans, tj. AP-1 (białkowy aktywator transkrypcji 1, ang. activator protein 1) czy PEA3 (aktywator wzmacniający ekspresję genów wirusa polio). Ich działanie związane jest z wiązaniem sekwencji cis promotorów umożliwiając start transkrypcji. Ze względu na duże podobieństwa promotorów, na uwagę zasługują tkankowo-specyficzne różnice w poziomie syntezy enzymów z rodziny MMP. Dane literaturowe wskazują na przykład na odmienne rozmieszczenie regionów regulatorowych wykrytych w MMP-9 w osteoblastach i keratocytach [34]. Jednak mechanizm obserwowanych różnic nie został dotychczas wyjaśniony. Ważną rolę w kontroli syntezy enzymów z rodziny MMP odgrywają także mechanizmy epigenetyczne. Dane literaturowe wskazują m.in. na zależność zmian pomiędzy poziomem metylacji regionu promotorowego a wyciszeniem ekspresji [35]. Także fosforylacja lub acetylacja histonów, głównie ekspresji genów H3 i H4, powoduje zmiany w syntezie metaloproteinaz, na przykład MMP-9 [36]. Nie bez znaczenia jest również regulacja zachodząca posttranskrypcyjnie. Najlepiej zbadany jest po tym względem wpływ TGFβ na zwiększeniem stabilności mrna żelatynaz MMP-9 i MMP- 2 czy wpływ kortyzolu na zwiększenie stabilności mrna MMP-13 [29,30]. MMP są syntetyzowane, a następnie wydzielane do macierzy zewnątrzkomórkowej jako formy nieaktywne, tzw. zymogeny. Zymogen może być aktywowany w macierzy zewnątrzkomórkowej na wiele sposobów: poprzez ograniczoną proteolizę przez inne enzymy z rodziny MMP, przez działanie innych rodzajów enzymów np. furyny, aktywatora plazminogenu czy konwertazy, a także poprzez działanie aktywnych form tlenu. Natomiast działanie zaktywowanych MMP może być regulowana przez specyficzne tkankowo inhibitory: TIMP (ang. tissue inhibitors of metalloproteinases). Są to glikoproteiny, które wiążą się do domeny katalitycznej metaloproteinaz, hamując ich aktywność. Obecnie opisane zostały 4 rodzaje TIMP: TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3, TIMP-4. Inhibitory TIMP oddziałują swoim N-końcem z centrum aktywnym MMP, zajmując miejsce przeznaczone dla potencjalnego substratu i hamując aktywność enzymu w stosunku stechiometrycznym 1:1. Czynnikiem determinującym rozpoznawanie określonego enzymu jest obecność Postępy Biochemii 62 (1)

4 grupy karboksylowej w TIMP, a poszczególne inhibitory różnią się między sobą zdolnością do wiązania określonego przedstawiciela rodziny MMP. Przykładowo, TIMP-1 hamuje głównie MMP-3 i MMP-9, podczas gdy TIMP-2 z podobną siłą działa na wszystkie enzymy z rodziny MMP. Natomiast domena C-końcowa TIMP wiąże się z domeną hemopeksynową niektórych prommp, co może prowadzić do aktywacji enzymu. Przykładowo, w czasie aktywacji prommp-2 przez MT-MMP i TIMP-2, C- końcowa domena TIMP-2 łączy się z domeną hemopeksynową prommp-2, co jest jednym z niezbędnych etapów aktywacji, a zajście całego procesu jest możliwie tylko przy stosunkowo niskim stężeniu TIMP-2. Aktywność MMP może być również regulowana przez niespecyficzne inhibitory, tj. α2-makroglobulina czy zakotwiczona w błonie glikoproteina RECK (ang. reversion-inducing-cysteine-rich protein), hamująca aktywności MMP-9, MMP-2 i MMP-14 [4,5,14,37-39]. Ze względu na podwyższoną aktywnością enzymów z rodziny MMP związaną z wieloma różnymi stanami patologicznymi (np. przewlekłe stany zapalne, choroby reumatyczne, neurodegeneracyjne, choroby układu krążenia, formowanie guzów, powstawanie przerzutów i inne) przedstawiciele rodziny MMP są potencjalnie ważnym celem badań terapeutycznych [7]. Substancjami wykorzystywanymi do zahamowania, tkankowej aktywności MMP w stanach patologicznych stały się początkowo naturalne, endogenne inhibitory enzymów z rodziny MMP: TIMP oraz α2-makroglobulina. Zastosowanie α2-makroglobuliny okazało się korzystne w badaniach nad mysim modelem sepsy [40]. Natomiast wykorzystanie w terapii inhibitorów z grupy TIMP okazało się znacznie trudniejsze w związku z ich oddziaływaniami nie tylko z MMP, a także z innymi cząsteczkami (na przykład integryną α3β1 dla TIMP-2). Ogranicza to selektywne hamowanie endopeptydaz, utrudniając również określenie optymalnych parametrów stężenia inhibitorów niezbędne w terapii [41,42]. Dlatego też, dalsze badania związane z wykorzystaniem inhibitorów do zahamowania tkankowej aktywności MMP skoncentrowano na wykorzystaniu inhibitorów syntetycznych o określonych parametrach wiązania z enzymem. Pierwsza generacja syntetycznych inhibitorów, którą stanowiły kwasy hydroksamonowe, wpływała na blokowanie aktywności MMP poprzez wiązanie z jonem cynku w centrum aktywnym enzymów. Niestety, niska selektywność oraz liczne efekty uboczne spowodowały, że żadna z ponad 50 zsyntetyzowanych cząsteczek nie przeszła pozytywnie badań klinicznych [43]. Czynnikami zdolnymi do hamowania aktywności MMP, będącymi nową klasa związków zaprojektowaną do terapii chorób reumatoidalnych, były kwasy karboksylowe. Inhibitory należące do tej grupy (na przykład inhibitor MMP-13) charakteryzowały się wysoką selektywnością i skutecznością. Znakomitą selektywność względem MMP wykazywały także inhibitory nowej generacji, których cechą charakterystyczną był odmienny sposób hamowania aktywności enzymów. Związki te nie wiążą się bowiem bezpośrednio do jonu cynku w centrum aktywnym enzymów. Wyniki badań na mysim modelu dny moczanowej wskazują na znaczne zmniejszenie objawów klinicznych choroby po zastosowaniu tego typu inhibitora [6,44,45]. Innym sposobem zablokowania funkcji MMP, jest użycie przeciwciał. Poprzez bezpośrednie wiązanie z domeną katalityczną enzymu hamują one jego aktywność [46-49]. MIĘŚNIE SZKIELETOWE WPROWADZENIE Funkcjonalną jednostką mięśni szkieletowych jest wielojądrowe, cylindryczne włókno mięśniowe. Podczas rozwoju zarodkowego kręgowców mięśnie szkieletowe rozwijają się z komórek prekursorowych pochodzących z mezodermy. Ich rozwój podlega ścisłej kontroli czynników transkrypcyjnych: Pax3 i Pax7. Pod ich wpływem aktywacji ulegają miogeniczne czynniki regulatorowe (MRF, ang. myogenic growth factor): MyoD i Myf-5 stymulujące wczesne etapy miogenezy przekształcenie niezróżnicowanych komórek w mioblasty i ich proliferację. W kolejnym etapie dochodzi do zatrzymania podziałów komórkowych i rozpoczęcie różnicowania. Proces ten kontrolowany jest przez miogeninę i MRF4, tzw. późne miogeniczne czynniki regulatorowe. Mioblasty zaczynają syntetyzować specyficzne dla mięśni białka, takie jak desmina czy miozyna i ostatecznie łączą się w wielojądrowe miotuby (Ryc. 3A). W czasie miogenezy nie wszystkie komórki biorą jednak udział w tworzeniu włókien mięśniowych. Pewna ich część nie łączy się w miotuby, pozostając blisko miofibryli. Komórki te, nazwane komórkami satelitowymi, zlokalizowane są pomiędzy błoną włókna mięśniowego a otaczającą go błoną podstawną. W mięśniach dorosłych zwierząt komórki satelitowe pozostają w stanie spoczynku, zachowując jednak zdolność do podziałów. Ich aktywacji towarzyszy szereg procesów pozwalających na fizjologiczny wzrost czy regenerację mięśni szkieletowych [50-54]. REGENERACJA MIĘŚNI SZKIELETOWYCH Proces regeneracji mięśni szkieletowych może być indukowany poprzez różne mechanizmy: odnerwienie, niedokrwienie, uszkodzenie mechaniczne, poprzez działanie toksyn i inne. Jednak bez względu na rodzaj uszkodzenia, regeneracja następuje w dwóch nakładających się fazach: miolizy i rekonstrukcji. We wczesnych fazach regeneracji dominują procesy degeneracyjne związane z miolizą włókien, podczas gdy na etapie rekonstrukcji przeważa naprawa tkanki (Ryc. 3B). Po uszkodzeniu włókna mięśniowego, w wyniku przerwania sarkolemmy, następuje wzrost wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia, skutkujący aktywacją enzymów (między innymi kalpain) zdolnych do trawienia białek takich jak nebulina, desmina, α-aktynina czy tropomiozyna. Degradacja tych białek prowadzi do zniszczenia struktury sarkomerów włókna mięśniowego. Zanim zajdzie proces regeneracji, uszkodzone fragmenty włókien zostają usunięte na drodze fagocytozy przez napływające do mięśnia komórki stanu zapalnego [50,51,53,55]. Uszkodzeniu mięśni szkieletowych towarzyszy wzrost syntezy cytokin prozapalnych tj. TNF- α i IL-1β, które stymulują komórki śródbłonka do syntezy cząsteczek adhezyjnych: E-selektyny i P-selektyny. Obecność tych białek z jednej strony przyczynia się do napływu neutrofili do miejsca uszkodzenia, pierwszych komórek fagocytujących szczątki uszkodzonej tkanki, z drugiej promuje adhezję neutrofili. Towarzyszy temu synteza IL-6 i IL-8 będącymi chemoatraktantami neutrofili. Neutrofile wydzielają natomiast chemoatraktanty, przywabiające inne komórki do miejsca uszkodzenia, a 28

5 Rycina 3. Udział miogenicznych czynników regulacyjnych w miogenezie zarodkowej i w regeneracji mięśni szkieletowych. W czasie wczesnych etapów proces miogenezy pozostaje pod kontrolą MyoD i Myf-5, natomiast miogenina i MRF4 biorą udział w rozpoczęciu procesu różnicowania, powodując zatrzymanie podziałów i rozpoczęcie procesu różnicowania (A). Po uszkodzeniu i aktywacji komórek satelitowych, syntezie ulegają Myf-5 lub MyoD. Następnie oba czynniki są syntetyzowane w tych samych komórkach w czasie fazy proliferacji. Przy braku MyoD, komórki przechodzą kilka rund podziałów i wracają do stanu uśpienia. Następnie syntezie ulegają miogenina i MRF4, a komórki wchodzą w program końcowego różnicowania (B). komórkami dominującymi w miejscu uszkodzenia stają się makrofagi. Wzrostowi ich liczby towarzyszy spadek liczby neutrofili. Makrofagi obecne w uszkodzonych mięśniach można podzielić na dwie populacje: makrofagi prozapalne M1, które są odpowiedzialne za usuwanie uszkodzonych włókien oraz makrofagi M2 stymulujące komórki satelitowe do podziałów. Umiarkowany odczyn zapalny towarzyszący uszkodzeniu i regeneracji mięśni jest korzystny dla organizmu. Jednak, początkowo korzystne działanie komórek stanu zapalnego polegające na usuwaniu zniszczonej tkanki, wydzielaniu czynników promujących proliferację mioblastów, czy syntezie macierzy zewnątrzkomórkowej i metaloproteinaz, na późniejszych etapach regeneracji staje się szkodliwe. Przedłużona obecność komórek stanu zapalnego może zaburzać naprawę tkanki prowadząc m.in. do uszkodzenia nowopowstających miotub [55-59]. Po usunięciu uszkodzonych włókien przez napływające do miejsca uszkodzenia komórki stanu zapalnego, następuje etap regeneracji włókien i syntezy macierzy zewnątrzkomórkowej. W czasie naprawy mięśni następującej po uszkodzeniu, komórki satelitowe wykorzystują błonę podstawną włókien martwiczych jako rusztowanie zapewniające powstanie nowych włókien w podobnym miejscu. Składniki budujące błonę podstawną są niezbędne również dla powstawania połączeń nerwowo-mięśniowych. Prawidłowa rekonstrukcja mięśnia uzależniona jest od ponownego unerwienia i unaczynienia tkanki, a ostateczny poziom odbudowy uszkodzonego mięśnia jest zawsze proporcjonalny do liczby prawidłowo unerwionych i ukrwionych włókien mięśniowych [50,52,55,56]. Natomiast zaburzenia na każdym z etapów naprawy tkanki mogą skutkować nieprawidłowym procesem regeneracji objawiającym się degeneracją włókien mięśniowych oraz zaburzeniami w syntezie i degradacji składników macierzy prowadząc do rozwoju zwłóknienia. Zwłóknienie jest procesem nadmiernego nagromadzenia składników macierzy zewnątrzkomórkowej, powodującym destrukcję normalnej architektury tkanki i zaburzenia w jej funkcjonowaniu. Proces ten może być wywoływany przez nadmierną syntezę kolagenu i innych białek macierzy lub spadek rozkładu składników macierzy spowodowany spadkiem aktywności enzymów degradujących białka macierzy. Także podwyższona lub przedłużona obecność komórek stanu zapalnego może przyczynić się Postępy Biochemii 62 (1)

6 do rozwoju zwłóknienia. Błona podstawna włókien martwiczych może w tym przypadku zastać zfagocytowana zanim będzie zdolna do zadziałania jako rusztowanie dla nowo powstających włókien mięśniowych lub ich unerwienia. Nadmierne wydzielanie cytokin i czynników wzrostu, oprócz stymulacji komórek satelitowych do proliferacji czy różnicowania, stymuluje również proliferację i aktywację fibroblastów. Z czasem, fibroblasty te uczestniczą w formowaniu trwałej tkanki fibrotycznej poprzez gromadzenie wyprodukowanych przez nie kolagenu, fibronektyny czy proteoglikanów. Ograniczenie stanu zapalnego może zatem ograniczyć procesy degeneracyjne i tworzenie się blizny, jednak zmniejszenie aktywności cytokin, czynników wzrostu i prostaglandyn może zahamować silę sygnałów wzmagających regenerację [50,52,54,59,60]. UDZIAŁ MMP W PRZEKSZTAŁCANIU ŚRODOWISKA ZEWNĄTRZKOMÓRKOWEGO MIĘŚNI SZKIELETOWYCH Środowisko zewnątrzkomórkowe mięśni szkieletowych jest strukturą dynamicznie dostosowującą się do ciągłych zmian wynikających ze zmiennych warunków towarzyszących wzrostowi czy naprawie tkanki. Procesy te związane są z określoną sekwencją zachodzących na siebie zdarzeń wymagających komunikacji pomiędzy komórkami. Głównymi składnikami macierzy zewnątrzkomórkowej w mięśniach szkieletowych są kolagen typu I, III oraz IV, laminina, tenascyna, fibronektyna oraz siarczan dermatanu i siarczan heparanu. Składniki te nie pełnią jedynie funkcji strukturalnej, ale wpływają również na adhezję, migrację i fuzję mioblastów. Synteza poszczególnych składników macierzy zewnątrzkomórkowej oraz ich organizacja przestrzenna są precyzyjnie regulowane na poszczególnych etapach różnicowania oraz regeneracji mięśni. Tuż po uszkodzeniu mięśnia dochodzi do degradacji macierzy zewnątrzkomórkowej i uwolnienia z niej różnych czynników wzrostu. Składniki macierzy poprzez wiązanie czynników wzrostu regulują ich dostępność i aktywność w tkance, modyfikując tym samym ich wpływ na mioblasty czy włókna mięśniowe. W kilka dni po uszkodzeniu fibryna i fibronektyna pochodzące z krwi zaczynają tworzyć nową, pierwotną macierz. Stanowi ona miejsce przyczepu dla napływających fibroblastów, które rozpoczynają syntezę białek oraz proteoglikanów. Pierwszymi syntetyzowanymi białkami są fibronektyna oraz tenascyna, a następnie kolagen typu III. Rozpoczęcie syntezy kolagenu typu I odbywa się później, ale jego synteza pozostaje podwyższona nawet przez kilka tygodni. Choć początkowo jest to zjawisko korzystne, odkładanie składników ECM staje się patologiczne jeśli jest kontynuowane bez kontroli, powodując tworzenie tkanki włóknistej otaczającej włókna [50-52,54,55,61]. Enzymami zaangażowanymi w przekształcanie struktury macierzy poprzez degradację jej składników są metaloproteinazy macierzy zewnątrzkomórkowej [10,62-64]. Dane literaturowe wskazują, że u różnych gatunków kręgowców w proces przebudowy tkanki mięśniowej towarzyszącej regeneracji czy wzrostowi mięśni, zaangażowanych może być szereg metaloproteinaz, tj. MMP-1, MMP-2, MMP- 3, MMP-7, MMP-9, MMP-10, MMP-13, MMP-14 i MMP-16. Należą one do czterech grup: kolagenaz, żelatynaz, MMP błonowych i stromielizyn. Kolagenazy odpowiedzialne są przede wszystkim za degradację kolagenu do tropokolagenu A i B, czyniąc go tym samym substratem podatnym na działanie innych, niespecyficznych proteinaz. Stromielizyny zdolne są do degradacji lamininy, fibronektyny, elastyny i rdzeni białkowych proteoglikanów obecnych w macierzy zewnątrzkomórkowej otaczającej włókna mięśniowe. Natomiast błonowe MMP oprócz degradacji składników macierzy zewnątrzkomórkowej odpowiedzialne są za aktywację innych przedstawicieli rodziny MMP, np. MMP-2. Jednak enzymami pełniącymi kluczową rolę w przekształceniu środowiska zewnątrzkomórkowego włókien mięśniowych są, należące do żelatynaz, degradujące m.in. zdenaturowany kolagen, MMP-9 i MMP-2 [63,65,66]. W nieuszkodzonych mięśniach poziom syntezy żelatynaz pozostaje bardzo niski, a MMP-9 i MMP-2 lokalizują się w podobnych obszarach pomiędzy włóknami. Także aktywność obu enzymów w nieuszkodzonej tkance jest niska lub niewykrywalna [67,68]. Jednym z czynników stymulujących aktywność żelatynaz w mięśniach szkieletowych wydaje się być stymulacja mechaniczna. Stymulacja mechaniczna mięśni może powodować szereg korzystnych zmian takich jak wzrost masy, siły mięśnia czy wzmocnienie błony podstawnej poprzez modyfikacje zawartości kolagenu typu IV. Jednak intensywne ćwiczenia mogą również przyczyniać się do powstawanie wielu, często bardzo drobnych, uszkodzeń. Uszkodzenia te przyczyniają się do stymulacji syntezy żelatynaz [69]. W konsekwencji enzymy te stają się aktywne, a jako pierwsza aktywowana zostaje MMP-9. Następnie dochodzi do wzrostu aktywności MMP-2. Synteza żelatynaz zależna jest także od rodzaju stymulacji. Poziom syntezy MMP-2 oraz jej aktywność w całym mięśniu wzrasta podczas długotrwałego treningu, podczas gdy transkrypt MMP-9 jak i aktywność enzymu indukowane są już przez pojedyncze ćwiczenie [70]. Przemijający wzrost syntezy MMP-2 i MMP-9 towarzyszy także pouszkodzeniowej regeneracji mięśni szkieletowych. Zmiany te badane były w mięśniach indukowanych do regeneracji w różny sposób. Wykazano, że nastrzykiwanie mysich mięśni kardiotoksyną, powodujące miejscową destrukcję tkanki, skutkuje wzrostem aktywności MMP-9 i MMP-2. Postępujący wzrost aktywności żelatynaz widoczny jest już w pierwszych dniach po uszkodzeniu mięśnia [67]. Podobnie, w mięśniach szczura w całości poddanych uszkodzeniu (miażdżenie od ścięgna do ścięgna na całej długości mięśnia) widoczny jest wzrost aktywności obu enzymów [68,71]. Co ciekawe, niezależnie od rodzaju uszkodzenia wzrost syntezy i aktywności enzymów przebiega sekwencyjnie. Początkowo, na etapie miolizy, w uszkodzonych mięśniach poziom MMP-9 przewyższa MMP-2, później, na etapie rekonstrukcji, aktywność MMP-2 staje się dominująca. Zauważono również, że poziom syntezy MMP-9 obserwowany w uszkodzonej tkance mięśniowej jest związany z rozwojem stanu zapalnego oraz martwicą włókien. Na tym etapie MMP-9 lokalizuje się głównie w komórkach stanu zapalnego oraz w zaktywowanych komórkach satelitowych [67,72]. Wydaje się, że podstawową funkcją MMP-9 w uszkodzonym mięśniu na etapie miolizy jest degradacja białek macierzy zewnątrzkomórkowej oraz ułatwianie pro- 30

7 liferacji lub migracji mioblastów. Synteza MMP-2 związana jest natomiast z przekształceniem środowiska komórkowego, towarzyszącemu powstawaniu nowych włókien w późniejszych etapach regeneracji [67,68,73]. Dane literaturowe wskazują również na udział MMP-1, enzymu zdolnego do degradacji kolagenu, w procesie przekształcenia macierzy zewnątrzkomórkowej podczas pouszkodzeniowej regeneracji mięśni szkieletowych. Aktywność MMP-1 przyczynia się z jednej strony do przyspieszenia odbudowy tkanki, co widoczne jest jako wzrost liczby nowo formowanych włókien mięśniowych. Wykazano również, że MMP-1 hamuje rozwój włóknienia [74,75]. W różnych typach włókien mięśniowych budujących określone typy mięśni szkieletowych obserwuje się odmienną aktywność enzymów z rodziny MMP. Dojrzałe mięśnie szkieletowe są mozaiką różnych typów włókien mięśniowych, różniących się pod względem ich morfologicznych, biochemicznych i fizjologicznych właściwości, wykazujących różnice w swojej oksydatywnej i glikolitycznej aktywności. Czas skurczu mięśni różni się pomiędzy typami włókien mięśniowych z czym związana jest wydajność aparatu miozynowego, który zbudowany jest z różnych izoform białek w różnych typach włókien. Ze względu na te różnice dokonano klasyfikacji włókien mięśniowych, dzieląc mięśnie na typ I, IIA i IIB, odpowiadające włóknom wolno i szybko kurczącym się [76]. Obserwacje morfologiczne regenerujących mięśni szkieletowych szczura charakteryzujących się przewagą włókien o określonym typie wykazały, że ich reakcja na uszkodzenie jest różna. Mięśnie z przewagą włókien wolnych charakteryzują się słabą rekonstrukcją tkanki, natomiast mięśnie z przewagą włókien szybkich po uszkodzeniu przechodzą proces rekonstrukcji bardziej efektywnie i wykazują prawidłową strukturę około 14 dnia po uszkodzeniu. W uszkodzonych mięśniach wolnych obserwuje się natomiast nasilony proces włóknienia [53,68,77]. Aktywność MMP-9 i MMP-2 podczas regeneracji jest różna w mięśniach z przewagą włókien wolnych i szybkich na poszczególnych etapach naprawy tkanki. W mięśniach szybkich widoczna jest charakterystyczna sekwencja pojawiania się i zanikania aktywności MMP-9 i MMP-2 w fazie miolizy i rekonstrukcji. Natomiast w mięśniach wolnych, na etapie odbudowy włókien, obserwuje się zarówno typową aktywność MMP-2 jak i utrzymujący się nadal wysoki poziom MMP-9, nieobserwowany w prawidłowo regenerujących mięśniach szybkich. Wysoka aktywność MMP-9 obserwowana w słabo regenerującym mięśniu wolnym może zatem skutkować zaburzeniami w przekształcaniu macierzy zewnątrzkomórkowej i rozwojem włóknienia [68]. Hamowanie działania enzymów, w szczególności MMP-9, znacząco poprawia regenerację uszkodzonych mięśni, szczególnie w przypadku mięśni wolnych. Nastrzykiwanie uszkodzonego mięśnia Soleus, blokującym działanie MMP-9, przeciwciałem przeciwko MMP-9 czy niespecyficznym inhibitorem metaloproteinaz: doksycykliną powodowało zarówno wzrost liczby i wielkości nowo tworzonych włókien mięśniowych, jak i redukcję włóknienia. Efekt ten nie był widoczny przy nastrzykiwaniu uszkodzonego mięśnia przeciwciałem skierowanym przeciwko MMP-2 [71]. Wzrost poziomu czy aktywności metaloproteinaz towarzyszy także wielu stanom patologicznym mięśni szkieletowych. Miopatie były pierwszymi zbadanymi stanami chorobowymi mięśni, w przebiegu których udowodniono kluczową rolę metaloproteinaz macierzy zewnątrzkomórkowej [15,16]. W przebiegu choroby charakterystyczne są powtarzające się cykle degradacji i regeneracji tkanki, czemu towarzyszy nadmierna akumulacja składników macierzy zewnątrzkomórkowej. W obrazie histologicznym mięśnia obserwuje się liczne śródmiąższowe i okołonaczyniowe nacieki zapalne, wyraźny zanik włókien mięśniowych oraz martwicę tkanki. Towarzyszy temu nieznaczny proces naprawy mięśnia objawiający się niewielką liczbą nowo formowanych włókien. W wielu miopatiach synteza MMP-9, MMP-2, MMP-1 czy MMP-7 jest znacząco podwyższona. Aktywność MMP-9 wykrywana jest głównie w atroficznych włóknach mięśniowych. Podobną lokalizację wykazuje MMP-2, choć poziom syntezy tego enzymu jest znacznie niższy. Enzym ten wydaje się jednak odgrywać kluczową rolę podczas rozwoju atrofii mięśni, a myszy pozbawione funkcjonalnego genu dla MMP-2 charakteryzuje mniejsza atrofia mięśni oraz prawidłowy poziom kolagenu typu IV i lamininy [64,78-80]. Wiele analiz dotyczących syntezy i aktywności enzymów z rodziny MMP przeprowadzono na mięśniach szkieletowych pacjentów z dystrofią mięśniową Duchenne a (DMD) lub na zwierzęcych modelach dystrofii mięśniowej (myszy mdx, psy CXMD). Zarówno w przypadku ludzkiej dystrofii mięśniowej jak i w zwierzęcych modelach dystrofii, mięśnie dystroficzne charakteryzuje nieprawidłowy układ włókien oraz nadmierna akumulacja białek macierzy zewnątrzkomórkowej. Składnikami macierzy, które ulegają akumulacji są m.in. kolagen i fibronektyna, a ich poziom w przebiegu dystrofii wzrasta wraz z wiekiem organizmu. Analizy mięśni myszy mdx czy psów CXMD wykazały, że poziom syntezy MMP-9 jest podwyższony w degenerujących mięśniach, a wzrost syntezy MMP-2 towarzyszy etapowi formowania regenerujących włókien [81,82]. Także aktywacja MMP-9 jest związana z odpowiedzią zapalną i aktywacją komórek satelitowych, podczas gdy podwyższona aktywność MMP- 2 towarzyszy powstawaniu nowych włókien mięśniowych [62]. Podobnie, poziom kolagenazy MMP-13, zmienia się podczas regeneracji mięśni szkieletowych. Podczas zaindukowanej kardiotoksyną regeneracji, aktywność MMP-13 wzrasta przejściowo po uszkodzeniu, a poziom aktywności związany jest ze stopniem uszkodzenia tkanki [83,84]. W dystroficznych mięśniach zaobserwowano również wzrost syntezy i innych przedstawicieli metaloproteinaz np. MMP- 3, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MPP-12 i MT1-MMP. Co ciekawe, synteza MMP-11 obniża się wraz z postępem choroby [81,82,85,86]. Regeneracja dojrzałych mięśni zachodzi dzięki aktywacji rezerwowych, niezróżnicowanych komórek satelitowych. Aktywacja komórek satelitowych, ich różnicowanie w mioblasty, migracja, proliferacja, a następnie fuzja jednojądrowych mioblastów prowadząca do powstania funkcjonalnego, wielojądrowego włókna mięśniowego jest związana z procesami syntezy i degradacji białek oraz strukturalną adaptacją, których mechanizmy nie są jeszcze Postępy Biochemii 62 (1)

8 Rycina 4. Rola MMP w regeneracji mięśni szkieletowych. W czasie regeneracji mięśni szkieletowych MMP wydzielana jest przez zaktywowane komórki satelitowe, fibroblasty czy napływające do uszkodzonego mięśnia komórki stanu zapalnego. Rola MMP nie ogranicza się jedynie do degradacji strukturalnych składników macierzy zewnątrzkomórkowej. Enzymy te pośredniczą w interakcjach między komórkami, a także pomiędzy komórkami a błoną podstawną, przyczyniają się do uwalniania cząsteczek sygnałowych czy modyfikują działanie czynników wzrostu i cytokin. W ten sposób odpowiedzialne są za przekształcenie środowiska komórkowego uszkodzonego mięśnia umożliwiając proliferację mioblastów, ich migrację czy powstawanie nowych włókien. dobrze poznane. Jednak liczne doświadczenia wskazują, że na każdym etapie istotną rolę odgrywa wiele enzymów z rodziny MMP, choć zakres ich działania może być inny. Przykładowo, w czasie migracji mioblastów działanie MMP wiąże się przede wszystkim z degradacją białek strukturalnych, co ułatwia komórkom przemieszczanie poprzez macierz zewnątrzkomórkową. Dane literaturowe wskazują, że MMP-1 wzmaga migrację mioblastów prawdopodobnie poprzez indukcję aktywności odpowiedzialnej za degradację zdenaturowanego kolagenu pre-mmp-2 [63,87]. Nadprodukcja MMP-2, podobnie jak MMP-7 zwiększa również dystans na jaki mogą migrować mioblasty [88,89]. MMP-13, uczestniczący m.in. w degradacji kolagenu typu I, II, III czy V, wpływa także pozytywnie na migrację mioblastów, a jego zablokowanie hamuje ten proces [83]. Podobnie, wyciszenie ekspresji genu MMP-3 przy wykorzystaniu specyficznego sirna obniża szybkość migracji mioblastów [90]. Zahamowanie MMP-9 poprzez traktowanie komórek w warunkach in vitro specyficznym przeciwciałem wykazuje podobny wpływ, podczas gdy dodanie egzogennego MMP-9 do medium hodowlanego przyspiesza migrację, hamowaną poprzez obecność inhibitora MMP [91,92]. Enzymy z rodziny MMP zaangażowane są również w fuzje mioblastów. Biochemiczne i immunologiczne badania wykazały, że na powierzchni mioblastów ulegających fuzji zachodzą liczne zmiany dotyczące nie tylko białek błonowych, ale i składników pozakomórkowych. Aktywność enzymów z rodziny MMP nie ogranicza się jednak w czasie fuzji jednojądrowych mioblastów w wielojądrowe miotuby jedynie do degradacji strukturalnych składników macierzy zewnątrzkomórkowej. Enzymy te przyczyniają się do uwalniania cząsteczek sygnałowych czy modyfikują działanie czynników wzrostu i cytokin pośrednicząc w oddziaływaniach między łączącymi się komórkami. Niezależnie od mechanizmu, nadprodukcja MMP prowadzi w konsekwencji do bardziej wydajnego formowania miotub w porównaniu do hodowli komórek kontrolnych [93]. Przykładowo, mysie mioblasty linii C2C12, u których obserwowano zwiększony poziom syntezy MMP-2/MT1-MMP tworzą większe miotuby, choć MT1-MMP wydaje się jednak działać tylko na początkowym etapie fuzji [94]. Formowanie miotub blokowane było także w przypadku hamowania aktywności MMP- 14. Dodatkowe dowody na udział enzymów z rodziny MMP w procesie fuzji mioblastów pochodzą z badań dotyczących działania specyficznych inhibitorów metaloproteinaz: TIMP. Dodanie TIMP-1, TIMP-2 lub TIMP-3 do hodowli mioblastów powoduje zahamowanie tworzenia miotub [95]. Podobny efekt uzyskiwany był dzięki nadprodukcji białka RECK (glikoproteina zlokalizowana błonowo hamująca aktywność MMP). Co ciekawe, synteza RECK jest regulowana przez miogeniczne czynniki regulatorowe: MyoD hamuje aktywność promotora, podczas gdy MRF4 aktywuje go [37,94]. 32

9 PODSUMOWANIE Enzymy z rodziny MMP włączone są w szereg procesów towarzyszących przekształceniu tkanki mięśniowej zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych. Degradacja kolagenu, jak i innych białek strukturalnych macierzy zewnątrzkomórkowej jest inicjowana przez enzymy z rodziny MMP, jednak enzymy te mają znacznie szersze spektrum działania. MMP odgrywają bowiem ważną rolę zarówno w reorganizacji strukturalnych składników macierzy zewnątrzkomórkowej jak i w uwalnianiu cząsteczek sygnałowych czy modyfikacji działania czynników wzrostu i cytokin. W ten sposób przyczyniają się do przekształcenia środowiska komórkowego mięśnia kontrolując zarówno podziały komórek, ich migrację jak powstawanie nowych włókien (Ryc. 4). W czasie fizjologicznego procesu wzrostu, podczas regeneracji uszkodzonego mięśnia czy w stanach patologicznych, równowaga pomiędzy magazynowaniem i degradacją składników macierzy zewnątrzkomórkowej jest kluczowa dla przebudowy tkanki czy formowania rany. Dlatego zarówno synteza jak i aktywność MMP muszą pozostawać pod ścisłą kontrolą, a zaburzenia w sekwencji aktywacji i wyciszania aktywności mogą prowadzić do nieprawidłowości w funkcjonowaniu i architekturze tkanki. PIŚMIENNICTWO 1. Brinckerhoff CE, Matrisian LM (2002) Matrix metalloproteinases: a tail of a frog that became a prince. Nat Rev Mol Cell Biol 3: Mott JD, Werb Z (2004) Regulation of matrix biology by matrix metalloproteinases. Curr Opin Cell Biol 16: Olszynski K, Zimowska M (2009) Structure and function of matrix metalloproteinases. Postepy Biochem 55: Visse R, Nagase H (2003) Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry. Circ Res 92: Amar S, Fields GB (2015) Potential clinical implications of recent matrix metalloproteinase inhibitor design strategies. Expert Rev Proteomics 12: Aureli L, Gioia M, Cerbara I, Monaco S, Fasciglione GF, Marini S, Ascenzi P, Topai A, Coletta M (2008) Structural bases for substrate and inhibitor recognition by matrix metalloproteinases. Curr Med Chem 15: Fields GB (2015) New strategies for targeting matrix metalloproteinases. Matrix Biol 44-46: Itoh Y (2015) Membrane-type matrix metalloproteinases: Their functions and regulations. Matrix Biol 44-46: Apte SS, Parks WC (2015) Metalloproteinases: A parade of functions in matrix biology and an outlook for the future. Matrix Biol 44-46: Bellayr IH, Mu X, Li Y (2009) Biochemical insights into the role of matrix metalloproteinases in regeneration: challenges and recent developments. Future Med Chem 1: Page-McCaw A, Ewald AJ, Werb Z (2007) Matrix metalloproteinases and the regulation of tissue remodelling. Nat Rev Mol Cell Biol 8: Rodriguez D, Morrison CJ, Overall CM (2010) Matrix metalloproteinases: what do they not do? New substrates and biological roles identified by murine models and proteomics. Biochim Biophys Acta 1803: Amalinei C, Caruntu ID, Giusca SE, Balan RA (2010) Matrix metalloproteinases involvement in pathologic conditions. Rom J Morphol Embryol 51: Gill SE, Parks WC (2008) Metalloproteinases and their inhibitors: regulators of wound healing. Int J Biochem Cell Biol 40: Manicone AM, McGuire JK (2008) Matrix metalloproteinases as modulators of inflammation. Semin Cell Dev Biol 19: Parks WC, Wilson CL, Lopez-Boado YS (2004) Matrix metalloproteinases as modulators of inflammation and innate immunity. Nat Rev Immunol 4: Rohani MG, Parks WC (2015) Matrix remodeling by MMPs during wound repair. Matrix Biol 44-46: Gialeli C, Theocharis AD, Karamanos NK (2011) Roles of matrix metalloproteinases in cancer progression and their pharmacological targeting. FEBS J 278: Hadler-Olsen E, Winberg JO, Uhlin-Hansen L (2013) Matrix metalloproteinases in cancer: their value as diagnostic and prognostic markers and therapeutic targets. Tumour Biol 34: Kessenbrock K, Plaks V, Werb Z (2010) Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment. Cell 141: Sampieri CL, Leon-Cordoba K, Remes-Troche JM (2013) Matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors in gastric cancer as molecular markers. J Cancer Res Ther 9: Shuman Moss LA, Jensen-Taubman S, Stetler-Stevenson WG (2012) Matrix metalloproteinases: changing roles in tumor progression and metastasis. Am J Pathol 181: Hamano Y, Zeisberg M, Sugimoto H, Lively JC, Maeshima Y, Yang C, Hynes RO, Werb Z, Sudhakar A, Kalluri R (2003) Physiological levels of tumstatin, a fragment of collagen IV alpha3 chain, are generated by MMP-9 proteolysis and suppress angiogenesis via alphav beta3 integrin. Cancer Cell 3: McQuibban GA, Butler GS, Gong JH, Bendall L, Power C, Clark-Lewis I, Overall CM (2001) Matrix metalloproteinase activity inactivates the CXC chemokine stromal cell-derived factor-1. J Biol Chem 276: Overall CM, Wrana JL, Sodek J (1991) Transcriptional and post-transcriptional regulation of 72-kDa gelatinase/type IV collagenase by transforming growth factor-beta 1 in human fibroblasts. Comparisons with collagenase and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase gene expression. J Biol Chem 266: Rivilis I, Milkiewicz M, Boyd P, Goldstein J, Brown MD, Egginton S, Hansen FM, Hudlicka O, Haas TL (2002) Differential involvement of MMP-2 and VEGF during muscle stretch- versus shear stress-induced angiogenesis. Am J Physiol Heart Circ Physiol 283: H Salo T, Lyons JG, Rahemtulla F, Birkedal-Hansen H, Larjava H (1991) Transforming growth factor-beta 1 up-regulates type IV collagenase expression in cultured human keratinocytes. J Biol Chem 266: Allen DL, Teitelbaum DH, Kurachi K (2003) Growth factor stimulation of matrix metalloproteinase expression and myoblast migration and invasion in vitro. Am J Physiol Cell Physiol 284: C Piperi C, Papavassiliou AG (2012) Molecular mechanisms regulating matrix metalloproteinases. Curr Top Med Chem 12: Yan C, Boyd DD (2007) Regulation of matrix metalloproteinase gene expression. J Cell Physiol 211: Eric R, Jessica N, Anna Sm, Dick Wgt, Helene R, Tara H, Thomas G (2009) Endurance exercise activates matrix metalloproteinases in humanskeletal muscle. J Appl Physiol, 106: Torrente Y, El Fahime E, Caron NJ, Del Bo R, Belicchi M, Pisati F, Tremblay JP, Bresolin N (2003) Tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) stimulates chemotactic response in mouse myogenic cells. Cell Transplant 12: Delany AM, Brinckerhoff CE (1992) Post-transcriptional regulation of collagenase and stromelysin gene expression by epidermal growth factor and dexamethasone in cultured human fibroblasts. J Cell Biochem 50: Munaut C, Salonurmi T, Kontusaari S, Reponen P, Morita T, Foidart JM, Tryggvason K (1999) Murine matrix metalloproteinase 9 gene. 5 -upstream region contains cis-acting elements for expression in osteoclasts and migrating keratinocytes in transgenic mice. J Biol Chem 274: Couillard J, Demers M, Lavoie G, St-Pierre Y (2006) The role of DNA hypomethylation in the control of stromelysin gene expression. Biochem Biophys Res Commun 342: Postępy Biochemii 62 (1)

10 36. Yan C, Wang H, Toh Y, Boyd DD (2003) Repression of 92-kDa type IV collagenase expression by MTA1 is mediated through direct interactions with the promoter via a mechanism, which is both dependent on and independent of histone deacetylation. J Biol Chem 278: Alexius-Lindgren M, Andersson E, Lindstedt I, Engstrom W (2014) The RECK gene and biological malignancy - its significance in angiogenesis and inhibition of matrix metalloproteinases. Anticancer Res 34: Bourboulia D, Stetler-Stevenson WG (2010) Matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs): Positive and negative regulators in tumor cell adhesion. Semin Cancer Biol 20: Oh J, Takahashi R, Kondo S, Mizoguchi A, Adachi E, Sasahara RM, Nishimura S, Imamura Y, Kitayama H, Alexander DB, Ide C, Horan TP, Arakawa T, Yoshida H, Nishikawa S, Itoh Y, Seiki M, Itohara S, Takahashi C, Noda M (2001) The membrane-anchored MMP inhibitor RECK is a key regulator of extracellular matrix integrity and angiogenesis. Cell 107: Birkenmeier G, Nicklisch S, Pockelt C, Mossie A, Steger V, Glaser C, Hauschildt S, Usbeck E, Huse K, Sack U, Bauer M, Schafer A (2006) Polymyxin B-conjugated alpha 2-macroglobulin as an adjunctive therapy to sepsis: Modes of action and impact on lethality. J Pharmacol Exp Ther 318: Seo DW, Li H, Guedez L, Wingfield PT, Diaz T, Salloum R, Wei BY, Stetler-Stevenson WG (2003) TIMP-2 mediated inhibition of angiogenesis: an MMP-independent mechanism. Cell 114: Stetler-Stevenson WG, Seo DW (2005) TIMP-2: an endogenous inhibitor of angiogenesis. Trends Mol Med 11: Vandenbroucke RE, Libert C (2014) Is there new hope for therapeutic matrix metalloproteinase inhibition? Nat Rev Drug Discov 13: Gege C, Bao B, Bluhm H, Boer J, Gallagher BM, Korniski B, Powers TS, Steeneck C, Taveras AG, Baragi VM (2012) Discovery and evaluation of a non-zn chelating, selective matrix metalloproteinase 13 (MMP-13) inhibitor for potential intra-articular treatment of osteoarthritis. J Med Chem 55: Hu J, Van den Steen PE, Houde M, Ilenchuk TT, Opdenakker G (2004) Inhibitors of gelatinase B/matrix metalloproteinase-9 activity comparison of a peptidomimetic and polyhistidine with single-chain derivatives of a neutralizing monoclonal antibody. Biochem Pharmacol 67: Kaimal R, Aljumaily R, Tressel SL, Pradhan RV, Covic L, Kuliopulos A, Zarwan C, Kim YB, Sharifi S, Agarwal A (2013) Selective blockade of matrix metalloprotease-14 with a monoclonal antibody abrogates invasion, angiogenesis, and tumor growth in ovarian cancer. Cancer Res 73: Martens E, Leyssen A, Van Aelst I, Fiten P, Piccard H, Hu J, Descamps FJ, Van den Steen PE, Proost P, Van Damme J, Liuzzi GM, Riccio P, Polverini E, Opdenakker G (2007) A monoclonal antibody inhibits gelatinase B/MMP-9 by selective binding to part of the catalytic domain and not to the fibronectin or zinc binding domains. Biochim Biophys Acta 1770: Sela-Passwell N, Kikkeri R, Dym O, Rozenberg H, Margalit R, Arad-Yellin R, Eisenstein M, Brenner O, Shoham T, Danon T, Shanzer A, Sagi I (2012) Antibodies targeting the catalytic zinc complex of activated matrix metalloproteinases show therapeutic potential. Nat Med 18: Shiryaev SA, Remacle AG, Golubkov VS, Ingvarsen S, Porse A, Behrendt N, Cieplak P, Strongin AY (2013) A monoclonal antibody interferes with TIMP-2 binding and incapacitates the MMP-2-activating function of multifunctional, pro-tumorigenic MMP-14/MT1-MMP. Oncogenesis 2: e Best TM, Hunter KD (2000) Muscle injury and repair. Phys Med Rehabil Clin N Am 11: Costamagna D, Berardi E, Ceccarelli G, Sampaolesi M (2015) Adult stem cells and skeletal muscle regeneration. Curr Gene Ther 15: Dumont NA, Bentzinger CF, Sincennes MC, Rudnicki MA (2015) Satellite Cells and Skeletal Muscle Regeneration. Compr Physiol 5: Moraczewski J, Archacka K, Brzoska E, Ciemerych MA, Grabowska I, Janczyk-Ilach K, Streminska W, Zimowska M (2008) From planarians to mammals - the many faces of regeneration. Int J Dev Biol 52: Moyer AL, Wagner KR (2011) Regeneration versus fibrosis in skeletal muscle. Curr Opin Rheumatol 23: Ceafalan LC, Popescu BO, Hinescu ME (2014) Cellular players in skeletal muscle regeneration. Biomed Res Int 2014: Arnold L, Henry A, Poron F, Baba-Amer Y, van Rooijen N, Plonquet A, Gherardi RK, Chazaud B (2007) Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis. J Exp Med 204: Brunelli S, Rovere-Querini P (2008) The immune system and the repair of skeletal muscle. Pharmacol Res 58: Butterfield TA, Best TM, Merrick MA (2006) The dual roles of neutrophils and macrophages in inflammation: a critical balance between tissue damage and repair. J Athl Train 41: Tidball JG, Villalta SA (2010) Regulatory interactions between muscle and the immune system during muscle regeneration. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 298: R Prisk V, Huard J (2003) Muscle injuries and repair: The role of prostaglandins and inflammation. Histol Histopathol 18: Brzoska E, Ciemerych MA, Przewozniak M, Zimowska M (2011) Regulation of muscle stem cells activation: the role of growth factors and extracellular matrix. Vitam Horm 87: Carmeli E, Moas M, Reznick AZ, Coleman R (2004) Matrix metalloproteinases and skeletal muscle: a brief review. Muscle Nerve 29: Chen X, Li Y (2009) Role of matrix metalloproteinases in skeletal muscle: migration, differentiation, regeneration and fibrosis. Cell Adh Migr 3: Kieseier BC, Schneider C, Clements JM, Gearing AJ, Gold R, Toyka KV, Hartung HP (2001) Expression of specific matrix metalloproteinases in inflammatory myopathies. Brain 124: Alameddine HS (2012) Matrix metalloproteinases in skeletal muscles: friends or foes? Neurobiol Dis 48: Davis ME, Gumucio JP, Sugg KB, Bedi A, Mendias CL (2013) MMP inhibition as a potential method to augment the healing of skeletal muscle and tendon extracellular matrix. J Appl Physiol (1985) 115: Kherif S, Lafuma C, Dehaupas M, Lachkar S, Fournier JG, Verdiere- -Sahuque M, Fardeau M, Alameddine HS (1999) Expression of matrix metalloproteinases 2 and 9 in regenerating skeletal muscle: a study in experimentally injured and mdx muscles. Dev Biol 205: Zimowska M, Brzoska E, Swierczynska M, Streminska W, Moraczewski J (2008) Distinct patterns of MMP-9 and MMP-2 activity in slow and fast twitch skeletal muscle regeneration in vivo. Int J Dev Biol 52: Warren GL, Summan M, Gao X, Chapman R, Hulderman T, Simeonova PP (2007) Mechanisms of skeletal muscle injury and repair revealed by gene expression studies in mouse models. J Physiol 582: Rullman E, Rundqvist H, Wagsater D, Fischer H, Eriksson P, Sundberg CJ, Jansson E, Gustafsson T (2007) A single bout of exercise activates matrix metalloproteinase in human skeletal muscle. J Appl Physiol 102: Zimowska M, Olszynski KH, Swierczynska M, Streminska W, Ciemerych MA (2012) Decrease of MMP-9 activity improves soleus muscle regeneration. Tissue Eng Part A 18: Kherif S, Dehaupas M, Lafuma C, Fardeau M, Alameddine HS (1998) Matrix metalloproteinases MMP-2 and MMP-9 in denervated muscle and injured nerve. Neuropathol Appl Neurobiol 24: Frisdal E, Teiger E, Lefaucheur JP, Adnot S, Planus E, Lafuma C, D Ortho M P (2000) Increased expression of gelatinases and alteration of basement membrane in rat soleus muscle following femoral artery ligation. Neuropathol Appl Neurobiol 26: