Rola oksydazy NADPH NOX4 w regulacji procesów proliferacji, starzenia i różnicowania komórek

Transkrypt

1 Rola oksydazy NADPH NOX4 w regulacji procesów proliferacji, starzenia i różnicowania komórek STRESZCZENIE Oksydaza NADPH NOX4 to enzym będący źródłem reaktywnych form tlenu w wielu tkankach ludzkiego organizmu. Produkty aktywności NOX4 wpływają na różnorodne procesy zachodzące na poziomie komórek i tkanek. Jednym z nich jest starzenie komórkowe. Wykazano rolę tej oksydazy zarówno w starzeniu replikacyjnym, jak i indukowanym onkogenami. Z drugiej strony NOX4 uczestniczy w stymulacji podziałów niektórych typów komórek nowotworowych oraz prawidłowych, co sprzyja rozwojowi patologii. NOX4 bierze także udział w tranzycji nabłonkowo-mezenchymalnej, istotnej dla inwazji oraz przerzutów komórek nowotworowych. Bardzo wiele badań dotyczy roli NOX4 w fizjologii oraz patologii układu krwionośnego. Wykazano wpływ NOX4 na regulację skurczu naczyń krwionośnych, rozwój miażdżycy oraz wzrost komórek układu krwionośnego, ich apoptozę i różnicowanie. NOX4 pełni w organizmie zarówno pozytywną, jak i negatywną rolę. Lepsze poznanie roli NOX4 w procesach, w które jest zaangażowany oraz ścieżek sygnałowych, w których uczestniczy daje potencjalnie szanse wpływu na hamowanie rozwoju choroby. WPROWADZENIE Wolne rodniki to cząsteczki, które ze względu na obecność jednego lub kilku niesparowanych elektronów bardzo łatwo wchodzą w reakcje chemiczne z wieloma różnymi cząsteczkami. W żywych komórkach główną rolę odgrywają reaktywne formy tlenu (RFT) oraz azotu. Pośród RFT można wyróżnić rodniki hydroksylowe (HO ), anionorodniki ponadtlenkowe ( ) oraz ich nierodnikowe, ale nadal bardzo reaktywne pochodne tlen singletowy ( 1 ) oraz nadtlenek wodoru (H 2 ). Do reaktywnych form azotu natomiast należy NO oraz produkty jego przemian - kation nitrozoniowy (NO + ), anion nitroksylowy (NO - ) i nadtlenoazotyn (ONOO - ) [1]. Niegdyś wolnym rodnikom w komórkach przypisywano jedynie negatywną rolę. Wykazywano ich udział w procesie nowotworzenia, mutagenezy, uszkodzeniach DNA oraz starzeniu organizmu [2]. RFT łatwo wchodzą w reakcje ze związkami organicznymi, prowadząc do peroksydacji lipidów oraz uszkadzania białek modyfikacji aminokwasów i grup prostetycznych, często skutkujących agregacją lub fragmentacją łańcuchów białkowych. Bardzo niebezpieczne dla komórki i całego organizmu jest także utlenianie składników kwasów nukleinowych, skutkujące uszkodzeniem materiału genetycznego. Pod wpływem RFT może także dojść do rozrywania wiązań glikozydowych pomiędzy monomerami cukrowców oraz uszkadzanie reszt cukrowych glikolipidów i glikoprotein na powierzchni komórek, prowadzące do zmian właściwości antygenowych tych cząsteczek i całych komórek, co obserwuje się w rozwoju wielu chorób, na przykład w zwyrodnieniu stawów [3]. Dorota Przybylska Grażyna Mosieniak Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego PAN Pracownia Molekularnych Podstaw Starzenia, Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego PAN, ul. Pasteura 3, Warszawa; tel. (22) , d.przybylska@ nencki.gov.pl Artykuł otrzymano 20 grudnia 2013 r. Artykuł zaakceptowano 14 lutego 2014 r. Słowa kluczowe: NOX4, oksydaza NADPH 4, reaktywne formy tlenu, starzenie komórkowe Skróty: NOX4 oksydaza NADPH 4; RFT reaktywne formy tlenu; VSMC komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych Podziękowania: Praca powstała podczas realizacji projektu badawczego nr 0728/B/ P01/2011/40 przyznanego przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego. Komórki wykształciły jednak wiele mechanizmów obronnych przed RFT, takich jak przerwanie łańcuchowych reakcji utleniania oraz eliminacja lub naprawa skutków reakcji RFT z cząsteczkami [3]. Stopniowo odkrywano także biologiczne funkcje pełnione przez te reaktywne cząsteczki, takie jak na przykład anionorodnik ponadtlenkowy oraz jego pochodne, które są bardzo istotnymi składnikami kaskad przekazywania sygnału w komórce oraz aktywacji różnych białek [1]. W fizjologicznych warunkach produkcja reaktywnych form tlenu odbywa się w ściśle określonych przedziałach komórki i w określonym czasie. Nadtlenek wodoru oraz anionorodnik ponadtlenkowy, poprzez regulację stanu redoks, są zaangażowane w regulację procesu różnicowania komórek, proliferację oraz migrację. Z kolei nadprodukcja RFT wiąże się z zachwianiem równowagi redoks w komórce i może prowadzić do zaburzenia funkcjonowania komórki i apoptozy. Zjawiska te mają miejsce w patologiach takich jak miażdżyca, niewydolność serca, neurodegeneracja, oraz również w czasie starzenia organizmu [4]. RFT powstają w wyniku aktywności mitochondriów niewielki procent elektronów przenoszonych przez kompleksy enzymatyczne obecne na wewnętrznej błonie tego organellum wycieka i w wyniku nieenzymatycznej reakcji redukuje czą- Postępy Biochemii 60 (1)

2 steczkę tlenu do, przekształcanego następnie w H 2. Wyciek ma miejsce głównie na poziomie kompleksu I oraz w momencie przekazywania elektronów przez koenzym Q na kompleks II i III [5]. Uważa się, że podczas oddychania komórkowego około 0,2-2% tlenu cząsteczkowego nie jest redukowana do cząsteczki wody, lecz jest przekształcana w anionorodnik ponadtlenkowy [6]. Innym mechanizmem produkcji RFT są reakcje enzymatyczne przeprowadzane przez enzymy takie jak oksydazy NADPH (NOX), oksydaza ksantynowa, syntaza tlenku azotu oraz cytochrom P450. Spośród nich to właśnie oksydazy NADPH wydają się być bardzo ważnymi enzymami zdolnymi do produkcji RFT, które w sposób ściśle kontrolowany są w stanie podnieść poziom RFT w określonych przedziałach komórki [7]. Niniejsza praca przeglądowa poświęcona jest jednej z izoform oksydazy NADPH NOX4 oraz jej roli w regulacji różnych procesów komórkowych. OKSYDAZY NADPH Pierwszą opisaną oksydazą NADPH było białko gp91 phox, później nazwane NOX2. Oksydaza ta jest aktywna w komórkach układu odpornościowego takich jak neutrofile i makrofagi i znajduje się na błonie fagolizosomu zawierającego patogen. W momencie kontaktu z patogenem dochodzi do tak zwanego wybuchu tlenowego, czyli wydzielenia znacznych ilości reaktywnych form tlenu w celu zabicia bakterii. Za wydzielanie anionorodnika ponadtlenkowego, przekształcanego przez dysmutazę ponadtlenkową do nadtlenku wodoru, odpowiedzialna jest NOX2. Do oksydazy tej przyłączona jest podjednostka p22 phox, a do funkcjonowania tego kompleksu niezbędne są jeszcze cytoplazmatyczne białka p47 phox, p40 phox, które odpowiadają za organizację kompleksu oraz białko p67 phox, do którego dołączają się białka z rodziny Rac, wiążące GTP [8]. Wkrótce po odkryciu oksydazy NOX2 wykazano występowanie enzymów funkcjonujących w podobny sposób w komórkach nie związanych z układem odpornościowym. U pacjentów z brakiem gp91 phox odkryto oksydazę produkującą anionorodnik ponadtlenkowy w fibroblastach. Izoformę tę nazwano NOX1 i znaleziono ją także w komórkach mięśni gładkich naczyń krwionośnych oraz w wielu typach komórek nowotworowych [8]. NOX1 wymaga obecności białek NOXO1 (homolog białka p47 phox ) oraz NOXA1 (homolog białka p67 phox ), a aktywność tego enzymu jest regulowana przez angiotensynę II i płytkopochodny czynnik wzrostu (PDGF). Wykazano, że NOX1 może produkować niewielkie ilości wolnych rodników tlenowych także bez dodatkowej stymulacji [9]. Kolejno odkrywane izoformy oksydaz NADPH zbudowane są według podobnego planu (Ryc. 1). Trzon cząsteczki stanowi domena transbłonowa, przenikająca sześciokrotnie przez błonę. Związane są z nią 2 reszty hemu jest to homolog białka gp91 phox. Zarówno koniec karboksylowy, jak i aminowy znajdują się w cytoplazmie, a na C-końcu występuje sekwencja przyłączająca FAD lub NADPH [10]. Do tej pory odkryto 7 izoform oksydaz NADPH: NOX1-5 oraz DUOX1-2. W zależności od izoformy, białka te są produkowane w różnych tkankach, na przykład NOX3 jest obecne w komórkach ucha środkowego oraz w niewielkiej ilości w mózgu [8]. Podobnie jak w przypadku NOX1, oksydaza NOX3 wymaga do aktywności obecności NOXO1 i NOXA1. Rycina 1. Schemat przedstawiający strukturę białek z rodziny oksydaz NADPH. Na podstawie [44], zmienione. Z kolei aktywność NOX5 nie jest uzależniona od dodatkowych białek, natomiast na końcu aminowym zawiera sekwencję z motywem EF, podobną do tej, która występuje w kalmodulinie, do której przyłączane są 4 jony wapnia [7]. Aktywność tego białka jest więc zależna od wewnątrzkomórkowego stężenia Ca 2+ [11]. Białko NOX5 jest syntetyzowane w komórkach jąder, nerek, śledziony, ale także w śródbłonku oraz komórkach mięśni gładkich naczyń krwionośnych. Z kolei DUOX1 oraz DUOX2 produkują reaktywne formy tlenu w komórkach nabłonka tarczycy. Plan ich budowy odbiega od wzorca mają siedem domen transbłonowych oraz, jak w przypadku NOX5, N-końcową domenę EF. Aktywność DUOX1 i 2 jest więc również zależna od wewnątrzkomórkowego stężenia jonów wapnia [8,11,12]. Produkty aktywności białek z rodziny oksydaz NADPH przedstawiono w Tabeli 1. Tabela 1. Główne produkty aktywności oksydaz NADPH oraz wymagane podjednostki. dodatkowe Symbol białka produkowane RFT podjednostki p22 NOX1 phox, NOXO1 i NOXA1 p22 NOX2 phox, p47 phox, p40 phox, p67 phox p22 NOX3 phox, NOXO1, H 2 i NOXA1 NOX4 H 2 p22 phox NOX5, H 2 nie wymaga DUOX1 H 2 nie wymaga DUOX2 H 2 nie wymaga Na podstawie źródeł cytowanych w tekście pracy. 70

3 OKSYDAZA NADPH 4 (NOX4) Izoforma 4 oksydazy NADPH (NOX4) jest zbudowana analogicznie do pozostałych białek tej rodziny. Składa się z 6 domen transbłonowych i wymaga obecności cytozolowej podjednostki p22 phox. Zidentyfikowano 4 warianty transkrypcyjne NOX4 NOX4B, NOX4C, NOX4D oraz NOX4E. Izoformy B i C mają zmieniony koniec karboksylowy białka i w związku z tym nie mogą związać odpowiednio NADPH lub FAD i NADPH. Izoformy D i E z kolei nie posiadają domen transbłonowych [13]. Podobnie jak inne oksydazy NADPH, ze względu na swoją budowę NOX4 związana jest z błonami. Enzym ten zlokalizowany jest w siateczce endoplazmatycznej w przestrzeni okołojądrowej, nie znajduje się go jednak w błonie komórkowej [14]. Graham i wsp. [15] pokazali, że białko to w nowotworowych komórkach nabłonkowych gruczołu piersiowego jest zakotwiczone w mitochondrium za pomocą N-końcowego fragmentu, a Ago i wsp. [16] dowiedli tego samego w komórkach mięśnia sercowego. Badania Kurody [17] wykazały z kolei, iż NOX4 może występować także w jądrze komórkowym komórek śródbłonka pochodzących z żyły pępowinowej (HUVEC), gdzie tworzy funkcjonalny kompleks z białkiem p22 phox. Po dodaniu substratu (NADPH) do lizatu białkowego otrzymanego z frakcji jądrowej tych komórek, obserwuje się przy pomocy testu chemiluminescencyjnego produkcję RFT. Wyciszenie ekspresji genu NOX4 za pomocą techniki RNAi skutkowało spadkiem, a stymulacja NOX4 estrami forbolu (PMA) wzrostem poziomu RFT. Doniesienia te potwierdzają wyniki doświadczeń opisanych przez Anilkumara i wsp. [18], którzy zidentyfikowali w pełni funkcjonalny 28-kDa wariant splicingowy białka NOX4 (NOX4D), znajdujący się w jądrze oraz jąderku. NOX4 w jądrze komórkowym prawdopodobnie odgrywa rolę w regulacji ekspresji genów związanych z odpowiedzią na stres oksydacyjny [17]. NOX4 ma unikalny charakter, ponieważ jako jedyna spośród tej rodziny oksydaz jest aktywna konstytutywnie [19]. Aktywność tej oksydazy jest zależna od jej poziomu w komórce, który z kolei jest wprost proporcjonalny do ilości transkryptu NOX4. Okres półtrwania NOX4 nie jest dokładnie określony, ale doświadczenia przeprowadzone na komórkach transfekowanych wektorem zawierający NOX4 pod kontrolą promotora indukowanego tetracykliną wykazały, że enzym ten jest szybko syntetyzowany w odpowiedzi na ten induktor i degradowany w przeciągu kilku godzin po jego zabraniu [20]. Ostatnie badania [21] doprowadziły do identyfikacji partnera podjednostki p22 phox, białka Poldip2 (ang. polymerase [DNA-directed] delta-interacting protein 2), w obecności którego NOX4 produkuje trzykrotnie więcej wolnych rodników tlenowych, pełniących rolę w procesie tworzenia aktynowych włókien stresowych, istotnych w procesie migracji komórek [21]. Głównym produktem aktywności NOX4 jest nadtlenek wodoru, ale mechanizm tej reakcji nie jest znany. Prawdopodobnie powstający w wyniku redukcji tlenu cząsteczkowego anionorodnik ponadtlenkowy jest natychmiast dysmutowany do nadtlenku wodoru [7,20]. Nadtlenek wodoru nie jest obdarzony ładunkiem, dzięki czemu może swobodnie przenikać przez błony biologiczne i funkcjonować jako cząsteczka sygnałowa [12]. Istnieją jednak prace pokazujące, że NOX4 produkuje również anionorodnik ponadtlenkowy głównie w komórkach mięśnia sercowego [16]. NOX4 jest białkiem szeroko rozpowszechnionym w organizmie człowieka. Jego syntezę wykazano w fibroblastach, keratynocytach, osteoklastach, neuronach oraz w komórkach układu krążenia komórkach mięśnia sercowego, śródbłonka oraz w komórkach mięśni gładkich naczyń krwionośnych [7]. Jednak po raz pierwszy został on zidentyfikowany jako nerkowy homolog białka gp91 phox - renox (ang. Renal NAD(P)H oxidase) [22]. Białko to jest wytwarzane na wysokim poziomie i jest źródłem wolnych rodników tlenowych w proksymalnych kanalikach krętych kory nerkowej. Geiszt i wsp. [22] sugerowali, że NOX4 może działać jako sensor stężenia tlenu w komórce i regulować syntezę erytropoetyny w komórkach kory nerki. Erytropoetyna, jako białko indukowane niedotlenieniem, jest produkowane pod wpływem czynnika transkrypcyjnego HIF-1α. Czynnik ten jest destabilizowany przez reaktywne formy tlenu, pojawiające się przy prawidłowym, fizjologicznym stężeniu tlenu w komórce, gdy erytropoetyna nie jest potrzebna. Natomiast podczas obniżonego stężenia tlenu w komórce produkcja RFT jest ograniczona i w związku z tym HIF-1α może aktywować syntezę erytropoetyny [22]. ROLA NOX4 W STARZENIU KOMÓRKOWYM Udział RFT w indukcji procesu starzenia był postulowany już w latach pięćdziesiątych zeszłego wieku, kiedy to Harman sformułował wolnorodnikową teorię starzenia [2]. Od tamtej pory większość badań koncentrowało się na roli mitochondriów jako głównego źródła RFT w komórce ulegającej starzeniu. Jednakże prace prowadzone w ostatnich latach dowodzą, że również oksydazy NADPH mogą odgrywać istotną rolę w tym procesie. Starzenie komórkowe jest procesem związanym z nieodwracalnym zahamowaniem cyklu komórkowego i wiąże się z nagromadzeniem uszkodzeń DNA w telomerowych odcinkach chromosomów [23]. Powstawanie tych uszkodzeń może być wynikiem stopniowego skracania telomerów w każdej kolejnej rundzie replikacji DNA lub też mogą one powstawać pod wpływem czynników działających genotoksycznie, takich jak RFT, promieniowanie nadfioletowe, gamma, rentgenowskie oraz chemioterapeutyki. Starzenie związane ze skracaniem telomerów określa się mianem starzenia replikacyjnego, podczas gdy starzenie indukowane czynnikami uszkadzającymi DNA to tzw. przedwczesne starzenie wywoływane stresem. W komórce, w której doszło do uszkodzenia DNA aktywowany jest szlak odpowiedzi na uszkodzenia DNA (DDR, ang. DNA damage response), który prowadzi do trwałego zahamowania cyklu komórkowego. Dzięki temu komórki z uszkodzonym materiałem genetycznym, którego nie mogą naprawić, nie dzielą się, ale zostają przeprogramowane ulegają starzeniu. Zmienia się ich morfologia oraz funkcja, stają się bardziej aktywne metabolicznie i wydzielają do środowiska zewnętrznego wiele związków, w tym cytokin prozapalnych. Powstający w wyniku nagromadzenia w tkankach komórek starych chroniczny stan zapalny w bardzo istotny sposób wpływa na zaburzenia funkcjonowania tkanki, promując rozwój zmian patologicznych [24]. Informacje na temat potencjalnej roli NOX4 w starzeniu komórkowym pojawiły się już w pierwszej publikacji dotyczącej tego białka [22]. Autorzy wykazali, że fibroblasty z nadprodukcją NOX4 mają cechy komórek starych - zmie- Postępy Biochemii 60 (1)

4 niają swoją morfologię oraz zaprzestają podziałów. Zwiększona ilość RFT będąca wynikiem aktywności NOX4, może zaburzać równowagę redoks w komórkach i prowadzić także do uszkodzeń DNA, które są przyczyną starzenia [25]. McCrann i wsp. [26] wykazali, że w komórkach mięśni gładkich naczyń, izolowanych z aorty starych szczurów poziom NOX4 jest wyższy niż w komórkach pochodzących od młodych zwierząt. Komórki te były także poliploidalne. Doświadczenia in vitro na komórkach mięśni gładkich izolowanych z aorty szczura (ang. vascular smooth muscle cells, VSMC), z nadekspresją genu kodującego NOX4 wykazały akumulację komórek poliploidalnych i zmianę ich morfologii stawały się one hipertroficzne i miały fenotyp komórek starych. Jednocześnie obserwowano spadek ilości oraz nieprawidłową lokalizację surwiwiny, białka niezbędnego podczas rozdziału chromosomów w czasie mitozy, co może tłumaczyć wzrost odsetka komórek aneuploidalnych [26]. Badania in vitro na komórkach śródbłonka izolowanych z żyły pępowinowej (HUVEC) wykazały wpływ NOX4 na starzenie replikacyjne tych komórek. Za pomocą techniki interferencji RNA (shrna) obniżono znacząco ekspresję genu białka NOX4 i obserwowano, że komórki te przechodzą więcej podziałów niż komórki z normalnym poziomem tego enzymu. W momencie zatrzymania proliferacji miały one krótsze telomery w porównaniu z komórkami kontrolnymi, transfekowanymi pustym plazmidem. Sugeruje to udział RFT produkowanych przez NOX4 w procesie starzenia replikacyjnego. Brak białka NOX4 oznacza jednocześnie obniżony poziom RFT w komórce, które mogłyby uszkadzać materiał genetyczny i w konsekwencji prowadzić do aktywacji punktu kontroli w fazie G1 cyklu komórkowego i zatrzymania podziałów. Rzeczywiście, w komórkach z obniżonym poziomem białka NOX4 obserwowano niższą ilość utlenionej formy guaniny (8-oxo- -dg), znacznika oksydacyjnych uszkodzeń DNA, a także obniżony poziom ufosforylowanej formy histonu H2AX (γh2ax), znacznika podwójnych pęknięć DNA, niż w komórkach z normalnym poziomem tej oksydazy. Wyniki te wskazują na istotną rolę NOX4 w starzeniu komórek śródbłonka naczyń [27]. Ta sama grupa zbadała również wpływ NOX4 na mitochondria, szukając możliwego mechanizmu modulującego oddziaływanie tego białka na proces starzenia komórkowego. Zaobserwowali oni, że sieć mitochondrialna miała inną strukturę w komórkach z wyciszoną za pomocą shrna ekspresją genu NOX4 niż w komórkach kontrolnych mitochondria były odseparowane od siebie i nie tworzyły sieci. Były jednak dużo bardziej oporne na niekorzystny wpływ promieniowania potencjał błonowy tych mitochondriów nie spadał nawet po minucie naświetlania, a dopiero po 3 minutach ulegał zaburzeniu. Za pomocą wysokorozdzielczej respirometrii pokazali również, że równolegle do procesu starzenia replikacyjnego, wraz z czasem trwania hodowli in vitro, mitochondria komórek powoli tracą swoją aktywność, a oddychanie staje się mniej efektywne. Natomiast mitochondria komórek z obniżonym poziomem NOX4 oddychają z taką samą intensywnością przez cały czas trwania hodowli. Zaobserwowano także, że w komórkach z fizjologicznym poziomem NOX4 z czasem obniża się poziom białek kompleksu I łańcucha oddechowego, co może tłumaczyć spadek aktywności mitochondriów. Tak więc ciągła, konstytutywna aktywność NOX4 wpływa z czasem na zaburzenia funkcjonowania tych organelli i być może jest to związane z mitochondrialną lokalizacją tego białka w komórkach HUVEC [28]. Inni badacze także wskazują, że nie tylko aktywność, ale również lokalizacja NOX4 może być bardzo istotna dla starzenia komórkowego. Komórki mięśni gładkich izolowane z ludzkiej aorty, które miały zwiększony poziom syntezy NOX4D, jądrowej 28-kDa izoformy oksydazy NOX4, wykazywały wyższy poziom fosforylacji histonu H2AX (γh2ax), znacznika podwójnych uszkodzeń nici DNA, niż komórki ze zmutowaną, nieaktywną formą tego białka. Uszkodzenia te były wynikiem działania RFT, ponieważ hodowla komórek w obecności inhibitora oksydaz NADPH lub katalazy czy dysmutazy ponadtlenkowej skutkowała spadkiem fosforylacji histonu. Autorzy nie badali co prawda czy komórki z nieaktywną NOX4D ulegają procesowi starzenia później niż komórki z prawidłową formą tego białka [18], ale wyniki ich badań wskazują jednoznacznie na potencjalną jego rolę w indukcji uszkodzeń DNA, które mogą prowadzić do starzenia komórkowego. Starzenie komórkowe jest bardzo istotnym mechanizmem przeciwnowotworowym. Aktywacja onkogenów może powodować tak zwany stres replikacyjny. Ciągły sygnał do podziału komórki sprawia, że mechanizmy wewnątrzkomórkowe nie nadążają z naprawą błędnie zreplikowanych fragmentów bądź pęknięć w obrębie nici DNA i w końcu dochodzi do aktywacji punktu kontrolnego cyklu komórkowego i zahamowania proliferacji komórek. Zjawisko to jest nazywane starzeniem indukowanym onkogenami. Zaktywowane onkogeny mogą indukować wytwarzanie RFT, które w tej sytuacji są kolejnym czynnikiem uszkadzających DNA. Najnowsze badania dowodzą, że źródłem RFT w starzeniu indukowanym onkogenami mogą być właśnie oksydazy NADPH. Weyemi i wsp. [29] przeprowadzili badania na unieśmiertelnionej linii komórek tarczycy transfekowanych wektorem zawierającym onkogen H-Ras będący pod kontrolą promotora indukowanego doksocykliną. Ekspresji onkogenu towarzyszyła indukcja syntezy białka NOX4, która w normalnych warunkach w tych komórkach jest aktywna jedynie na niskim poziomie. Oprócz wzrostu poziomu transkryptu NOX4, obserwowano również wzrost aktywności tego enzymu manifestującego się wzrostem stężenia RFT w komórkach. Aktywacja produkcji H-Ras skutkowała wzrostem uszkodzeń DNA, w tym fosforylacją histonu H2AX, akumulacją białka p21 Cip1 oraz tworzeniem skupisk heterochromatyny w jądrze komórkowym są to markery starzenia komórkowego. Zahamowanie syntezy NOX4 oraz p22 phox za pomocą techniki sirna obniżało liczbę uszkodzeń DNA w komórkach oraz skupisk heterochromatyny o około 50%, a także obniżało poziom białka p21 Cip1. Zastosowanie antyoksydanta N-acetylo-L-cysteiny dawało podobny efekt. Wyniki te wskazują więc na istotną funkcję białka NOX4, które będąc indukowane onkogenem, działa przeciwnowotworowo, hamując proliferację i prowadząc do starzenia [29]. Badania te potwierdzili Kodama i wsp. [30], przeprowadzając doświadczenia na fibroblastach izolowanych z płuc. Wykazali ponadto, że NOX4 indukowana onkogenem Ras lub nadprodukcja tej oksydazy mogą prowadzić do starzenia komórkowego poprzez aktywację kinazy p38mapk oraz wzrost poziomu białka p16 Ink4a. W ten 72

5 sposób wykazali nowy, potencjalny mechanizm prowadzący do zahamowania podziałów nieprawidłowych komórek. Badania Senturk i wsp. [31] pokazują z kolei, że NOX4 może odgrywać ważną rolę w starzeniu komórek nowotworowych w sposób niezależny od onkogenów. Komórki nowotworowe wątroby traktowano transformującym czynnikiem wzrostu β (TGF-β), które pod jego wpływem ulegały procesowi starzenia. Proces ten był niezależny od białka p53 i p16 Ink4a, ale zależny od p21 Cip1 i p15 Ink4b. Komórki zatrzymywały się w fazie G1 cyklu komórkowego i miały zwiększoną syntezę oraz aktywność białka NOX4. Wyciszenie ekspresji NOX4 lub zastosowanie N-acetylo-L-cysteiny - zmiatacza wolnych rodników tlenowych skutkowało odwróceniem fenotypu starzeniowego badanych komórek. Poziom białek p21 Cip1 i p15 Ink4b z powrotem ulegał obniżeniu, a komórki zaczynały się dzielić. NOX4 jest więc białkiem odgrywającym kluczową rolę w utrzymaniu zahamowania podziałów komórek pod wpływem TGF-β [31]. ROLA NOX4 W PROLIFERACJI KOMÓREK Wyniki badań przedstawione w poprzednim rozdziale dowodzą, że zwiększona aktywność NOX4 może prowadzić do trwałego zahamowania proliferacji. Z drugiej jednak strony niektóre badania wskazują na udział NOX4 i produkowanych przez nią RFT w proliferacji komórek nowotworowych. W komórkach prawidłowych nadprodukcja NOX4 indukuje spadek tempa proliferacji oraz starzenie. W przypadku wzmożonej syntezy w komórkach linii nowotworowych, między innymi raka piersi oraz jajnika, efekt ten jest przeciwny. Tempo podziałów rośnie, komórki chętniej migrują i mają inwazyjny charakter. Zastosowanie katalazy bądź inhibitora oksydazy NADPH odwracało ten efekt, potwierdzając teorię, że to RFT produkowane przez NOX4 są odpowiedzialne za ten fenotyp [15]. NOX4 bierze także udział w regulacji proliferacji oraz migracji VSMC izolowanych z tętnicy płucnej. Procesy te odgrywają ważną rolę w przemodelowaniu tętnicy płucnej w czasie rozwoju pierwotnego nadciśnienia płucnego. Ekspresja oraz aktywność NOX4 wzrasta pod wpływem czynnika wzrostu nowotworów (TGF-β1), syntetyzowanego w czasie tej choroby. TGF-β1 oddziałuje na czynnik transkrypcyjny SMAD2/3, który ulega fosforylacji i translokacji do jądra, gdzie tworzy kompleks indukujący ekspresję m.in. genu NOX4. RFT produkowane przez NOX4 są istotne w proliferacji komórek mięśni gładkich tętnicy płucnej, sugerując iż proces ten indukowany przez TGF-β1 jest przynajmniej częściowo zależny od stanu redoks komórki. Wyciszenie ekspresji NOX4 hamowało proliferację komórek, co potwierdza tę tezę. Wykazanie zależności pomiędzy poziomem TGF-β1, syntezę i aktywnością NOX4 a proliferacją i migracją VSMC sugeruje, że enzym ten może odgrywać istotną rolę w rozwoju nadciśnienia płucnego [32]. Niedawno wykazano także rolę NOX4 oraz DUOX2 w proliferacji prawidłowych fibroblastów. Aktywność obu tych oksydaz wzrastała pod wpływem PDGF, co skutkowało uruchomieniem szlaków sygnałowych wiodących poprzez białka Akt oraz ERK1 do fosforylacji białka Rb i indukcji proliferacji. Wyciszenie ekspresji NOX4 lub DUOX2 powodowało spadek fosforylacji białka ERK1 oraz aktywację p53 oraz akumulację p21 Cip1, prowadzących do zahamowania cyklu komórkowego. Z kolei wyciszenie ekspresji genów białek NOX4 lub DUOX2 razem z p53 lub p21 Cip1 dawało odwrotny efekt obserwowano fosforylację białka Rb. Wysnuto więc wniosek, że oksydazy NOX4 oraz DUOX2 biorą udział w regulacji wejścia komórek w cykl komórkowy, inaktywując zależny od białka p53 punkt kontroli mitozy [33]. ROLA NOX4 W RÓŻNICOWANIU KOMÓREK ORAZ TRANZYCJI NABŁONKOWO-MEZENCHYMALNEJ Wyniki prowadzonych badań wskazują na udział białka NOX4 również w rozwoju chorób takich jak idiopatyczne zwłóknienie płuc czy zwłóknienie mięśnia sercowego towarzyszące niewydolności serca, które związane są z różnicowaniem komórek. Pod wpływem obecnego podczas rozwoju tych chorób czynnika wzrostu nowotworu TGF-β1 odpowiednio w fibroblastach płucnych oraz fibroblastach obecnych w sercu dochodzi do wzrostu syntezy NOX4 i zwiększonej produkcji RFT. Fenotyp tych komórek ulega zmianie - dochodzi do produkcji α-aktyny mięśni gładkich (α-sma) oraz prokolagenu I (α1), które są charakterystyczne dla miofibroblastów. Wyciszenie ekspresji NOX4 lub zastosowanie N-acetylo-L-cysteiny zabezpieczało komórki przed syntezą tych białek oraz odróżnicowaniem. Z molekularnego punktu widzenia, zahamowanie ekspresji NOX4 powodowało spadek aktywacji (fosforylacji) czynników transkrypcyjnych z rodziny SMAD, pod których kontrolą znajduje się gen dla α-sma. [34, 35]. Zjawisko różnicowania fibroblastów do miofibroblastów ma także miejsce podczas rozwoju łagodnego przerostu prostaty oraz raka prostaty. Również i tu obecny TGF-β1 indukuje ekspresję NOX4 oraz obniża syntezę białek związanych z usuwaniem RFT tioredoksyny, reduktazy tioredoksyny, peroksydazy glutationowej, a także transportera selenu, pierwiastka istotnego dla funkcjonowania tych enzymów. Indukcja produkcji białek charakterystycznych dla miofibroblastów, między innymi α-smc, jest pod kontrolą kinazy JNK, której aktywność zależy od statusu redoks komórki. Tak więc i w tym przypadku badacze wskazali na istotną rolę RFT pochodzących od NOX4. Rzeczywiście, wyciszenie ekspresji genu tej oksydazy za pomocą shrna lub przywrócenie ekspresji selenoenzymów skutkuje zablokowaniem aktywności kinazy JNK i zahamowaniem różnicowania komórek. Daje to nadzieje na zapobieganie i leczenie raka prostaty [36]. Trochę inny mechanizm indukcji syntezy α-smc, wskazujący tym razem na udział kinazy p38mapk, zidentyfikowano w VSMC izolowanych z aorty. VSMC to komórki mogące mieć dwa różne fenotypy kurczliwy lub wydzielniczy. Komórki o fenotypie wydzielniczym mogą się dzielić, migrować oraz wydzielać wiele białek i w ten sposób odgrywają rolę w patogenezie różnych chorób, w tym miażdżycy. Wykazano, że pod wpływem TGF-β może dojść do przemiany fenotypu wydzielniczego na kurczliwy, co może być potencjalnym celem terapii chorób związanych z układem sercowo-naczyniowym. W wyniku inkubacji komórek z TGF-β dochodzi do syntezy α-sma, markera VSMC o fenotypie kurczliwym oraz nadprodukcji NOX4. Wyłączenie ekspresji genu tej oksydazy skutkuje również brakiem syntezy α-sma. Wykazano, iż synteza α-sma jest zależna od kinazy p38mapk działającej w odpowiedzi na RFT. Kinaza ta aktywuje SRF (ang. serum response factor), czynnik trans- Postępy Biochemii 60 (1)

6 krypcyjny wchodzący w kompleks z MRTF (ang. myocardin- -related transcription factor), który przyłącza się do promotora dla α-sma i reguluje jego syntezę. Udało się więc wyjaśnić molekularny mechanizm zmiany patologicznego, wydzielniczego fenotypu VSMC na fenotyp kurczliwy i wskazano na pozytywną rolę oksydazy w tym procesie [37]. Istotną rolę NOX4 wykazano również w procesie tranzycji komórek nabłonkowych do mezenchymalnych, który może mieć znaczenie fizjologiczne np. w czasie rozwoju organizmu, gojeniu się ran, ale także prowadzić do patologii, gdzie towarzyszy włóknieniu różnych narządów. Ta tranzycja może być również wykorzystywana przez komórki nowotworowe do inwazji oraz przerzutowania, ponieważ komórki mezenchymalne mają zwiększoną plastyczność oraz chętniej migrują w porównaniu do komórek nabłonkowych. Komórki nowotworowe wydzielają wiele cytokin, w tym TGF-β, który jest głównym induktorem tej tranzycji. W komórkach nabłonkowych gruczołu piersiowego, zarówno prawidłowych jak i nowotworowych, TGF-β indukuje czynnik transkrypcyjny SMAD3, który pozytywnie reguluje syntezę NOX4. Dochodzi do zwiększenia poziomu tego białka oraz jednocześnie wzrostu ilości RFT, które są niezbędne w przekazywaniu sygnału skutkującego produkcją fibronektyny białka charakterystycznego dla komórek mezenchymalnych. Zahamowanie aktywności czynnika transkrypcyjnego SMAD2 lub wyciszenie ekspresji NOX4 prowadziło do braku syntezy fibronektyny oraz zaburzenia migracji, tak ważnej cechy komórek przerzutujących. Wyniki te pokazują, że NOX4 jest istotne w postępie transformacji komórek nabłonkowych gruczołu piersiowego do komórek mezenchymalnych, a poznanie molekularnego mechanizm tego procesu stwarza nadzieję na opracowanie terapii hamującej ten proces w stanach patologicznych [38]. ROLA NOX4 W FIZJOLOGII I PATOLOGII UKŁADU KRWIONOŚNEGO Chociaż występowanie NOX4 stwierdza się w wielu tkankach, a jej działanie ma wpływ na różne procesy w różnych typach komórek, to jednak szczególnie dużo uwagi poświęca się roli NOX4 w fizjologii i patologii układu krwionośnego. Wykazano na przykład, że RFT będące wynikiem aktywności NOX4 biorą udział w regulacji rozszerzania i skurczu naczyń oraz odgrywają istotną rolę w procesie migracji, głównie komórek mięśni gładkich naczyń. NOX4 przypisuje się również rolę w wapnieniu naczyń krwionośnych, ale także we wzroście komórek układu krwionośnego, ich apoptozie, różnicowaniu oraz starzeniu [7]. Jednym z białek mających wpływ na aktywność NOX4 oraz innych białek z tej rodziny oksydaz jest angiotensyna II. W fizjologicznych stężeniach hormon ten powoduje skurcz mięśni gładkich naczyń krwionośnych i w ten sposób odpowiada za regulację ciśnienia krwi. Badania in vitro VSMC izolowanych ze szczurzej aorty i hodowanych w obecności angiotensyny II wskazują, że hormon ten pośrednio stymuluje aktywność oksydaz NADPH. Angiotensyna II aktywuje fosfolipazę D, która hydrolizuje fosfatydylocholinę do kwasu fosfatydowego oraz diacyloglicerolu, z którego w konsekwencji powstaje kwas arachidonowy. Doświadczenia pokazały, że VSMC stymulowane zarówno angiotensyną II jak i kwasem fosfatydowym lub kwasem arachidonowym mają wyższą aktywność oksydaz NADPH oraz, co za tym idzie, wytwarzają więcej RFT w porównaniu do komórek nie traktowanych i stają się hipertroficzne [39]. Ponadto angiotensyna II może aktywować ścieżkę zależną od kinazy JAK oraz czynników transkrypcyjnych z rodziny STAT (JAK/STAT) i w ten sposób regulować ekspresję NOX4. Rzeczywiście wykazano, iż w promotorze genu NOX4 znajduje się sekwencja rozpoznawana przez czynniki transkrypcyjne STAT1 oraz STAT2. Nadprodukcja tych czynników lub aktywacja ścieżki JAK/STAT za pomocą interferonu γ skutkuje wzrostem ekspresji genu, a w konsekwencji również podniesieniem puli aktywnej oksydazy NOX4 w komórkach [40]. W VSMC hodowanych in vitro w obecności czynnika martwicy nowotworów α (TNFα) także obserwowano wzrost ekspresji NOX4. Wiadomo, że czynnik ten indukuje ścieżkę przesyłania sygnału prowadzącą do aktywacji czynnika transkrypcyjnego NF-κB, która odpowiada za regulację ekspresji genów związanych ze stanem zapalnym. Dowiedziono, że NF-κB przyłącza się do promotora NOX4 i odpowiada za regulację jego ekspresji [41]. Stan zapalny oraz stres oksydacyjny są istotnymi procesami biorącymi udział w patogenezie chorób związanych z układem sercowo-naczyniowym. Jest szereg prac wskazujących na rolę NOX4 w tych patologiach związanych z układem krwionośnym i pozostają one w zgodzie z opisanymi wcześniej mechanizmami regulacji jego ekspresji. Badania in vivo na myszach wykazały, że ekspresja NOX4 wzrasta w komórkach mięśnia sercowego narażonego na bodźce prowadzące do jego przerostu, takie jak angiotensyna II lub fenylefryna. U transgenicznych myszy ze zwiększoną ekspresją NOX4 obserwowano stopniowe powiększanie się lewej komory serca, zwłóknianie serca oraz podwyższoną liczbę komórek ulegających apoptozie w porównaniu do komórek mięśnia sercowego, które syntetyzowały nieaktywną katalitycznie formę NOX4. Badania in vitro prowadzone na miocytach serca z nadprodukcją NOX4 nie potwierdziły hipertrofii na poziomie komórkowym, ale zaobserwowano wzrost odsetka komórek apoptotycznych. NOX4 w tych komórkach występuje w mitochondriach i produkuje anionorodnik ponadtlenkowy do ich wnętrza. W wyniku tej aktywności dochodzi do utleniania reszt cysteinowych białek mitochondrialnych związanych z cyklem kwasów trójkarboksylowych i białek łańcucha transportu elektronów oraz obniżenia syntezy niektórych białek związanych z biogenezą mitochondriów. Powoduje to zaburzenie funkcjonowania mitochondriów, uwolnienie cytochromu c i aktywację procesu apoptozy [16]. Wyniki te zostały potwierdzone przez Kurodę i wsp. [42], którzy wykorzystując transgeniczne myszy z wyłączoną ekspresją NOX4 jedynie w komórkach mięśnia sercowego nie obserwowali patologicznych zmian w sercu. Mimo że myszy miały podwyższone ciśnienie krwi, komórki mięśniowe nie wykazywały hipertrofii, nie tworzyły zwłóknień ani nie ulegały apoptozie. Nie obserwowano również produkcji wolnych rodników tlenowych, co jednoznacznie wskazuje, iż to właśnie NOX4 jest ich jedynym źródłem w tych komórkach. Można więc wysnuć wniosek, że RFT produkowane przez NOX4 prowadzą do oksydacyjnych uszkodzeń w mitochondriach, co odgrywa rolę w patogenezie chorób związanych z zaburzeniem pracy mięśnia sercowego [42]. Produkowane przez oksydazy NADPH wolne rodniki tlenowe biorą udział we wtórnym zwężeniu tętnicy po za- 74

7 1. Dröge W (2002) Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol Rev 82: Harman D (1956) Aging: a theory based on free radical and radiation chemistry. J Gerontol 11: Bartosz G (2013) Druga twarz tlenu. Wolne rodniki w przyrodzie. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, str , Dikalov S (2011) Cross talk between mitochondria and NADPH oxidases; Free Radic Biol Med 51: Potargowicz E, Szerszenowicz E, Staniszewska M, Nowak D (2005) Mitochondria jako źródło reaktywnych form tlenu. Postepy Hig Med Dosw 59: Li X, Fang P, Mai J, Choi ET, Wang H, Yang XF (2013) Targeting mitochondrial reactive oxygen species as novel therapy for inflammatory diseases and cancers. J Hematol Oncol 6: Monetzano AC, Burger D, Ceravolo GS, Yusuf H, Montero M, Touyz RM (2011) Novel Nox homologues in the vasculature: focusing on Nox4 and Nox5. Clin Sci (Lond) 120: Bedard K, Krauze KH (2007) The NOX family of ROS-generating NADPH Oxidases: Physiology and Pathophysiology. Physiol Rev 87: Lassègue B, Griendling KK (2010) NADPH oxidases: functions and pathologies in the vasculature. Arterioscler Thromb Vasc Biol 30: Touyz RM, Briones AM, Sedeek M, Burger D, Montezano AC (2011) NOX isoforms and reactive oxygen species in vascular health. Mol Interv 11: Schramm A, Matusik P, Osmenda G, Guzik T (2012) Targeting NADPH oxidases in vascular pharmacology. Vascul Pharmacol 56: Cai H (2005) NAD(P)H oxidase-dependent self-propagation of hydrogen peroxide and vascular disease. Circ Res 96: Goyal P, Weissmann N, Rose F, Grimminger F, Schäfers HJ, Seeger W, Hänze J (2005) Identification of novel NOX4 splice variants with impact on ROS levels in A549 cells. Biochem Biophys Res Commun 329: Chen K, Kirber MT, Xiao H, Yang Y, Keaney JF Jr. (2008) Regulation of ROS signal transduction by NADPH oxidase 4 localization. J Cell Biol 181: Graham KA, Kulawiec M, Owens KM, Li X, Desouki MM, Chandra D, Singh KK (2010) NADPH oxidase 4 is an oncoprotein localized to mitochondria. Cancer Biol Ther 10: Ago T, Kuroda J, Pain J, Fu C, Li H, Sadoshima J (2010) Upregulation of NOX4 by hypertrophic stimuli promotes apoptosis and mitochondrial dysfunction in cardiac myocytes. Circ Res 106: Kuroda J, Nakagawa K, Yamasaki T, Nakamura K, Takeya R, Kuribayashi F, Imajoh-Ohmi S, Igarashi K, Shibata Y, Sueishi K, Sumimoto H (2005) The superoxide-producing NAD(P)H oxidase NOX4 in the nucleus of human vascular endothelial cells. Genes Cells 10(12): Anilkumar N, San Jose G, Sawyer I, Santos CX, Sand C, Brewer AC, Warren D, Shah AM (2013) A 28-kDa splice variant of NADPH oxibiegu angioplastyki (restenoza) [43]. Dotychczas uważano, że zjawisko to jest związane z napływem komórek układu odpornościowego do miejsca zabiegu, natomiast dziś wiadomo już, że jest to proces niezależny od układu odpornościowego. RFT produkowane przez komórki mięśni gładkich środkowej i wewnętrznej błony tętnicy oraz fibroblasty tkanki łącznej okrywającej naczynia (przydanki) wpływają na proliferację oraz migrację VSMC. W ten sposób uczestniczą w patologicznej przebudowie tętnic - nadmiernym przeroście błony wewnętrznej naczynia (neointimy). Za ten proces odpowiedzialny jest zarówno NOX1 jak i NOX4 [43]. Wyniki te potwierdzają szerokie spektrum oddziaływania NOX4 na funkcjonowanie układu krwionośnego. PODSUMOWANIE Oksydaza NADPH 4, NOX4, ulega konstytutywnej syntezie w wielu typach komórek, głównie związanych z układem sercowo-naczyniowym. NOX4, w zależności od wariantu transkrypcyjnego, występuje w błonach siateczki endoplazmatycznej, w mitochondrium lub jądrze komórkowym i od jej umiejscowienia mogą zależeć funkcje tego białka. Wskazuje się, że NOX4 może pełnić zarówno pozytywną jak i negatywną rolę w organizmie człowieka (Ryc. 2). Wzmożona aktywacja tej oksydazy umożliwia indukcję procesu starzenia w komórkach z aktywowanym onkogenem lub niezależnie od obecności onkogenu, co zabezpiecza organizm przed nowotworzeniem. Bierze także udział w przywracaniu prawidłowego fenotypu kurczliwego komórkom mięśni gładkich naczyń, hamując proces rozwoju miażdżycy. Z drugiej jednak strony aktywność NOX4 wiązana jest często ze stanami patologicznymi (Ryc. 3). Nadtlenek wodoru oraz anionorodnik ponadtlenkowy, będące produktami aktywności tej oksydazy, mogą działać jako induktory syntezy różnych białek, szczególnie tych zależnych od statusu redoks komórki. Badaczom udało się wykazać wpływ NOX4 na rozwój chorób związanych z układem sercowo- -naczyniowym. Poznanie molekularnych mechanizmów tych procesów jest bardzo istotne, ponieważ stwarza to szansę na opracowanie terapii hamujących aktywność NOX4 w stanach patologicznych, dając możliwość kontrolowania rozwoju chorób takich jak miażdżyca, włóknienie serca czy nadciśnienie. Rycina 2. Schemat ilustrujący procesy komórkowe, w których wykazano udział NOX4. Rycina 3. Schemat ilustrujący zmiany patologiczne, w których postuluje się udział NOX4. PIŚMIENNICTWO Postępy Biochemii 60 (1)

8 dase-4 is nuclear-localized and involved in redox signaling in vascular cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol 33: e Martyn KD, Frederick LM, von Loehneysen K, Dinauer MC, Knaus UG (2006) Functional analysis of NOX4 reveals unique characteristics compared to other NADPH oxidases; Cell Signal 18: Serrander L, Cartier L, Bedard K, Banfi B, Lardy B, Plastre O, Sienkiewicz A, Fórró L, Schlegel W, Krause KH (2007) NOX4 activity is determined by mrna levels and reveals a unique pattern of ROS generation. Biochem J 406: Lyle AN, Deshpande NN, Taniyama Y, Seidel-Rogol B, Pounkova L, Du P, Papaharalambus C, Lassègue B, Griendling KK (2009) Poldip2, a novel regulator of NOX4 and cytoskeletal integrity in vascular smooth muscle cells. Circ Res 105: Geiszt M, Kopp JB, Várnai P, Leto TL (2000) Identification of renox, an NAD(P)H oxidase in kidney. Proc Natl Acad Sci USA 97: Fumagalli M, Rossiello F, Clerici M, Barozzi S, Cittaro D, Kaplunov JM, Bucci G, Dobreva M, Matti V, Beausejour CM, Herbig U, Longhese MP, d Adda di Fagagna F (2012)Telomeric DNA damage is irreparable and causes persistent DNA-damage-response activation. Nat Cell Biol 14: Sikora E, Arendt T, Bennett M, Narita M (2011) Impact of cellular senescence signature on ageing research. Ageing Res Rev 11: Beckam KB, Ames BN (1998)The Free Radical Theory of Aging Matures. Physiol Rev 78: McCrann DJ, Yang D, Chen H, Carroll S, Ravid K (2009) Upregulation of NOX4 in the aging vasculature and its association with smooth muscle cell polyploidy. Cell Cycle 8: Lener B, Kozieł R, Pircher H, Hütter E, Greussing R, Herndler-Brandstetter D, Hermann M, Unterluggauer H, Jansen-Dürr P (2009) The NADPH oxidase NOX4 restricts the replicative lifespan of human endothelial cells. Biochem J 423: Kozieł R, Pircher H, Kratochwil M, Lener B, Hermann M, Dencher NA, Jansen-Dürr P (2013) Mitochondrial respiratory chain complex I is inactivated by NADPH oxidase NOX4. Biochem J 452: Weyemi U, Lagente-Chevallier O, Boufraqech M, Prenois F, Courtin F, Caillou B, Talbot M, Dardalhon M, Al Ghuzlan A, Bidart JM, Schlumberger M, Dupuy C (2011) ROS-generating NADPH oxidase NOX4 is a critical mediator in oncogenic H-Ras-induced DNA damage and subsequent senescence. Oncogene 31: Kodama R, Kato M, Furuta S, Ueno S, Zhang Y, Matsuno K, Yabe- Nishimura C, Tanaka E, Kamata T (2012) ROS-generating oxidases NOX1 and NOX4 contribute to oncogenic Ras-induced premature senescence. Genes Cells 18: Senturk S, Mumcuoglu M, Gursoy-Yuzugullu O, Cingoz B, Akcali KC, Ozturk M (2010) Transforming growth factor-beta induces senescence in hepatocellular carcinoma cells and inhibits tumor growth. Hepatology 52: Sturrock A, Cahill B, Norman K, Huecksteadt TP, Hill K, Sanders K, Karwande SV, Stringham JC, Bull DA, Gleich M, Kennedy TP, Hoidal JR (2006) Transforming growth factor-beta1 induces NOX4 NAD(P) H oxidase and reactive oxygen species-dependent proliferation in human pulmonary artery smooth muscle cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 290: L661-L Salmeen A, Park BO, Meyer T (2010) The NADPH oxidases NOX4 and DUOX2 regulate cell cycle entry via a p53-dependent pathway. Oncogene 29: Amara N, Goven D, Prost F, Muloway R, Crestani B, Boczkowski J (2010) NOX4/NADPH oxidase expression is increased in pulmonary fibroblasts from patients with idiopathic pulmonary fibrosis and mediates TGFβ1-induced fibroblast differentiation into myofibroblasts. Thorax 65: Cucoranu I, Clempus R, Dikalova A, Phelan PJ, Ariyan S, Dikalov S, Sorescu D (2005) NAD(P)H oxidase 4 mediates transforming growth factor-beta1-induced differentiation of cardiac fibroblasts into myofibroblasts. Circ Res 97: Sampson N, Koziel R, Zenzmaier C, Bubendorf L, Plas E, Jansen-Dürr P, Berger P (2011) ROS signaling by NOX4 drives fibroblast-to-myofibroblast differentiation in the diseased prostatic stroma. Mol Endocrinol 25: Martin-Garrido A, Brown DI, Lyle AN, Dikalova A, Seidel-Rogol B, Lassègue B, San Martín A, Griendling KK (2011) NADPH oxidase 4 mediates TGF-β-induced smooth muscle α-actin via p38mapk and serum response factor. Free Radic Biol Med 50: Boudreau HE, Casterline BW, Rada B, Korzeniowska A, Leto TL (2012) NOX4 involvement in TGF-beta and SMAD3-driven induction of the epithelial-to-mesenchymal transition and migration of breast epithelial cells. Free Radic Biol Med 53: Griendling KK, Minieri CA, Ollerenshaw JD, Alexander RW (1994) Angiotensin II stimulates NADH and NADPH oxidase activity in cultured vascular smooth muscle cells. Circ Res 74: Manea A, Tanase LI, Raicu M, Simionescu M (2009) Jak/STAT signaling pathway regulates NOX1 and NOX4-based NADPH oxidase in human aortic smooth muscle cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol 30: Manea A, Tanase LI, Raicu M, Simionescu M (2010) Transcriptional regulation of NADPH oxidase isoforms, NOX1 and NOX4, by nuclear factor-kappab in human aortic smooth muscle cells. Biochem Biophys Res Commun 396: Kuroda J, Ago T, Matsushima S, Zhai P, Schneider MD, Sadoshima J (2010) NADPH oxidase 4 (NOX4) is a major source of oxidative stress in the failing heart. Proc Natl Acad Sci USA 107: Szöcs K, Lassègue B, Sorescu D, Hilenski LL, Valppu L, Couse TL, Wilcox JN, Quinn MT, Lambeth JD, Griendling KK (2002) Upregulation of NOX-based NAD(P)H oxidases in restenosis after carotid injury. Arterioscler Thromb Vasc Biol 22: Schröder K (2010) Isoform specific functions of NOX protein-derived reactive oxygen species in the vasculature. Curr Opin Pharmacol 10: The role of NADPH oxidase NOX4 in regulation of proliferation, senescence and differentiation of the cells Dorota Przybylska, Grażyna Mosieniak Laboratory of Molecular Bases of Ageing, Nencki Institute of Experimental Biology PAS, Pasteura 3 Str., Warsaw, Poland d.przybylska@nencki.gov.pl Key words: NOX4, NADPH oxidase 4, reactive oxygen species, cellular senescence ABSTRACT NADPH oxidase NOX4 is a source of reactive oxygen species in many tissue of human body. NOX4 products of activity are connected with various processes that take on the cellular and tissue level. One of them is cellular senescence. The role of this oxidase in the regulation of replicative and oncogene-induced senescence was shown in both normal and cancer cells. On the other hand NOX4 also stimulates to proliferation various types of cancer and primary cells, what promotes pathologies. NOX4 participates in epithelial-mesenchymal transition, important for tumor cells invasion and metastasis. Many research concern the role of NOX4 in the physiology and pathology of the cardiovascular system. It was shown that NOX4 has an impact on vasoconstriction, atherosclerosis development, vascular cells hypertrophy, apoptosis and differentiation. NOX4 plays both positive and negative role in the organism. Better understanding of NOX4 regulation and its involvement in signaling pathways give a hope to control the development of many diseases. 76