MONOFLUO KIT. P. jirovecii

Transkrypt

1 MONOFLUO KIT P. jirovecii An Indirect Immunofluorescence Test for the Detection of P. jirovecii in Human Clinical Specimens / Test d'immunofluorescence indirecte pour la détection de P. jirovecii dans les échantillons cliniques humains / Prueba indirecta de inmunofluorescencia para la detección de P. jirovecii en muestras clínicas humanas / Indirekter Immunofluoreszenztest (IFFT) zur Bestimmung von P. jirovecii in Humanproben / Test di immunofluorescenza indiretta per la rivelazione di P. jirovecii in campioni clinici umani / Teste de imunofluorescência Indirecta para Detecção de P. jirovecii em Amostras Clínicas de Origem Humana / En indirekte immunofluorescens test for opdagelse af P. jirovecii i kliniske humanprøver / En indirekt immunofluorescenstest för detektion av P. jirovecii i humana kliniska prov / Μια εξέταση έμμεσου ανοσοφθορισμού για την ανίχνευση της P. jirovecii σε ανθρώπινα κλινικά δείγματα Test do wykrywania P. jirovecii metodą immunofluorescencji pośredniej w materiale klinicznym pobranym od ludzi FOR PROFESSIONAL USE ONLY USAGE RESERVE AUX PROFESSIONNELS PARA USO PROFESIONAL ÚNICAMENTE AUSSCHLIESSLICH FÜR BERUFLICHE ZWECKE SOLO PER USO PROFESSIONALE EXCLUSIVAMENTE PARA USO PROFISSIONAL KUN TIL FAGLIGT BRUG ENDAST FÖR PROFESSIONELL ANVÄNDNING ΓΙΑ ΕΠΑΓΓΕΛΜΑΤΙΚΗ ΧΡΗΣΗ ΜΟΝΟ Axis-Shield Diagnostics Limited Bio-Rad The Technology Park, Dundee DDE 1XA 3, boulevard Raymond Poincaré United Kingdom Marnes-la-Coquette France Tel. : +44 (0) Tel. : +33 (0) Fax. : +44 (0) Fax. : +33 (0)

2 POLSKI ZASTOSOWANIE TESTU Zestaw MONOFLUO KIT P.jirovecii służy do jakościowego wykrywania metodą pośredniej immunofluorescencji oocyst P.jirovecii w popłuczynach pęcherzykowo-oskrzelikowych (BAL) oraz w indukowanej plwocinie. Test ma zastosowanie podczas diagnostyki podejrzewanego zakażenia P.jirovecii. Wyniki należy interpretować w świetle objawów klinicznych i innych danych diagnostycznych. WPROWADZENIE Pneumocystis jirovecii (P. carinii) jest jednokomórkowym eukariontem występującym w płucach wielu gatunków ssaków, także u człowieka. Drobnoustroje z rodzaju Pneumocystis izolowane od ludzi określane były pierwotnie mianem P. carinii f. sp. hominis. Podgatunek wprowadzony został dla rozróżnienia drobnoustrojów Pneumocystis izolowanych od ludzi i tych występujących u innych ssaków. Drobnoustroje z rodzaju Pneumocystis izolowane od ludzi zostały uznane niedawno za odrębny gatunek, a nazwa ich zmieniona została na Pneumocystis jirovecii. 1 Drobnoustrój ten rozprzestrzenia się drogą powietrzną wywołując zazwyczaj zakażenie bezobjawowe. Jest to organizm patogenny głównie dla osób o upośledzonej odporności, szczególnie dla chorych na AIDS 2,3, u których wywołuje zapalenie płuc. Innymi czynnikami ryzyka, związanymi ze zwiększonym zachorowaniem na zapalenie płuc o etiologii P.jirovecii jest niedożywienie, zaburzenia hematologiczne, kolagenozy naczyń, pierwotny niedobór odporności komórkowej oraz leczenie immunosupresyjne, np. u pacjentów po transplantacji i u pacjentów z białaczką, przyjmujących leki cytotoksyczne. Zapalenie płuc o etiologii P.jirovecii może rozwinąć się szybko lub zaczynać się powoli i podstępnie. Objawami klinicznymi są: zwiększenie częstości oddechów i występowanie szczytów gorączki. Zdjęcie rentgenowskie wykazuje zmiany naciekowe; testy wydolności płuc wskazują na zablokowanie pecherzykowo-włośniczkowe, będące skutkiem uszkodzenia wymiany gazowej w pęcherzykach płucnych, co objawia się niedotlenieniem i nadmiarem dwutlenku węgla we krwi. Diagnozę zakażenia P.jirovecii stawia się zazwyczaj po obserwacji mikroskopowej materiału biopsyjnego pobranego z otwartych płuc lub bronchoskopowo, preparatu z popłuczyn pęcherzykowo-oskrzelowych (BAL) 4,5 lub z indukowanej plwociny. Do wizualizacji drobnoustroju stosuje się różne barwniki nie swoiste, jak azotan srebra w barwieniu metodą Gomoriego, błękit toluidyny, barwienie Grama-Weigerta, Giemsy i Wrighta-Giemsy. Ponieważ barwniki te reagują ze ścianą komórkową i z innymi strukturami drożdżaków, komórki P.jirovecii odróżniane są od komórek grzybów na podstawie morfologii. Metody wymagające barwienia są czasochłonne i ich interpretacja często wymagają wysokiej klasy specjalistów. Uzyskanie przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko oocystom P.jirovecii umożliwiło rozwój metod immunofluorescencyjnych, pozwalających na szybką i jednoznaczną identyfikację oocyst P.jirovecii w popłuczynach pęcherzykowo-oskrzelowych, 6,7 lub w indukowanej plwocinie 8,9. Test MONOFLUO KIT P.jirovecii wykorzystuje mysie monoklonalne przeciwciała, reagujące zarówno ze szczepami P.jirovecii izolowanymi od ludzi, jak i od gryzoni, do wykrywania oocyst tych drobnoustrojów w popłuczynach pęcherzykowo-oskrzelowych (BAL) lub w indukowanej plwocinie (IS). ZASADA TESTU Popłuczyny pęcherzykowo-oskrzelowe (BAL) lub wstępnie opracowana plwocina zostają odwirowane i przepłukane. Osad, po zawieszeniu, jest umieszczany na szkiełku mikroskopowym do fluorescencji i utrwalany. Materiał podlega trawieniu enzymatycznemu. Po inkubacji, przemywaniu, suszeniu, na szkiełko nanoszone są mysie przeciwciała monoklonalne i skierowane przeciwko nim przeciwciała znakowane fluorescencyjnie. W mikroskopie fluorescencyjnym oocysty są widoczne jako umiarkowanie świecące lub mocno świecące jasnozielone, równomiernie lub nierównomiernie wybarwione komórki. Obecność oocyst w BAL lub indukowanej plwocinie wskazuje na zakażenie P.jirovecii. A Przeciwciało monoklonalne anty- P.jirovecii B Koniugat: FITC przeciwciała przeciwko immunoglobulinom mysim (gotowe do użycia) SKŁ ADZESTAWU 1 1ml Mysie przeciwciała monoklonalne przeciwko P.jirovecii + albumina bydlęca, konserwant: 0.1% azydek sodu. Gotowe do użycia. 1 1ml Przeciwciała przeciwko mysim immunoglobulinom znakowane izotiocjanianem fluoresceiny (FITC) + barwnik kontrastowy błękit Evansa. Gotowe do użycia. C Enzym (liofilizowany) 1 fiolka Enzym do opracowania materiałów klinicznych. Zrekonstytuować w 200 µl M HCl (w zestawie) i rozcieńczyć bezpośrednio przed użyciem. D Rozcieńczony kwas solny (0.001M. HCl) 1 0.5ml Do rekonstytucji enzymu. Gotowy do użycia. 1

3 E Rozcieńczalnik enzymu Szkiełka na materiał kliniczny 1 3ml Bufor TRIS z aktywatorem enzymu. Gotowy do użycia. 25 szkiełek Szkiełka pokryte PTFE (żółte) z czterema kwadratowymi dołkami F Podłoże do zatapiania 2 3ml Glicerol zbuforowany fosforanem, Citifluor jako środek zapobiegający wyświecaniu. Gotowy do użycia. Instrukcja obsługi PRZECHOWYWANIE ODCZYNNIKÓW Informacje o postępowaniu z odczynnikami 1. Odczynniki zestawu przechowywać w tepmeraturze 2-8 C i wykorzystywać do daty ważności podanej na opakowaniu. Nie używać odczynników po terminie ważności. 2. Nie mieszać odczynników z różnych zestawów. 3. Nie zamrażać odczynników. 4. Liofilizowany enzym należy zrekonstytuować przed użyciem (patrz p. Przygotowanie odczynników i Procedura). Pozostałe odczynniki są gotowe do użycia. 5. Po rekonstytucji za pomocą 200 µl M HCl, enzym jest trwały do 3 miesięcy od czasu rekonstytucji, przechowywany w temp C. 6. Podłoże do zatapiania preparatów należy chronić przed światłem. Można je przechowywać w temp C lub w temp. pokojowej C. 7. Szkiełka mikroskopowe można przechowywać w temp C. 8. W rozcieńczalniku enzymu może powstać precypitat. Ponieważ nie ma on wpływu na wynik testu, nie należy usiłować go rozpuścić. 9. Unikać zanieczyszczenia odczynników. Do każdego odczynnika i badanej próbki zmieniać końcówkę pipety automatycznej. Pobieranie, przechowywanie i wstępne opracowywanie próbek Test przeznaczony jest do badań wykonywanych z popłuczyn pęcherzykowo-oskrzelowych lub indukowanej plwociny. Optymalną ilością materiału jest 30 ml popłuczyn i 2-4 ml plwociny, pobranych do jałowego naczynia, zgodnie z obowiązującą procedurą, oznaczenie wykonać jak najszybciej po pobraniu materiału. Aby zinaktywować wirusy HIV, mogące występować w materiale klinicznym, przed właściwym przygotowaniem należy rozcieńczyć go równą objętością etanolu absolutnego i inkubować przez 10 minut w temp. pokojowej (18-25 C). Zanieczyszczone materiały usuwać zgodnie z lokalnymi przepisami. Próbki plwociny należy upłynnić (przez homogenizację lub inkubację), dodając na 10 minut przed oznaczeniem Sputasol, Sputolysin lub podobnie działający środek mukolityczny, inkubując próbki w temp. pokojowej (18-25 C). OSTRZEŻ ENIA I Ś RODKI OSTROŻ NOŚ CI Podukt wyłącznie do diagnostyki in vitro. Środki ostrożności 1. Ściśle stosować się do zaleceń zawartych w niniejszej instrukcji, zwłaszcza dotyczących postępowania z odczynnikami i ich przechowywania oraz postępowania z próbkami. 2. Z wszystkimi próbkami klinicznymi należy postępować jak z materiałem potencjalnie zakaźnym, zgodnie z obowiązującymi przepisami dotyczącymi materiałów biologicznych. Postępowanie z takimi materiałami zgodnie z zasadami Dobrej Praktyki Laboratoryjnej zawarto w: CDC/NIH Health Manual Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 5 th edition, Nie pipetować ustami. 4. Podczas pracy nie palić, nie spożywać posiłków, nie pić i nie używać kosmetyków. 5. Odpowiednio chronić i osłaniać wszelkie uszkodzenia skóry. 6. Niektóre odczynniki (przeciwciała anty- P.jirovecii i koniugat-fitc) są konserwowane azydkiem sodu. Związek ten może reagować z miedzią i ołowiem, tworząc azydki metali o właściwościach wybuchowych. Aby zapobiec akumulacji azydku w zlewie i rurach, po wylaniu odczynników zawierających azydek spłukać zlew dużą ilością wody. 7. Karty charakterystyki substancji niebezpiecznych zawartych w zestawie są dostępne w Bio-Rad na życzenie. 2

4 Odczynnik A PRZECIWCIAŁA Szkodliwy Odczynnik C ENZYM Szkodliwy R22: Substancja szkodliwa po połknięciu. R32: W wyniku kontaktu z kwasami uwalnia się bardzo toksyczny gaz. S23: Nie wdychać oparów. S36: Nosić odpowiednie ubranie ochronne. S60: Odczynnik oraz jego opakowanie należy utylizować jako odpady niebezpieczne. R42: Może działać uczulająco po inhalacji. S22: Nie wdychać pyłu. S26: W przypadku dostania się do oczu, przemyć. natychmiast wodą i skonsultować się z lekarzem. S36/37: Nosić odpowiednie ubranie i rękawice ochronne. S45: W razie wypadku lub pojawienia się złego samopoczucia po pracy z odczynnikiem, natychmiast skonsultować się z lekarzem (w miarę możliwości okazać etykietę). S60: Odczynnik oraz jego opakowanie należy utylizować jako odpady niebezpieczne. PROCEDURA Materiały i sprzęt niezbędne ale nie ujęte w zestawie 1. Dokładne pipety do naniesienia 5 µl, 15 µl, 20 µl, 200 µl. 2. Wirówka do odwirowania objętości około 30 ml przy 3000 x g. 3. Woda destylowana lub dejonizowana. 4. Butelka do płukania preparatów z wodą destylowaną lub dejonizowaną. 5. Bezwodny aceton cz.d.a. 6. Etanol absolutny cz.d.a. 7. Cieplarka na 37 C. 8. Wilgotna komora do inkubacji preparatów w temp. 37 C. 9. Mikroskopowe szkiełka nakrywkowe, 18x18 mm i 50x20 mm. 10. Mikroskop fluorescencyjny wyposażony w filtry do obserwacji fluorescencji fluoresceiny i błękitu Evansa. 11. Cytospin (np.cytospin 2) (opcja). 12. Timer na 5 do 30 minut. 13. Bibuła. 14. Odpowiedni środek mukolityczny do upłynnienia plwociny np. Sputolysin (Behring Diagnostic) lub Sputasol (Oxoid). Używać zgodnie z zaleceniami producenta; alternatywnie, można użyć 0.1% roztwór ditiotreitolu (w/v) w stosunku 1:1 do objętości próbki, i inkubować w temp. 37 C przez czas wymagany do upłynnienia materiału. N.B. Ditiotreitol działa drażniąco na oczy i skórę. W przypadku kontaktu przemyć dużą ilością wody przez co najmniej 10 minut. W przypadku dyskomfortu, zasięgnąć porady lekarza. 15. Sól zbuforowana fosforanem Przygotowanie i rekonstytucja odczynników Przed użyciem odczynniki powinny osiągnąć temperaturę pokojową. Zrekonstytuować liofilizowany enzym za pomocą 200 µl 0.001M HCl; uzyskany roztwór będzie 10x stężony. Na etykiecie zapisać datę rekonstytucji i pozostawić w temp. pokojowej (18-25 C) na 10 minut. Wymieszać dokładnie przez odwracanie, do uzyskania jednorodnej zawiesiny bez zawieszonych cząstek. Rekonstytuowany enzym jest trwały przez 3 miesiące w temp C. WYKONANIE TESTU Wstępna obróbka próbek Oznaczenie należy wykonać jak najszybciej po pobraniu próbek materiału. Podczas testu należy pamiętać o potencjalnym występowaniu wirusa HIV w próbkach i postępować z nimi z zachowaniem środków ostrożności wymaganych dla materiałów zakaźnych. Próbki indukowanej plwociny należy przed oznaczeniem upłynnić przy pomocy środka mukolitycznego, jak Sputasol. Nie zawierające śluzu materiały, jak BAL, zwykle nie wymagają traktowania mukolitycznego. Protokół 1. Odwirować próbki przez 15 minut przy 3000 x g i przepłukać osad/pelet wodą destylowaną lub dejonizowaną. Zawieszając całkowicie osad, powtórzyć czynność jeszcze raz lub dwa razy. 2. Ostatecznie zawiesić osad w małej ilości wody, tak, aby materiał nie był zbyt gęsty, i wytrząsać na worteksie. 3. Nanieść µl próbki do jednego lub kilku dołków na szkiełku podstawowym. Wysuszyć szkiełko w temp. 37 C. Używając Cytospin, nanieść ml BAL i odwirować przy 900 rpm, stosując biały lub beżowy filtr. 4. Utrwalić preparat, pokrywając go 1-2 kroplami bezwodnego acetonu, poczym pozwolić, aby wyparował w temp. pokojowej. 5. Preparaty naniesione w Cytospinie przepłukać pod strumieniem wody destylowanej lub dejonizowanej, aby usunąć z próbki sól, która zmniejsza skuteczność trawienia enzymem. 3

5 6. Wysuszyć preparaty na powietrzu. 7. Rozcieńczyć zrekonstytuowany enzym 1:10 (1+9) za pomocą rozcieńczalnika enzymu. Rozcieńczyć tylko ilość enzymu potrzebną do wykonywanych preparatów. 8. Na wysuszone i utrwalone preparaty nanieść 20 µl rozcieńczonego enzymu, dokładnie pokrywając całą powierzchnię dołka. 9. Preparaty inkubować przez DOKŁADNIE 30 minut w komorze wilgotnej w temp. 37 C. Dłuższa inkubacja może spowodować nadtrawienie oocyst. Staną się one mniej charakterystyczne i preparat będzie trudniejszy do interpretacji. 10. Przepłukać preparaty pod strumieniem wody destylowanej lub dejonizowanej, tak, aby nie lać wody bezpośrednio na preparat. 11. Osuszyć szkiełka bibułą i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. 12. Do każdej próbki dodać 15 µl przeciwciał anty- P.jirovecii, dokładnie pokrywając całą powierzchnię dołka. Preparaty inkubować przez 15 minut w komorze wilgotnej w temp. 37 C. 13. Przepłukać preparaty, jak w p. 10, i wysuszyć na powietrzu. 14. Do każdej próbki dodać 15 µl koniugatu: przeciwciał przeciwko mysim przeciwciałom, znakowanych FITC, dokładnie pokrywając całą powierzchnię dołka. Preparaty inkubować przez 15 minut w komorze wilgotnej w temp. 37 C. 15. Przepłukać dołki, i wysuszyć preparaty na powietrzu. 16. Do każdego dołka nanieść kroplę podłoża do zatapiania preparatów i przykryć szkiełkiem nakrywkowym odpowiedniej wielkości. Odwrócić szkiełko na bibule i delikatnie nacisnąć, aby usunąć nadmiar podłoża do zatapiania i pęcherzyki powietrza. 17. W preparacie obserwować oocysty o mocno lub średnio świecącej jasno-zielonej fluorescencji, zabarwione równo- lub nierównomiernie. Uszkodzone komórki i inne cząstki można zabarwić kontrastowo błękitem Evansa, który daje czerwoną fluorescencję. Obejrzeć całą powierzchnię preparatu. INTERPRETACJA WYNIKÓW WYNIK DODATNI Pięć lub więcej fluoryzujących oocyst na całej powierzchni szkiełka. WYNIK WĄTPLIWY Jedna do pięciu fluoryzujących oocyst. WYNIK UJEMNY Brak fluoryzujących oocyst. Jeżeli podejrzewane jest zakażenie P.jirovecii należy powtórzyć badanie z większą ilością materiału wyjściowego. OŚRODEK 1 10 CHARAKTERYSTYKA TESTU Badano 223 próbki BAL i indukowanej plwociny, pobrane od pacjentów zakażonych HIV, z objawami ze strony układu oddechowego, i porównywano z wynikami uzyskanymi po barwieniu zmodyfikowaną metodą Grocott. Zgodność wyników wynosiła 90.6%. W przypadku 21 (9.4%) wyników nie zgodnych, pobrano 6 kolejnych próbek, z których dla pięciu uzyskano wynik dodatni w obu testach. OŚRODEK 2 8 Wyniki dla 135 próbek indukowanej plwociny, porównano z barwieniem metodą Grocott. Zgodność wyników wynosiła 88.9%. 15 próbek (11.1%) było dodatnich/wątpliwych w teście MONOFLUO KIT P.jirovecii i ujemnych po barwieniu Grocott. Autorzy sugerują większą czułość wykrywania P.jirovecii w preparacie cytologicznym z plwociny, barwionym immunofluorescencyjnie, w porównaniu z barwieniem konwencjonalnym. OŚRODEK 3 9 Badano 254 próbki BAL i indukowanej plwociny, pobrane od 75 pacjentów z AIDS, innych chorych poddawanych immunosupresji, w tym pacjentów po przeszczepach, oraz od chorych z atypowym zapaleniem płuc, i porównywano z wynikami uzyskanymi po barwieniu metodą Grocott. Zgodność wyników wynosiła 94.1%. 15 próbek (5.9%) było dodatnich lub wątpliwych w teście MONOFLUO KIT P.jirovecii i ujemnych po barwieniu Grocott. Autorzy wnioskują o większej niezawodności i czułości testu MONOFLUO KIT P.jirovecii. OŚRODEK 4 6 W celu wykrycia zakażenia P.jirovecii badano 50 próbek BAL i 50 próbek indukowanej plwociny metodą pośredniej immunofluorescencji, bezpośredniej immunofluorescencji, zmodyfikowaną metodą Wrighta-Giemsy i zmodyfikowaną metodą barwienia azotanem srebra. Za próbkę dodatnią uznawano rozmaz dający wynik dodatni w co najmniej dwóch metodach. Przyjmując tę definicję, czułość i swoistość testu MONOFLUO KIT P.jirovecii określono następująco. BAL Czułość = 90.5% Swoistość = 100% IS Czułość = 97.0% Swoistość = 100% 4

6 OŚRODEK 5 Badano 152 próbki BAL, pobrane od pacjentów z klinicznymi objawami zapalenia płuc o etiologii P.jirovecii, I porównywano z wynikami uzyskanymi po barwieniu metodą Grocott. Wyniki uzyskane każdą metodą porównano z klinicznymi dowodami zakażenia P.jirovecii (PCP). W pięciu przypadkach, dowody kliniczne były wątpliwe, w czterech z nich test MONOFLUO KIT P.jirovecii wypadł dodatnio, a barwienie Grocott ujemnie. W jednym przypadku było odwrotnie: uzyskano wynik dodatni po barwieniu Grocott i ujemny w teście MONOFLUO KIT P.jirovecii. Zgodność wyników testu MONOFLUO KIT P.jirovecii z dowodami klinicznymi PCP = 146/147 = 99.3% (jeden wynik wątpliwy w metodzie IF) Zgodność wyników barwienia Grocott z dowodami klinicznymi PCP = 140/147 = 95.2% Zgodność wyników testu MONOFLUO Kit P.carinii z barwieniem metodą Grocott = 94.5% OGRANICZENIA TESTU 1. Wynik ujemny nie wyklucza zakażenia P.jirovecii. Wyniki testu należy interpretować w świetle danych klinicznych i wyników innych testów diagnostycznych. W razie potrzeby powtórzyć test dla nowej próbki. 2. Nadmiar śluzu w próbce może powodować niedostateczne zabarwienie preparatu. 3. Znakowane fluoresceiną, mysie przeciwciało monoklonalne potencjalnie może reagować krzyżowo z obecnymi w próbce Candia albicans, reakcja ta może być mylnie zinterpretowana jako wynik fałszywie dodatni 16. LITERATURA 1. Stringer JR, Beard CB, Miller RF, Wakefield AE: A New Name (Pneumocystis jiroveci) for Pneumocystis from Humans. Emerg Infect Dis 8(9): , Kovacs JA et al. Diagnosis of Pneumocystis carinii Pneumonia: Improved Detection in Sputum with use of Monoclonal Antibodies. The New Eng J Med, March , 318 No. 10, Posner D, Khan FA. Respiratory Infections in AIDS. A Comprehensive Care Approach. J Respir Dis, June 1987, Broaddus CM et al. Bronchoalveolar Lavage and Transbronchial Biopsy for the Diagnosis of Pulmonary Infections in the Acquired Immunodeficiency Syndrome. Ann Intern Med, 102, , Mills J. Pneumocystis carinii and Toxoplasma Gondii Infections in Patients with AIDS. Rev Infect Dis, 8, Cregan P et al. Comparison of Four Methods for the Rapid Detection of Pneumocystis carinii in Respiratory Systems. J Clin Microb, 28 No. 11, , Dournon E et al. Diagnosis of Pneumocystis carinii pneumonia by non-experts. The Lancet, Jan , Midgley J et al. Increased Sensitivity of Immunofluorescence for the Detection of Pneumocystis carinii. The Lancet, Dec 23/ , Magee JG et al. Pneumocystis carinii pneumonia: Detection of Parasites by Immunofluorescence Based on a Monoclonal Antibody. Medical Laboratory Sciences, 48, , Midgley J et al. Monoclonal Immunofluorescence Compared with Silver Stain for Investigating Pneumocystis carinii pneumonia. J Clin Path, 44, 75-76, Gill VJ et al. Detection of Pneumocystis carinii by Fluorescent-Antibody Stain Using a Combination of Three Monoclonal Antibodies. J Clin Microbiol. 25 No. 10, , Datry A., Rozenbaum W., Rosenheim M., Danis M., Duflo B. et Gentilini M. - Parasitoses Opportunistes et SIDA. Méthodes de diagnostic. Feuil. Biol., 1985, XXVI, Petithory J.C., Derouin F., Ardoin F. - Les parasitoses dans le SIDA. Rev. Franç. Lab., Suppl : 15 ème Congrès National des Biologistes des Hôpitaux Généraux, Port Barcarès, Sept. 1986, Medrano F, Montes-Cano M, Conde M, de la Horra C, Respaldiza N, Gasch A, Perez-Lozano MJ, Varela JM, Calderon EJ: Pneumocystis jirovecii in general population. Emerg Infect Dis 11(2):245-50, US Department of Health and Human Services. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, Fifth Edition. Washington, DC: US Government Printing Office, January, Koch M & Heizmann W. Problems in the Detection of Pneumocystis carinii by Indirect Immunofluorescence. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect Dis, 1, 58-59,

7 For in vitro diagnostic use / do diagnostyki in vitro Catalogue number / Numer katalogowy Lot / Numer serii 60 tests / 60 testów Caution / Uwaga See instructions for use / Sprawdź w instrukcji obsługi Use by / Zużyć do Store at 2-8ºC / Przechowywać w temperaturze 2-8 C Manufactured by / Wytwórca Keep away from light / Chronić przed światłem Axis-Shield Diagnostics Limited The Technology Park, Dundee DD2 1XA, United Kingdom. Tel: +44 (0) , Fax: +44 (0) shield@uk.axis-shield.com Website: Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette, France Tel: +33 (0) , Fax: +33 (0) Website: RPBL946/R5 02/2009