KACPER PTASZEK STUDENCKIE KOŁO NAUKOWE HOMUNCULUS UNIWERSYTET GDAŃSKI

Transkrypt

1 KACPER PTASZEK STUDENCKIE KOŁO NAUKOWE HOMUNCULUS UNIWERSYTET GDAŃSKI 17 listopada 2012

2 UDZIAŁ ZWIERZĄT LABORATORYJNYCH większość laureatów Nagrody Nobla w dziedzinie fizjologii lub medycyny korzystało w swoich badaniach z modeli zwierzęcych obszary badań, w których uczestniczą zwierzęta laboratoryjne 1. genetyczne 7. fizjologiczne 2. farmakologiczne 8. onkologiczne 3. immunologiczne 9. hematologiczne 4. toksykologiczne 10. stomatologiczne 5. radiologiczne 11. embriologiczne 6. transplantologiczne Brylińska i Kwiatkowska, 1996

3 UDZIAŁ ZWIERZĄT LABORATORYJNYCH cechy zwierząt laboratoryjnych predysponujące je do badań: podobieństwa strukturalne i funkcjonalne m.in. materiału genetycznego, procesów fizjologicznych, narządów, układów ciała możliwość precyzyjnej kontroli warunków środowiska oraz analizy wpływu modyfikacji na życie zwierzęcia względnie krótki cykl życia co pozwala na prześledzenie analizowanych parametrów od urodzenia do śmierci złożony rozwój liczne potomstwo stosunkowo niskie koszty utrzymania

4 UDZIAŁ ZWIERZĄT LABORATORYJNYCH

5 UDZIAŁ ZWIERZĄT LABORATORYJNYCH CZY ZWIERZĘTA LABORATORYJNE MOŻNA ZASTĄPIĆ? badania in vitro prowadzone na hodowlach komórkowych bądź tkankowych (nieraz również na bezkomórkowych) są pożyteczne w fazie wstępnej procesu badawczego dostarczają cennych informacji o procesach wewnątrzkomórkowych pozwalają na wstępne testowanie toksyczności pomagają w poznaniu mechanizmów działania substancji pozwalają testować związki chemiczne na kom. nowotworowych pozyskanych od ludzi Paradziej-Łukowicz J., 2011

6 UDZIAŁ ZWIERZĄT LABORATORYJNYCH CZY ZWIERZĘTA LABORATORYJNE MOŻNA ZASTĄPIĆ? badania in silico są możliwe, gdy zebrano informacje o mierzonych parametrach podczas badań in vitro i in vivo wykorzystują programy komputerowe, które w oparciu o dotychczas uzyskane dane i wyniki badań przeprowadzają: analizy zależności aktywności np. substancji od struktury prognozują przewidywane działanie biologiczne wyniki badań in silico wymagają i tak potwierdzenia w badaniach na zwierzętach Paradziej-Łukowicz J., 2011

7 UDZIAŁ ZWIERZĄT LABORATORYJNYCH NIE MOŻNA NA RAZIE ZASTĄPIĆ NICZYM BADAŃ NA ZWIERZĘTACH, PONIEWAŻ ŻYWY ORGANIZM TO UKŁAD RÓŻNYCH STRUKTUR POWIĄZANYCH ZE SOBĄ NA TYLU PŁASZCZYZNACH, ŻE JEST TO W SZTUCZNYCH WARUNKACH NIE DO ODTWORZENIA Paradziej-Łukowicz J., 2011

8 UDZIAŁ ZWIERZĄT LABORATORYJNYCH gatunki zwierząt laboratoryjnych 1. bezkręgowce Formica rufa (mrówka rudnica) 2. kręgowce ryby płazy ssaki Drosophila melanogaster (muszka owocowa) Caenorhabditis elegans (nicień) Danio rerio (danio pręgowany) Xenopus laevis (platana szponiasta) Mus musculus (mysz domowa) Rattus norvegicus (szczur wędrowny) Coturnix japonica (przepiórka japońska) Felis catus (kot) Canis lupus familiaris (pies) Brylińska i Kwiatkowska, 1996

9 UDZIAŁ ZWIERZĄT LABORATORYJNYCH gryzonie jako modelowe zwierzęta dla neurobiologów w badaniach neurobiologicznych w Wielkiej Brytanii w roku 2005 użyto myszy, szczurów i innych gryzoni, co stanowiło 84,5% wszystkich zwierząt laboratoryjnych zbliżone parametry procesów fizjologicznych (szczury) badania: farmakologiczne, hematologiczne, immunologiczne, transplantologiczne, onkologiczne, toksykologiczne, żywieniowe genom myszy w 99% zbieżny z genomem człowieka badania: genetyczne, hematologiczne, immunologiczne, transplantologiczne, onkologiczne, toksykologiczne, Foundation for Biomedical Research, 2007 Sanger Institute, 2002

10 behawior złożony system zachowań zwierzęcia w odpowiedzi na sygnały docierające ze środowiska organizmu lub z wnętrza organizmu w obrębie gatunku zależy od wieku, płci, a także od pory roku, pory dnia, temperatury mierzony jest przy pomocy testów behawioralnych

11 testy behawioralne socjalne poznawcze lękowe

12 socjalne zachowania socjalne test interakcji socjalnej

13 TEST INTERAKCJI SOCJALNEJ (Albonetti i Farbolini, 1994) przebieg testu 1. umieszczenie zwierząt w klatce obserwacyjnej minutowa obserwacja zwierząt zwracając szczególną uwagę na a) zachowania ofensywne (=agresywne) atak; gryzienie; grożenie; pozycja on the top b) zachowania defensywne (=obronne) unikanie; odwrót; znieruchomienie; pozycja on the back c) zachowania ambiwalentne boksowanie; odpychanie; zwracanie uwagi d) zachowania obojętne czyszczenie futra; eksploracja

14 TEST INTERAKCJI SOCJALNEJ klasyfikacja zwierząt podział na dominujące i submisywne określając pozycję socjalną badanego zwierzęcia bierze się pod uwagę jedynie zachowania agresywne i obronne, które wykazywał podczas szeregu interakcji z innymi osobnikami współczynnik agresji = zachowań ofensywnych zachowań defensywnych współczynnik agresji > 1 zwierzę dominujące współczynnik agresji < 1 zwierzę submisywne

15 TEST INTERAKCJI SOCJALNEJ różnice między grupami zwierząt dominujące submisywne wyższy poziom agresji niższy poziom agresji tendencja do obrony własnego terytorium brak obrony terytorium Albonetti i Farabollini, 1994 ucieczka po przegranej reakcja wycofania lub znieruchomienie wysoki spoczynkowy poziom testosteronu niski spoczynkowy poziom testosteronu Blanchard i wsp., 1993 niska podatność na uzależnienia wysoka podatność na uzależnienia Piazza i wsp., 1989; Piazza i Le Moal, 1996; Kabbaj i wsp., 2001

16 TEST INTERAKCJI SOCJALNEJ różnice między grupami zwierząt dominujące niższy poziom serotoniny w okolicy przedczołowej odporność na stres niższy spoczynkowy poziom kortykosteronu w sytuacji stresowej wysiew katecholamin i podwyższone ciśnienie Nelson i Chiavegatto, 2001 Albonetti i Farabollini, 1994; Ely i wsp., 1997 submisywne wyższy poziom serotoniny wrażliwość na stres wyższy spoczynkowy poziom kortykosteronu w sytuacji stresowej silniejsza aktywacja osi PPN

17 TEST INTERAKCJI SOCJALNEJ różnice między grupami zwierząt dominujące brak zmian brak zmian Stefański i wsp., 2001 Bartolomucci i wsp., 2001 submisywne obniżenie ogólnej liczby leukocytów i limfocytów T i B oraz komórek NK w sytuacji stresowej obniżona aktywność cytotoksyczna komórek NK

18 t. aktywności dobowej t. otwartego pola t. nowości t. dziurawej podłogi t. rota rod t. siły uchwytu t. reakcji zaskoczenia t. unikania t. labiryntu t. labiryntu wodnego t. rozpoznawania obiektu t. hamowania bodźca nieświadomego t. otworów (5/9) t. rutyn t. preferencji miejsca t. samopodawania POMIARY ZACHOWAŃ ZWIERZĄT poznawcze aktywność i eksploracja wraż. ruchowa i koordynacja uczenie się i pamięć uwaga uzależnienia

19 przebieg testu TEST NOWOŚCI (Piazza i wsp., 1989) 1. umieszczenie zwierzęcia w nowym środowisku jest to pleksiglasowa klatka o wymiarach 43 x 43 x 20 cm minutowa automatyczna obserwacja aktywności ruchowej zwierzęcia, podczas której aparat zlicza liczbę przesłonięć fotokomórek w płaszczyźnie pionowej i poziomej obliczając ruch a) ruchy horyzontalne poruszanie się zwierzęcia w płaszczyźnie poziomej (np. eksploracja) b) ruchy wertykalne wywoływane przez zwierzę stojące na tylnych łapkach (tzw. słupki) c) ruchy ambulatoryjne

20 TEST NOWOŚCI klasyfikacja zwierząt podział na wysoko- (HR) i niskoaktywne (LR) określając aktywność lokomotoryczną badanego zwierzęcia bierze się pod uwagę jedynie liczbę ruchów w płaszczyźnie horyzontalnej wynik wyższy od zwierzę HR (wysokoaktywne) wynik niższy od zwierzę LR (niskoaktywne) wysoka aktywność eksploracyjna zwierząt HR wynika z niskiego poziomu lęku wywołanego nową sytuacją lub nowym otoczeniem (Cools i Gringras, 1998)

21 TEST NOWOŚCI cechy charakteryzujące zwierzęta wysokoaktywne 1. wykazują behawior poszukiwania nowości (Dellu i wsp., 1996) 2. wyższa reakcja motoryczna po iniekcjach psychostymulantów, np. amfetaminy (Hooks i wsp., 1991) rozwijają również szybciej sensytyzację oraz łatwiej wykształcają model dożylnego samopodawania amfetaminy (Piazza i wsp., 1991) 3. różnice w poziomie neuroprzekaźników a) wyższy poziom dopaminy w układzie mezolimbicznym i w prażkowiu b) niższy poziom serotoniny w jądrze półleżącym i prążkowiu c) w sytuacji stresowej silniejsza aktywacja osi PPN oraz wyższy wysiew kortykosteronu (Piazza i wsp., 1991)

22 TEST NOWOŚCI cechy charakteryzujące zwierzęta wysokoaktywne 4. mniejsza podatność na choroby a) nowotworowe i autoimmunologiczne (Sakic i wsp., 1992) b) parodontozę (Breivik i wsp., 2000) c) chroniczne zapalenie kości i chrząstek (Sajti i wsp., 2004) 5. niższe stężenie prolaktyny (Rots i wsp., 1996), estradiolu, tyroksyny i tyreotropiny (Balada i wsp., 1992)

23 przebieg testu TEST LABIRYNTU WODNEGO (Morris i wsp., 1982) 1. umieszczenie zwierzęcia w okrągłym zbiorniku (średnica = 140 cm) częściowo wypełnionym wodą 2. pomiar czasu od momentu umieszczenia zwierzęcia w wodzie do odnalezienia platformy, która znajduje się w przeciwległym końcu zbiornika doświadczenia oryginalne test powtarzano w ciągu trzech następujących po sobie dniach, by ocenić postępy szczura

24 podłoże teoretyczne testu TEST LABIRYNTU WODNEGO doświadczenie stanowi behawioralny model badania pamięci gryzoń umieszczony w wodzie aktywnie pływa, by odnaleźć wyjście ze stresogennej sytuacji platforma, każda kolejna próba przyśpiesza uczenie się, że platforma jest miejscem ucieczki zwierzęta lokalizując platformę kierują się kształtem pomieszczenia i znajdującymi się wewnątrz obiektami tworząc mapę przestrzenną całego pomieszczenia podczas każdej kolejnej próby zwierzę odnajduje platformę szybciej zdolność zapamiętywania = X czas odnalezienia platformy dla próby 3 dnia X czas odnalezienia platformy dla próby 1 dnia

25 podłoże teoretyczne testu TEST LABIRYNTU WODNEGO pamięć o położeniu platformy utrzymuje się przez kilkadziesiąt dni test pamięci polega na wyjęciu platformy, zwierzę pamiętając właściwą lokalizację będzie krążyć w miejscu, gdzie kiedyś znajdowała się platforma

26 zastosowanie praktyczne TEST LABIRYNTU WODNEGO projekt Studenckiego Koła Naukowego Homunculus Rola suplementacji diety w związki o działaniu antystresowym na wywoływane przez stres zmiany zdolności uczenia się u szczurów cel badań: ocena roli suplementacji diety w związki przeciwdziałające negatywnym skutkom stresu indukowane przez zmiany zdolności uczenia się u szczurów grupy doświadczalne: 1. stresowane z suplementacją diety 2. stresowane bez suplementacji diety 3. niestresowane z suplementacją diety 4. niestresowane bez suplementacji diety

27 zastosowanie praktyczne TEST LABIRYNTU WODNEGO Rola suplementacji diety w związki o działaniu antystresowym na wywoływane przez stres zmiany zdolności uczenia się u szczurów wyniki

28 t. zawieszenia za ogon t. ciepłej płytki t. Von Frey a t. nieprzerzutności t. otwartego pola t. Labiryntu krzyżowego t. 5 płytek (Arona) t. jasno-ciemnego pomieszczenia t. Vogela t. wymuszonego pływania t. zawieszenia za ogon POMIARY ZACHOWAŃ ZWIERZĄT lękowe reakcja na ból zachowania lękowe depresja

29 TEST UNIESIONEGO LABIRYNTU KRZYŻOWEGO (EPM) przebieg testu (Lister, 1987; File, 1990; Belzung i Griebei, 2001) 1. test EPM przeprowadza się w labiryncie składającym się z: a) dwóch ramion otwartych o wymiarach 50 x 10 cm b) dwóch ramion zamkniętych (nieprzezroczystych) o wymiarach 50 x 10 cm ramiona umieszczone są 100 cm nad podłogą 2. 5-minutowa obserwacja począwszy od momentu umieszczenia zwierzęcia w labiryncie (w polu środkowym pyszczkiem w stronę ramienia zamkniętego)

30 TEST UNIESIONEGO LABIRYNTU KRZYŻOWEGO (EPM) przebieg testu 3. parametry obserwowane podczas testu a) latencja startu czas po jakim zwierzę rozpocznie eksplorację b) liczba wejść i wyjść w obrębie ramion zamkniętych i otwartych c) wychylenia z ramion zamkniętych na pole środkowe d) czas spędzony w obrębie ramion zamkniętych, otwartych i polu środkowym e) poziom defekacji i mikcji

31 TEST UNIESIONEGO LABIRYNTU KRZYŻOWEGO (EPM) podłoże teoretyczne testu test bazuje na naturalnej tendencji gryzoni do aktywnej eksploracji nowego środowiska, którą ograniczają awersyjne właściwości uniesionej i otwartej części czas spędzony na eksplorowaniu ramion zamkniętych porównany do czasu przebywania w ramionach otwartych świadczy o poziomie lęku badanych zwierząt

32 TEST ZACHOWAŃ LĘKOWYCH NA NATURALNEGO DRAPIEŻNIKA (PREDATOR STRESS) przebieg testu (Nanda i wsp., 2008; Vanelzakker i wsp., 2011) 1. test rozdzielony jest na dwa dni: a) pierwszego umieszcza się zwierzę na czas 15 minut w klatce identycznej do mieszkalnej, która z kolei znajduje się boksie wykonanym z białej laminowanej płyty o wymiarach 100 x 100 x 60 cm pozwala to określić reakcję na nowe otoczenie b) drugiego ponownie umieszcza się zwierzę w klatce, jednakże po minucie od rozpoczęcia do boksu trafia drapieżnik kot i badanie trwa kolejne 15 minut

33 TEST ZACHOWAŃ LĘKOWYCH NA NATURALNEGO DRAPIEŻNIKA (PREDATOR STRESS) przebieg testu 2. podczas obu pomiarów zapisuje się następujące parametry: a) aktywność eksploracyjna liczona dwojako, jako czas spędzony na poruszaniu [1] oraz liczbę epizodów [2] b) zahamowanie zachowań liczone jako łączny czas epizodów znieruchomień (brak ruchu) oraz stanów wzmożonej czujności (brak aktywnej eksploracji) [1] oraz liczbę epizodów przytoczonych zachowań [2] c) wspinanie się liczona liczba epizodów d) czyszczenie ciała liczona liczba epizodów

34 TEST ZACHOWAŃ LĘKOWYCH NA NATURALNEGO DRAPIEŻNIKA (PREDATOR STRESS) podłoże teoretyczne testu 1. badanie związane z bezpośrednim wpływem naturalnego drapieżnika na zachowania gryzoni wskazują na: a) wzrost poziomu lęku (Klein i wsp., 1994; Nanda i wsp., 2008) b) zwiększenie liczby zachowań lękowych (np. znieruchomień) 2. na podstawie pomiarów określono również struktury mózgowe aktywne podczas obecności drapieżnika, a należą do nich: a) hipokamp (Diamond i wsp., 1999; Mesches i wsp., 1999) b) ciało migdałowate (Vouimba i wsp., 2006; Woodson i wsp., 2008)

35 literatura naukowa: BIBLIOGRAFIA 1. Brylińska, J. i Kwiatkowska, J. (1996). Zwierzęta laboratoryjne. Metody hodowli i doświadczeń. Warszawa: Universitas. 2. Sadowski, T. (2009). Biologiczne mechanizmy zachowania się zwierząt. Warszawa: PWN. ważniejsze artykuły naukowe: 1. Albonetti, M. i Farabollini, F. (1994). Social stress by repeated defeat: effects on social behavior and emotionality. Behav Brain Res, strony Belzung, C. i Griebei, G. (2001). Measuring normal and pathological anxiety-like behavior in mice: a review. Behav Brain Res, strony File, S. (1990). New strategies in the search for anxiolytics. Drug Des Deliv, strony Lister, R. (1987). The use of a plus-maze to measure anxiety in the mouse. Psychopharmacology (Berl), strony Morris, R., Garrud, P., Rawlins, J. i O'Keefe, J. (1982). Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions. Nature, strony Nanda, S., Qi, C., Roseboom, P. i Kalin, N. (2008). Predator stress induces behavioral inhibition and amygdala somatostatin receptor 2 gene expression. Genes Brain Behav, strony Piazza, P., Deminiere, J., Le Moal, M. i Simon, H. (1989). Factors that predict individual vulnerability to amphetamine self-administration. Science, strony Vanelzakker, M., Zoladz, P., Thompson, V., Park, C., Halonen, J., Spencer, R. i Diamond, D. (2011). Influence of Pre- Training Predator Stress on the Expression of c-fos mrna in the Hippocampus, Amygdala and Striatum following long-term spatial memory retrival. Front Behav Neurosci, numer 30 inne źródła: 1. portal Amerykańskiego Towarzystwa Badań nad Zwierzętami Laboratoryjnymi ( 2. portal Fundacji Badań Biomedycznych ( 3. witryna Instytutu Sangera, Hixton, Wielka Brytania (