MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2009, 61: Sebastian Wardak, Marek Jagielski 1
|
|
- Maksymilian Cichoń
- 5 lat temu
- Przeglądów:
Transkrypt
1 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2009, 61: Sebastian Wardak, Marek Jagielski 1 OCENA PRZYDATNOŚCI WYBRANYCH METOD GENOTYPOWYCH I FENOTYPOWYCH DO WEWNĄTRZGATUNKOWEGO RÓŻNICOWANIA PAŁECZEK CAMPYLOBACTER JEJUNI ORAZ CAMPYLOBACTER COLI IZOLOWANYCH OD LUDZI. II. PRZYDATNOŚĆ METOD PFGE, ERIC-PCR, PCR-FLA-A-RFLP I MLST Zakład Bakteriologii NIZP - PZH w Warszawie Kierownik: prof. dr hab. M. Jagielski Oceniono przydatność metod PFGE, ERIC-PCR oraz PCR-flaA-RFLP do wewnątrzgatunkowego różnicowania izolatów pałeczek C. jejuni C. coli wyosobnionych od ludzi ze sporadycznych zakażeń oraz z ognisk zakażeń pokarmowych. Izolaty z ognisk zakażeń pokarmowych dodatkowo analizowano metodą MLST. Wykazano, że spośród zastosowanych genotypowych metod typowania najwyższą wartością indeksu różnicowania izolatów pałeczek C. jejuni charakteryzowała się metoda PFGE i ERIC-PCR. Stwierdzono, że wszystkie oceniane genotypowe metody mogą być wykorzystywane do potwierdzania pokrewieństwa izolatów pałeczek C. jejuni i C. coli pochodzących od osób z poszczególnych ognisk zakażenia tymi drobnoustrojami. W drugiej części prezentowanej pracy przedstawiono ocenę przydatności metod PFGE (Restriction Enzyme Analysis - Pulsed Field Gel Electrophoresis), PCR-flaA-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism of flaa gene) oraz ERIC-PCR (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus) do różnicowania izolatów pałeczek Campylobacter jejuni i Campylobacter coli wyosobnionych od ludzi w latach Ponadto metodą MLST (Multilocus Sequence Typing) porównano profile alleliczne genów metabolizmu podstawowego izolatów pałeczek C. jejuni wyosobnionych od ludzi z trzech ognisk zakażenia pokarmowego. 1 Praca naukowa finansowana ze środków na naukę w latach jako projekt badawczy nr NN
2 64 S. Wardak, M. Jagielski Nr 1 MATERIAŁ I METODY Przedmiot badań oraz dane kliniczne osób od których izolowano pałeczki Campylobacter. Dane dotyczące badanych izolatów pałeczek C. jejuni i C. coli opisano uprzednio (14). Analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych genomowego DNA pałeczek C. jejuni oraz C. coli metodą elektroforezy w zmiennym homogennym polu elektrycznym o kształcie sześciok ą t a f o r e m n e g o ( P F G E ). Izolację całkowitego DNA do analizy polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych metodą elektroforezy w zmiennym polu elektrycznym przeprowadzono zgodnie z wytycznymi CAMPYNET ( html) i z modyfikacją własną. Do badania użyto tej samej zawiesiny komórek bakteryjnych w roztworze PBS o gęstości 7 w skali McFarlanda, która została przygotowana w celu izolacji genomowego DNA. Bloczki wykonane po zmieszaniu 300 μl zawiesiny bakteryjnej z 600 µl 1% agarozy umieszczano w sterylnych probówkach typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml zawierającej 1,0 ml buforu ESP (0,5 M EDTA, 1% Sarkozyl) oraz 10 µl roztworu proteinazy K o stężeniu 20 mg/ml i inkubowano w temperaturze 55 o C przez godzin. Po usunięciu buforu ESP bloczki płukano pięciokrotnie w 1 ml buforu TE. Fragment bloczka o szerokości około 2 mm umieszczano w nowej, sterylnej probówce typu Eppendorf zawierającej 20 jednostek enzymu restrykcyjnego SmaI i inkubowano przez godzin w temperaturze 30 o C. Następnie inkubowany fragment bloczka umieszczano w 200 μl 0,75 x TBE (90 mm Tris-kwas borny, 2 mm EDTA, ph 8,0). W celu stwierdzenia poprawności wykonania badania oraz określenia międzyżelowego poziomu identyczności w kolejnych rozdziałach w żelu agarozowym jako kontroli używano szczepu z kolekcji PZH C. jejuni PZH 93/06. Jako wzorzec wielkości fragmentów DNA zastosowano Lambda Ladder, który umieszczano co 5-6 ścieżkę w 1% żelu agarozowym. Elektroforezę pulsacyjną prowadzono w 0,5 x stężonym buforze TBE w aparacie Gene Mapper (Bio-Rad). Zgodnie z wytycznymi CAMPYNET zastosowano następujące warunki elektroforezy: temperatura rozdziału 14 o C; napięcie 6 V/cm; początkowy czas pulsu 0,5 s, czas końcowy pulsu 40 s, czas elektroforezy 22 godziny. Elekroforegramy dokumentowano przy użyciu GelScan wersja v firmy Kucharczyk T.E. (Polska), a następnie analizowano przy użyciu oprogramowania komputerowego Gel Compar II Software v. 5.0 firmy Applied Maths, (Belgia). Izolaty bakteryjne zaliczano do określonego profilu PFGE, jeżeli nie obserwowano różnic w ich wzorach restrykcyjnych. Analiza polimorfizmu genetycznego badanych izolatów pałeczek C. jejuni oraz C. coli metodą ERIC-PCR (Enterobacterial Repetitiv e I n t e r g e n i c C o n s e n s u s ). Badanie zostało przeprowadzone zgodnie wytycznymi zaproponowanymi przez Steinbrueckner i wsp. (12). Metodą ERIC-PCR analizowano genomowy DNA izolatów pałeczek C. jejuni oraz C. coli. Amplifikaty ERIC-PCR uzyskano w reakcji PCR z zastosowaniem jednej pary starterów: Eric1 i Eric2 opisanych przez Versalovic i wsp. (13). Amplifikację DNA prowadzono w objętości 25 μl w termocyklerze Mastercycler type 5333 v (Eppendorf, Niemcy). Mieszaninę reakcyjną przygotowano dla wszystkich badanych izolatów jednocześnie ze względu na próbę uniknięcia wpływu nieznacznych zmian stężenia poszczególnych składników mieszaniny na produkt amplifikacji. W celu przygotowania mastermiksu na 150 oddzielnych reakcji do 1950 μl
3 Nr 1 Wewnątrzgatunkowe różnicowanie pałeczek Campylobacter 65 jałowej wody dejonizowanej dodawano 375 μl dziesięciokrotnie stężonego buforu reakcyjnego (NH 4 ) 2 SO 4 (dołączonego przez producenta do polimerazy), 525 μl 25 mm roztworu MgCl 2 (dołączonego przez producenta do polimerazy), 75 μl mieszaniny deoksynukleotydów (końcowe stężenie każdego z dntp 200 μm) oraz 300 μl mieszaniny starterów Eric1 oraz Eric2. Mieszaninę rozlewano po 22,5 μl do probówek PCR o objętości 0,2 ml. Następnie dodawano preparat matrycowego DNA w ilości 2,5 μl oraz 1 μl polimerazy DNA Taq (Fermentas, Litwa) o aktywności 1 j./μl i niezwłocznie umieszczano w termocyklerze. W celu stwierdzenia poprawności wykonania badania oraz określenia międzyżelowego poziomu identyczności w kolejnych rozdziałach w żelu agarozowym jako kontroli używano szczepu z kolekcji PZH C. jejuni PZH 93/06. Kontrolę ujemną stanowiła mieszanina reakcyjna bez matrycowego DNA. Analizę polimorfizmu genetycznego amplifikatów uzyskanych metodą ERIC-PCR prowadzono w 2% żelu agarozowym. (Agarose Electophoresis Grade, MP Biomedicals, Niemcy) w buforze TAE. Jako wzorca wielkości DNA używano1 kb DNA Ladder (Fermentas, Litwa), który umieszczano co 5-6 ścieżkę w przygotowanym żelu agarozowym. Elekroforegramy dokumentowano przy użyciu GelScan wersja v firmy Kucharczyk T.E. (Polska), a następnie analizowano przy użyciu oprogramowania komputerowego Gel Compar II Software v. 5.0 firmy Applied Maths, (Belgia). Analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych amplifikowanego fragmentu genu flaa badanych izolatów pałeczek C. jejuni oraz C. coli (Restriction Fragment Length Polymorphism of flaa gene - PCR-flaA- R F L P ). Badanie zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi CAMPYNET ( Metodą PCR-flaA-RFLP analizowano amplifikaty uzyskane z genomowym DNA izolatów pałeczek z C. jejuni oraz C. coli. Amplifikaty do analizy PCR-flaA-RFLP uzyskano w reakcji PCR z zastosowaniem pary starterów: FlaA1 i FlaA2. W celu przygotowania mastermiksu dla 10 oddzielnych reakcji do 145 μl jałowej wody dejonizowanej dodawano 25 μl dziesięciokrotnie stężonego buforu reakcyjnego (NH 4 ) 2 SO 4 (dołączonego przez producenta do polimerazy), 15 μl 25 mm roztworu MgCl 2 (dołączonego przez producenta do polimerazy), 5 μl mieszaniny deoksynukleotydów (końcowe stężenie każdego z dntp 200 μm), 20 μl mieszaniny starterów FlaA1 oraz FlaA2 (końcowe stężenie każdego startera 0,4 μm) oraz 10 μl polimerazy DNA Taq o aktywności 1 j./μl (końcowa aktywność 1 j./reakcję). Mieszaninę dokładnie mieszano i rozlewano po 22,5 μl do probówek PCR (Eppendorf, Niemcy) o objętości 0,2 ml. Następnie dodawano matrycowego DNA w ilości 2,5 μl i próbki niezwłocznie umieszczano w termocyklerze. Otrzymane w wyniku PCR produkty reakcji poddawano trawieniu enzymem restrykcyjnym DdeI o aktywności 10 j./µl (Sigma, Niemcy). Mieszanina reakcyjna zawierała 5 µl produktu reakcji PCR, 2 µl buforu SH (dołączonego przez producenta enzymu), 0,2 µl enzymu restrykcyjnego oraz 12,8 µl sterylnej wody dejonizowanej. Próbki inkubowano w temp. 37ºC przez godzin. Produkty powstałe w wyniku działania enzymu restrykcyjnego określano po rozdziale w 2,5% żelu agarozowym. Jako wzorca wielkości DNA używano GeneRuler 100 bp DNA Ladder (Fermentas), który umieszczano co 5-7 ścieżkę w przygotowanym żelu agarozowym. W celu stwierdzenia poprawności wykonania badania oraz określenia międzyżelowego poziomu identyczności w kolejnych rozdziałach w żelu agarozowym jako kontroli używano szczepu z kolekcji PZH C. jejuni PZH 93/06. Kontrolę ujemną stanowiła zaś mieszanina reakcyjna bez matrycowego DNA. Elekroforegramy dokumentowano przy użyciu zestawu do dokumentacji fotograficznej
4 66 S. Wardak, M. Jagielski Nr 1 wyników elektroforezy GelScan wersja v firmy Kucharczyk T.E. (Polska), a następnie analizowano przy użyciu oprogramowania komputerowego Gel Compar II Software v. 5.0 firmy Applied Maths, (Belgia). Ustalenie pokrewieństwa izolatów pałeczek C. jejuni metodą porównywania profili allelicznych genów metabolizmu podstawowego tzw. Multilocus Sequence Typing (MLST). Analizę MLST przeprowadzono dla wybranych 6 izolatów pałeczek C. jejuni (82/06, 92/06, 76/07, 82/07, 124/07, 125/07) wyosobnionych od pacjentów z 3 zbiorowych ognisk zakażenia pokarmowego: Użyto 7 par oligonukleotydów starterowych PCR opisanych na stronie internetowej org/campylobacter/mlst-info/cjejuni/cjejuni-info.shtml jako przydatnych do amplifikacji fragmentów genów: aspa, glna, glta, glya, pgm, tkt, unca. A n a l i z a s t a t y s t y c z n a. Wyniki uzyskane metodą ERIC-PCR, PCR-flaA-RFLP, PFGE oraz REAP analizowano przy użyciu oprogramowania GelCompar II Software v. 5.0 (Applied Maths, Belgia). Podobieństwo genetyczne izolatów przedstawiono w postaci dendrogramów utworzonych przy wykorzystaniu metody klasteryzacji UPGMA (Unweighted Pair Group Method Rusing Arithmetic averages) i współczynnika korelacji Pearson a w przypadku analizy profili uzyskanych metodą ERIC-PCR oraz współczynnika podobieństwa Dice a do analizy profili uzyskanych metodą PFGE. Dla każdej z zastosowanych metod określono indeks różnicowania (indeks Simpsona) izolatów należących do gatunku pałeczek C. jejuni (5). Im wartość indeksu bliższa wartości 1 tym wyższa zdolność różnicowania danej metody. WYNIKI Wyniki różnicowania izolatów pałeczek C. jejuni oraz C. coli metodą elektroforezy pulsacyjnej (PFGE). Metodą PFGE analizie poddano wszystkie badane izolaty pałeczek C. jejuni i C. coli (Ryc. 1). W wyniku rozdziału elektroforetycznego metodą PFGE otrzymano wzory zawierające od 4 do 13 prążków o wielkości od 48 kpz do 539 kpz. Wzory PFGE większości izolatów pałeczek C. coli charakteryzowały się w porównaniu do wzorów PFGE izolatów pałeczek C. jejuni obecnością prążków głównie o wielkości od około 50 kpz do około 250 kpz. Analiza przy użyciu oprogramowania Gel Compar II Software v. 5.0 (Applied Maths, Belgia) uzyskanych metodą PFGE elektroforetycznych wzorów genomowego DNA badanych izolatów pałeczek C. jejuni i C. coli pozwoliła na utworzenie dendrogramu, z którego wynika, że oba gatunki zostały rozdzielone na dwie gałęzie. Całkowite podobieństwo izolatów należących do obu gatunków pałeczek Campylobacter wyniosło 41,5%. W wyniku badania powtarzalności wyników typowania szczepu pałeczek C. jejuni PZH 93/06 stwierdzono iż międzyżelowy poziom identyczności profili wynosił 100%. Izolaty pałeczek C. jejuni i C. coli pochodzące z czterech udokumentowanych ognisk zakażenia pokarmowego z lat wykazywały taki sam profil w obrębie ogniska. Wśród 128 badanych izolatów pałeczek C. jejuni wyróżniono 117 profili, spośród których aż 107 było unikatowych (tj. były reprezentowane przez pojedyncze izolaty). Pozostałe 10 profili reprezentowało od dwóch (9 profili) do trzech izolatów (1 profil). Obliczona wartość indeksu różnicowania izolatów pałeczek C. jejuni na podstawie analizy polimorfizmu genetycznego metodą PFGE wyniosła 0,999. Szczegó-
5 Nr 1 Wewnątrzgatunkowe różnicowanie pałeczek Campylobacter 67 Ryc. 1. Dendogram przedstawiający wyniki genetycznego zróżnicowania wszystkich badanych izolatów pałeczek C. jejuni (n=135) i C. coli (n=20) metodą PFGE z zastosowaniem endonukleazy SmaI (Dice, Opt:1,50%, Tol 1,50%). Ramką oznaczono profile izolatów pałeczek C. coli.
6 68 S. Wardak, M. Jagielski Nr 1 Ryc. 2. Dendogram przedstawiający wyniki genetycznego zróżnicowania wszystkich badanych izolatów pałeczek C. jejuni (n=135) i C. coli (n=20) metodą ERIC-PCR (Person, Opt:1,50%, Tol 1,50%). Ramką oznaczono profile izolatów pałeczek C. coli.
7 Nr 1 Wewnątrzgatunkowe różnicowanie pałeczek Campylobacter 69 Ryc.3. Analiza wyników genetycznego zróżnicowania izolatów pałeczek C. coli (n=20) metodą PCR-flaA-RFLP z zastosowaniem endonukleazy DdeI.
8 70 S. Wardak, M. Jagielski Nr 1 łowa analiza dendrogramu wykazała także, że izolaty pałeczek C. jejuni wyosobnione w różnych rejonach kraju nie były ze sobą klonalnie powiązane. Wśród 17 izolatów pałeczek C. coli wyróżniono 15 profili, spośród których 13 było unikatowych. Pozostałe dwa profile reprezentowały po dwa izolaty. A n a l i z a w y n i k ó w E R I C - P C R. Analizie poddano wszystkie badane izolaty pałeczek C. jejuni i C. coli (Ryc. 2). Po elektroforetycznym rozdziale amplifikatów uzyskano wzory zawierające od 5 do 14 prążków odpowiadających fragmentom DNA o wielkości od około 250 pz do około 2500 pz. Analiza elektroforegramów pozwoliła na wykrycie charakterystycznego prążka o wielkości około 900 pz obecnego w elektroforegramach amplifikatów fragmentów genomowego DNA większości izolatów pałeczek C. jejuni oraz prążków o wielkości około 500 pz i 600 pz obecnego w elektroforegramach amplifikatów fragmentów genomowego DNA większości izolatów pałeczek C. coli. W wyniku analizy wzorów amplifikatów przy użyciu oprogramowania Gel Compar II Software v. 5.0 (Applied Maths, Belgia), uzyskano dendrogram, z którego wynika, że izolaty pałeczek C. jejuni i C. coli zostały rozdzielone na dwie gałęzie. Całkowite podobieństwo izolatów należących do obu gatunków pałeczek Campylobacter wyniosło 42,7%. W wyniku badania powtarzalności wyników typowania ERIC-PCR szczepu pałeczek C. jejuni PZH 93/06 stwierdzono, iż międzyżelowy poziom identyczności profili z użyciem algorytmu UPGMA oraz współczynnika korelacji Pearson a wynosił 98,4%. Poziom ten potraktowano jako punkt odcięcia dla wyznaczenia liczby profili pałeczek C. jejuni oraz C. coli uzyskanych metodą ERIC-PCR. Izolaty pałeczek Campylobacter pochodzące z poszczególnych ognisk charakteryzowały się wysokim poziomem podobieństwa genetycznego, od 99,09% do 99,42% dla izolatów z ogniska. A więc wszystkie izolaty pałeczek C. jejuni oraz C. coli pochodzące z czterech udokumentowanych ognisk zakażenia pokarmowego z lat posiadały takie same profile w obrębie ogniska. Wśród 128 badanych izolatów pałeczek C. jejuni wyróżniono 107 profili ERIC-PCR spośród których 90 było unikatowych. Pozostałe 17 profili wykryto u dwóch (13 profili) lub trzech izolatów (4 profile). Obliczona wartość indeksu różnicowania izolatów pałeczek C. jejuni na podstawie analizy polimorfizmu genetycznego metodą ERIC- PCR wyniosła 0,997. Wśród 17 izolatów pałeczek C. coli wyróżniono 15 profili, spośród których 13 było unikatowych. Pozostałe dwa profile reprezentowały po dwa izolaty. Wyniki różnicowania izolatów pałeczek C. jejuni oraz C. coli metodą PCR-flaA- R F L P. Metodą PCR-flaA-RFLP analizie poddano wszystkie badane izolaty pałeczek C. jejuni oraz C. coli. W wyniku elektroforetycznego rozdziału restrykcyjnych fragmentów amplifikowanego fragmentu genu flaa otrzymano wzory zawierające od 2 do 5 prążków odpowiadających fragmentom DNA o wielkości od około 150 pz do ponad 1000 pz. Analiza wzorów PCR-flaA-RFLP izolatów pałeczek C. jejuni i C. coli z wykorzystaniem oprogramowania Gel Compar II Software v. 5.0 (Applied Maths, Belgia), umożliwiła wyróżnienie 21 profili (Ryc. 3). W wyniku badania powtarzalności wyników typowania PCR-flaA-RFLP szczepu pałeczek C. jejuni PZH 93/06 stwierdzono, iż międzyżelowy poziom identyczności wzorów PCR-flaA-RFLP tego izolatu wynosił 100%. Izolaty pałeczek C. jejuni i C. coli pochodzące z czterech udokumentowanych ognisk zakażenia pokarmowego wykazywały takie same wzory PCR-flaA-RFLP w ramach ogniska. Cztery profile PCR-flaA-RFLP były wspólne dla izolatów obu gatunków pałeczek Campylobacter, pozostałe były charakterystyczne dla izolatów pałeczek C. jejuni albo pałeczek C. coli. Analizując osobno izolaty C. jejuni oraz C. coli stwierdzono, że wśród 128 badanych
9 Nr 1 Wewnątrzgatunkowe różnicowanie pałeczek Campylobacter 71 izolatów pałeczek C. jejuni wyróżniono 18 profili, spośród których dwa dotyczyły tylko pojedynczych izolatów. Pozostałe 16 profili reprezentowało od dwóch do 19 izolatów. Obliczona wartość indeksu różnicowania izolatów pałeczek C. jejuni na podstawie analizy PCR-flaA-RFLP wyniosła 0,912. Wśród 17 izolatów pałeczek C. coli wyróżniono 7 profili, spośród których pięć dotyczyły tylko pojedynczych izolatów. Pozostałe dwa profile reprezentowały po sześć izolatów. Wyniki analizy pokrewieństwa izolatów metodą porównywania profili allelicznych genów metabolizmu podstawowego tzw. Multilocus Sequence Typing (MLST). Wśród 6 badanych izolatów wyosobnionych od pacjentów z trzech ognisk zakażenia pokarmowego wyróżniono 3 różne profile alleliczne. Izolaty z poszczególnych ognisk należały do jednego profilu allelicznego. Uzyskane profile alleliczne (2,1,12,9,2,1,25), (4,44,10,1,1,7,1), (9,1,4,6,4,5,1) zaliczono odpowiednio do 3 nowych typów sekwencyjnych, którym nadano numery: ST 3847, 3848 oraz Uzyskane typy sekwencyjne zaliczono następnie do kompleksu klonalnego odpowiednio: ST-21, ST- 257 oraz ST-45. Dostępny w bazie danych opis dotyczący poszczególnych izolatów pałeczek C. jejuni zaliczonych do powyższych kompleksów, pozwolił na stwierdzenie, że izolaty te były wyosobnione głównie w krajach Unii Europejskiej najczęściej od ludzi z objawami zapalenia żołądkowo jelitowego oraz od kur bądź z kurzego mięsa. Analiza wybranych przypadków zakażeń wywołanych przez pałeczki C. jejuni oraz C. coli w oparciu o dane epidemiologiczne oraz genotypową charakterystykę izolatów wyosobnionych od zakażonych o s ó b. Analizie poddano dane epidemiologiczne przypadków objawowych zakażeń oraz uzyskane wyniki różnicowania izolatów pałeczek C. jejuni i C. coli wyosobnionych od trojga osób, u których zaobserwowano wielokrotne, objawowe zakażenie tymi drobnoustrojami. Przeprowadzone badania różnicowania wykazały, że poszczególne izolaty wyosobnione od jednej osoby nie były spokrewnione i nie należały do jednego profilu w zastosowanych metodach typowania. Analizie poddano także dane epidemiologiczne oraz wyniki różnicowania izolatów pałeczek C. jejuni oraz C. coli wyosobnionych od osób z ognisk bądź ze sporadycznych przypadków zakażeń. Izolaty te wybrano ze względu na występowanie nierozróżnialnych profili PFGE u dwu i więcej izolatów (10 profili C. jejuni i dwa profile C. coli, wraz z czterema profilami zawierającymi izolaty z ognisk). W badaniach 12 profili reprezentujących 25 izolatów pałeczek C. jejuni i C. coli nie pochodzących z ognisk, 2 reprezentowało po 2 izolaty wyosobnione od chorego oraz od osoby z otoczenia chorego, jeden profil reprezentował 2 izolaty wyosobnione od tego samego pacjenta podczas choroby i po jej ustąpieniu. Wśród pozostałych 9 profili PFGE, 4 profile reprezentowały izolaty wyosobnione w podobnym przedziale czasowym do 3 miesięcy od ludzi zamieszkujących jeden region, dwa profile reprezentowały izolaty wyosobnione w przedziale czasowym do 3 miesiący od ludzi zamieszkujących różne regiony a trzy profile reprezentowały izolaty wyosobnione w przedziale czasowym większym niż 3 miesiące od ludzi zamieszkujących różne regiony. Przeprowadzone badania wykazały, że izolaty pałeczek C. jejuni i C. coli zaliczone do poszczególnych profili PFGE były także zaliczone do tych samych, bądź podobnych profili, w pozostałych zastosowanych metodach.
10 72 S. Wardak, M. Jagielski Nr 1 DYSKUSJA Do typowania pałeczek Campylobacter wykorzystywane są różne metody zarówno fenotypowe jak i genotypowe (16). Szczególnie użyteczne do wewnątrzgatunkowego typowania wielu gatunków bakterii okazały się, dynamicznie rozwijające się w ostatnich latach, metody biologii molekularnej. Jak dotąd opisano wiele różnorodnych technik genotypowania różniących się m. in. potencjałem różnicowania, powtarzalnością, czaso- i pracochłonnością, kosztami aparatury i odczynników oraz sposobem interpretacji wyników. Jak wynika z danych piśmiennictwa, w naszym kraju, do czasu rozpoczęcia obecnych badań, nie wykonywano typowania pałeczek Campylobacter izolowanych od ludzi przy użyciu takich metod jak MLST, PFGE, ERIC-PCR oraz PCR-flaA-RFLP. W pracy wykorzystano 155 izolatów pałeczek Campylobacter reidentyfikowanych lub wyhodowanych w NIZP-PZH, z czego 110 izolatów było wyhodowanych od 107 osób z kampylobakteriozą w roku 2006 stanowiąc prawie 70% wszystkich zgłoszonych przypadków kampylobakteriozy w tymże roku (10). Charakterystyka izolatów pałeczek C. jejuni i C. coli pochodzących z większości rejestrowanych w Polsce przypadków kampylobakteriozy pozwoliła na określenie ich stopnia zróżnicowania genotypowego. Trzy kolejno oceniane genotypowe metody tj. PFGE, PCR-flaA-RFLP i ERIC-PCR wykazały wysoki potencjał wewnątrzgatunkowego różnicowania badanych izolatów pałeczek C. jejuni i C. coli. Najniższy w tej grupie potencjał różnicowania wykazywała metoda PCR-flaA-RFLP, która oparta jest na analizie polimorfizmu genu flaa. Wartość indeksu różnicowania badanych pałeczek C. jejuni, metodą PFGE z wykorzystaniem procedury CAMPYNET, wyniosła 0,999 i była najwyższa spośród wartości indeksu różnicowania wszystkich użytych w prezentowanej pracy metod. W przypadku pałeczek C. jejuni wysokie zróżnicowanie stwierdzono zarówno wśród izolatów wyosobnionych w laboratorium mikrobiologicznym PSSE Bielsko-Biała, które stanowiły większość badanych w obecnej pracy izolatów (65%), jak również u izolatów wyosobnionych w laboratoriach mikrobiologicznych w innych regionach kraju. Badania innych autorów, uzyskane przy użyciu metody PFGE, także wskazują na wysokie zróżnicowanie genetyczne izolatów pałeczek C. jejuni izolowanych od ludzi oraz z innych źródeł (2, 6, 8). Inną zastosowaną w niniejszej pracy metodą była analiza restrykcyjna amplifikowanego fragmentu genu flaa o wielkości około 1,7 kpz (PCR-flaA-RFLP). Gen ten koduje białko FlaA - flagelinę, wchodzącą w skład rzęski tego drobnoustroju. Wielu autorów wskazuje, że najlepsze wyniki różnicowania pałeczek Campylobacter otrzymywane były z użyciem restryktazy DdeI (2, 11). Europejska sieć doskonałości Med-Vet-Net CAMPYNET zaproponowała, podobnie jak w przypadku metody PFGE, wystandaryzowaną procedurę wykonania PCR-flaA-RFLP przy użyciu restryktazy DdeI. Obliczona wartość indeksu różnicowania pałeczek C. jejuni przy użyciu metody PCR-flaA-RFLP wg procedury CAMPYNET była dość wysoka, wynosiła bowiem 0,912, była jednak niższa niż w przypadku różnicowania tego drobnoustroju metodą PFGE lub ERIC-PCR. Kolejną metodą użytą w badaniach do analizy polimorfizmu genetycznego pałeczek C. jejuni i C. coli było ERIC-PCR (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-PCR). Metoda ta jest stosowana do typowania nie tylko wielu drobnoustrojów takich jak np. pałeczki z rodzaju Enterobacteriaceae, ale także bakteriofagów czy grzybów (4). W piśmiennictwie jest stosunkowo niewiele prac poświęconych badaniom zróżnicowania pałeczek Campylobacter
11 Nr 1 Wewnątrzgatunkowe różnicowanie pałeczek Campylobacter 73 przy wykorzystaniu powyższej metody. W Polsce typowanie pałeczek C. jejuni izolowanych od drobiu z użyciem starterów ERIC przeprowadzili Wojciech i wsp. (18) oraz Wieczorek (17). Autorzy ci wskazują na wysokie zróżnicowanie genetyczne wśród badanych izolatów C. jejuni. W obecnych badaniach wartość indeksu różnicowania izolatów pałeczek C. jejuni metodą ERIC-PCR była bardzo wysoka i wyniosła 0,997, co klasyfikuje powyższą metodę na drugim miejscu pod względem przydatności do różnicowania izolatów C. jejuni zaraz po metodzie PFGE. Niewątpliwą zaletę metody ERIC-PCR stanowi niski koszt przygotowania próbek do badań. Jednakże metoda ta, jak twierdzi wielu autorów, jest wrażliwa na zmiany stężenia składników mieszaniny reakcyjnej. Z tego względu w trakcie badań wstępnych wypróbowano kilka stężeń jonów magnezu oraz polimerazy i wybrano takie, które poprawiły wydajność amplifikacji i ułatwiły analizę profili. W badaniach posłużono się także jedną serią mieszaniny składników (tzw. mastermix) niezbędnych do przeprowadzenia reakcji PCR. Ponadto w obecnej pracy do izolacji matrycowego DNA zastosowano metodę wykorzystującą lizę komórek bakteryjnych, które były zbierane z hodowli na stałym podłożu i zawieszane w roztworze PBS (gęstość zawiesiny 7 w skali McFarlanda). Liza komórek następowała a obecności detergentu (Triton-X100) i proteinazy K, bez etapów dalszego zagęszczania DNA. Takie postępowanie umożliwiło otrzymanie porównywalnych zawartości DNA w preparatach badanych izolatów, dzięki czemu uniknięto konieczności określania stężenia DNA metodą spektrofotometryczną, której stosowanie w przypadku niedostatecznie oczyszczonego preparatu może dawać błędne wyniki oznaczeń ilościowych. Analiza dendrogramu przedstawiająca zbiorczo wszystkie badane izolaty pałeczek Campylobacter wykazała, że wzory uzyskane metodą ERIC-PCR, tak jak to było w przypadku PFGE, pozwalają na różnicowanie tego drobnoustroju w obrębie gatunków: C. jejuni i C. coli. W wyniku przeprowadzonej analizy zaobserwowano także występowanie w większości wzorów charakterystycznego prążka o wielkości około 900 pz w przypadku pałeczek C. jejuni oraz około 500 pz i ponad 600 pz w przypadku pałeczek C. coli. Giesendorf i wsp. (3) wykorzystali różne warianty tzw. metody PCR - fingerprinting do opracowania techniki różnicowania pałeczek Campylobacter. Autorzy ci analizowali profile 33 izolatów C. jejuni, 30 izolatów C. coli oraz 8 izolatów C. lari otrzymane przy użyciu różnych konfiguracji starterów ERIC (startery ERIC1R i ERIC2), REP (startery REP1R i REP2), i AP (starter 1026). Zaobserwowali oni występowanie odcinków DNA charakterystycznych dla poszczególnych gatunków. Przy użyciu starterów ERIC 2 i 1026 stwierdzili, że wszystkie oceniane wzory badanych izolatów C. coli posiadały prążek odpowiadający wielkości około 700 pz, podczas gdy C. lari posiadał fragment wielkości około 1100 pz. Natomiast przy użyciu starterów REP autorzy otrzymali we wszystkich profilach badanych izolatów pałeczek C. jejuni fragment DNA o wielkości około 800 pz. Tak więc wyniki własnych badań jak i innych autorów wskazują, że metoda ERIC-PCR może posłużyć nie tylko do wewnątrzgatunkowego różnicowania tych pałeczek ale także do różnicowania poszczególnych gatunków w obrębie rodzaju Campylobacter. W przypadku pałeczek C. coli najlepsze rezultaty różnicowania uzyskano stosując metodę PFGE jak i ERIC-PCR, które to metody pozwoliły wyróżnić 15 różnych profili wśród 17 badanych izolatów. Może to świadczyć o wysokim zróżnicowaniu pałeczek C. coli. Należy jednak mieć na uwadze, że wniosek ten wyciągnięto na podstawie wyników badania stosunkowo niewielkiej liczby izolatów tego gatunku. W obecnej pracy wykonano również analizę powtarzalności zastosowanych metod dla szczepu C. jejuni PZH 93/06. Badania te pozwoliły na określenie poziomu identyczności
12 74 S. Wardak, M. Jagielski Nr 1 uzyskanych profili badanego szczepu w przypadku PFGE i PCR-flaA-RFLP na poziomie 100%, oraz 98,4% w przypadku ERIC-PCR co świadczy o pełnej powtarzalności przeprowadzonych badań. W wyniku określenia zróżnicowania genotypowego stwierdzono, że przy użyciu wszystkich omawianych metod izolaty pałeczek C. jejuni i C. coli pochodzące od osób z poszczególnych ognisk zostały zaliczone, do odpowiednich profili o nierozróżnialnych wzorach. Przeprowadzone badania wykazały, że izolaty pałeczek C. jejuni pochodzące od osób z trzech ognisk charakteryzowały się także takimi samymi w poszczególnych ogniskach, nie opisanymi do tej pory typami sekwencyjnymi MLST (ST 3847, 3848, 3849). Uzyskane typy sekwencyjne zaliczono do kompleksów klonalnych 21, 257 i 45, do których należą izolaty wyosobnione głównie w krajach Unii Europejskiej przeważnie od ludzi z kampylobakteriozą oraz od kur i z kurzego mięsa. W przypadku omawianych ognisk za podejrzany nośnik czynnika etiologicznego przyjmowano najczęściej mięso drobiowe (prawdopodobnie poddane nieodpowiedniej obróbce termicznej). Tak więc uzyskane w badaniach własnych wyniki wskazują, że izolaty pochodzące z ognisk mogą stanowić część kompleksów klonalnych zawierających izolaty prawdopodobnie w większym stopniu przystosowane do przeżycia w organizmie gospodarza, który stanowią kury będące najczęstszym źródłem zakażenia pałeczkami C. jejuni u ludzi. W celu uzyskania pełnej charakterystyki pokrewieństwa izolatów pałeczek C. jejuni wyosobnionych w kraju planowane są dalsze badania oparte na większej liczbie izolatów tego gatunku. Niewątpliwą zaletę metody MLST stanowi możliwość porównania profili allelicznych genów metabolizmu podstawowego badanych izolatów ze stale aktualizowaną bazą profili dostępną na stronach internetowych. Jednak zbyt wysoki koszt jednostkowy tej metody oraz znaczna pracochłonność stanowią obecnie ograniczenie w rutynowym jej stosowaniu. Szczególnie interesującym aspektem przydatności omawianych metod genotypowych do różnicowania drobnoustrojów, zwłaszcza gdy jest ono przeprowadzane na większej liczbie izolatów z danego terenu, jest możliwość zidentyfikowania potencjalnych ognisk epidemicznych z tzw. tła endemicznego. W przypadku pacjentów zamieszkujących ten sam region kraju od których wyosobniono w podobnym czasie izolaty pałeczek C. jejuni i C. coli o nierozróżnialnych profilach PFGE, można wnioskować, że osoby te mogły być narażone na ekspozycję na wspólne źródło zakażenia. Tak więc wyniki przeprowadzonych badań różnicowania połączone z analizą danych epidemiologicznych wskazują na możliwość istnienia kilku prawdopodobnych, niezarejestrowanych ognisk zbiorowego zakażenia pałeczkami Campylobacter. W niniejszej pracy stwierdzono także obecność kilku klonów, wyosobnionych od pacjentów zamieszkujących różne regiony kraju: w podobnym przedziale czasowym lub izolowanych w różnych okresach które prawdopodobnie mogą być częścią rozproszonego ogniska bądź stanowią stabilny w czasie klon (szczep) tego drobnoustroju. Możliwość występowania w środowisku stabilnych w czasie klonów Campylobacter sugerują także inni autorzy (2, 7, 9). Być może utrzymywanie się w środowisku takich szczepów jest w pewnych przypadkach dla tych bakterii lepszą strategią przetrwania. Jednakże jeżeli o rozprzestrzenieniu jakiegoś szczepu, o stabilnym genotypie, decydowałoby jego lepsze przystosowanie do różnorodnych warunków środowiska, to wyłania się pytanie, dlaczego takie szczepy nie rozprzestrzeniły się w stopniu znacznie wyższym niż wykryto to w obecnej i w cytowanych powyżej pracach. W obecnej pracy interesująca okazała się również analiza wyników PFGE i innych metod typowania pałeczek C. jejuni wyosobnionych od ludzi z wie-
13 Nr 1 Wewnątrzgatunkowe różnicowanie pałeczek Campylobacter 75 lokrotnymi, objawowymi zakażeniami pałeczkami Campylobacter. Wyniki genotypowania izolatów, które wywołały zakażenia u tych pacjentów wskazują, że poszczególne izolaty wyosobnione od każdego chorgo nie są ze sobą spokrewnione. Tak więc kolejne zachorowanie u danej osoby było wywoływane przez inny szczep. Może to świadczyć o braku nabywania odporności na zakażenia pałeczkami Campylobacter u ludzi po przebytej kampylobakteriozie wywołanej przez szczepy o innych właściwościach fenotypowych i genotypowych. W świetle tej tezy interesujące są badania Black i wsp. (1), którzy stwierdzili, że powtórne zakażenie człowieka tym samym szczepem pałeczek Campylobacter, może wywołać pamięć immunologiczną i odporność gospodarza na kolejne zakażenie tym szczepem. Podsumowując, uzyskane w obecnej pracy wyniki pozwalają stwierdzić, że ocena genetycznego zróżnicowania pałeczek Campylobacter metodą PFGE i ERIC-PCR oraz PCR-flaA-RFLP może dostarczyć informacji przydatnych w analizie sytuacji epidemiologicznej kampylobakteriozy. Metody te w trakcie obecnych badań z powodzeniem wykorzystano do analizy pokrewieństwa izolatów wyosobnionych od pacjentów w pierwszym zarejestrowanym w Polsce ognisku zakażenia pokarmowego spowodowanego zakażeniem pałeczkami C. coli (15). W obecnych badaniach największą zaletą metody ERIC-PCR oraz PCR-flaA-RFLP w porównaniu z metodą PFGE była łatwość wykonania badania oraz szybkość uzyskania wyników, co jest niezmiernie ważne w przypadkach gdy istnieje pilna potrzeba udzielenia odpowiedzi o ewentualnym pokrewieństwie izolatów. W przypadku ERIC-PCR oraz RFLP-flaA-RFLP wynik był uzyskiwany po około 10 godzinach, natomiast wynik typowania z zastosowaniem PFGE dopiero po 3 dniach. Jednakże to metoda PFGE charakteryzowała się największym potencjałem dyskryminacyjnym dla badanych bakterii. Przy użyciu metody ERIC-PCR, jak twierdzi wielu autorów, należy się liczyć z możliwością wystąpienia nieswoistych reakcji wynikających z wrażliwości tej metody na stężenie jonów magnezu, dezoksynukleotydów czy polimerazy. Z tego względu wydaje się właściwe przygotowanie bezpośrednio przed użyciem dużej serii mastermixu, która zapewni wykonanie całości zaplanowanych badań. W przypadku metody PCR-flaA-RFLP w porównaniu z dwiema wyżej wspomnianymi metodami zaobserwowano niższą wartość indeksu różnicowania wynoszącą 0,912 wobec 0,999 dla metody PFGE i 0,997 dla metody ERIC-PCR. Jednakże metoda ta jest szybka i łatwa w wykonaniu oraz mniej kosztowna w porównaniu z PFGE. Z tego względu w dochodzeniu epidemiologicznym dla szybkiego określenia stopnia pokrewieństwa badanych izolatów pałeczek Campylobacter wskazane jest ich badanie w pierwszej kolejności metodą ERIC-PCR i PCR-flaA-RFLP. Metody te są możliwe do wdrożenia nawet w terenowych laboratoriach wyposażonych w aparaturę do PCR i do elektroforezy. Natomiast w następnym etapie, szczególnie dla nierozróżnialnych izolatów, powinno zostać wykonywane badanie metodą PFGE. Lepsze poznanie metod służących typowaniu tych drobnoustrojów pozwoli na szybką reakcję odpowiednich służb w przypadku wystąpienia większej epidemii zakażenia pałeczkami Campylobacter, co może znacznie poprawić działanie nadzoru epidemiologicznego, a przez to ograniczyć ewentualne zagrożenia dla zdrowia publicznego w naszym kraju.
14 76 S. Wardak, M. Jagielski Nr 1 S. Wardak, M. Jagielski EVALUATION OF GENOTYPIC AND PHENOTYPIC METHODS FOR THE DIFFERENTIATION OF CAMPYLOBACTER JEJUNI AND CAMPYLOBACTER COLI CLINICAL ISOLATES FROM POLAND. II. PFGE, ERIC-PCR, PCR-FLAA-RFLP AND MLST SUMMARY Campylobacter jejuni and Campylobacter coli are leading cause of bacterial gastroenteritis in many developed countries. We compared pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), enterobacterial repetitive intergenic consensus (ERIC-PCR) and restriction fragment length polymorphisms of the flagellin gene (PCR-flaA-RFLP) for distinguishing 128 C. jejuni isolates and 17 C. coli clinical isolates isolated between 2006 and 2007 in Poland. We also analysed seven isolates from three C. jejuni family outbreaks and three isolates from one C. coli family outbreak. These isolates were also analysed by multilocus sequence typing (MLST). PFGE and PCR-flaA-RFLP were performed as described by CAMPYNET. The methods were evaluated and compared on the basis of their abilities to identify outbreaks isolates and discriminate between unrelated isolates (with D index). PFGE was found to be the most discriminatory method (D=0,999), followed by ERIC-PCR (D=0,997) and PCR-flaA-RFLP (D=0,912). PFGE and ERIC-PCR clearly divided C. jejuni and C. coli into two clusters. PFGE, ERIC-PCR and PCR-flaA-RFLP distinguished 117, 107 and 18 distinct profiles, respectively, among 128 C. jejuni isolates. Among 17 C. coli isolates, 15 PFGE and ERIC-PCR, and 7 PCR-flaA-RFLP profiles were found. All the methods identified the outbreaks strains. MLST analysis showed that C. jejuni isolates obtained from three outbreaks belonged to three new 3847, 3848 and 3849 STs. We found isolates with the indistinguishable patterns in each method which were obtained from humans from the same region and related in time that potentially represent common-source outbreaks. We also found isolates with the indistinguishable patterns in each method that were obtained from humans from different part of Poland. This is the first report of using MLST, ERIC-PCR and PCR-flaA-RFLP methods to distinguish C. jejuni and C. coli clinical isolates in Poland. Our results demonstrate that all typing methods evaluated in this study are highly discriminatory and useful to investigate Campylobacter outbreaks in Poland. Our results also show that the genetic diversity of polish C. jejuni and C. coli isolates is very high. PIŚMIENNICTWO 1. Black RE, Levine MM, Clements ML i inni. Experimental Campylobacter jejuni infection in humans. J Infect Dis 1988;157: Fitzgerald C, Stanley K, Andrew S i inni. Use of pulsed-field gel electrophoresis and flagellin gene typing in identifying clonal groups of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in farm and clinical environments. Appl Environ Microbiol 2001;67: Giesendorf BA, van Belcum A, Koeken A i inni. Development of species-specific DNA probes for Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, and Campylobacter lari by polymerase chain reaction fingerprinting. J Clin Microbiol 1993;31: Gillings M, Holley M. Repetitive element PCR fingerprinting (rep-pcr) using enterobacterial repetitive intergenic consensus (ERIC) primers is not necessarily directed at ERIC elements. Lett Appl Microbiol 1997;25: Hunter PR, Gaston MA. Numerical index of the Discriminatory ability of typing systems: an application of Simpson s index of diversity. J Clin Microbiol 1988;26:
15 Nr 1 Wewnątrzgatunkowe różnicowanie pałeczek Campylobacter Lindmark H, Harbom B, Thebo L I inni. Genetic characterization and antibiotic resistance of Campylobacter jejuni isolated from meats, water, and humans in Sweden. J Clin Microbiol 2004 Feb;42: Manning G, Duim B, Wasenaar T i inni. Evidence for a genetically stable strain of Campylobacter jejuni. Appl Environ Microbiol 2001;67: Nielsen EM, Engberg J, Fussing V i inni. Evaluation of phenotypic and genotypic methods for subtyping Campylobacter jejuni isolates from humans, poultry, and cattle. J Clin Microbiol 2000;38: Owen RJ, Sutherland K, Fitzgerald C i inni. Molecular subtyping scheme for serotypes HS1 and HS4 of Campylobacter jejuni. J Clin Microbiol 1995;33: Sadkowska-Todys M, Wardak S. Kampylobakterioza w 2006 roku. Przegl Epidemiol 2008;62: Santesteban E, Gibson J, Owen RJ. Flagellin gene profiling of Campylobacter jejuni heat-stable serotype 1 and 4 complex. Res Microbiol 1996;147: Steinbrueckner B, Ruberg F, Kist M. Bacterial genetic fingerprint: a reliable factor in the study of the epidemiology of human campylobacter enteritis? J Clin Microbiol 2001;39: Versalovic J, Koeuth T, Lupski JR. Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes. Nucleic Acids Res 1991;19: Wardak S, Jagielski M. Ocena przydatności wybranych metod genotypowych i fenotypowych do wewnątrzgatunkowego różnicowania pałeczek Campylobacter jejuni oraz Campylobacter coli izolowanych od ludzi. I. Przydatność biotypowania, określania profilu lekooporności i profilu plazmidowego oraz plazmidowego wzoru restrykcyjnego. Med Dośw Mikrobiol 2009;61: Wardak S, Szych J, Sadkowska-Todys M. The first report on Campylobacter coli family outbreak detected in Poland in Euro Surveill 2008;13; Wassenaar TM, Newell DG. Genotyping of Campylobacter spp. Appl Environ Microbiol 2000;66: Wieczorek K. Identyfikacja i różnicowanie termotolerancyjnych izolatów Campylobacter w oparciu o wybrane metody biologii molekularnej (rozprawa doktorska), kierownik projektu prof. dr hab. Jacek Osek, Państwowy Instytut Weterynaryjny - Państwowy Instytut Badawczy, Wojciech L, Bednarski M, Wieliczko A i inni. Genotype analysis of Campylobacter jejuni isolated from broilers in Poland. Pol J Vet Sci 2005;8:41-7. Otrzymano: 10 II 2009 Adres Autora: Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Bakteriologii NIZP-PZH swardak@pzh.gov.pl
16
Zastosowanie metody RAPD do różnicowania szczepów bakteryjnych
Zastosowanie metody RAPD do różnicowania szczepów bakteryjnych Wstęp teoretyczny Technika RAPD (ang. Random Amplification of Polymorphic DNA) opiera się na prostej reakcji PCR, przeprowadzanej na genomowym
Bardziej szczegółowoZASTOSOWANIE METOD GENOTYPOWYCH W DOCHODZENIU POKREWIEŃSTWA IZOLATÓW PAŁECZEK CAMPYLOBACTER COLI WYHODOWANYCH OD CHOREGO DZIECKA ORAZ OD PSA
MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2009, 61: 235-241 Sebastian Wardak 1, Urszula Duda 2, B. Wojsa 2 ZASTOSOWANIE METOD GENOTYPOWYCH W DOCHODZENIU POKREWIEŃSTWA IZOLATÓW PAŁECZEK CAMPYLOBACTER COLI WYHODOWANYCH OD
Bardziej szczegółowoTaqNova-RED. Polimeraza DNA RP20R, RP100R
TaqNova-RED Polimeraza DNA RP20R, RP100R RP20R, RP100R TaqNova-RED Polimeraza DNA Rekombinowana termostabilna polimeraza DNA Taq zawierająca czerwony barwnik, izolowana z Thermus aquaticus, o przybliżonej
Bardziej szczegółowoĆwiczenie 2. Identyfikacja płci z wykorzystaniem genu amelogeniny (AMGXY)
Ćwiczenie 2. Identyfikacja płci z wykorzystaniem genu amelogeniny (AMGXY) Cel ćwiczenia Amplifikacja fragmentu genu amelogeniny, znajdującego się na chromosomach X i Y, jako celu molekularnego przydatnego
Bardziej szczegółowoĆwiczenie 3. Amplifikacja genu ccr5 Homo sapiens wykrywanie delecji Δ32pz warunkującej oporność na wirusa HIV
Ćwiczenie 3. Amplifikacja genu ccr5 Homo sapiens wykrywanie delecji Δ32pz warunkującej oporność na wirusa HIV Cel ćwiczenia Określenie podatności na zakażenie wirusem HIV poprzez detekcję homo lub heterozygotyczności
Bardziej szczegółowoMED. DOŚW. MIKROBIOL., 2009, 61: Katarzyna Zacharczuk, Rafał Gierczyński
MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2009, 61: 133-142 Katarzyna Zacharczuk, Rafał Gierczyński OCENA PRZYDATNOŚCI NOWYCH ENZYMÓW RESTRYKCYJNYCH SFAAI ORAZ SMII DO RÓŻNICOWANIA IZOLATÓW YERSINIA ENTEROCOLITICA 4/O3 I
Bardziej szczegółowoPRZYDATNO WYBRANYCH TECHNIK PCR W RÓNICOWANIU TERMOTOLERANCYJNYCH SZCZEPÓW CAMPYLOBACTER
YWNO. Nauka. Technologia. Jako, 2005, 4 (45) Supl., 132 138 KINGA WIECZOREK, JACEK OSEK PRZYDATNO WYBRANYCH TECHNIK PCR W RÓNICOWANIU TERMOTOLERANCYJNYCH SZCZEPÓW CAMPYLOBACTER S t r e s z c z e n i e
Bardziej szczegółowoCorynebacterium diphtheriae
Porównanie wybranych molekularnych metod typowania Corynebacterium diphtheriae Comparison of selected molecular methods for Corynebacterium diphtheriae typing Aleksandra A. Zasada, Marek Jagielski Narodowy
Bardziej szczegółowoTaqNovaHS. Polimeraza DNA RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925
TaqNovaHS RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925 RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925 TaqNovaHS Polimeraza TaqNovaHS jest mieszaniną termostabilnej polimerazy DNA
Bardziej szczegółowoAutor: dr Mirosława Staniaszek
Zakład Hodowli Roślin Ogrodniczych Pracownia Genetyki i Hodowli Roślin Warzywnych Fot. J. Sobolewski Procedura identyfikacji genu Frl warunkującego odporność pomidora na Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici
Bardziej szczegółowoZakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA
Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA Zakład Biologii Molekularnej Wydział Farmaceutyczny, WUM ul. Banacha 1, 02-097 Warszawa IZOLACJA DNA Z HODOWLI KOMÓRKOWEJ.
Bardziej szczegółowoPCR bez izolacji testujemy Direct PCR Kits od ThermoFisher Scientific
PCR bez izolacji testujemy Direct PCR Kits od ThermoFisher Scientific Specjalnie dla Was przetestowaliśmy w naszym laboratorium odczynniki firmy Thermo Scientific umożliwiające przeprowadzanie reakcji
Bardziej szczegółowoĆWICZENIE 1 i 2 Modyfikacja geu wołowej beta-laktoglobuliny przy użyciu metody Overlap Extension PCR (wydłużania nakładających się odcinków)
ĆWICZENIE 1 i 2 Modyfikacja geu wołowej beta-laktoglobuliny przy użyciu metody Overlap Extension PCR (wydłużania nakładających się odcinków) Celem ćwiczenia jest wprowadzenie mutacji punktowej do genu
Bardziej szczegółowoMED. DOŚW. MIKROBIOL., 2009, 61: Sebastian Wardak, Marek Jagielski 1
MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2009, 61: 47-61 Sebastian Wardak, Marek Jagielski 1 OCENA PRZYDATNOŚCI WYBRANYCH METOD GENOTYPOWYCH I FENOTYPOWYCH DO WEWNĄTRZGATUNKOWEGO RÓŻNICOWANIA PAŁECZEK CAMPYLOBACTER JEJUNI
Bardziej szczegółowoZestaw do wykrywania Babesia spp. i Theileria spp. w kleszczach, krwi i hodowlach komórkowych
Nr kat. PK25N Wersja zestawu: 1.2012 Zestaw do wykrywania spp. i Theileria spp. w kleszczach, krwi i hodowlach komórkowych dwie oddzielne reakcje PCR 2x50 reakcji PCR (50 µl), włączając w to kontrole Zestaw
Bardziej szczegółowoTransformacja pośrednia składa się z trzech etapów:
Transformacja pośrednia składa się z trzech etapów: 1. Otrzymanie pożądanego odcinka DNA z materiału genetycznego dawcy 2. Wprowadzenie obcego DNA do wektora 3. Wprowadzenie wektora, niosącego w sobie
Bardziej szczegółowoZestaw do wykrywania Anaplasma phagocytophilum w kleszczach, krwi i hodowlach komórkowych
Nr kat. PK24N Wersja zestawu: 1.2016 Zestaw do wykrywania phagocytophilum w kleszczach, krwi i hodowlach komórkowych dwie oddzielne reakcje PCR 2x50 reakcji PCR (50 µl), włączając w to kontrole Detekcja
Bardziej szczegółowoZestaw do wykrywania Chlamydia trachomatis w moczu lub w kulturach komórkowych
Nr kat. PK15 Wersja zestawu: 1.2016 Zestaw do wykrywania w moczu lub w kulturach komórkowych na 50 reakcji PCR (50µl), włączając w to kontrole Detekcja oparta jest na amplifikacji fragmentu genu crp (cysteine
Bardziej szczegółowoZestaw dydaktyczny. genotypowanie szczepów 5taphy/ococcus aureus metodą PCR-RFLP
2014-07-17 Zestaw dydaktyczny EasyGenotyping PCR-RFLP - S. aureus genotypowanie szczepów 5taphy/ococcus aureus metodą PCR-RFLP Celem ćwiczenia jest przeprowadzenie typowania genetycznego dostarczonych
Bardziej szczegółowoZakład Bakteriologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego Państwowego Zakładu Higieny w Warszawie Kierownik: prof. dr hab. M.
MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2011, 63: 305-314 Tomasz Wołkowicz 1, Jolanta Szych 1, Sebastian Wardak 2 Analiza podłoża genetycznego i mechanizmów rozprzestrzeniania się oporności na tetracyklinę populacji szczepów
Bardziej szczegółowoRT31-020, RT , MgCl 2. , random heksamerów X 6
RT31-020, RT31-100 RT31-020, RT31-100 Zestaw TRANSCRIPTME RNA zawiera wszystkie niezbędne składniki do przeprowadzenia syntezy pierwszej nici cdna na matrycy mrna lub całkowitego RNA. Uzyskany jednoniciowy
Bardziej szczegółowoZakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA
Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA Zakład Biologii Molekularnej Wydział Farmaceutyczny, WUM ul. Banacha 1, 02-097 Warszawa tel. 22 572 0735, 606448502
Bardziej szczegółowoPolimeraza Taq (1U/ l) 1-2 U 1 polimeraza Taq jako ostatni składniki mieszaniny końcowa objętość
Ćwiczenie 6 Technika PCR Celem ćwiczenia jest zastosowanie techniki PCR do amplifikacji fragmentu DNA z bakterii R. leguminosarum bv. trifolii TA1 (RtTA1). Studenci przygotowują reakcję PCR wykorzystując
Bardziej szczegółowoOPRACOWANIE ZESTAWU DIAGNOSTYCZNEGO DO GENETYCZNEGO TYPOWANIA SZCZEPÓW BAKTERYJNYCH METODĄ PCR MP
MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2008, 60: 39-54 Beata Krawczyk, Karolina Stojowska, Justyna Leibner-Ciszak OPRACOWANIE ZESTAWU DIAGNOSTYCZNEGO DO GENETYCZNEGO TYPOWANIA SZCZEPÓW BAKTERYJNYCH METODĄ PCR MP Katedra
Bardziej szczegółowoOcena wpływu zastosowanych odczynników na szybkość uzyskania wyniku identyfikacji laseczki wąglika w teście RSI-PCR dla genu plcr
MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2011, 63: 321-326 Aleksandra A. Zasada Ocena wpływu zastosowanych odczynników na szybkość uzyskania wyniku identyfikacji laseczki wąglika w teście RSI-PCR dla genu plcr Zakład Bakteriologii
Bardziej szczegółowoPOLIMERAZY 1. Kinga Wieczorek, Jacek Osek. Acta Sci. Pol., Medicina Veterinaria 7(2) 2008, WST P. no ci, zwłaszcza pochodzenia
Acta Sci. Pol., Medicina Veterinaria 7(2) 2008, 29-39 TYPOWANIE MOLEKULARNE SZCZEPÓW CAMPYLOBACTER PRZY U YCIU TECHNIK OPARTYCH NA REAKCJI ŁA CUCHOWEJ POLIMERAZY 1 Kinga Wieczorek, Jacek Osek Pa stwowy
Bardziej szczegółowoBiologia medyczna, materiały dla studentów
Zasada reakcji PCR Reakcja PCR (replikacja in vitro) obejmuje denaturację DNA, przyłączanie starterów (annealing) i syntezę nowych nici DNA (elongacja). 1. Denaturacja: rozplecenie nici DNA, temp. 94 o
Bardziej szczegółowoPL B1. UNIWERSYTET PRZYRODNICZY W LUBLINIE, Lublin, PL BUP 26/11
PL 214501 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 214501 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 391458 (51) Int.Cl. C12Q 1/68 (2006.01) C12N 15/29 (2006.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej
Bardziej szczegółowoGenotypowanie szczepów Clostridium perfringens izolowanych od chorych z objawami zatrucia pokarmowego oraz próbek żywności
MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2016, 68: 191-201 Genotypowanie szczepów Clostridium perfringens izolowanych od chorych z objawami zatrucia pokarmowego oraz próbek żywności Genotyping Clostridium perfringens strains
Bardziej szczegółowoGel-Out. 50 izolacji, 250 izolacji. Nr kat , Zestaw do izolacji DNA z żelu agarozowego. wersja 0617
Gel-Out Zestaw do izolacji DNA z żelu agarozowego. wersja 0617 50 izolacji, 250 izolacji Nr kat. 023-50, 023-250 Pojemność kolumny do izolacji DNA - do 20 µg DNA, minimalna pojemność - 2 µg DNA (przy zawartości
Bardziej szczegółowoAmpli-LAMP Babesia canis
Novazym Products Zestaw do identyfikacji materiału genetycznego pierwotniaka Babesia canis canis techniką Loop-mediated Isothermal AMPlification (LAMP) Numery katalogowe produktu: AML-Bc-200 AML-Bc-400
Bardziej szczegółowoSekcja Higieny i Epidemiologii, Wojskowy Instytut Medyczny w Warszawie
ZASADY POSTĘPOWANIA W OGNISKACH EPIDEMICZNYCH WYWOŁYWANYCH PRZEZ SZCZEPY STAPHYLOCOCCUS AUREUS. ZADANIA ZESPOŁU DS. ZAKAŻEN SZPITALNYCH lek. med.marta Kania-Pudło 1, mgr Katarzyna Bojarska 2, prof. dr
Bardziej szczegółowoDr hab. Beata Krawczyk Katedra Mikrobiologii, Politechnika Gdańska
Narzędzia diagnostyki molekularnej w typowaniu genetycznym (genotypowaniu) Dr hab. Beata Krawczyk Katedra Mikrobiologii, Politechnika Gdańska Publikacja współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w
Bardziej szczegółowoGlimmer umożliwia znalezienie regionów kodujących
Narzędzia ułatwiające identyfikację właściwych genów GLIMMER TaxPlot Narzędzia ułatwiające amplifikację tych genów techniki PCR Primer3, Primer3plus PrimerBLAST Reverse Complement Narzędzia ułatwiające
Bardziej szczegółowoAmpliTest Babesia spp. (PCR)
AmpliTest Babesia spp. (PCR) Zestaw do wykrywania sekwencji DNA specyficznych dla pierwotniaków z rodzaju Babesia techniką PCR Nr kat.: BAC21-100 Wielkość zestawu: 100 oznaczeń Objętość pojedynczej reakcji:
Bardziej szczegółowoPowodzenie reakcji PCR wymaga właściwego doboru szeregu parametrów:
Powodzenie reakcji PCR wymaga właściwego doboru szeregu parametrów: dobór warunków samej reakcji PCR (temperatury, czas trwania cykli, ilości cykli itp.) dobór odpowiednich starterów do reakcji amplifikacji
Bardziej szczegółowo47 Olimpiada Biologiczna
47 Olimpiada Biologiczna Pracownia biochemiczna zasady oceniania rozwia zan zadan Część A. Identyfikacja zawartości trzech probówek zawierających cukry (0 21 pkt) Zadanie A.1 (0 13 pkt) Tabela 1 (0 7 pkt)
Bardziej szczegółowoMED. DOŚW. MIKROBIOL., 2014, 66: 89-98
MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2014, 66: 89-98 Opracowanie szybkiego testu PCR-RFLP do identyfikacji pałeczek Yersinia enterocolitica bioserotypu 1B/O8 z epidemicznego szczepu tych drobnoustrojów izolowanych w
Bardziej szczegółowoInstrukcja ćwiczeń Biologia molekularna dla II roku Analityki Medycznej. Reakcja odwrotnej transkrypcji. Projektowanie starterów do reakcji PCR.
INSTRUKCJA Ćwiczenie nr 5 Odczynniki: Sprzęt: 1. 5xNG cdna Buffer 2. 50 µm oligo(dt)20 3. NG dart RT mix l 4. Probówki typu Eppendorf 0,2 ml 5. Woda wolna od RNaz 6. Lód 1. Miniwirówka 2. Termocykler 3.
Bardziej szczegółowoMetody badania ekspresji genów
Metody badania ekspresji genów dr Katarzyna Knapczyk-Stwora Warunki wstępne: Proszę zapoznać się z tematem Metody badania ekspresji genów zamieszczonym w skrypcie pod reakcją A. Lityńskiej i M. Lewandowskiego
Bardziej szczegółowoOporność na antybiotyki w Unii Europejskiej Dane zaprezentowane poniżej zgromadzone zostały w ramach programu EARS-Net, który jest koordynowany przez
Informacja o aktualnych danych dotyczących oporności na antybiotyki na terenie Unii Europejskiej Październik 2013 Główne zagadnienia dotyczące oporności na antybiotyki przedstawione w prezentowanej broszurze
Bardziej szczegółowodr hab. Beata Krawczyk Katedra Mikrobiologii PG Publikacja współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego
PFGE Pulsed Field Gel Electrophoresis dr hab. Beata Krawczyk Katedra Mikrobiologii PG Publikacja współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego 1 PFGE Elektroforeza
Bardziej szczegółowoAnna Litwiniec 1, Beata Choińska 1, Aleksander Łukanowski 2, Żaneta Świtalska 1, Maria Gośka 1
Anna Litwiniec 1, Beata Choińska 1, Aleksander Łukanowski 2, Żaneta Świtalska 1, Maria Gośka 1 1 Zakład Genetyki i Hodowli Roślin Korzeniowych, Pracownia Biotechnologii, Instytut Hodowli i Aklimatyzacji
Bardziej szczegółowoZastosowanie metody MLVA do genotypowania Corynebacterium diphtheriae. Badania wstępne 1
MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2011, 63: 209-218 Aleksandra A. Zasada, Marek Jagielski,Magdalena Rzeczkowska, Aleksandra Januszkiewicz Zastosowanie metody MLVA do genotypowania Corynebacterium diphtheriae. Badania
Bardziej szczegółowoWstęp. Key words: MSSCP, PCR RFLP, Staphylococcus spp., 16S rrna, 16S 23S rrna
Streszczenie Zakażenia szpitalne stanowią złożony problem dla współczesnego lecznictwa i są przyczyną przedłużonego leczenia, rekonwalescencji, zwiększonych kosztów a nawet wielu zgonów wśród pacjentów
Bardziej szczegółowoGenetyka, materiały dla studentów Pielęgniarstwa
Markery genetyczne: definicja Marker genetyczny jest to cecha, która może być wykorzystana do identyfikacji osobników lub gatunków. Cechy markerów genetycznych Monogeniczny: warunkowany przez jeden gen
Bardziej szczegółowoZRÓŻNICOW ANIE GENETYCZNE SZCZEPÓW DROŻDŻY FERM ENTUJĄCYCH KSYLOZĘ
ŻYW NO ŚĆ 3(20)Supl 1999 JOANNA CHMIELEWSKA, JOANNA KAWA-RYGIELSKA ZRÓŻNICOW ANIE GENETYCZNE SZCZEPÓW DROŻDŻY FERM ENTUJĄCYCH KSYLOZĘ S t r e s z c z e n i e W pracy podjęto próbę wykorzystania metody
Bardziej szczegółowoTYPOWANIE MOLEKULARNE W DOCHODZENIU EPIDEMIOLOGICZNYM
TYPOWANIE MOLEKULARNE W DOCHODZENIU EPIDEMIOLOGICZNYM Stefania Giedrys-Kalemba 7 110 Podstawowym zadaniem zespołu kontroli zakażeń jest prowadzenie systematycznego nadzoru i rejestracji zakażeń w celu
Bardziej szczegółowoPL B1. UNIWERSYTET PRZYRODNICZY W LUBLINIE, Lublin, PL BUP 04/14. SYLWIA OKOŃ, Dąbrowica, PL KRZYSZTOF KOWALCZYK, Motycz, PL
PL 220315 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 220315 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 400252 (22) Data zgłoszenia: 06.08.2012 (51) Int.Cl.
Bardziej szczegółowoWalidacja metod wykrywania, identyfikacji i ilościowego oznaczania GMO. Magdalena Żurawska-Zajfert Laboratorium Kontroli GMO IHAR-PIB
Walidacja metod wykrywania, identyfikacji i ilościowego oznaczania GMO Magdalena Żurawska-Zajfert Laboratorium Kontroli GMO IHAR-PIB Walidacja Walidacja jest potwierdzeniem przez zbadanie i przedstawienie
Bardziej szczegółowoAmpli-LAMP Salmonella species
Novazym Products Novazym Polska ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań, tel. +48 0 61 610 39 10, fax +48 0 61 610 39 11, email info@novazym.com Zestaw do identyfikacji materiału genetycznego bakterii z rodzaju
Bardziej szczegółowoDr n. med. Dorota Żabicka, NPOA, KORLD, Zakład Epidemiologii i Mikrobiologii Klinicznej NIL
Raport opracowany ze środków finansowych będących w dyspozycji Ministra Zdrowia w ramach realizacji programu polityki zdrowotnej pn. Narodowy Program Ochrony Antybiotyków na lata 06-00 Narodowy Instytut
Bardziej szczegółowoIdentyfikacja 20 nowych rejonów zmiennych w genomach Staphylococcus aureus przydatnych do genotypowania koagulazo-dodatnich gronkowców
MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2017, 69: 93-103 Roman Kotłowski Identyfikacja 20 nowych rejonów zmiennych w genomach Staphylococcus aureus przydatnych do genotypowania koagulazo-dodatnich gronkowców Identification
Bardziej szczegółowoAmpli-LAMP Goose Parvovirus
Novazym Products Zestaw do identyfikacji materiału genetycznego parwowirusa GPV u gęsi techniką Loop-mediated Isothermal AMPlification (LAMP) Numery katalogowe produktu: AML-GPV-200 AML-GPV-400 Wydanie
Bardziej szczegółowoĆwiczenie 5 Klonowanie DNA w wektorach plazmidowych
Ćwiczenie 5 Klonowanie DNA w wektorach plazmidowych Celem ćwiczenia jest sklonowanie fragmentu DNA (powielonego techniką PCR i wyizolowanego z żelu agarozowego na poprzednich zajęciach) do wektora plazmidowego
Bardziej szczegółowoPL 217144 B1. Sposób amplifikacji DNA w łańcuchowej reakcji polimerazy za pomocą starterów specyficznych dla genu receptora 2-adrenergicznego
PL 217144 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 217144 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 391926 (22) Data zgłoszenia: 23.07.2010 (51) Int.Cl.
Bardziej szczegółowoOcena rozprawy doktorskiej Pani lek. wet. Iwony Kozyry p.t. Molekularna charakterystyka zoonotycznych szczepów rotawirusa świń
Prof. dr hab. Zbigniew Grądzki Katedra Epizootiologii i Klinika Chorób Zakaźnych Wydział Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie Ocena rozprawy doktorskiej Pani lek. wet. Iwony Kozyry
Bardziej szczegółowoGenotypowanie metodą REA-PFGE pałeczek Listeria monocytogenes izolowanych z próbek materiału klinicznego, próbek środowiskowych i próbek żywności
MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2011, 63: 199-207 Agnieszka Kołakowska, Grzegorz Madajczak Genotypowanie metodą REA-PFGE pałeczek Listeria monocytogenes izolowanych z próbek materiału klinicznego, próbek środowiskowych
Bardziej szczegółowoProwadzący: dr Lidia Boss znacznik fluorescencyjny (np. SYBR Green II)
Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii Biologia i Biologia Medyczna II rok Katedra Biologii Molekularnej Przedmiot: Biologia Molekularna z Biotechnologią ============================================================================
Bardziej szczegółowoEvaluation of ITS-PCR and PCR MP techniques for Streptococcus agalactiae genetic differentiation
MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2014, 66: 149-160 Ocena przydatności metod: ITS-PCR i PCR MP w genotypowaniu Streptococcus agalactiae Evaluation of ITS-PCR and PCR MP techniques for Streptococcus agalactiae genetic
Bardziej szczegółowoOznaczenie polimorfizmu genetycznego cytochromu CYP2D6: wykrywanie liczby kopii genu
Ćwiczenie 4 Oznaczenie polimorfizmu genetycznego cytochromu CYP2D6: wykrywanie liczby kopii genu Wstęp CYP2D6 kodowany przez gen występujący w co najmniej w 78 allelicznych formach związanych ze zmniejszoną
Bardziej szczegółowoWojewódzka Stacja Sanitarno-Epidemiologiczna w Poznaniu
Wojewódzka Stacja Sanitarno-Epidemiologiczna w Poznaniu PROGRAM WHO ELIMINACJI ODRY/RÓŻYCZKI Program eliminacji odry i różyczki został uchwalony przez Światowe Zgromadzenie Zdrowia 28 maja 2003 roku. Realizacja
Bardziej szczegółowoWydział Biologii Zakład Mikrobiologii
Prof. dr hab. Adam Kaznowski Poznań, 20.06.2016 r. Recenzja rozprawy doktorskiej mgr Justyny Małgorzaty Drewnowskiej pt. Genetic structure of environmental Bacillus cereus sensu lato strains isolated from
Bardziej szczegółowoJaki koń jest nie każdy widzi - genomika populacji polskich ras koni
Jaki koń jest nie każdy widzi - genomika populacji polskich ras koni Gurgul A., Jasielczuk I., Semik-Gurgul E., Pawlina-Tyszko K., Szmatoła T., Bugno-Poniewierska M. Instytut Zootechniki PIB Zakład Biologii
Bardziej szczegółowoPracownia Mikrobiologii ZDL, Wojewódzki Szpital Specjalistyczny im. L. Rydygiera, Kraków Kierownik: prof. dr hab. A. Budak 3
MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2010, 62: 67-75 Alicja Budak 1,2, Paulina Paluchowska 1, Dorota Włodarczyk 1, Paweł Nowak 1, Małgorzata Węgrzyn, Wojciech Mudyna 3 GENETYCZNA CHARAKTERYSTYKA SZCZEPÓW ACINETOBACTER
Bardziej szczegółowoTechniki molekularne w mikrobiologii SYLABUS A. Informacje ogólne
Techniki molekularne w mikrobiologii A. Informacje ogólne Elementy sylabusu Nazwa jednostki prowadzącej kierunek Nazwa kierunku studiów Poziom kształcenia Profil studiów Forma studiów Rodzaj Rok studiów
Bardziej szczegółowoRozprawa doktorska. mgr inż. Karolina Stojowska
Politechnika Gdańska Wydział Chemiczny Katedra Mikrobiologii Rozprawa doktorska Opracowanie nowych metod typowania genetycznego bakterii opartych o ligację adaptorów oligonukleotydowych do fragmentów restrykcyjnych
Bardziej szczegółowoDIAGNOSTYKA POLSKICH SZCZEPÓW WIRUSA MOZAIKI PEPINO (PEPINO MOSAIC VIRUS)
Progress in Plant Protection / Postępy w Ochronie Roślin, 47 (2) 2007 DIAGNOSTYKA POLSKICH SZCZEPÓW WIRUSA MOZAIKI PEPINO (PEPINO MOSAIC VIRUS) HENRYK POSPIESZNY, BEATA HASIÓW, NATASZA BORODYNKO Instytut
Bardziej szczegółowoKlonowanie molekularne Kurs doskonalący. Zakład Geriatrii i Gerontologii CMKP
Klonowanie molekularne Kurs doskonalący Zakład Geriatrii i Gerontologii CMKP Etapy klonowania molekularnego 1. Wybór wektora i organizmu gospodarza Po co klonuję (do namnożenia DNA [czy ma być metylowane
Bardziej szczegółowo(62) Numer zgłoszenia, z którego nastąpiło wydzielenie:
PL 227091 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 227091 (21) Numer zgłoszenia: 419590 (22) Data zgłoszenia: 20.01.2014 (62) Numer zgłoszenia,
Bardziej szczegółowoZestawy do izolacji DNA i RNA
Syngen kolumienki.pl Gotowe zestawy do izolacji i oczyszczania kwasów nukleinowych Zestawy do izolacji DNA i RNA Katalog produktów 2012-13 kolumienki.pl Syngen Biotech Sp. z o.o., 54-116 Wrocław, ul. Ostródzka
Bardziej szczegółowoNovabeads Food DNA Kit
Novabeads Food DNA Kit Novabeads Food DNA Kit jest nowej generacji narzędziem w technikach biologii molekularnej, umożliwiającym izolację DNA z produktów spożywczych wysoko przetworzonych. Metoda oparta
Bardziej szczegółowoMetody odczytu kolejności nukleotydów - sekwencjonowania DNA
Metody odczytu kolejności nukleotydów - sekwencjonowania DNA 1. Metoda chemicznej degradacji DNA (metoda Maxama i Gilberta 1977) 2. Metoda terminacji syntezy łańcucha DNA - klasyczna metoda Sangera (Sanger
Bardziej szczegółowoProgram ćwiczeń z inżynierii genetycznej KP-III rok Biologii
Program ćwiczeń z inżynierii genetycznej KP-III rok Biologii Ćwiczenie 1 i 2: Metody izolacji, oczyszczania DNA kolokwium wstępne: sprawdzenie podstawowych wiadomości z zakresu genetyki, i biologii molekularnej
Bardziej szczegółowoBadanie próbek żywności na obecność Genetycznie Zmodyfikowanych Organizmów. Rozdział 9
Badanie próbek żywności na obecność Genetycznie Zmodyfikowanych Organizmów Rozdział 9 Wykrywanie jakościowe kukurydzy MON810, kukurydzy Bt-176 i soi Roundup Ready metodą PCR M. Querci, M. Maretti, M. Mazzara
Bardziej szczegółowoOpis przedmiotu zamówienia wraz z wymaganiami technicznymi i zestawieniem parametrów
Załącznik nr 1 do SIWZ Nazwa i adres Wykonawcy Opis przedmiotu zamówienia wraz z wymaganiami technicznymi i zestawieniem parametrów Przedmiot zamówienia; automatyczny system do diagnostyki molekularnej:
Bardziej szczegółowoElektroforeza kwasów nukleinowych
Elektroforeza kwasów nukleinowych Elektroforeza jest podstawową techniką wizualizacji kwasów nukleinowych pozwala bezpośrednio identyfikować cząsteczki DNA ze stosunkowo wysoką czułością (po odpowiednim
Bardziej szczegółowoZA STO SO W A N IE M ETO D Y P C R DO RÓ ŻN IC O W A N IA DRO ŻDŻY PR ZEM Y SŁO W Y C H
ŻYW NO ŚĆ 3(20)Supl 1999 JOANNA KAWA-RYGIELSKA ZA STO SO W A N IE M ETO D Y P C R DO RÓ ŻN IC O W A N IA DRO ŻDŻY PR ZEM Y SŁO W Y C H Streszczenie Metoda PCR została wykorzystana do identyfikacji hybrydów
Bardziej szczegółowoOznaczenie polimorfizmu genetycznego cytochromu CYP2D6: wykrywanie liczby kopii genu
Ćwiczenie 4 Oznaczenie polimorfizmu genetycznego cytochromu CYP2D6: wykrywanie liczby kopii genu Wstęp CYP2D6 kodowany przez gen występujący w co najmniej w 78 allelicznych formach związanych ze zmniejszoną
Bardziej szczegółowoNa tej pracowni wyjątkowo odpowiedzi na zadania należy udzielić na osobnym arkuszu odpowiedzi.
Pracownia biochemiczna arkusz zadań Czas: 90 min. Łączna liczba punktów do zdobycia: 30 Na tej pracowni wyjątkowo odpowiedzi na zadania należy udzielić na osobnym arkuszu odpowiedzi. Drodzy uczestnicy!
Bardziej szczegółowoĆwiczenie 1 Plazmidy bakteryjne izolacja plazmidowego DNA
Ćwiczenie 1 Plazmidy bakteryjne izolacja plazmidowego DNA Plazmidy stanowią pozachromosomalny materiał genetyczny bakterii. Warunkują one szereg cech fenotypowych, jak oporność na leki, syntezę substancji
Bardziej szczegółowoWYKRYWANIE OBECNOŚCI BAKTERII Z RODZAJU LISTERIA W ŻYWNOŚCI
ĆWICZENIE IV Autor i główny prowadzący dr Dorota Korsak WYKRYWANIE OBECNOŚCI BAKTERII Z RODZAJU LISTERIA W ŻYWNOŚCI Wstęp Rodzaj Listeria należy do typu Firmicutes wspólnie z rodzajem Staphylococcus, Streptococcus,
Bardziej szczegółowoElektroforeza kwasów nukleinowych
Elektroforeza kwasów nukleinowych Elektroforeza jest podstawową techniką wizualizacji kwasów nukleinowych pozwala bezpośrednio identyfikować cząsteczki DNA i jest stosunkowo czuła (po odpowiednim wybarwieniu
Bardziej szczegółowoAmpliTest Salmonella spp. (Real Time PCR)
AmpliTest Salmonella spp. (Real Time PCR) Zestaw do wykrywania sekwencji DNA specyficznych dla bakterii z rodzaju Salmonella techniką Real Time PCR Nr kat.: BAC01-50 Wielkość zestawu: 50 oznaczeń Objętość
Bardziej szczegółowoProtokoły do zajęć praktycznych z mikrobiologii ogólnej i żywności dla studentów kierunku: Dietetyka
Protokoły do zajęć praktycznych z mikrobiologii ogólnej i żywności dla studentów kierunku: Dietetyka Protokół I, zajęcia praktyczne 1. Demonstracja wykonania preparatu barwionego metodą Grama (wykonuje
Bardziej szczegółowoElektroforeza kwasów nukleinowych
Elektroforeza kwasów nukleinowych Elektroforeza jest podstawową techniką wizualizacji kwasów nukleinowych pozwala bezpośrednio identyfikować cząsteczki DNA ze stosunkowo wysoką czułością (po odpowiednim
Bardziej szczegółowoFarmakogenetyka Biotechnologia Medyczna I o
ĆWICZENIE 2 Oznaczanie polimorfizmu cytochromu CYP2D6 za pomocą tradycyjnych metod biologii molekularnej: PCR-RFLP I. Łańcuchowa reakcja polimerazy PCR (polymerase chain reaction) Technika PCR rozwinęła
Bardziej szczegółowoFizjologiczne i molekularne markery tolerancji buraka cukrowego na suszę. Dr Danuta Chołuj
Fizjologiczne i molekularne markery tolerancji buraka cukrowego na suszę Dr Danuta Chołuj Szacunkowe straty plonu buraków cukrowych w Europie na skutek suszy kształtują się pomiędzy 5 a 30 % W jakiej fazie
Bardziej szczegółowoProjektowanie reakcji multiplex- PCR
Projektowanie reakcji multiplex- PCR Dzięki nowoczesnym, wydajnym zestawom do PCR, amplifikacja DNA nie jest już takim wyzwaniem, jak w latach 80-tych i 90-tych. Wraz z poprawą metodyki, pojawiły się ciekawe
Bardziej szczegółowo10) istotne kliniczne dane pacjenta, w szczególności: rozpoznanie, występujące czynniki ryzyka zakażenia, w tym wcześniejsza antybiotykoterapia,
Załącznik nr 2 Standardy jakości w zakresie mikrobiologicznych badań laboratoryjnych, w tym badań technikami biologii molekularnej, oceny ich jakości i wartości diagnostycznej oraz laboratoryjnej interpretacji
Bardziej szczegółowoZakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA Analityka Medyczna 2016
Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA Analityka Medyczna 2016 Zakład Biologii Molekularnej Wydział Farmaceutyczny, WUM ul. Banacha 1, 02-097 Warszawa Analiza
Bardziej szczegółowoPublikacja współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego
Nowoczesne metody diagnostyczne Diagnostyka laboratoryjna a wprowadzanie nowych metod diagnostycznych dr hab. Beata Krawczyk Katedra Mikrobiologii PG Publikacja współfinansowana ze środków Unii Europejskiej
Bardziej szczegółowoScenariusz lekcji z biologii w szkole ponadgimnazjalnej
Scenariusz lekcji z biologii w szkole ponadgimnazjalnej Temat lekcji: Planowanie doświadczeń biologicznych jak prawidłowo zaplanować próbę kontrolną? Cele kształcenia IV etap edukacyjny: 1. Wymagania ogólne:
Bardziej szczegółowoZestaw do izolacji DNA z żeli agarozowych. Nr kat. EM08 Wersja zestawu:
Zestaw do izolacji DNA z żeli agarozowych Nr kat. EM08 Wersja zestawu: 1.2014 www.dnagdansk.com 2 Nr kat. EM08 I. PRZEZNACZENIE ZESTAWU Zestaw EXTRACTME DNA GEL OUT przeznaczony jest do szybkiej i wydajnej
Bardziej szczegółowoAKTUALNOÂCI BINET. Nr 10/ Drogie Koleżanki i Koledzy. Inwazyjna choroba meningokokowa w 2015 roku
www.koroun.edu.pl Drogie Koleżanki i Koledzy Witamy serdecznie, oddajemy w Państwa ręce kolejny numer Aktualności BINet. Jest on poświęcony epidemiologii inwazyjnych zakażeń wywoływanych przez Neisseria
Bardziej szczegółowoMonitoring genetyczny populacji wilka (Canis lupus) jako nowy element monitoringu stanu populacji dużych drapieżników
Monitoring genetyczny populacji wilka (Canis lupus) jako nowy element monitoringu stanu populacji dużych drapieżników Wojciech Śmietana Co to jest monitoring genetyczny? Monitoring genetyczny to regularnie
Bardziej szczegółowoZestaw do oczyszczania DNA po reakcjach enzymatycznych
Cat. No. EM07.1 Wersja: 1.2017 NOWA WERSJA Zestaw do oczyszczania DNA po reakcjach enzymatycznych EXTRACTME jest zarejestrowanym znakiem towarowym BLIRT S.A. www.blirt.eu Nr kat. EM07.1 I. PRZEZNACZENIE
Bardziej szczegółowoZalecenia rekomendowane przez Ministra Zdrowia. KPC - ang: Klebsiella pneumoniae carbapenemase
Zalecenia dotyczące postępowania w przypadku identyfikacji w zakładach opieki zdrowotnej szczepów bakteryjnych Enterobacteriaceae wytwarzających karbapenemazy typu KPC * * KPC - ang: Klebsiella pneumoniae
Bardziej szczegółowoMapowanie fizyczne genomów -konstrukcja map wyskalowanych w jednostkach fizycznych -najdokładniejszą mapą fizyczną genomu, o największej
Mapowanie fizyczne genomów -konstrukcja map wyskalowanych w jednostkach fizycznych -najdokładniejszą mapą fizyczną genomu, o największej rozdzielczości jest sekwencja nukleotydowa -mapowanie fizyczne genomu
Bardziej szczegółowo