Receptory jądrowe. w terapii nowotworów

Transkrypt

1 Receptory jądrowe w terapii nowotworów

2 NRs NRs NRs NRs

3

4 Apoptoza samobójca fagocyt resztki samobójcy

5

6

7

8 Komórki apoptotyczne - barwienie DAPI

9 Barwienie jąder komórkowych jodkiem propydyny jądro zdrowe jądro apoptotyczne

10

11 Detection of apoptosis FACS PI staining G0/G1 DNA laddering (electrophoresis) apoptic S G2/M G0/G1 apoptic S G2/M

12

13 Receptory jądrowe mogą: 1. nasilać proliferację i działać przeciwapoptotycznie (a ich i niedobór indukuje uje apoptozę) np. ER w komórkach nabłonka gruczołu mlecznego AR w komórkach nabłonka prostaty Receptor ekdysonu w komórkach układu nerwowego owadów 2. nasilać apoptozę i działać przeciwproliferacyjnie: np. GR - zwłaszcza w limfocytach RXR w różnych typach komórek RAR w różnych typach komórek VDR w różnych typach komórek PPAR w różnych typach komórek Receptor ekdysonu w komórkach ślinianek larw owadów Podział ten jest jednak bardzo uproszczony,, a działanie receptorów jądrowych w wielu przypadkach zależy y od typu komórki i czynników w towarzyszących.

14 Niektóre receptory (ER,( AR, PR) ) stymulują ekspresję cykliny D, która aktywuje Cdk4. Prowadzi to do fosforylacji prb,, które oddysocjowuje od kompleksu DP-E2F, co pozwala na transkrypcję genów nasilajacych proliferację. Inne receptory (VDR,( RAR) ) indukują ekspresję p21, które blokuje aktywność Cdk,, co utrzymuje komórki w fazie G1

15 ER i PR - Aktywacja ER nasila wzrost w tkankach docelowych i może nasilać wzrost nowotworów w sutka i macicy. - Estradiol nasila proliferację nabłonka i stromy macicy, a zmniejszenie poziomu estrogenów w prowadzić może e do apoptozy komórek nabłonkowych. - Jeśli komórki raka piersi sąs pozytywne dla ERα i PR, to jest to prawdopodobnie rak zależny od hormonów. W takim przypadku stosuje się terapie antyestrogenową. 3 lata mammografia

16 AR - Aktywacja AR nasilaj proliferację komórek docelowych i może nasilać wzrost raka prostaty. - Gruczoł prostaty silnie odpowiada na dihydrotestosteron.. Androgeny sąs niezbędne do utrzymania proliferacji i różnicowania r komórek prostaty. Kastracja lub chemiczne zablokowanie androgenów prowadzi do masywnej apoptozy nabłonka prostaty i inwolucji prostaty. - Zmniejszenie poziomu androgenów w lub zablokowanie AR jest metodą leczenia raka prostaty. ludzka prostata z wybarwionymi AR

17 TR - Aktywacja TR przez hormony h tarczycy jest niezbędn dna do indukcji apoptozy w ogonie kijanek płazp azów. W procesie tym zaangażowane sa receptory TRα i TRβ które heterodimeryzują z RXRα i RXRβ. - Tyroidy mogą nasilać proapoptotyczne działanie anie kwasu all-trans retinowego (ATRA) - Aktywacja TR nasila aktywność kaspaz - Hormony tyroidowe mogą regulować apoptozę tkanek targetowych wpływaj ywając c na poziom ekspresji Fas i sfas.

18 GR - Aktywacja GR może hamować proliferację i indukować apoptozę limfocytów w T i przez to * wywierać efekt antyleukemiczny, * powodować zanik grasicy, * zmniejszać liczbę krążą ążących limfocytów w T * hamować zapalenie - Dlatego agonistów GR używa u się w terapii białaczek aczek limfoblastycznych lub w zapaleniu. aktywowany GR (wybarwiony na żółto) w komórkach COS-7 - Mogą być czynnikami wzrostowymi. Np. ich i niewielka, bazalna aktywność w mózgu m jest niezbędn dna dla właściwego w rozwoju i przeżycia neuronów. Dopiero wysoki poziom aktywacji, indukowany y np. przez stres może prowadzić do apoptozy neuronów

19 VDR - Witamina D3 (VD3( VD3) indukuje apoptozę komórek raka sutka, zwłaszcza w obecności ci tamoksifenu (antyestrogen). Może e mieć podobne działanie anie na inne linie komórkowe. - Są prace wskazujące, że e obniżona ona ekspresja receptorów w dla VDR może być przyczyną zmniejszenia wrażliwo liwości na VD3 i zwiększenia prawdopodobieństwa rozwoju raka sutka. VD3 - polimorfizm VDR ma wpływ na ryzyko zachorowania na raka prostaty y lub raka sutka - Analogi VD3 w modelach zwierzęcych mogą powodować regresję raka sutka zarówno zależnego od estrogenów w jak i niezależnego nego od estrogenów. Pod warunkiem, że e komórki nowotworowe mają funkcjonalny receptor VDR.

20 PPARγ receptor regulujący dojrzewanie adipocytów - Myszy heterozygotyczne z brakiem jednego allelu PPARγ traktowane kancerogenem częś ęściej zapadają na raka okręż ężnicy niż myszy dzikie. - Heterosomatyczne mutacje PPARγ znajduje się u 10% pacjentów w z rakiem okręż ężnicy a delecje w PPARγ nawet u 40% pacjentów w z nowotworem prostaty (w komórkach nowotworowych). Mutacje te prowadzą do utraty funkcji przez PPARγ.

21 PPARγ - ligandy PPARγ: - prostaglandyna-d2, prostaglandyna-j2 (prostaglandyny hamujące proces zapalny) - troglitazon - ciglitazon - rosiglitazon - pioglitazon leki przeciwcukrzycowe

22 PPARγ - ligandy PPARγ hamują proliferacje i indukują apoptozę w wielu typach komórek, zarówno nowotworowych jak i normalnych, ale apoptoza jest często bardziej nasilona w komórkach nowotworowych niż normalnych. - Ligandy PPARγ mogą indukować różnicowanie w nowotworach sutka, okręż ężnicy, płuc p i osteosarkomie,, przynajmniej w liniach komórkowych hodowanych in vitro. Osteosarcoma cells with the labelled glucopyranosyl residues, sialic acid and N-acetylglucosaminyl residues. The nuclei stained with Hoechst

23 PPARγ - osteosarcoma - Osteosarkoma jest najczęstszym nowotworem kości, rozwijającym się najczęś ęściej u ludzi w drugiej dekadzie życia. Jest bardzo agresywnym nowotworem, który łatwo metastazuje.. Przyczyna śmierci pacjentów w sąs najczęś ęściej przerzuty, które trudno diagnozować.. Guzy przerzutowe sąs bardzo oporne (nawet całkowicie) na konwencjonalną chemoterapię. - Zarówno osteoblasty jak i adipocyty pochodzą od tych samych komórek progenitorowych w stromie szpiku. Wydaje się, że e aktywacja PPARγ może e prowadzić do indukcji różnicowania r komórek osteosarcoma. - W liniach komórkowych ludzkiej osteosarkomy jest ekspresja PPARγ. - Troglitazone i ciglitazon hamuja proliferacje tych linii, wywołuj ują różnicowanie i indukują apoptozę.

24 Troglitazone (PPARγ ligand) induces apoptosis in human osteosarcoma cell lines 72 h incubation

25 Ciglitazone (PPARγ ligand) inhibits proliferation and increases differentiation in human osteosarcoma cell lines PB inhibitor of HDAC DMSO ciglitazon

26

27 RARα

28 Witamina A i jej pochodne Witamina A Pochodne używane w terapii all-trans 13-cis

29 Retinoidy i ich receptory - niedobór r witaminy A (retinol, kwas retinowy i aldehyd retinowy) jest jedną z trzech głównych g chorób b wywoływanych ywanych niewłaściwym poziomem żywienia (po niedoborze kalorii i anemii wynikającej z braku żelaza) - retinol jest używany u do syntezy rodopsyny (nidobór grozi kurzą ślepotą ) - retinol nie jest uzyskiwany z diety, ale jest syntetyzowany w jelicie w wyniku enzymatycznego cięcia cia β-karotenu, α-karotenu i β-kryptoksantyny. - dobrym źródlem witaminy A estrów retinylowych, które w jelicie sa hydrolizowane do retinolu są jajka, mleko, wątroba, w tłuszcz) t

30 Retinoidy i ich receptory - Retinoidy działaj ają poprzez 2 typy receptorów w jądrowychj drowych: * RAR (RARα,, RARβ,, RARγ) - kwas all trans retinowy * RXR (RXRα,, RXRβ,, RXRγ) - kwas 9-cis 9 retinowy - Receptory retinoidów, oprócz współdzia działaniaania z typowymi koaktywatorami wykorzystują jako kofaktor białko CRABPII (cellular retinoic acid-binding protein II) - Białko CRABPII łączy się z kwasem retinowym,, a nastęnie tworzy kompleks z RAR-RXR RXR i zwiększa jego aktywność transkrypcyjną poprzez: * uwolnienie kwasu retinowego i przekazanie go na receptor * zwiększenie stabilności wiązania RAR-RXR RXR do promotora genu targetowego - Z białkiem CRABPII może e integrować cyklina D3,, której obecność dodatkowo stabilizuje kompleks

31 Cyclin D3 enhances transactivation of RA target genes through its interaction with CRABPII associated with RAR

32 Acute Promyeolocytic Leukemia (APL) -ostra białaczka promieloblastyczna - Szybko rozwijająca się białaczka wynikająca z namnażania ania się promielocytów.. Normalnie promielocyty namnażaj ają i różnicujr nicują się w ściśle kontrolowany sposób b w szpiku. W APL dzielą się w sposób niekontrolowany i nie dojrzewają. - Komórki nowotworowe wypełniaj niają szpik i uniemożliwiaj liwiają mu produkcję komórek krwi. Komórki nowotworowe sąs wprawdzie leukocytami, ale jako niedojrzałe e nie mogą spełnia niać normalnych funkcji, więc c pacjenci zagrożeni są zarówno anemią i krwotokami, siniakami jak i infekcjami. Promielocyty gromadzą się we wszystkich narządach chorego. - Stanowi ok. 10% wszystkich białaczek mieloidalnych u dorosłych (ok osób b w USA rocznie), czyli jest nowotworem dość rzadkim.

33 Hematopoietic Differentiation

34 Diagnostic Techniques (Morphology) Blast

35

36 Leukemic infiltrate of skin

37 Leukemic infiltrate of gum

38 Petechiae

39 Acute Promyelocytic Leukemia (APL) t(15;17)-juxtaposes PML (unknown function) next to the RAR-alpha (retinoic( acid receptor) ) creating a chimeric protein PML-RAR

40 PML-RAR - Molekularna przyczyna APL to (prawie w 100%) translokacja dotycząca ca chromosomu 17. W 99% przypadków w u pacjentów w z translokacją występuje wymiana odcinków w chromosomu 15 i 17, co jest markerem tej choroby. Chronologicznie byłb to drugi przypadek (po chromosomie Philadelphia) udowodnienia genetycznego podłoża a nowotworu. - Translokacja obejmuje RARα na genie 17 i gen, PML (promyelocytic leukemia gene), z chromosomu 15. -Korzyść terapeutyczna: * w latach 1960-tych czas od diagnozy APL do śmierci pacjenta wynosił 1-22 tygodnie, w zależno ności od jakości opieki (!). * Obecnie ok. 80% przypadków w udaje się całkowicie wyleczyć. - W niektórych przypadkach translokacja obejmuje chromosom 5 i 11 zamiast 15.

41 APL with t(15;17) PML-RAR RARα PML locus RARα locus chromosome 15 chromosome 17 PML/RARα fusion gene RARα/PML fusion gene chromosome 15/17 chromosome 17/15

42 PML-RAR RARα fusion protein leads to APL PML RARα growth and survival advantage block of hematopoietic differentiation Acute Promielocytic Leukemia (APL)

43 PML-RAR - Prawidłow owe białko PML znajdowane jest w jądrze j (ciałka Kremera 10-30/j 30/jądro). PML kolokalizuje w ciałkach Kremera z białkami SUMO-1, Sp-100, Sp140, CBP, DAXX, RB i p53. - PML-RAR RARα oddziałuje z PML, destabilizuje ciałka Kremera i powoduje, że e białka które je budują (łącznie z PML) lokują się w innych częś ęściach jądra, j uniemożliwiaj liwiając c normalne funkcjonowanie PML. - PML jest kluczowym białkiem dla utrzymania struktury ciałek jądrowych j (Kremera( Kremera), a poprzez działanie anie na PML kompleks PML-RAR RARα wpływa na funkcje wszystkich białek w ciałkach jądrowych. j

44 PML-RAR RARα powoduje: * zablok blokowanieowanie różnicowanie promielocytów * nasilenie proliferacji komórek * zwiększenie niestabilności genomu -

45 PML-RAR: zablokowanie różnicowania - w braku RA heterodimery RAR-RXR RXR hamują transkrypcję genów targetowych poprzez rekrutację represorów i deacetylaz histonowych - RA w fizjologicznych dawkach powoduje oddysocjowanie represorów,, przyłą łączenie koaktywatorów i aktywacje transkrypcyjną genów targetowych prowadzącą do zahamowania proliferacji i nasilenia różnicowania różnych r komórek, w tym linii mieloblastycznej - PML-RAR RARα może e się wiąza zać do HRE i może dimeryzować z RXRα.. Co więcej PML-RAR RARα wiąż ąże e RA z takim samym powinowactwem jak RARα. - W fizjologicznych dawkach RA, białka PML-RARα działaj ają jako silne represory transkrypcji z powodu nasilonego powinowactwa do korepresorów i deacetylaz histonowych. - Efekt ten jest znoszony przez farmakologiczne dawki RA wówczas wczas kompleks oddysocjowuje,, a zamiast niego przyłą łącza się koaktywator i rusza ekspresja genów. represorowy - wydaje się, że e do zablokowania różnicowania r konieczne jest zblokowanie szlaków w RARα i PML

46 Dual leukemic function of PML-RAR RARα PML RARα RXRα DR5 RARα PML Block of differentiation control of genome stability proapoptotic factor cell cycle regulatory factor Growth survival advantage Acute Promielocytic Leukemia (APL)

47 PML-RAR nasilenie proliferacji komórek - Inaczej niż klasyczne onkogeny, PML-RAR RARα nie transformuje fibroblastów, natomiast na wszystkie komórki nie-hematopoetyczne działa a jako silny inhibitor proliferacji (na większo kszość hematopoetycznych dziala tak samo) - In vivo leukemia rozwija się u myszy transgenicznych tylko jeśli PML-RAR RARα ulega ekspresji w linii mieloidalnej. -Ekspresja PML-RAR RARα we wszystkich komórkach u myszy transgenicznych jest letalna w okresie embrionalnym. nie wiadomo dlaczego właśniew mielocyty zachowują się odmiennie. -Szlaki indukowane przez PML i RA-RAR RARα-RXRα hamują proliferację. PML-RAR RARα może e promować proliferację hamując c szlak PML i RA-RAR RARα-RXRα

48 PML-RAR zmniejszenie apoptozy komórek - PML-RAR RARα powoduje że promielocyty stają się oporne na wiele sygnałów apoptotyczych (np. Fas, TNFα, IFNs). Podobny efekt daje zablokowanie PML, więc c zahamowanie apoptozy w promielocytach z PML-RAR RARα może e wynikać z interferencji z PML. - Niedawno wykazano, że e PML działa a jako p53-zale zależny i p53-niezale niezależny ny induktor apoptozy. PML oddziałuje z p53 in vitro i in vivo,, jest niezbędny do jego właściwejw acetylacji i indukcji genów targerowych dla p53 - W APL unieczynniające ce mutacje w genie p53 sąs bardzo rzadkie (inaczej niż w innych ostrych białaczkach), aczkach), gdyż funkcja p53 jest zaburzona w wyniku zaburzeń działania ania PML. Nie ma więc presji selekcyjnej na p53.

49 Consequence of PML-RAR RARα interference in PML function PML cellular stresses: - radiation - Fas-L - TNFα - oncogenic transformation PML RARα apoptosis cell cycle arrest p53-dependent p53-independent (radiation-induced induced (FAS-induced apoptosis of apoptosis of thymocytes) ) activated splenocytes) )

50 Role of PML in the p53 tumor suppresive pathway DNA damage PML RARα PML p53 acetylation p53-activation PML p53 CBP apoptosis

51 PML-RAR destabilizacja genomu - Komórki z myszy transgenicznych PML-RAR RARα maja dużo o aberracji chromosomowych - liczne białka odpowiedzialne za stabilizację genomu akumulują się w ciałkach Kremera (np. helikaza BLM Bloom syndrom DNA helicase). - BLM jest w niewłaściwych miejscach w komórkach z APL i w komórkach pozbawionych PLM. Prowadzi to do znacznego nasilenia wymiany między chromatydami siostrzanymi. Podobnie jest z innymi białkami zwiększaj kszającymi stabilność genomu. - PML-RAR RARα może e nasilać niestabilność genomu oprzez negatywny wpływ na ciałka Kremera.

52

53

54

55 morphology Effect of ATRA treatment on APL cells PML localization (immunofluorescence) control ATRA (time( time)

56 Effect of ATRA treatment on APL cells CD11b expression (FACS analysis) proliferation (FACS analysis,, PI staining) control ATRA (time( time)

57

58 Dziękuję i zapraszam za tydzień. Co warto zapamiętać: - jak jest przyczyna APL - jakie są właściwości PML-RAR i co wynika z zastosowania wysokich dawek kwasu retinowego u pacjentów chorych na APL - jakie może być działanie PPARγ w nowotworach Slajdy będą dostepne w bibliotece i na stronie Fan-clubu hemoksygenazy: