Laboratorium biotechnologia ogólna dla studentów kierunku biotechnologia wersja 1.3 PRODUKCJA KWASU CYTRYNOWEGO

Transkrypt

1 Kwas cytrynowy Kwas cytrynowy (2-hydroksy-1,2,3-propanotrikarboksylowy) o M cz = 192 i temperaturze topnienia 153ºC po raz pierwszy został wyizolowany z soku cytryn. W formie krystalicznej kwas ten występuje w postaci bezwodnej lub jednowodnej. Jednowodna forma jest otrzymywana przez krystalizację w temperaturze poniżej 36,6ºC, powyżej tej temperatury powstaje forma bezwodna. Kwas cytrynowy występuje w przyrodzie w owocach cytrusowych i ananasach. Owoce te do niedawna były głównym źródłem tego kwasu. Światowa produkcja kwasu cytrynowego przekracza ton rocznie, co jest podyktowane bardzo dużym zapotrzebowaniem na ten kwas ze strony przemysłu spożywczego, farmaceutycznego, chemicznego oraz metalurgicznego. Jego wykorzystanie wynika m.in. z działania konserwującego na skutek obniżania wartości ph środowiska. Jednocześnie jest związkiem nietoksycznym, o dobrych walorach smakowych i zapachowych. Zastosowanie kwasu cytrynowego i jego pochodnych w produkcji i przetwórstwie żywności jest stosowany (za zgodą FAO/WHO) jako inhibitor enzymów, głównie oksydaz powodujących utlenianie polifenoli, co objawia się ciemnieniem owoców i warzyw, wykorzystywany jest do produkcji napojów, słodyczy, owoców kandyzowanych i win, jako środek zakwaszający i stabilizujący, tworzenie połączeo kompleksowych z jonami metali (Fe, Cu, Zn) zadecydowało o zastosowaniu jako stabilizatora olejów; wiążąc metale katalizujące proces jełczenia tłuszczów, kwas cytrynowy przerywa reakcję tworzenia nadtlenków i innych produktów powstałych w wyniku utleniania nienasyconych kwasów tłuszczowych w procesie autooksydacji olejów, zdolnośd do wiązania metali ciężkich umożliwiła wykorzystanie kwasu cytrynowego do oczyszczania powierzchni metali przed spawaniem lub pokrywaniem powłokami ochronnymi, w mleczarstwie, wodne roztwory kwasu cytrynowego są stosowane do usuwania z aparatury kamienia mlecznego (osad z białka, tłuszczu i soli mineralnych mleka), w przemyśle farmaceutycznym stosowany jest jako środek dodawany do tabletek powodujący efekt musujący, w stacjach krwiodawstwa pochodne kwasu cytrynowego są stosowane jako środki zapobiegające krzepnięciu krwi, w chemii gospodarczej sole kwasu cytrynowego wypierają trudno biodegradowane fosforany ze składu detergentów, estry kwasy cytrynowego znalazły zastosowanie jako nietoksyczne plastyfikatory w cienkich powłokach ochraniających żywnośd. W 1893 roku Wehmer po raz pierwszy wykrył kwas cytrynowy w kulturach pędzlaków i nazwał je Citromyces pfefferianus, a Curie w 1917 roku stworzył przemysłowe podstawy produkcji tego kwasu dzięki odkryciu, że Aspergillus niger rośnie dobrze i wydziela duże ilości kwasu cytrynowego w pożywkach płynnych o ph 2,5-3,5. Wzrost ph powoduje przestawienie produkcji na kwas glukonowy, a dalej na szczawiowy. Niska wartośd ph chroni pożywkę przed zakażeniami, głównie bakteryjnymi. Producentami kwasu cytrynowego są wyselekcjonowane szczepy Aspergillus niger, A. wentii, A. clavatus oraz liczne drożdże z rodzaju Candida (C. lipolytica, C. tropicalis, C. intermedia, C. guilliermondi), które syntezują kwas cytrynowy w środowisku zawierającym n-alkany. Wśród szczepów z gatunku C. lipolytica został wyselekcjonowany szczep, u którego stwierdzono cykl płciowy (został nazwany na cześd odkrywcy Yarrowia lipolytica) i który może wytwarzad kwas cytrynowy z n-parafin, dzięki czemu znalazł szybko zastosowanie w przemyśle. Jednym z podstawowych aspektów przemawiających za stosowaniem drożdży jest ich zdolnośd do wykorzystywania w charakterze źródła węgla szerokiej gamy surowców, zwłaszcza niekonwencjonalnych. Jak wiadomo, używanie w procesach biotechnologicznych tanich odnawialnych surowców pozwala na znaczne obniżenie kosztów produkcji. W ostatnich latach, wraz z rozwojem produkcji biopaliw (biodiesla), atrakcyjnym i tanim surowcem stosowanym w procesach biotechnologicznych jest gliceryna. Szacuje się, że pod koniec 2010 r. na rynku europejskim będzie dostępnych około 1 mln ton gliceryny, którą zagospodaruje się różnymi metodami, w tym także metodami biotechnologicznymi. Jednak przetwarzanie glicerolu w użyteczne produkty w procesach biotechnologicznych znajduje się dopiero w fazie badao laboratoryjnych. Odpadowa gliceryna została wykorzystana szczególnie w procesach beztlenowych, m.in. do produkcji: 1,3 propanodiolu, dihydroksyacetonu, kwasu bursztynowego i wodoru. Wstępne badania, wskazują, że odpadowy glicerol zapewnia otrzymanie, w hodowlach z udziałem mutantów octanowych Y. lipolytica, wysokich ilości kwasu cytrynowego, dochodzących do 200 g/l. Ponadto wydajnośd kwasu cytrynowego z tego surowca była wyższa w porównaniu do hodowli prowadzonych w podłożach glukozowych. Interesujący jest również fakt, iż obok kwasu cytrynowego, w podłożach zawierających glicerol, szczep drożdży Y. lipolytica produkuje także duże ilości alkoholi cukrowych, takich jak erytrytol i mannitol. Kwas cytrynowy wytwarzają także Penicillium citrinum, Mucor piriformis. Jednak w praktyce przemysłowej największe znaczenie mają szczepy Aspergillus niger. Proces produkcyjny Produkcję kwasu cytrynowego prowadzi kilkoma metodami. Na początku najczęściej stosowano metodę powierzchniową, potem wgłębną, a ostatnio szczególnie w Japonii stosuje się hodowlę na pożywkach stałych.

2 Metoda powierzchniowa Oczyszczony melas rozcieocza się wodą do zawartości 15 17% cukru, zakwasza kwasem siarkowym do ph 6,3, dodaje pewną ilośd żelazocyjanku potasowego, sterylizuje, ochładza do temp. 40ºC i przetłacza do komór fermentacyjnych, odkażonych dwutlenkiem siarki lub formaliną. Komory fermentacyjne zawierają ok. 80 płytkich tac fermentacyjnych, które napełnia się roztworem melasy buraczanej i szczepi zarodnikami kultury A. niger, wyhodowanymi na podłożu z ziemniaczanym w probówkach i przeniesionymi następnie do kolb z wodą wodociągową. Wodna zawiesina grzyba jest pistoletem natryskowym równomiernie rozprowadzana na powierzchnię tac. Po około dwóch dniach powierzchnia pożywki pokrywa się białą grzybnią kiełkujących zarodników. W czasie fermentacji tworzy się duża ilośd dwutlenku węgla, który usuwa się poprzez nawiew jałowego powietrza. Nadmierne przewietrzanie wzmacnia jednak procesy oddechowe pleśni i zmniejsza wydajnośd fermentacji. Ponadto przyczynia się do nadmiernego parowania pożywki. Proces fermentacji trwa 9 11 dni w temp ºC. Po zakooczeniu procesu można spuścid melasę a pozostałą warstwę kożucha grzybni podwarstwid świeżą pożywką. W zebranym płynie pohodowlanym wytrąca się kwas szczawiowy (jako szczawian wapnia) i oddziela przez sączenie. Kwas cytrynowy jest wytrącany za pomocą węglanu wapnia (cytrynian wapnia), krystalizuje i uwalnia przy użyciu kwasu siarkowego. Wydajnośd fermentacji wynosi 50-70% w stosunku do użytego cukru. Suchy cytrynian zawiera 62 68% kwasu cytrynowego. Materiał odpadowy jakim jest grzybnia pleśni (ok. 10 kg/1 m 2 tac) może byd wykorzystana jako źródło białka (ok. 20%). Źródłem zanieczyszczeo mikrobiologicznych w powierzchniowej metodzie otrzymywania kwasu cytrynowego jest przede wszystkim melasa buraczana. W surowcu tym występują głównie bakterie z rodzaju Bacillus, Pseudomonas, a także Escherichia coli i Enterobacter aerogenes. Źródłem tych ostatnich bakterii oprócz melasy może byd także woda stosowana w procesie technologicznym, jeśli nie spełnia wymagao określonych norma. Wszystkie drobnoustroje występujące jako zanieczyszczenia są zdolne do redukcji azotanów (V) do azotanów (III), które działają hamująco na rozwój grzybni. Badania wykazały, ze w podłożu melasowym, po niewłaściwie przeprowadzonej sterylizacji, mogą pozostad żywe bakterie z rodzaju Lactobacillus i Leuconostoc, wywierające antagonistyczny wpływ na rozwój grzybni Aspergillus niger. Spośród pleśni najczęstszym zanieczyszczeniem jest Penicillium purpurogenum i Penicillium rubrum. W procesie technologicznym konidia tych pleśni dostają sie z powietrzem stosowanym do przewietrzania komór, a także wraz ze szczepionka konidiów Aspergillus niger podczas jej rozpylania na powierzchnie pożywki. Pleśnie te są bogate w enzymy hydrolityczne, dzięki którym rozwijają się na grzybni Aspergillus niger, powodując jej lizę. Aby uniknąd skutków zanieczyszczeo mikrobiologicznych, należy stosowad aktywna szczepionkę grzybni Asperillus niger, szybko opanowująca środowisko i obniżającą wartośd ph do poziomu hamującego rozwój mikroflory bakteryjnej. Podobnie jak w każdym procesie biotechnologicznym musi byd zapewniona wysoka czystośd aparatury i komór fermentacyjnych oraz powietrza do ich przewietrzania, ponieważ w przeciwnym razie te środowiska stad sie mogą źródłem zanieczyszczenia różna mikroflora, zakłócająca proces produkcji kwasu cytrynowego. Metoda wgłębna W chwili obecnej główny sposób produkcji kwasu cytrynowego. Dośd duże trudności napotkało przestawienie używanych szczepów z rozwoju na powierzchni na rozwój wewnątrz cieczy z zachowaniem wydajności wytwarzania kwasu cytrynowego. Obecnie nadal trwają badania nad dopracowaniem optymalnego składu pożywki i warunków fermentacji. Standardowo fermentacja przebiega w kadziach zaopatrzonych w mieszadła i systemy napowietrzające, w temp ºC w ciągu 10 dni. Wydajnośd tej metody liczona na kwas w stosunku do użytego cukru przekracza 90%. Metoda na pożywkach stałych Najpowszechniej rozwinięta w Japonii, gdzie 20% ilości produkowanego kwasu cytrynowego pochodzi z hodowli na podłożu stałym. Surowcem w tej metodzie mogą byd otręby, wytłoki z trzciny cukrowej, wadliwa melasa buraczana lub trzcinowa i inne odpadowe surowce roślinne. Technologia ta budzi też duże nadzieje ze względu na znacznie niższe obciążenie produkcji ściekami oraz wyższą tolerancję A. niger na obecnośd jonów metali i mikroelementów. Wydzielanie kwasu cytrynowego z podłoża hodowlanego Wydzielanie kwasu cytrynowego odbywa sie tzw. metodą cytrynianową. Polega ona na wytracaniu na gorąco cytrynianu wapnia, traktując roztwór pofermentacyjny wodorotlenkiem wapnia. Wytworzony osad cytrynianu wapnia [Ca 3 (C 6 H 5 O 7 ) 2 ] po oddzieleniu od masy reakcyjnej zadaje się roztworem H 2 SO 4, w celu otrzymania kwasu cytrynowego w postaci wolnej. Wytracony gips oddziela sie przez filtracje, roztwór zaś zagęszcza i wydziela czysty produkt przez krystalizacje. Handlowy kwas cytrynowy wyodrębniony ta metoda jest związany z jedna cząsteczka wody (C 6 H 5 O 7 xh 2 O). Metoda cytrynianowa jest bardzo uciążliwa dla przemysłowej produkcji kwasu cytrynowego, z uwagi na duże zużycie kwasu siarkowego, wodorotlenku wapnia, a także wytwarzanie w tym procesie nadmiernych ilości gipsu. W Instytucie Technologii Przemysłu Chemicznego i Spożywczego Akademii Ekonomicznej we Wrocławiu została opracowana metoda wydzielania i oczyszczania kwasu cytrynowego tzw. metoda bezcytrynianowa. Może byd ona wykorzystana tylko w tych przypadkach, w których do biosyntezy kwasu cytrynowego stosowane są substraty o wysokiej czystości, tj.: glukoza, skrobia, maczki cukrowe, a wiec głównie we wgłębnej hodowli Aspergillus niger. Metoda bezcytrynianowa polega na: - dezaktywacji grzybni w temp. 70 C i oddzieleniu od roztworu hodowlanego, - oczyszczeniu filtratu garbnikami i ziemia okrzemkowa, - odbarwieniu na kolumnie węglowej, - zatężeniu w wyparce próżniowej do 72% zawartości kwasu cytrynowego, - krystalizacji kwasu cytrynowego w temp. 7 C.

3 Wydajnośd krystalizacji kwasu cytrynowego wynosi około 50%. Odciek miedzykrystaliczny po odbarwieniu węglem aktywnym oczyszcza sie na jonitach (kationit i anionit). Proces oczyszczania jest tak prowadzony, aby oczyszczony odciek odpowiadał wymaganiom stawianym przez normę na spożywczy kwas cytrynowy w płynie. Poważnym problemem ekologicznym jest gips wytwarzany w procesie oczyszczania kwasu cytrynowego. Zagospodarowanie gipsu jako materiału budowlanego jest możliwe dopiero po odpowiednim oczyszczeniu. Roztwór hodowlany po oddzieleniu grzybni zawiera obok głównego metabolitu, jakim jest kwas cytrynowy, wiele cennych enzymów, głównie enzymy pektynolityczne, proteolityczne, a także glukanazy, co stwarza możliwośd ich przemyslowego pozyskiwania. Ponadto źródłem wielu enzymów (proteinazy, amylazy, pektynazy, oksydaza glukozowa), które mogą byd wydzielane dla celów handlowych, jest grzybnia Aspergillus niger. Wytwarzana w dużych ilościach w procesach biosyntezy kwasu cytrynowego może byd także wykorzystana na cele paszowe, ponieważ zawiera ponad 40% białka w suchej masie, z czego polowa to białko dobrze przyswajalne. Ponadto zawiera liczne mikroelementy. Szczepy Aspergillus niger stosowane do produkcji kwasu cytrynowego Szczepy A. niger stosowane w przemysłowej produkcji kwasu cytrynowego otrzymane zostały w wyniku mutagenizacji oraz skriningowych selekcji szczepów naturalnych. Jako mutageny stosowane są czynniki fizyczne (promieniowanie UV o dł. λ=260 nm), chemiczne lub kombinacje obu. Wykorzystuje się także techniki rekombinacji genetycznej. Selekcja szczepów o cennych właściwościach technologicznych prowadzona jest pod kątem dalszego zastosowania w ściśle określonych warunkach produkcyjnych. Uzyskane mutanty należy zabezpieczyd przed degradacją cech materiału biologicznego, np. poprzez liofilizację, przechowywanie konidiów z jałowym piaskiem, węglem aktywnym lub cytrynianem wapnia. Jednak mimo takich metod zabezpieczenia często dotychczasowy metabolizm ukierunkowany na syntezę kwasu cytrynowego zmienia się na oksydacyjny, w wyniku czego powstaje biomasa. Stąd konieczna jest ciągła selekcja odmian o pożądanych cechach. Biochemiczne uwarunkowania nadprodukcji kwasu cytrynowego u Aspergillus niger Nadprodukcja kwasu cytrynowego u niektórych odmian Aspergillus niger jest wynikiem zakłócenia cyklu Krebsa na skutek braku lub niskiej aktywności enzymów odpowiedzialnych za jego dalszą konwersję. Efekt ten jest warunkowany genetycznie, ale poprzez odpowiednie warunki hodowli można zintensyfikowad aktywnośd produkcyjną szczepów, zapewniając wysoką wydajnośd kwasu cytrynowego. Kwas cytrynowy jest jednym z etapów cyklu Krebsa, którego głównym zadaniem jest utlenianie związków organicznych, a nie wydzielanie ich do podłoża. Fermentacja cytrynowa, polega na gromadzeniu się znacznych ilości kwasu cytrynowego wskutek zablokowania enzymu biorącego udział w tlenowym rozkładzie cukrów. Jeśli weźmiemy pod uwagę, że niektóre metale (cynk, mangan, żelazo) są aktywatorami pewnych enzymów, to ich brak w pożywce powoduje blokowanie i powstają warunki, w których wytworzony kwas cytrynowy nie może byd zmetabolizowany i jest gromadzony w podłożu. Jest to korzystne z punktu widzenia mikrobiologii technicznej i znalazło praktyczne wykorzystanie w przemyśle. Produkcja kwasu cytrynowego jest w wysokim stopniu uzależniona od składu pożywki. Korzystne warunki procesu: - wysokie stężenie cukru (ok. 10% w hodowli wgłębnej i 16% w powierzchniowej) - niedobór jonów metali: Mn +2, Zn +2, Fe +2 (< 0,1 mg/ 100 cm3) - ograniczona ilośd związków azotu i fosforu (limitacja wzrostu grzybni) - niska wartośd ph (ok. 2,4-2,6) - dobre natlenienie środowiska (dot. procesu wgłębnego na pożywkach syntetycznych). Rys. 1. Szlaki metaboliczne przemiany glukozy do kwasu cytrynowego u Aspergillus niger: l synteza cytrynianowa, 2,3- hydrataza akonitanowa, 4 - dehydrogenaza izocytrynianowa, 5 - dehydrogenaza 2-ketoglutaranowa, 6 - liaza izocytrynianowa; pogrubione linie oznaczają miejsca osłabionej aktywności enzymatycznej. Kwas cytrynowy powstaje w początkowych przemianach cyklu Krebsa, w wyniku kondensacji acetylo-coa i szczawiooctanu, katalizowanej przez syntaze cytrynianowa (rys. 1). W procesie rozwoju grzybni (trofofaza), a następnie produkcji kwasu cytrynowego (idiofaza) heksozy asymilowane są w dwóch szlakach metabolicznych EMP (glikoliza) i pentozo fosforanowym (HMP). Ten ostatni szlak uaktywnia sie w fazie intensywnego rozwoju grzybni, po czym ustępuje glikolizie w fazie produkcji kwasu cytrynowego. Zatem głównym regulatorem szybkości glikolizy jest fosfofruktokinaza, która staje sie jednocześnie regulatorem biosyntezy kwasu cytrynowego. Enzym ten jest wrażliwy na obecnośd cytrynianu w środowisku, ale u szczepów Aspergillus niger w procesie produkcji kwasu cytrynowego represja ta jest znoszona nadmiarem jonów NH 4 + w komórkach, w

4 wyniku zakłóconych przemian białkowych spowodowanych niedoborem w podłożu jonów Mn 2+. Mechanizmem regulującym biosyntezę kwasu cytrynowego jest także ograniczenie syntezy ATP, który jest inhibitorem fosfofruktokinazy. Dowodzi to istnienia w grzybni alternatywnej tlenowej drogi oddechowej, jałowej energetycznie, a wiec nie blokującej glikolizy. Ten typ oddychania tlenowego, często występujący u roślin, nie został jeszcze dokładnie zbadany u szczepów Aspergillus niger. Wykazano natomiast jego istnienie w grzybni Neurospora crasa oraz u drożdży z rodzajów Candida i Rhodotorula, najczęściej podczas przejścia z fazy logarytmicznego wzrostu do fazy stacjonarnej. Alternatywna droga oddechowa ujawnia sie w momencie osłabienia oddychania z udziałem oksydazy cytochromowej, wtedy indukowana jest synteza oksydazy alternatywnej, układu enzymatycznego katalizującego przenoszenie elektronów na tlen. Indukcje tej oksydazy w komórkach grzybni może wywoład: - nagromadzenie sie NADH, - zmniejszenie zapotrzebowania na ATP, - niedobór ADP w mitochondriach, - niedobór jonów Cu+2 niezbędnych do funkcjonowania oksydazy cytochromowej. Wymienione czynniki sprawiają, ze cytoplazmatyczny koenzym NADH powstający w procesie glikolizy jest utleniany z udziałem oksydazy alternatywnej szlakiem, w którym energia nie wydziela sie w postaci ATP, lecz energii cieplnej. Mechanizm ten uruchamia sie przy rozkojarzeniu fosforylacji oksydatywnej. Oksydaza alternatywnego oddychania cechuje sie, w odróżnieniu od oksydazy cytochromowej, niskim powinowactwem do tlenu. Oznacza to, ze działalnośd tego enzymu wymaga znacznie wyższego stężenia tlenu w środowisku niż droga cytochromowa. Badania wykazały, ze dopiero stężenie tlenu powyżej 21% powoduje wzrost aktywności oddychania alternatywnego. We wgłębnym procesie otrzymywania kwasu cytrynowego, w fazie produkcji przy intensywnym napowietrzaniu, może byd wiec wzbudzana ta droga oddechowa. Zakłócenie procesu wynikające z braku dopływu tlenu może spowodowad utratę tej aktywności i przywrócenie oddychania z udziałem oksydazy cytochromowej. Efektem tych zmian jest zahamowanie syntezy kwasu cytrynowego na korzyśd produkcji biomasy. Takie zjawisko obserwuje sie podczas awarii systemu natleniania w przemysłowej produkcji kwasu cytrynowego metodą wgłębną. Do poznanych innych mechanizmów regulujących syntezę kwasu cytrynowego należy osłabienie przemian enzymatycznych w cyklu Krebsa na etapach: - hydratazy akonitanowej (hamowanej deficytem jonów Mn 2+ i Fe 2+ ), - mitochondrialnej dehydrogenazy izocytrynianowej (hamowanej cytrynianem), - dehydrogenazy 2-ketoglutaranowej (hamowanej wysokim stężeniem cukru i jonami NH 4 + ). Biosynteza kwasu cytrynowego u Aspergillus niger związana jest także z cyklem kwasów dikarboksylowych - glioksalowym (rys. 1). Cykl ten przez reakcje anaplerotyczne (uzupełniające) dostarcza kwasu szczawiowego, który jest prekursorem kwasu cytrynowego. Wykonanie dwiczenia (cz. 1) 1. Przygotowanie podłoża 1.1. Podłoże inokulacyjne W kolbie o pojemności cm 3 przygotowad 50 cm 3 podłoża inokulacyjnego zawierającego: - glicerol - 50,0 g - glukoza - 50,0 g - ekstrakt drożdżowy 3,0 g - ekstrakt słodowy 3,0 g - bactopepton - 5,0 g - woda 1000 cm 3 Składniki przeliczyd tak aby otrzymad wymaganą ilośd podłoża inokulacyjnego. Doprowadzid ph do wartości 5,5. Podłoże przygotowad do sterylizacji w autoklawie Podłoże produkcyjne W kolbie cm 3 przygotowad 100 cm 3 podłoża produkcyjnego o składzie: - glicerol 100,0 g - NH 4 Cl 3,0 g - MgSO 4 7H 2 O 1,0 g - KH 2 PO 4 0,2 g - ekstrakt drożdżowy 1,0 g - woda 1000 cm 3 Składniki przeliczyd tak aby otrzymad wymaganą ilośd podłoża produkcyjnego. Doprowadzid ph do wartości 5,5. Podłoże przygotowad do sterylizacji w autoklawie. 2. Posiew Candida lipolytica Wyjałowione podłoże inokulacyjne zaszczepid hodowlą drożdży C. lipolytica. Hodowle prowadzid na wytrząsarce rotacyjnej, w warunkach tlenowych w temperaturze 30 0 C.

5 Wyjałowione podłoże produkcyjne zaszczepid 5 ml zawiesiny komórek drożdży namnożonych w hodowli inokulacyjnej. Hodowle prowadzid na wytrząsarce rotacyjnej, w warunkach tlenowych w temperaturze 30 0 C. Wykonanie dwiczenia (cz. 2) 3. Oznaczanie kwasowości ogólnej Kwasowośd ogólna jest to suma wszystkich kwasów organicznych, jakie tworzą się podczas fermentacji cytrynowej, wśród których najwięcej powstaje kwasu cytrynowego (ponad 90%), reszta to głównie kwas szczawiowy i glukonowy. Wykonanie: Pobrad 20ml płynu pohodowlanego z hodowli produkcyjnej i przefiltrowad w zestawie do filtracji próżniowej używając sączków celulozowych o rozmiarach porów 0,45 µm. Następnie 2ml filtratu przenieśd do kolby stożkowej o pojemności 50 cm 3. Dodad 20ml wody destylowanej i miareczkowad 0,1 N NaOH wobec fenoloftaleiny (3-4 krople) do pierwszego trwałego różowego zabarwienia. Wynik podad w cm 3 0,1 N NaOH/100 cm 3 pożywki. Aktywna kultura powinna wykazywad kwasowośd ogólną odpowiadającą cm 3 0,1 N NaOH na 2ml roztworu (wymagania normatywne mieszczą się w granicach cm 3 0,1 N NaOH na 2 cm 3 roztworu). Wyliczyd ilośd wytworzonego kwasu cytrynowego wiedząc, że 1 cm 3 0,1 N NaOH odpowiada 7 mg kwasu cytrynowego jednowodnego lub 6,4 mg bezwodnego. 4. Kolorymetryczna metoda oznaczania kwasu cytrynowego (metoda Furtha-Herrmanna) Metoda kolorymetrycznego oznaczania kwasu cytrynowego polega na specyficznej i bardzo czułej reakcji zachodzącej pomiędzy stosowanymi odczynnikami: bezwodnikiem kwasu octowego, pirydyną i kwasem cytrynowym. W wyniku reakcji w badanym roztworze powstaje barwny kompleks, którego zabarwienie, zmieniające się od żółtego do brązowego zależy od stężenia kwasu cytrynowego. Dokładnośd metody wynosi ok. 3,5% i zależy od szybkości dodawania ściśle określonych objętości odczynników oraz temperatury, która podczas oznaczania powinna byd utrzymywana na stałym poziomie 32ºC przez 30 minut. Stężenie kwasu cytrynowego w 1 cm 3 powinno zawierad się w granicach 0,1 0,5 mg Sporządzanie roztworów wzorcowych do wykreślenia krzywej wzorcowej - Roztwór barwny (A) do cylindra miarowego o objętości 100 cm 3 wprowadzid 10ml podłoża produkcyjnego (wyjałowionego, nie zawierającego komórek drożdży) i uzupełnid wodą destylowaną do 100 cm 3 (1 cm 3 roztworu zawiera 0,1 cm 3 wyjściowego roztworu pożywki syntetycznej). - Roztwór (B) W kolbie miarowej o objętości 500 cm 3 rozpuścid 2,5 g kwasu cytrynowego w 500ml wody destylowanej (1 cm 3 roztworu zawiera 5 mg kwasu cytrynowego). Do zestawu kolbek miarowych (6x50 cm 3 ) dodad 2ml roztworu barwnego (A) oraz odpowiednią ilośd roztworu B (tabela 1). Dopełnid do kreski wodą destylowaną. TABELA 1. Roztwory wzorcowe kwasu cytrynowego Lp. 50 cm 3 roztworu wzorcowego zawiera Uwagi Roztwór A *cm 3 ] Roztwór B *cm 3 ] Woda dest. [cm 3 ] 1 2 0,0 48,0 Próba ślepa = 0 mg kwasu cytr ,0 47,0 1 cm 3 = 0,10 mg kw. cytr ,0 46,0 1 cm 3 = 0,20 mg kw. cytr ,0 45,0 1 cm 3 = 0,30 mg kw. cytr ,0 44,0 1 cm 3 = 0,40 mg kw. cytr ,0 43,0 1 cm 3 = 0,50 mg kw. cytr. 5. Wykonanie oznaczeo do krzywej wzorcowej Do 6 probówek szklanych przenieśd po 1ml kolejnych roztworów wzorcowych, dodad najpierw 1,3ml pirydyny, a następnie 5,7ml bezwodnika kwasu octowego, szybko wymieszad (vortex) i wstawid na 30 min. do wody o temp C. Pomiar absorbancji wykonad w ciągu 30 minut od wyjęcia próbek z łaźni, przy długości fali 420 nm. Średnie wyniki z trzech powtórzeo pomiarów absorbancji dla każdego ze stężeo kwasu cytrynowego użyd do wykreślenia krzywej wzorcowej. 6. Oznaczenie kwasu cytrynowego w płynie pohodowlanym Pobrad 2 ml przefiltrowanego płynu pohodowlanego z hodowli produkcyjnej do kolby miarowej o pojemności 500 cm 3 i uzupełnid wodą destylowaną do kreski. Całośd wymieszad. Przenieśd 1 ml roztworu do szklanej probówki i dalej postępowad jak w punkcie powyżej. Stężenie kwasu cytrynowego w hodowli odczytad z wykresu krzywej wzorcowej. 7. Pomiar absorbancji - przed rozpoczęciem pomiaru należy otworzyd pokrywę spektrofotometru urządzenie nagrzewa się 15 minut!!!

6 - po 15 minutach za pomocą pipety automatycznej wypełniamy szklaną kuwetę w 2/3 objętości roztworem wzorcowym próba ślepa (0g kw. cytrynowego) - trzymając kuwetę staramy się nie dotykad przeźroczystych ścianek naczynia!!! - w celu dokonania pomiaru naciskamy przycisk A, wpisujemy długośd fali (420 nm), potwierdzamy naciskając A i umieszczamy kuwetę w urządzeniu, po chwili odczytujemy wynik absorbancji dla próby kontrolnej - pomiar powtarzamy 3 razy, za każdym razem wyciągając i ponownie wkładając kuwetę (urządzenie reaguje na nacisk wywołany ciężarem kuwety) nie naciskamy żadnych przycisków!!! - wynik koocowy podajemy jako średnią trzech pomiarów - analogiczne pomiary wykonujemy dla kolejnych stężeo kw. cytrynowego, po każdym pomiarze dokładnie płuczemy kuwetę wodą destylowana i delikatnie suszymy w bibule - podobnie wykonujemy oznaczenie kw. cytrynowego w płynie pohodowlanym - po pomiarach kuwety dokładnie płuczemy wodą destylowaną i pozostawiamy do wysuszenia na bibule - urządzenie wyłączamy zamykając pokrywę spektrofotometru 8. Opracowanie wyników Wyniki pomiarów przestawid w formie sprawozdania (opis makroskopowy grzybni, zawartośd kw. cytrynowego, kwasowośd ogólna). Wyciągnąd wnioski z uzyskanych wyników. 9. Zagadnienia teoretyczne: - metody otrzymywania kwasu cytrynowego i jego wydzielanie z podłoża hodowlanego - mikroorganizmy produkujące kwas cytrynowy - uwarunkowania produkcji kwasu cytrynowego u Aspergillus niger - przykłady zastosowania kwasu cytrynowego 11. Literatura - Kowal K., Libudzisz Z.; Mikrobiologia techniczna; Wyd. Politechniki Łódzkiej; Kunicki-Goldfinger W.; Życie bakterii; Wyd. PWN; Warszawa; Schlegel H.; Mikrobiologia ogólna; Wyd. PWN; Warszawa; 2000