PL B1. Modyfikowany nanokrystaliczny hydroksyapatyt oraz sposób otrzymywania modyfikowanego nanokrystalicznego hydroksyapatytu

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (51) Int.Cl. A61F 2/02 ( ) A61K 33/04 ( ) A61L 31/02 ( ) C01B 25/32 ( ) (54) Modyfikowany nanokrystaliczny hydroksyapatyt oraz sposób otrzymywania modyfikowanego nanokrystalicznego hydroksyapatytu (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 19/13 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 06/16 (73) Uprawniony z patentu: WARSZAWSKI UNIWERSYTET MEDYCZNY, Warszawa, PL (72) Twórca(y) wynalazku: JOANNA KOLMAS, Warszawa, PL MARCIN SOBCZAK, Radom, PL WACŁAW L. KOŁODZIEJSKI, Warszawa, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Joanna Bocheńska

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest modyfikowany nanokrystaliczny hydroksyapatyt oraz sposób otrzymywania modyfikowanego nanokrystalicznego hydroksyapatytu mogącego znaleźć zastosowanie do wytwarzania syntetycznych biomateriałów, szczególnie materiałów kościozastępczych. Hydroksyapatyt to krystaliczny ortofosforan(v) wapnia o wzorze ogólnym Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2. W inżynierii biomateriałowej od wielu lat stosowany jest do wytwarzania implantów ceramicznych oraz materiałów wypełniających ubytki kostne (materiałów kościozastępczych). Charakteryzuje się wysoką bioaktywnością, biozgodnością a także osteokonduktywnością. Podstawowym składnikiem frakcji mineralnej tkanki kostnej a także tkanek zmineralizowanych zęba jest tzw. apatyt biologiczny. Intensywnie prowadzone badania wykazały, że jest to nanokrystaliczny hydroksyapatyt węglanowy zawierający szereg dodatkowych jonów, zarówno w swej strukturze, jak i na powierzchni kryształów. W tworzeniu syntetycznych biomateriałów dąży się więc do jak największego ich podobieństwa do apatytu biologicznego. W ostatnich latach ogromne zainteresowanie budzi także łatwość przeprowadzania w ap a- tytach różnych podstawień jonowych, a więc wprowadzania w ich strukturę różnorodnych jonów. Zadaniem tych jonów może być poprawa właściwości biologicznych, fizykochemicznych czy mechanicznych apatytu. Selen jest jednym z najważniejszych mikroelementów i należy do niezbędnych składników diety człowieka. Jeszcze do niedawna uważany był jedynie za czynnik wysoce toksyczny i szkodliwy dla ludzkiego organizmu. Jednak wykazano, że zajmuje on istotne miejsce w przebiegu różnorodnych procesów metabolicznych, jest składnikiem selenoprotein oraz peroksydazy glutationowej, enzymu chroniącego błony komórkowe przed szkodliwymi czynnikami. Wiele prowadzonych badań wskazuje, że niedobór selenu może powodować zahamowanie wzrostu kości u szczurów, a także znaczne ich osłabienie. Może mieć on wpływ na zapobieganie powstawania nowotworów, jak również na hamowanie ich rozwoju. Udowodniono także jego korzystny wpływ na odpowiedź zapalną osteoblastów w przerzutach nowotworowych niektórych typów do kości. Zawartość selenu w diecie w decydującym stopniu zależy od zasobności gleby w ten pierwiastek. Niestety znaczna część gleb jest uboga w selen. Nadmierne sztuczne nawożenie gleby oraz kwaśne deszcze w znacznym stopniu redukują pochłanianie selenu przez rośliny i zwierzęta. Ujemny wpływ na przyswajalność tego pierwiastka ma też zniszczenie pożywienia metalami ciężkimi. Dieta bogata w antyoksydanty w tym witamin E, A, C poprawia wchłanialność oraz wykorzystanie selenu w ustroju. Niedobór selenu w diecie może zaburzać funkcje obronne organizmu i objawiać się zwiększoną podatnością na infekcje, cięższym ich przebiegiem oraz wydłużeniem okresu zdrowienia. Zbyt mała ilość selenu jest odpowiedzialna za nasilenie procesów zwyrodnieniowych, reumatycznych, zapalnych, zwiększone ryzyko miażdżycy i chorób nowotworowych. Niedobór selenu sprzyja powstawaniu: depresji, miopatii, dystrofii i zwapnienia mięśni, zaburzeniom skurczu mięśnia sercowego, zwyrodnieniom naczyń krwionośnych, choroby Keshana, impotencji oraz ogólnemu spadkowi witalności. Obniżony poziom selenu stwierdzono w przebiegu chorób nowotworowych, łuszczycy, choroby wieńcowej, zawału serca, reumatoidalnego zapalenia stawów oraz prostaty. Selen zalecany jest do terapii wszystkich rodzajów trądziku, a także w chorobach grzybiczych (drożdżaki, Candida). Zalecana dzienna minimalna dawka profilaktyczna selenu wynosi: 50 g dla kobiet; 65 g dla kobiet w ciąży; 75 g dla kobiet karmiących; 70 g dla mężczyzn; Leczniczo w chorobie nowotworowej i w chemioterapii stosuje się najczęściej u dorosłych dawki g dziennie na około 60 kg masy ciała. U dzieci odpowiednio mniejsze przeliczeniowo około 90 g na 10 kg masy ciała. Węglowodany w znaczący sposób zmniejszają przyswajalność selenu. Z kolei nadmierne dawki selenu mogą po pewnym czasie stosowania wywołać zatrucie. Selen jest jednym z mikroelementów o najwęższym zakresie pomiędzy niedoborem w diecie a poziomem toksycznym dla ludzkiego organizmu. W związku z tym bardzo trudna jest jego suplementacja drogą doustną. Ponadto obliczenie ilości selenu, którą należy przyjmować jest trudne ze względu na nawyki żywieniowe pacjentów, a co za tym idzie podawanie selenu drogą doustną obciążone jest dużym ryzykiem braku efektu lub przedawkowania.

3 PL B1 3 Opracowano wiele metod otrzymywania proszku hydroksyapatytowego. Są to między innymi metody mokre, suche, topnikowe, mechanochemiczne, hydrotermalne czy zol-żel. Znane są także sposoby pozyskiwania takiego materiału ze źródeł pochodzenia naturalnego, np. tkanek kostnych zwierzęcych (przede wszystkim wołowej i wieprzowej), koralu czy kości niektórych gatunków ryb. Należy podkreślić, że wśród wyżej wymienionych sposobów otrzymywania apatytów najczęściej wykorzystywane są metody mokre, a więc oparte na reakcjach w roztworach wodnych. Celem wynalazku jest zwiększenie bezpieczeństwa oraz skuteczności terapii selenem, zwłaszcza dla osób wymagających implantów kościozastępczych w chorobach nowotworowych kości. Istotą wynalazku jest modyfikowany nanokrystaliczny hydroksyapatyt domieszkowany jonami selenianowymi o wzorze ogólnym 1: hydroksyapatycie a n oznacza odpowiednio 3 lub 4. Podanie tak modyfikowanego nanokrystalicznego apatytu w materiale kościozastępczym, czy materiale implantacyjnym zwiększy jego korzystne właściwości. Oprócz standardowej funkcji rus z- towania (hydroksyapatyt) dla nowotworzonej tkanki kostnej, powolne miejscowe uwalnianie selenu zapewni dodatkowe działanie hamujące rozwój nowotworu i zwiększy bezpieczeństwo oraz sk u- teczność terapii. Selen wprowadzony w postaci apatytu domieszkowanego będzie korzystnie działał na peroksydazę glutationową w komórkach (działanie antyoksydacyjne) przede wszystkim w miejscu zastosowania. Sposób otrzymywania nanokrystalicznego hydroksyapatytu domieszkowanego selenem polega na metodzie mokrej. Do wodnego roztworu soli wapnia, korzystnie azotanu(v) lub chlorku wapnia, wkrapla się powoli mieszaninę roztworów wodnych: soli ortofosforanu(v), korzystnie wodoroortofosforanu(v) amonu oraz soli selenianu(iv), korzystnie selenianu sodu lub soli selenianu (VI), korzystnie selenianiu sodu, amonu lub potasu. Ilości odczynników są dobrane stechiometrycznie, zgodnie ze wzorem ogólnym 1: hydroksyapatycie a n oznacza odpowiednio 3 lub 4. Stosuje się roztwory wodne o stężeniach 0,1 0,3 mol/dm 3. Roztwory po sporządzeniu doprowadza się do odczynu ph 8 9, korzystnie za pomocą roztworu amoniaku. Wkraplanie prowadzi się przy ciągłym intensywnym mieszaniu i utrzymywaniu ph roztworu. Reakcję prowadzi się w temperaturze od pokojowej do 70 C. Po zakończeniu wkraplania uzyskaną zawiesinę intensywnie miesza się jeszcze przez 4 8h, a następnie pozostawia bez mieszania w temperaturze pokojowej przez 24 48h. Uzyskany osad oddziela się od roztworu, korzystnie odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem, wielokrotnie przepłukując osad wodą destylowaną w celu odmycia nadmiaru amoniaku, aż do momentu uzyskania obojętnego odczynu przesączu. Następnie otrzymany osad suszy się, korzystnie w temperaturze 70 C przez h. Uzyskany materiał rozdrabnia się. Tak otrzymany materiał może być poddany kalcynacji w temperaturze C. W badaniach fizykochemicznych (m. in. dyfraktometria proszkowa XRD, spektroskopia w średniej podczerwieni, czy mikroskopia elektronowa) potwierdzono otrzymanie nanokrystalicznego hydroksyapatytu domieszkowanego jonami selenianowymi(iv) lub (VI). P r z y k ł a d 1 Otrzymywanie nanokrystalicznego hydroksyapatytu domieszkowanego jonami selenianowymi(iv) o zawartości selenu około 3%. 7,08 g Ca(NO 3 ) 2 4H 2 O umieszcza się w kolbie okrągłodennej i rozpuszcza się w ok. 150 ml wody destylowanej. Roztwór doprowadza się do odczynu alkalicznego (ph 9) za pomocą roztworu amoniaku (o stężeniu 3 mol/dm 3 ). Kolbę z roztworem umieszcza się na mieszadle magnetycznym z funkcją grzania. Roztwór podgrzewa się do ok. 60 C intensywnie mieszając 2,31 g (NH 4 ) 2 HPO 4 rozpuszcza się w zlewce w ok. 60 ml wody destylowanej. Do roztworu dodaje się 0,33 g Na 2 SeO 3 5H 2 O i intensywnie miesza do rozpuszczenia. Otrzymany roztwór doprowadza się do ph 9 roztworem amoniaku (o stężeniu 3 mol/dm 3 ), a następnie umieszcza się go w biurecie. Roztwór w biurecie wkrapla się powoli do kolby z roztworem soli wapnia stale kontrolując i utrzymując ph powyżej 8. Podczas operacji wkraplania zawiesinę w kolbie intensywnie miesza się. Po zakończeniu operacji wkraplania

4 4 PL B1 utrzymuje się zadaną temperaturę (ok. 60 C) oraz mieszanie jeszcze przez 4 h. Następnie wyłącza się ogrzewanie oraz mieszadło i otrzymaną zawiesinę pozostawia w temperaturze pokojowej przez 48 h. Po tym czasie przesącza się pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymany osad przy użyciu zestawu ze spieku szklanego oraz membrany filtracyjnej o wielkości porów do 45 m. Podczas sączenia osad płucze się intensywnie wodą destylowaną w celu usunięcia nadmiaru amoniaku (aż do uzyskania obojętnego odczynu przesączu). Następnie sączek z osadem przenosi się na szkiełko zegarkowe i suszy się w suszarce w ok. 70 C przez 12 h. Uzyskany osad przenosi się do moździerza agatowego i delikatnie rozdrabnia. Poniżej zamieszczony jest dyfraktogram proszkowy uzyskanego osadu oraz widmo w średniej podczerwieni. Na dyfraktogramie widoczne są szerokie refleksy odpowiadające słabo krystalicznemu hydroksyapatytowi. Parametry komórki elementarnej (a = 9,445; c = 6,869) wskazują na wbudowanie się jonu selenianowego(iv) w strukturę hydroksyapatytu. Dla porównania, parametry komórki elementarnej hydroksyapatytu nie zawierającego selenu, a otrzymanego w tych samych warunkach wynoszą odpowiednio: a = 9,427 oraz c = 6,873. Na widmie FTIR widoczne są pasma charakterystyczne dla hydroksyapatytu (pasma drgań grup fosforanowych v 1 +v 3 w zakresie cm -1, v 4 w zakresie cm -1 oraz pasmo drgań strukturalnych grup OH przy 3570 cm -1 ). Przy 763 cm -1 oraz 832 cm -1 występują pasma drgań grup selenianowych(iv). Dla porównania, w Na 2 SeO 3 5H 2 O występują one odpowiednio przy 725 i 788 cm -1. Różnice w odpowiednich liczbach falowych wskazują na wprowadzenie anionów selenianowych(iv) do sieci krystalicznej apatytu. Zawartość selenu w otrzymanym hydroksyapatycie wyznaczona metodą atomowej spektroskopii absorpcyjnej (ASA) wynosi 2,76% masowych. Rysunek 2. Widmo w średniej podczerwieni (technika transmisyjna, z tabletki w KBr) materiału otrzymanego w syntezie z przykładu 1.

5 PL B1 5 P r z y k ł a d 2 Otrzymywanie nanokrystalicznego hydroksyapatytu domieszkowanego jonami selenianowymi(vi) o zawartości selenu około 6%. 7,08 g Ca(NO 3 ) 2 4H 2 O umieszcza się w kolbie okrągłodennej i rozpuszcza się w ok. 150 ml wody destylowanej. Roztwór doprowadza się do odczynu alkalicznego (ph 9) za pomocą roztworu amoniaku (o stężeniu 3 mol/dm 3 ). Kolbę z roztworem umieszcza się na mieszadle magnetycznym z funkcją grzania. Roztwór podgrzewa się do ok. 50 C intensywnie mieszając. 2,24 g (NH 4 ) 2 HPO 4 rozpuszcza się w zlewce w ok. 60 ml wody destylowanej. Do roztworu dodaje się 0,49 g Na 2 SeO 4 i intensywnie miesza do rozpuszczenia. Otrzymany roztwór doprowadza się do ph 9 roztworem amoniaku (o stężeniu 3 mol/dm 3 ), a następnie umieszcza się go w biurecie. Roztwór w biurecie wkrapla się powoli do kolby z roztworem soli wapnia stale kontrolując i utrzymując ph powyżej 8. Podczas operacji wkraplania zawiesinę w kolbie intensywnie miesza się. Po zakończeniu operacji wkraplania utrzymuje się zadaną temperaturę (ok. 50 C) oraz mieszanie jeszcze przez 4 h. Następnie wyłącza się ogrzewanie oraz mieszadło i otrzymaną zawiesinę pozostawia się w temperaturze pokojowej przez 48 h. Po tym czasie przesącza się pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymany osad przy użyciu zestawu ze spieku szklanego oraz membrany filtracyjnej o wielkości porów do 45 m. Podczas sączenia osad płucze się intensywnie wodą destylowaną w celu usunięcia nadmiaru amoniaku (aż do uzyskania obojętnego odczynu przesączu). Następnie sączek z osadem przenosi się na szkiełko zegarkowe i suszy się w suszarce w ok. 70 C przez 12 h. Uzyskany osad przenosi się do moździerza agatowego i delikatnie rozdrabnia. Poniżej zamieszczony jest dyfraktogram proszkowy uzyskanego osadu oraz widmo w średniej podczerwieni. Na dyfraktogramie widoczne są szerokie refleksy odpowiadające słabo krystalicznemu hydroksyapatytowi. Parametry komórki elementarnej (a = 9,435; c = 6,870) wskazują na wbudowanie się jonu selenianowego(vi) w strukturę hydroksyapatytu. Dla porównania, parametry komórki elementarnej hydroksyapatytu nie zawierającego selenu, a otrzymanego w tych samych warunkach wynoszą odpowiednio: a = 9,427 oraz c = 6,873. Na widmie FTIR widoczne są pasma charakterystyczne dla hydroksyapatytu (pasma drgań grup fosforanowych v 1 +v 3 w zakresie cm -1, v4 w zakresie cm -1 oraz pasmo drgań strukturalnych grup OH przy 3570 cm -1 ). Przy 911 cm -1 występuje mało intensywne pasmo drgań grup selenianowych(vi). Dla porównania w Na 2 SeO 4 występuje ono przy 890 cm -1. Różnica w liczbach falowych wskazuje na wprowadzenie anionów selenianowych(vi) do sieci krystalicznej apatytu. Zawartość selenu w otrzymanym hydroksyapatycie wyznaczona metodą ASA wynosi 5,83% masowych.

6 6 PL B1 Zastrzeżenia patentowe 1. Modyfikowany nanokrystaliczny hydroksyapatyt domieszkowany jonami selenianowymi o wzorze ogólnym 1: hydroksyapatycie a n oznacza odpowiednio 3 lub Sposób otrzymywania modyfikowanego nanokrystalicznego hydroksyapatytu domieszkowanego jonami przy zastosowaniu metody mokrej, znamienny tym, że do wodnego roztworu soli wapnia wkrapla się stopniowo roztwór soli ortofosforanu(v) oraz selenianu(iv) lub (VI) w ilościach stechiometrycznych, zgodnie ze wzorem 1: hydroksyapatycie a n oznacza odpowiednio 3 lub 4, wkraplanie prowadzi się przy ciągłym intensywnym mieszaniu w temperaturze od pokojowej do 70 C, po czym po zakończeniu wkraplania, uzyskaną zawiesinę intensywnie miesza się jeszcze przez 4 8 h utrzymując temperaturę z operacji wkraplania, następnie pozostawia bez mieszania w temperaturze pokojowej przez h, a uzyskany osad odsącza się, po czym uzyskany produkt rozdrabnia się, przy czym roztwory wodne po sporządzeniu doprowadza się do odczynu ph 8 9 i odczyn zasadowy utrzymuje się również w czasie wkraplania. 3. Sposób według zastrz.2, znamienny tym, że uzyskany produkt poddaje się kalcynacji w temperaturze C. 4. Sposób według zastrz. 2 albo 3, znamienny tym, że otrzymany osad płucze się wielokrotnie wodą destylowaną do uzyskania obojętnego odczynu przesączu. Departament Wydawnictw UPRP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)