ANNALES ACADEMIAE MEDICAE GEDANENSIS TOM XLIII SUPLEMENT 3

Transkrypt

1 ANNALES ACADEMIAE MEDICAE GEDANENSIS TOM XLIII SUPLEMENT 3

2

3 GDASKI UNIWERSYTET MEDYCZNY Boena Dera-Tomaszewska Epidemiologia i chorobotwórczo pałeczek Salmonella Enteritidis oraz serowarów Salmonella izolowanych w Polsce po raz pierwszy Epidemiology and pathogenicity of Salmonella Enteritidis and Salmonella serovars first isolated in Poland Rozprawa habilitacyjna Zakład Mikrobiologii Lekarskiej Katedry Mikrobiologii Gdaskiego Uniwersytetu Medycznego Krajowy Orodek Salmonella Kierownik: dr hab. n. med. Lidia Piechowicz GDASK 2013

4 Wydano za zgod Senackiej Komisji Wydawnictw Gdaskiego Uniwersytetu Medycznego REDAKTOR NACZELNY EDITOR-IN-CHIEF Marek Grzybiak HONOROWY REDAKTOR NACZELNY HONORARY EDITOR-IN-CHIEF Stefan Raszeja KOMITET REDAKCYJNY EDITORIAL BOARD z-ca redaktora naczelnego Adam Szarszewski sekretarz redakcji Włodzimierz Kuta redaktor techniczny Tadeusz Skowyra Tomasz Bczek, Zdzisław Bereznowski, Dariusz Kozłowski, Anna Grygorowicz, Andrzej Hellmann, Jerzy Kuczkowski, Krzysztof Narkiewicz, Michał Obuchowski, Zbigniew Kmie, Julian wierczyski, Aleksandra urowska ADRES REDAKCJI ADDRESS OF EDITORIAL OFFICE Annales Academiae Medicae Gedanensis Zakład Anatomii Klinicznej Gdaskiego Uniwersytetu Medycznego ul. Dbinki 1, Gdask, Poland Artykuły opublikowane w Annales Academiae Medicae Gedanensis s zamieszczane w bazie EMBASE Articles published in Annales Academiae Medicae Gedanensis are covered by the Excerpta Medica database (EMBASE) PL ISSN Gdaski Uniwersytet Medyczny

5 Motto: Not all salmonella-types are equally pathogenic for man, although none of them can be considered as essentially harmless. F.N. Sickenga (Transmission of salmonellae and pathogenes of salmonellosis in man. W: The world problem of salmonellosis, Hague, E. Van Oye, Dr. W. Junk Publisher, 1964, str. 219) Z okazji 50-lecia Krajowego Orodka Salmonella ( ) z wyrazami szacunku i w dowód uznania, prac dedykuj wszystkim, którzy swoj karier naukow i ycie zawodowe zwizali z jego działalnoci.

6 Składam serdeczne podzikowania Pani prof. dr hab. med. Renacie Głonickiej, wieloletniemu Kierownikowi Krajowego Orodka Salmonella i opiekunowi naukowemu niniejszej rozprawy, za otwarto, yczliwo, stworzenie warunków do pracy, do stawiania hipotez i ich weryfikacji, za czas powicony na dyskusj merytoryczn w ramach wszystkich realizowanych prac,.p. Pani prof. dr hab. med. Annie Podhajskiej, która zaszczepiła we mnie zainteresowanie nauk i skierowała na drog pracy naukowej,.p. Pani dr hab. Janinie Lalko i.p. Pani prof. dr hab. med. Krystynie Pietkiewicz za ogromn yczliwo, motywowanie do pracy i rozwoju zainteresowa naukowych oraz moim Koleankom i Kolegom z Zakładu Mikrobiologii Lekarskiej, bez których współpracy i przyja ni praca ta nigdy by nie powstała, a take wszystkim pozostałym Osobom, które powicały mi swój cenny czas, dzieliły si swoimi dowiadczeniami, wspierały w trudnych chwilach i okazywały wyrozumiało. Szczególne podzikowania składam Pani prof. Annie Kdzi, Kierownikowi Katedry Mikrobiologii, za wnikliw ocen merytoryczn niniejszej pracy, za wielk yczliwo, wsparcie i wszelk pomoc niezbdn przy realizacji procesu habilitacyjnego.

7 SPIS TRECI Wykaz stosowanych skrótów Wstp Rodzaj Salmonella Ogólna charakterystyka bakterii Salmonella Wystpowanie pałeczek Salmonella Klasyfikacja i nazewnictwo bakterii Salmonella Struktura antygenowa bakterii Salmonella Antygeny somatyczne Antygeny otoczkowe Antygeny rzskowe Schemat White a-kauffmanna-le Minora Genetyczne podstawy zrónicowania bakterii Salmonella Ogólna charakterystyka genomu Salmonella Analiza porównawcza sekwencji genomów Salmonella Wyspy patogennoci bakterii Salmonella Pozachromosomalne elementy genetyczne bakterii Salmonella Plazmidy Bakteriofagi Patogeneza zakae Salmonella Ogólna charakterystyka mechanizmów zakae Salmonella Udział czynników wirulencji w patogenezie zakae Salmonella Etiologia i charakterystyka kliniczna zakae Salmonella Izolacja i identyfikacja bakterii Salmonella Typowanie serologiczne Typowanie bakteriofagowe Zapobieganie, zwalczanie i kontrola zakae spowodowanych bakteriami Salmonella Serowary Salmonella wystpujce w Polsce w latach Salmonella enterica subsp. enterica serowar Enteritidis Wystpowanie pałeczek Salmonella Enteritidis Typy bakteriofagowe Salmonella Enteritidis Białko szoku termicznego Hsp60 bakterii Salmonella Enteritidis Cele pracy Materiał i metody Typowanie biochemiczne i serologiczne Szczepy bakteryjne Hodowla szczepów Testy biochemiczne

8 Surowice diagnostyczne do identyfikacji serologicznej bakterii Salmonella Aglutynacja szkiełkowa Schemat typowania serologicznego szczepów Salmonella Typowanie bakteriofagowe Szczepy bakteryjne Podłoa do typowania bakteriofagowego Zestaw bakteriofagów typujcych Metoda typowania bakteriofagowego Dane epidemiologiczne o zakaeniach Salmonella w Polsce Analiza statystyczna epidemiologicznych wska ników zakae Salmonella u ludzi w Polsce w latach Okrelanie podobiestwa immunologicznego i molekularnego pomidzy białkiem Hsp60 bakterii S. Enteritidis i ludzkim białkiem Hsp Otrzymywanie endogennego białka Hsp60 Salmonella Enteritidis Szczep bakteryjny Hodowla bakterii Liza komórek bakteryjnych Precypitacja białek bakteryjnych Oczyszczanie białka z zastosowaniem złoa Sepharose 4B Elucja preparatywna białka Hsp60 S. Enteritidis Okrelanie czystoci, masy czsteczkowej i swoistoci białka Hsp60 S. Enteritidis Oznaczanie stenia białka Hsp60 S. Enteritidis Otrzymywanie surowic króliczych anty-hsp60 Salmonella Enteritidis Syntetyczne fragmenty ludzkiego białka Hsp Porównywanie reakcji serologicznych białka Hsp60 S. Enteritidis, ludzkiego białka Hsp60 i jego syntetycznych fragmentów metod ELISA Antygeny Test ELISA Zahamowanie reakcji immunoenzymatycznej w tecie ELISA Standaryzacja metody Wyniki Badania serologiczne i epidemiologiczne wyniki bada własnych i opracowa dokonanych na podstawie opublikowanych danych epidemiologicznych dotyczcych serowarów Salmonella wystpujcych u ludzi w Polsce

9 4.2.Analiza epidemiologicznych wska ników zakae Salmonella (ogółem i dla wybranych serowarów) u ludzi w Polsce w latach Rozkład współczynników zakae Salmonella w czasie Analiza statystyczna trendu współczynników zakae Salmonella Test chi-kwadrat dla trendu Trend liniowy Regresja Poissona Typowanie bakteriofagowe pałeczek S. Enteritidis wyniki bada własnych i opracowa dokonanych na podstawie opublikowanych danych epidemiologicznych dotyczcych typów bakteriofagowych wystpujcych w Polsce Okrelenie podobiestwa immunologicznego i prawdopodobnych rejonów podobiestwa molekularnego pomidzy białkiem Hsp60 bakterii S. Enteritidis i ludzkim białkiem Hsp Otrzymanie endogennego białka Hsp60 S. Enteritidis Porównanie reakcji serologicznych białka Hsp60 S. Enteritidis, ludzkiego białka Hsp60 i jego syntetycznych fragmentów w testach ELISA Dyskusja Wnioski Pimiennictwo Streszczenie Summary Aneks

10 10 WYKAZ STOSOWANYCH SKRÓTÓW AFLP ATTC AT BSA camp CDC cfu CIP CL CT DNA DSMZ DT EFSA ELISA EMM FAFLP FAO FRCI GIS GlcNAc GNU GroEL GUS H HACCP Hfr Hsp H 2 S ICSP Inc IS IgY KCN amplified fragment length polimorphism / polimorfizm długoci zamplifikowanych fragmentów DNA American Type Culture Collection szczepy atypowe nietypowo reagujce z fagami typujcymi bovine serum albumin / albumina surowicy wołowej cyclic adenosine monophosphate / cykliczny adenozynomonofosforan Centers for Disease Control and Prevention (Atlanta, USA) colony forming unit / jednostka tworzca koloni Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur (Pary, Francja) confluent lysis / całkowita liza cholera toxin / toksyna V. cholerae deoxyribonucleic acid / kwas deoksyrybonukleinowy Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH (Brunszwik, Niemcy) definitive type / typ bakteriofagowy (w odniesieniu do S. Typhimurium) European Food Safety Authority enzyme-linked immunosorbent assay / test immunoenzymatyczny fazy stałej Edwards Motility Medium fluorecent amplified fragment length polimorphism / polimorfizm długoci zamplifikowanych fragmentów DNA z zastosowaniem markerów fluorescencyjnych Food and Agriculture Oraganization symbol, którym oznaczono wzorcowy szczep prezentujcy nowy, trzeci gatunek w obrbie rodzaju Salmonella Główny Inspektorat Sanitarny N-acetyloglukozamina rekurencyjny akronim od słów GNU s Not Unix (GNU to uniksopodobny system operacyjny złoony wyłcznie z wolnego oprogramowania) białko szoku termicznego E. coli z rodziny białek Hsp60 Główny Urzd Statystyczny antygen rzskowy hazard analysis and critical control points / analiza zagroe i krytycznych punktów kontroli high frequency of recombination / wysoka czsto rekombinacji (w odniesieniu do szczepów bakteryjnych) heat shock protein / białko szoku termicznego siarkowodór International Committee on Systematic of Prokaryotes incompatibility / niezgodno (grupa niezgodnoci w odniesieniu do plazmidów) insertion sequence / sekwencja insercyjna immunoglobulin Y / immunoglobulina Y cyjanek potasu

11 Wykaz stosowanych skrótów 11 kda kilodalton KDO kwas 3-deoksy-D-manno-oktulozonowy KOS Krajowy Orodek Salmonella kpz kilo par zasad LPS lipopolysaccharide / lipopolisacharyd LT heat-labile toxin / ciepłowraliwa toksyna E. coli M mukoid / luzowy (w odniesieniu do antygenu) MIP macrophage inducing proteins / białka indukujce makrofagi MLEE multilocus enzyme electophoresis / elektroforetyczna analiza izoenzymów MLST multilocus sequence typing / sekwencjonowanie okrelonych fragmentów kilku wybranych genów odznaczajacych si pewnym stopniem polimorfizmu MLVA multilocus variable number of tandem repeats analysis / polimorfizm iloci tandemowych powtórze Mpz mega par zasad MurNAC kwas N-acetylomuraminowy MZiOS Ministerstwo Zdrowia i Opieki Społecznej NIZP-PZH Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego Pastwowy Zakład Higieny NT szczepy nie typujce si nie reagujce z fagami typujcymi O antygen somatyczny OL opaque lysis / mtna liza OD optical density / gsto optyczna OMP outer membrane protein / białko błony zewntrznej ONPG ortho-nitrophenyl-β-d-galactopyranoside / ortho-nitrofenylo-β-dgalaktopiranozyd PAGE polyacrylamide gel electophoresis / elektroforeza w elu poliakrylamidowym PBS phosphate buffered saline / fizjologiczny roztwór soli buforowany fosforanami PCR polymerase chain reaction / łacuchowa reakcja polimerazy PFGE pulsed field gel electrophoresis / elektroforeza w zmiennym polu elektrycznym PMF proton motive force / siła protonomotoryczna PO 4 grupa fosforanowa PT phage type / typ bakteriofagowy PVDF polyvinilidene difluoride membrane / membrana wykonana z polifluorku wynilidenu (stosowana do elektrotransferu) PZH Pastwowy Zakład Higieny R rough / szorstki (forma szorstka w odniesieniu do bakterii) RAPD random amplification of polymorfic DNA / losowa amplifikacja polimorficznych fragmentów DNA RTD routine test dilution (najwysze rozcieczenie preparatu fagowego pozwalajce uzyska całkowit lub prawie całkowit liz ze szczepem homologicznym) S smooth / gładki (forma gładka w odniesieniu do bakterii) S. Salmonella SCL semi-confluent lysis / prawie całkowita liza SDS sodium dodecyl sulfate / dodecylosiarczan sodu ser. serowar SPI Salmonella pathogenicity island / wyspa patogennoci bakterii Salmonella

12 12 Boena Dera-Tomaszewska ST subsp. TBS TSI TTSS VNTR war. WHO WHOCC-Salm heat-stable toxin / ciepłooporna toksyna E. coli subspecies / podgatunek tris buffered saline / fizjologiczny roztwór soli buforowany Trisem triple sugar iron agar / agarowe podłoe trójcukrowe z elazem type three secretion system / system sekrecji typu III variable number of tandem repeats / zmienna liczba tandemowych powtórze wariant World Health Organization WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella

13 13 1. WSTP 1.1. RODZAJ SALMONELLA Ogólna charakterystyka bakterii Salmonella Powszechnie dzi znane i cieszce si zł sław bakterie z rodzaju Salmonella, powoduj zachorowania ludzi i zwierzt. Pałeczki Salmonella wystpuj głównie w przewodzie pokarmowym zwierzt stałocieplnych, a take gadów, płazów, ptaków oraz ludzi. Niektóre serowary charakteryzuj si znaczc adaptacj do okrelonych organizmów i dlatego nazywane s gatunkowo swoistymi (tzw. host-adapted serowary). Niektóre z nich powoduj wyłcznie zachorowania ludzi (np. S. Typhi), inne tylko wybranych gatunków zwierzt (np. S. Gallinarum, S. Abortusequi, S. Abortusovis, S. Dublin, S. Choleraesuis) [390]. Pozostałe mog stanowi przyczyn zakae i ludzi, i zwierzt. Wszystkie naley traktowa jako potencjalnie chorobotwórcze zarówno dla przedstawicieli wiata zwierzcego, jak i człowieka. Nawet taki serowar jak Salmonella Gallinarum, o szczególnych preferencjach wzgldem gospodarza (drób), powszechnie uwaany za nieszkodliwy dla człowieka, moe stanowi zagroenie dla ludzi. Dua liczba tych drobnoustrojów (dua dawka zakaajca) moe spowodowa zachorowanie [351]. W Polsce izolowano pałeczki Salmonella Gallinarum zarówno od osób chorych, jak i z przypadków zakae bezobjawowych [84, 216]. Rodzaj Salmonella naley do rodziny Enterobacteriaceae [35, 105, 115] i stanowi najliczniejsz grup bakterii w obrbie tej rodziny. Obejmuje on dwa gatunki: Salmonella enterica (w obrbie którego wyosobniono 6 podgatunków) i Salmonella bongori [309]. Gram-ujemne, ruchliwe, peritrichalnie urzsione, redniej wielkoci pałeczki z rodzaju Salmonella, o ogólnych cechach zgodnych z definicj rodziny Enterobacteriaceae, prezentuj ponadto właciwoci decydujce o ich odrbnoci rodzajowej [35, 105, 198]. Nie fermentuj laktozy z powodu braku enzymu -galaktozydazy, nie fermentuj równie sacharozy, adonitolu i salicyny. Fermentacja glukozy przebiega z wytworzeniem kwasu i gazu lub tylko kwasu. Bezgazowa fermentacja glukozy stanowi cech znamienn diagnostycznie i jest typowa dla Salmonella Typhi pałeczki duru brzusznego, czsto te wystpuje u Salmonella Typhisuis czy Salmonella Gallinarum. Warianty nie wytwarzajce gazu podczas fermentacji glukozy spotykane s równie wród innych typów serologicznych. Znakomita wikszo pałeczek Salmonella fermentuje dulcytol. Najwaniejszymi wyjtkami wród serotypów nie fermentujacych tego alkoholu s pałeczki Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi A, Salmonella Gallinarum biowar Pullorum i Salmonella Choleraesuis. Salmonella nie wytwarzaj acetylometylokarbinolu, daj dodatni reakcj z czerwieni metylow, co wskazuje na tzw. kwany typ fermentacji cukrów. Wikszo z nich dobrze ronie na podłoach zawierajcych cytrynian, wyko-

14 14 Boena Dera-Tomaszewska rzystywany jako jedyne ródło wgla. Nie rosn w obecnoci cyjanku potasu (KCN), nie wytwarzaj ureazy, dezaminazy fenyloalaniny oraz dekarboksylazy kwasu glutaminowego. Z nielicznymi wyjtkami (Salmonella Paratyphi A; niektóre szczepy Salmonella Gallinarum) wytwarzaj dekarboksylaz lizyny. W wikszoci nie rozrzedzajelatyny i nie rozkładaj kwasu malonowego, natomiast szybko rozkładaj sole niektórych kwasów organicznych (d-winian sodowo-potasowy, cytrynian, mucynian). Nie wytwarzaj indolu. Wikszo szczepów nalecych do rodzaju Salmonella wytwarza siarkowodór (H 2 S). W odniesieniu do arabinozy, ksylozy, ramnozy, trehalozy i inozytolu poszczególne serowary Salmonella zachowuj si rónie [198]. Istniej jednak pewne odstpstwa, czasem nawet dosy znaczne, od podanej definicji biochemicznej rodzaju Salmonella, opierajcej si głównie na cechach charakterystycznych dla przedstawicieli najliczniej reprezentowanego podgatunku enterica. Najwaniejsze z nich to: niewytwarzanie gazu podczas fermentacji wglowodanów, brak zdolnoci rozkładania dulcytolu, wytwarzania dekarboksylazy lizyny czy ornityny, brak wzrostu na podłou cytrynianowo-amonowym, fermentacji mannitolu czy rozkładania d- winianu sodowo-potasowego, a take wytwarzanie ladowych iloci lub brak wytwarzania H 2 S. Wród znanych serotypów Salmonella opisano odmiany wytwarzajce indol, szczepy fermentujce laktoz, sacharoz lub salicyn, a take wykazujce zdolno wzrostu w obecnoci KCN. Pamita jednak naley, e brak zdolnoci do fermentacji dulcytolu postrzegane jako odstpstwo od powszechnie prezentowanego profilu biochemicznego wikszoci pałeczek Salmonella stanowi cech istotn w identyfikacji przedstawicieli podgatunków arizonae, diarizonae i houtenae [149, 309]. Podobnie jak brak zdolnoci do rozkładania d-winianu sodowo-potasowego jest cech stał, charakterystyczn dla wszystkich pozostałych podgatunków (poza enterica) gatunku Salmonella enterica i dla gatunku Salmonella bongori. Laktoz fermentuje 25% przedstawicieli podgatunku arizonae i 75% pogatunku diarizonae a zdolno do fermentacji salicyny jest jedn z cech charakterystycznych dla podgatunku houtenae. elatynaz wytwarzaj pałeczki Salmonella z podgatunków salamae, arizonae, diarizonae, houtenae i indica. Moliwo rozkładania kwasu malonowego wyrónia pałeczki podgatunków salamae, arizonae i diarizonae. Wzrost w obecnoci KCN stanowi cech istotn w identyfikacji bakterii Salmonella z podgatunku houtenae i z gatunku Salmonella bongori. Bakterie Salmonella nie nale do wybrednych drobnoustrojów, doskonale rosn na zwykłych podłoach, powszechnie uywanych do bada w pracy laboratoryjnej. Skpy wzrost wykazuj jedynie szczepy prezentujce takie serowary jak: S. Typhi, S. Abortusovis, S. Sendai i S. Gallinarum [105, 198]. Wystpujc w formie gładkiej S (smooth), bakterie te rosn w podłoach płynnych w postaci równomiernego zmtnienia, a na stałych podłoach agarowych tworz wypukłe, lnice kolonie, o gładkiej powierzchni i równych brzegach. W postaci szorstkiej R (rough), tworz osad w hodowlach płynnych, a kolonie na podłou agarowym s płaskie, maj nieregularne brzegi, szorstk i

15 Wstp 15 such powierzchni. Niektóre szczepy, posiadajce antygen M (mucoid), rosn, tworzc luzowate kolonie. Bakterie Salmonella zachowuj zdolno do wzrostu i prawidłowego metabolizmu zarówno w warunkach tlenowych, jak i beztlenowych. Rosn dobrze w zakresie temperatur 8 45 C i przedziale ph od 4,0 do 9,5. Optymaln temperatur wzrostu stanowi 37 C. Bakterie te s wraliwe na ogrzewanie i nie przeywaj temperatury powyej 70 C, co pozwala eliminowa je z produktów spoywczych w procesie pasteryzacji. Pałeczki Salmonella s oporne na wysychanie. Przeywaj nawet przez lata, szczególnie w wysuszonym kale, w kurzu, w suszonych paszach i suszonej ywno- ci. Opisano take długotrwałe przeywanie tych bakterii w wodzie i ziemi. Procesy takie jak solenie, czy wdzenie, maj ograniczony wpływ na przeywalno pałeczek Salmonella. Tak wysoka oporno na suszenie, solenie, wdzenie a take zamraanie, wyjania dlaczego bakterie te bez trudu przeywaj w rónych produktach spoywczych [47]. Do zakaenia u ludzi dochodzi głównie drog pokarmow w nastpstwie spoycia skaonej wody lub ywnoci przewanie pochodzenia zwierzcego, skaonej pierwotnie (produkty pochodzce od zwierzt chorych) lub skaonej wtórnie kałem zwierzt albo ludzi chorych lub nosicieli. U dzieci równie wan rol w zakaeniach odgrywa droga fekalno-oralna. Te chorobotwórcze dla człowieka bakterie wywołuj midzy innymi dur brzuszny [141], dury rzekome [142], a najczciej ostre dolegliwoci ołdkowojelitowe nazywane potocznie zatruciem pokarmowym, objawiajcym si bólami brzucha, gorczk, biegunk, nudnociami i wymiotami [15]. Zakaenie pałeczkami z rodzaju Salmonella czsto wie si z trudnym do zwalczenia i niekiedy długotrwałym nosicielstwem tych bakterii. Czsto wystpowania zakae Salmonella jest najwysza w miesicach letnich. Na zakaenia szczególnie naraone s osoby z tzw. grupy podwyszonego ryzyka: dzieci do 5 lat, osoby starsze i osoby z upoledzon funkcj układu immunologicznego Wystpowanie pałeczek Salmonella Bakterie Salmonella stanowi przyczyn zakae około 3 bilionów osób rocznie na całym wiecie. Zgodnie z szacunkowymi danymi wiatowej Organizacji Zdrowia (WHO), około 22 miliony sporód wszystkich przypadków stanowi zakaenia pałeczk duru brzusznego, odpowiedzialn za 200 tysicy zgonów rocznie [69, 74]. Dur brzuszny rozprzestrzenia si na drodze fekalno-oralnej, poprzez skaon ywno i wod, i najczciej wystpuje na obszarach o złym stanie sanitarno-higienicznym. Wikszo przypadków duru brzusznego dotyczy tzw. krajów rozwijajcych si, szczególnie na subkontynencie indyjskim i w Południowo-Zachodniej Azji. Dur brzuszny stanowi endemiczn chorob równie w innych rejonach Azji oraz w Afryce [296]. Zachorowania na dur brzuszny s równie powszechnie notowane na rodkowym Wschodzie, w niektórych pastwach południowej i wschodniej Europy oraz w centralnej i południowej Ameryce.

16 16 Boena Dera-Tomaszewska W pozostałej czci wiata w krajach rozwinitych, pałeczki duru brzusznego stanowi przyczyn zachorowa jedynie u osób podróujcych do krajów rozwijajcych si i powoduj 3 30 przypadków zakae na kade 100 tysicy podrónych [354]. Epidemiologia durów rzekomych (paradurów) jest opisana mniej dokładnie ni epidemiologia duru brzusznego. Szacunkowe dane sugeruj, e 25% wszystkich tzw. gorczek jelitowych (enteric fever) moe by spowodowana przez pałeczki S. Paratyphi A [74]. Co wicej, S. Paratyphi A stanowi jedn z głównych przyczyn zakae Salmonella w południowej Azji [283] i moe powodowa tak ciki przebieg choroby jak pałeczki S. Typhi [249]. W krajach rozwijajcych si, przebieg choroby spowodowanej zakaeniem S. Paratyphi A, jest zwykle podobny do zakaenia spowodowanego przez S. Typhi, chocia (jak to wynika z bada przeprowadzonych w Indonezji, dotyczcych kontroli czynników ryzyka zakae rozpatrywanych w aspekcie pojedynczych przypadków) drogi przenoszenia tego zarazka s inne ni pałeczek S. Typhi, a współzakaenia (S. Paratyphi A i S. Typhi) rzadko rejestrowane [388]. Wydaje si mało prawdopodobnym, aby te dwa serowary, których rezerwuarem jest człowiek (human-restricted serovars), dzieliły jakkolwiek inn nisz ekologiczn poza jelitem człowieka. Bezporedni transfer lekoopornoci powinien by zatem rzadkim wydarzeniem, jakkolwiek oba te serowary mog nabywa podobne plazmidy ze wspólnego ródła, jakim jest naturalna flora jelita człowieka. W wiecie obserwujemy wci znaczne iloci przypadków salmoneloz zarówno u ludzi, jak i zwierzt. Czste s nadal izolacje pałeczek Salmonella z ywnoci i pasz, a take z otoczenia. Wszystkie pastwa borykaj si z tym problemem, stanowicym aktualne, jak i potencjalne zagroenie, modyfikowane przez róne czynniki, np.: takie jak klimat, przemysł, czy nawyki ywieniowe. Problem ten jest najmniej gro ny w pastwach skandynawskich. Stosunkowo niewielka liczba przypadków zakae pałeczkami Salmonella w tych krajach jest midzy innymi wynikiem wprowadzenia ustawy dotyczcej poddawania termicznej obróbce importowanych rodków spoywczych skaonych pałeczkami Salmonella. Wikszo bowiem problemów zwizanych z zakaeniami powstało w wyniku naruszenia prostych zasad higieny. Problemy te jednak mog zosta pokonane, czego przykładem od dziesitków ju lat jest Dania. Szalenie trudno jest uzyska faktyczne dane epidemiologiczne dotyczce zakae u ludzi spowodowanych pozostałymi serowarami Salmonella (poza S. Typhi, S. Paratyphi A, B i C), poniewa wielu pacjentów, w przypadku zwykłej salmonelozy nie poddaje si konsultacji medycznej, nie podlegajc tym samym adnej rejestracji. W Anglii i Walii rejestruje si u ludzi 20 do 30 tysicy przypadków salmonelozy rocznie. Jakkolwiek, szacuje si, i do kadego zarejestrowanego przypadku salmonelozy naleałoby doliczy co najmniej 3 dodatkowe, co zwikszyłoby liczb wszystkich przypadków do około 100 tysicy rocznie. W krajach Unii Europejskiej zakaeniu pałeczkami Salmonella (poza S. Typhi, S. Paratyphi A, B i C) ulega około 350 tysicy osób w cigu roku. Rejestruje si równie około 1000 zgonów rocznie [119, 120]. W Polsce, w cigu ostatnich lat, obserwujemy

17 Wstp 17 wprawdzie spadek liczby zakae pałeczkami Salmonella u ludzi, cigle jednak notujemy rednio około 20 tysicy przypadków bakteriologicznie potwierdzonej salmonelozy w skali roku [274, 291, 292, 293]. W Stanach Zjednoczonych liczba zakae wynosi około 200 tysicy przypadków rocznie [256]. Serowarami dominujcymi na wiecie s S. Enteritidis i S. Typhimurium. Niebezpieczestwo wynikajce ze zwikszonej inwazyjnoci niektórych serowarów Salmonella stało si problemem na skal wiatow przykładem moe by Salmonella Enteritidis. Problem ten stał si jeszcze bardziej zło- ony z powodu, rejestrowanego w wielu krajach, dramatycznego wzrostu liczby zakae u ludzi spowodowanych Salmonella Enteritidis. Ten alarmujcy wzrost zakae potwierdził pandemiczny charakter ekspansji tego serowaru [325]. Niezwykle przydatne informacje dotyczce geograficznego rozmieszczenia serowarów Salmonella na wiecie, otrzymujemy dziki pastwom, które prowadz rejestracj importowanych przypadków i ródeł ich pochodzenia. Niektóre pastwa równie systematycznie zbieraj i analizuj informacje dotyczce importowanych przypadków zatru pokarmowych. Wszystkie te dane uwzgldniajce ródło geograficzne, pozwalaj na ustalenie zwizków pewnych serowarów z okrelonymi rejonami wiata, co jest szczególnie wane dla tych regionów, gdzie wystpowanie przypadków zakae pochodzenia krajowego jest sporadyczne. Wikszo zakae ludzi spowodowanych pałeczkami Salmonella (poza S. Typhi i S. Paratyphi A, B i C) zwizanych jest głównie ze spoyciem ywnoci pochodzenia zwierzcego, szczególnie misa drobiowego i jaj, chocia inne produkty spoywcze odgrywaj równie znaczc rol. Badania prowadzone w latach , dotyczce ognisk zatru pokarmowych o zasigu midzynarodowym, wykazały ogromn rónorodno produktów spoywczych odpowiedzialnych za zakaenia pałeczkami Salmonella u ludzi (tab. 1). Tabela 1. Ogniska zatru pokarmowych Salmonella (o zasigu midzynarodowym) zarejestrowane na wiecie w latach , z uwzgldnieniem produktów odpowiedzialnych za zakaenie [311] Table 1. Recent cross-border outbreaks of non-typhoidal salmonellosis illustrates the diversity of transmission, [311] Rok Year Pastwo Country involved 1995 Wielka Brytania 1997 USA, Finlandia Liczba przypadków Number of cases Serowar Serovar Skaony produkt (nonik) Vehicle 27 S. Agona przekska z czbrem około 242 S. Stanley kiełki lucerny Uwagi Notes produkt importowany z Izraela

18 18 Boena Dera-Tomaszewska Rok Year Pastwo Country involved 1997 Europa Zachodnia 1998 Niemcy, Austria, Belgia, Szwecja, Finlandia, Wielka Brytania 2000 Islandia, Anglia, Walia, Holandia, Szkocja, 396 S. Typhimurium Niemcy Kanada (157) USA (11) 2001 Australia, Szwecja 2001 Australia, Kanada, Wielka Brytania 2001 kilka pastw europejskich 2001 pastwa skandynawskie 2003 Australia, Nowa Zelandia Liczba przypadków Number of cases nieznana Serowar Serovar S. Livingstone Skaony produkt (nonik) Vehicle nieznany nieznana S. Blockley wdzony wgorz (zidentyfikoway jako przyczyna zatru w kilku krajach) sałata 168 S. Enteritidis migdały nieznana S. Typhimurium chałwa (imp. Turcja) nieznana S. Stanley orzechy (imp. Chiny) nieznana S. Oranienburg czekolada wyprodukowana w Niemczech Uwagi Notes wiele przypadków zakae nabytych w czasie pobytu zagranic, w szczególnoci w Tunezji obecno skaonej chałwy stwierdzono równie w Niemczech, Norwegii i Wielkiej Brytanii 301 S. Enteritidis drób wiele przypadków dotyczyło turystów powracajcych z Krety i z Karpat nieznana S. Montevideo produkty zawierajce ziarno sezamowe (np.: chałwa) produkty importowane z Egiptu i Libanu

19 Wstp 19 Rok Year Pastwo Country involved Liczba przypadków Number of cases Serowar Serovar Skaony produkt (nonik) Vehicle Uwagi Notes 2004 nieznane nieznana S. Enteritidis migdały obecno skaonych migdałów stwierdzono w Chinach, na Tajwanie, w Korei, we Francji, Włoszech, w Japonii, Malezji, Meksyku i Wielkiej Brytanii 2004 nieznane nieznana S. Thompson sałata Ruccola obecno skaonej sałaty wykazano w Norwegii, Szwecji i Wielkiej Brytanii 2005 Kanada (3), USA (2) 2005 Szwecja (6), Szwajcaria (3), Niemcy (2), Austria (5), Wielka Brytania (3), Francja (27) 5 S. Thompson przysmaki dla zwierzt domowych 48 S. Stourbridge niepasteryzowany ser (z Francji) zakaeniu uległy osoby zajmujce si sprzeda tych artykułów 2005 Majorka 178 S. Goldcoast nieznany turyci ze Szkocji (37), Irlandii (6), Szwecji (6) Norwegii (8), Danii (3), Niemiec (20) i Finlandii (4) ulegli zakaeniu podczas pobytu na Majorce 2005 Dania 22 S. Typhimurium carpppaccio z surowej wołowiny produkt importowany z Włoch Istnieje obszerne pimiennictwo pochodzce z całego wiata, dotyczce rozpowszechnienia pałeczek Salmonella wród ludzi i niemal wszystkich rodzajów zwierzt, zawierajce oceny sytuacji epidemiologicznych w poszczególnych krajach oraz propozycje kontroli i zwalczania salmoneloz. Ze wzgldu na odmienne zasady opracowywania raportów dotyczcych zakae pałeczkami Salmonella, dane epidemiologiczne z rónych pastw s trudno porównywalne. Jakkolwiek w niektórych pastwach liczby rejestrowanych przypadków zakae Salmonella przedstawia si w postaci pewnych stałych współczynników (obecnie dostpnych take w rónych internetowych bazach danych), pozwalajcych oszacowa fak-

20 20 Boena Dera-Tomaszewska tyczn sytuacj epidemiologiczn. Std te pewne kierunki, tendencje, zjawiska dotyczce salmoneloz, ilustrowane za pomoc tych danych liczbowych mog by uznane za wska nik paralelnych zjawisk majcych miejsce w rzeczywistoci Klasyfikacja i nazewnictwo bakterii Salmonella Jedn z najbardziej charakterystycznych cech wiata mikroorganizmów jest jego ogromna rónorodno. Konieczno zapanowania nad tym bogactwem wymagała opracowania pewnego systemu, który pozwoliłby na uporzdkowanie wszystkich mikroorganizmów według okrelonych zasad [64, 66, 245, 279]. Taksonomia jest włanie tdziedzin nauk biologicznych, która zajmuje si teori i praktyk tworzenia systemów klasyfikacyjnych organizmów i obejmuje trzy działy. Klasyfikacja to jeden z działów taksonomii, który porzdkuje organizmy w grupy, tak zwane taksony. Klasyfikacja polega na podziale organizmów ywych na spokrewnione grupy [247, 260]. Podziału dokonuje si na podstawie wystpowania podobnych cech. Dwa pozostałe działy to identyfikacja i nazewnictwo (nomenklatura). Identyfikacja jest praktycznym działem taksonomii, a jej celem jest okrelenie czy badany mikroorganizm naley do wczeniej oznaczonego, czy do zupełnie nowego taksonu, któremu naley nada now nazw. Nazewnictwo zajmuje si terminologi stosowan do oznaczania poszczególnych taksonów. Nazewnictwo, to nadawanie nazw poszczególnym grupom taksonomicznym zgodnie z midzynarodowymi zasadami [225, 246]. W przeszłoci, w badaniach taksonomicznych posługiwano si głównie metodami umoliwiajcymi ocen właciwoci fenotypowych bakterii. Obecnie, do tego celu, wykorzystywane s równie metody biologii molekularnej, a zwłaszcza technika hybrydyzacji kwasów nukleinowych. Dziki temu, moliwe jest dokonanie charakterystyki i bezporedniego porównania genomów bakteryjnych. Filogenetyczne pokrewiestwo okrelone na podstawie ewolucyjnie zachowanych (konserwatywnych) sekwencji genomów stało si podstaw najnowszej taksonomii bakterii [205]. Jej struktura narzuca porzdek klasyfikacji drobnoustrojów uwzgldniajcy równie ich genetyczne podobiestwo. Współczesna klasyfikacja bakterii opiera si zatem na analizie cech morfologicznych, fizjologicznych, biochemicznych, chemicznych i genetycznych bakterii. Wprowadzenie technik genotypowych do bada z zakresu systematyki, stało si przyczyn toczcych si obecnie rearanacji wielu taksonów i wynikajcych z tego powodu zmian w klasyfikacji i nazewnictwie. Prace nad systematyk bakterii trwaj od kilku lat i maj na celu zmodyfikowanie ich taksonomii tak, by była ona wiernym odbiciem ich filogenezy. Zmianom taksonomicznym nie oparł si równie rodzaj Salmonella [148, 368]. Według propozycji Le Minora i Popoffa [226, 308], uzupełnionej badaniami Reevesa [323], które podgatunek Salmonella enterica subsp. bongori wyniosły do rangi gatunku, do rodzaju Salmonella nale dwa gatunki (species):

21 Wstp Salmonella enterica, w obrbie którego wydzielono sze podgatunków (subspecies): S. enterica subsp. enterica, S. enterica subsp. salamae, S. enterica subsp. arizonae, S. enterica subsp. diarizonae, S. enterica subsp. houtenae, S. enterica subsp. indica. 2. Salmonella bongori. Niniejsza propozycja zgłoszona przez jej autorów do zatwierdzenia przez Judical Commission of the International Committe on Systematics of Prokaryotes (ICSP), została prawomocnie zaakceptowana decyzj Komisji wyraon w stosownym dokumencie Opinion 80, opublikowanym w 2005 roku [177]. Uzyskana legalizacja dotyczyła jedynie zmian proponowanych w nazewnictwie zgodnie z zakresem kompetencji w/w Komisji, która ocenia wyłcznie poprawno nomenklaturow taksonów, a nie poprawno systematyczn. Komisja nie wypowiadała si na temat koncepcji istnienia dwóch gatunków w obrbie rodzaju Salmonella. Nowe nazwy taksonów stały si obowizujce w momencie ich opublikowania (tzw. nowy system). Równoczenie, decyzj ICSP zachowano wszystkie, wczeniej zatwierdzone nazwy (tzw. stary system), przy czym stary system nazewnictwa uywany jest ju przez niewielu bakteriologów. Zmiany w klasyfikacji i nazewnictwie bakterii Salmonella, zaproponowane przez Le Minora i Popoffa, przedstawione w ostatecznej wersji w Antigenic formulas of the Salmonella serovars, 7th revision [308], zostały szybko zaakceptowane i s ju powszechnie stosowane w praktyce, w tym przez tak wiodce orodki jak WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella (WHOCC-Salm) (Institut Pasteur, Pary, Francja), czy Centers for Disease Control and Prevention (CDC) (Atlanta, USA). Proponowane zmiany s odzwierciedleniem najnowszych osigni w zakresie taksonomii rodzaju Salmonella. Cechy biochemiczne poszczególnych gatunków i podgatunków pozwalajce na ich rónicowanie w obrbie rodzaju Salmonella oraz ich wraliwo na działanie faga O1 przedstawiono w tabeli 2. Bakterie z podgatunku Salmonella enterica subsp. enterica izolowane s głównie od zwierzt stałocieplnych. Pałeczki nalece do pozostałych podgatunków Salmonella enterica oraz gatunku Salmonella bongori przede wszystkim od zwierzt zmiennocieplnych i ze rodowiska naturalnego. W ramach wewntrzgatunkowego rónicowania bakterii Salmonella istnieje moliwo wyodrbnienia wielu wariantów serologicznych tak zwanych serowarów, na podstawie identyfikacji antygenów somatycznych, rzskowych oraz antygenu otoczkowego Vi (jeeli jest obecny). Zgodnie z zasadami prezentowanymi w Bacteriological Code (1990 Revision) [225], preferowany jest termin serowar (wariant serologiczny), który powinien zastpi funkcjonujcy do tej pory termin serotyp (typ serologiczny). W przeszłoci, wszystkim serowarom Salmonella nadawano nazwy.

22 22 Boena Dera-Tomaszewska Tabela 2. Cechy rónicujce pomidzy gatunkami i podgatunkami Salmonella [149, 309] Table 2. Differential characters of Salmonella species and subspecies [149, 309] gatunek species S. enterica S. bongori podgatunek subspecies enterica salamae arizonae diarizonae houtenae indica właciwoci / characters Dulcytol + + d + ONPG (2h) + + d + Malonian elatyna Sorbitol KCN + + d-winian sodowopotasowy + Galakturonian γ-glutaminotransferaza + (*) β-glukuronidaza d d + d Mucynian (70%) + + Salicyna + Laktoza (75%) + (75%) d Liza fagiem O d rodowisko wystpowania / usual habitat zwierzta stałocieplne warmblooded animals zwierzta zmiennocieplne i rodowisko / cold-blooded animals and environment (*) Typhimurium d, Dublin ; + = 90% lub wicej reakcji dodatnich; = 90% lub wicej reakcji ujemnych; d = róne serowary mog prezentowa róne typy reakcji; ONPG = ortho-nitrofenyloβ-d-galaktopiranozyd; KCN= cyjanek potasu (*) = Typhimurium d, Dublin ; + = 90% or more positive reactions; = 90% or more negative reactions; d = different reactions given by different serovars; ONPG = ortho-nitrophenyl-β-dgalactopyranoside; KCN= potassium cyanide W 1966 roku, na Kongresie Mikrobiologii w Moskwie (Ninth International Congress of Microbiology), podjto decyzj o zaprzestaniu nadawania nazw wariantom serologicznym Salmonella, z wyjtkiem serowarów nalecych do podgatunku enterica, który obejmuje ponad 99,0% wszystkich izolowanych szczepów Salmonella. Nazwy pozostałych serowarów zastpiono odpowiednimi wzorami antygenowymi. Funkcjonujcy przez wiele lat, sposób zapisywania nazw serowarów Salmonella [197] wymagał równie pewnych regulacji. Le Minor i Popoff zaproponowali [226, 308], by nazwy serowarów były pisane z wielkiej litery i nie kursyw np.: Typhi, Paratyphi B, Enteritidis, Agona. Pełna nazwa serowaru pierwszego podgatunku powinna uwzgldnia nazw rodzaju (pisan kursyw i z wielkiej litery), epitet okrelajcy gatu-

23 Wstp 23 nek, podgatunek i nazw danego wariantu serologicznego, np. Salmonella enterica subsp. enterica serowar Typhimurium, a w dopuszczalnej, uproszczonej wersji jedynie nazw rodzaju, symbol okrelajcy podgatunek enterica oraz nazw serowaru np. Salmonella subsp. I ser. Typhimurium. W praktyce klinicznej nazwa podgatunku nie musi by wymieniana, gdy jedynie serowary podgatunku enterica nosz nazwy. Typhimurium, London, Paratyphi B, Typhi, Enteritidis, Hadar, Mbandaka czy Newport, s serowarami podgatunku enterica. Skrócone nazwy serowarów podgatunku enterica, np. Salmonella serowar Typhimurium, Salmonella ser. Typhimurium lub Salmonella Typhimurium mog by uywane w rutynowej praktyce. Serowary piciu pozostałych podgatunków Salmonella enterica i serowary gatunku Salmonella bongori opisuje si wzorami antygenowymi. Przynaleno serowarów do tych podgatunków okrelono nastpujcymi symbolami: II serowary S. enterica subsp. salamae, IIIa S. enterica subsp. arizonae, IIIb S. enterica subsp. diarizonae, IV S. enterica subsp. houtenae, VI S. enterica subsp. indica. Pełna nazwa serowarów pozostałych podgatunków Salmonella enterica powinna zawiera nazw rodzajow, nazw podgatunku (lub symbol oznaczajcy dany podgatunek) i nazw serowaru wyraon wzorem antygenowym, np. Salmonella enterica subsp. salamae 17:b:z 26 lub w postaci skróconej Salmonella subsp. II 17:b:z 26, a nawet S. II 17:b:z 26 [227], jeeli z kontekstu wynika jednoznacznie, e uyty skrót nazwy rodzajowej (S.) dotyczy bakterii Salmonella. Serowary drugiego gatunku Salmonella bongori, oznaczono symbolem V. Liczb aktualnie [149] znanych wariantów serologicznych w poszczególnych gatunkach i podgatunkach rodzaju Salmonella, ilustruje tabela 3. Tabela 3. Liczba aktualnie znanych wariantów serologicznych w poszczególnych gatunkach i podgatunkach rodzaju Salmonella [149] Table 3. Actual numer of serovars in each species and subscpecies of genus Salmonella [149] gatunek / species 1. Salmonella enterica podgatunek subspecies enterica 1531 salamae 505 arizonae 99 diarizonae 336 houtenae 73 indica Salmonella bongori 22 Razem: 2579 n

24 24 Boena Dera-Tomaszewska Najnisz w hierarchii jednostk taksonomiczn jest podgatunek. Serowar nie posiada statusu taksonomicznego. Nie podlega wic zasadom nomenklaturowym prezentowanym w Bacteriological Code (1990 Revision) [225, 332], regulujcym nazewnictwo taksonów. Bakteriolodzy maj zatem pewn dowolno i mog kontynuowa stosowanie nazw serowarów Salmonella pisanych kursyw i z małej litery, jak to proponował Kauffmann [197] (tzn. Salmonella newport, Salmonella enteritidis), co niestety mylnie sugeruje, e mamy do czynienia z gatunkiem. Jednak wikszo bakteriologów akceptuje zmiany w nomenklaturze serowarów i sposobie ich zapisywania, o czym wiadczy coraz szersze stosowanie ich w praktyce. W miar rozwoju technik badawczych (biologia molekularna, serologia, mikroskopia elektronowa), cigle odkrywane s nowe bakterie. W marcu 2005 roku, podano do wiadomoci publicznej [382] informacj dotyczc odkrycia nowego gatunku bakterii Salmonella, dla którego zaproponowano nazw Salmonella subterranea [349]. Analiza sekwencji 16S rdna szczepu FRCI wyizolowanego z zanieczyszczonego, podpowierzchniowego osadu o niskim wska niku ph, wykazała, e jest on w 96,4% podobny do Salmonella bongori i w 96,3% podobny do Enterobacter cloacae. Szczep ten został uznany za szczep wzorcowy (type strain) nowego gatunku Salmonella i zdeponowany w kilku powszechnie dostpnych kolekcjach organizmów, midzy innymi w American Type Culture Collection (ATCC), w kolekcji Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen (DSMZ) oraz w Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur (CIP) (szczep FRCI = ATCC BAA-836 = DSM = CIP ). I chocia cz taksonomistów przeciwna jest tworzeniu nowych taksonów (gatunków lub rodzajów) wyłcznie w oparciu o cechy jednego szczepu (tzw. one-strain taxa) [379], prawomocne zaistnienie nowego, trzeciego gatunku w obrbie rodzaju Salmonella stało si faktem. Krajowy Orodek Salmonella (Gdask, Polska), podobnie jak inne, wiodce orodki na wiecie, pozytywnie ustosunkował si do zmian w klasyfikacji rodzaju Salmonella i zmian w nazewnictwie zaproponowanych przez Le Minora i Popoffa wprowadzajc je do rutynowej diagnostyki bakterii Salmonella i upowszechniajc w kraju [85, 133]. Zmiany w dziedzinie taksonomii rodzaju Salmonella uwzgldniono równie w nazewnictwie stosowanym w niniejszej pracy (z wyjtkiem wykazu pimiennictwa tytuły cytowanych publikacji przytaczano w oryginale) Struktura antygenowa bakterii Salmonella Antygenami nazywamy czynniki natury oywionej i nieoywionej, które po wprowadzeniu do ustroju krgowców, wzbudzaj odpowied immunologiczn (humoraln i komórkow) i swoicie reaguj z produktami tej odpowiedzi. Najczciej s to due czstki białek oraz cukrów, lipidy, komórki drobnoustrojów i inne. W szerszym za aspekcie, antygen praktycznie oznacza kad czsteczk, która moe by swoicie roz-

25 Wstp 25 poznawana przez elementy układu odpornoci nabytej, tzn. komórki B i/lub T. Antygeny cechuje: 1. immunogenno właciwo pobudzania do wytwarzania immunoglobulin lub swoistej odpowiedzi komórkowej 2. swoisto właciwo nadawania swoistego pitna produktom odpowiedzi immunologicznej (immunoglobulinom lub komórkom immunologicznie kompetentnym), która powoduje, e reaguj one jedynie z antygenami powodujcymi ich wytwarzanie lub z antygenami posiadajcymi identyczne determinanty antygenowe. U Gram-ujemnych pałeczek z rodzaju Salmonella wyróniamy 3 rodzaje antygenów: 1. antygeny somatyczne (O) 2. antygeny rzskowe (H) 3. antygeny otoczkowe (K); wystpuj tylko u niektórych przedstawicieli rodzaju Salmonella (antygen Vi, antygen M) Antygeny somatyczne Osłony komórek bakterii Gram-ujemnych, w tym równie pałeczek Salmonella, stanowi jedn z najbardziej złoonych struktur komórkowych [46, 406]. Zawieraj one: błon cytoplazmatyczn, przestrze periplazmatyczn z warstw peptydoglikanu i charakterystyczn dla tych bakterii błon zewntrzn (ryc. 1). Kada z wymienionych czci ma specyficzn budow tworzc łcznie osłon ochronn komórki. Stanowi ona równie warstw, przez któr odbywa si transport czsteczek zarówno do wntrza, jak i na zewntrz komórki. Błona cytoplazmatyczna jest półprzepuszczaln, dwuwarstwow błon, bdc barier pomidzy cytoplazm i otaczajcym j rodowiskiem. Pomidzy błonami: cytoplazmatyczn i zewntrzn, powstaje obszar zwany przestrzeni periplazmatyczn. Ma ona najprawdopodobniej charakter elu, w którym znajduje si cienka warstwa peptydoglikanu i liczne białka. Peptydoglikan, sztywna warstwa ciany komórkowej, czasem zwany równie murein, zbudowany jest z cukrów i aminokwasów. Peptydoglikan składa si z długich łacuchów dwóch pochodnych cukrowych, N- acetyloglukozaminy (GlcNAc) i kwasu N-acetylomuraminowego (MurNAc), podstawionych bocznymi łacuchami peptydowymi zbudowanymi z naprzemiennie wystpujcych aminokwasów w konfiguracji D i L przyłczonych do MurNAc.

26 26 Boena Dera-Tomaszewska Ryc. 1. Przekrój poprzeczny przez cian komórkow bakterii Salmonella (według [235]) Fig. 1. Schematic cross section of the surface envelope of Salmonella bacteria (according to [235]) Sztywno zapewniaj wizania poprzeczne midzy łacuchami peptydowymi. Charakter bocznych łacuchów peptydowych oraz wiza midzy nimi jest odmienny u rónych gatunków bakterii. Błona zewntrzna prezentuje unikatow budow. Jej podstawowym składnikiem s fosfolipidy, białka i pełnicy funkcje ochronne lipopolisacharyd (LPS), zwany równie endotoksyn. Wszystkie bakterie Gram-ujemne i tylko one wytwarzaj endotoksyny. Odkrycie, e wszystkie endotoksyny stanowi róne modyfikacje tej samej czsteczki, stanowiło ogromny przełom w badaniach nad tymi substancjami. Lipopolisacharyd znajduje si w zewntrznej warstwie błony zewntrznej. Ta termostabilna endotoksyna bdc jedn z głównych składowych błony zewntrznej [46], stanowi 3 5% suchej masy komórki bakteryjnej. Lipopolisacharyd jest heteropolimerem, składajcym si z zakotwiczonego w błonie lipidu A, polisacharydowego rdzenia oraz hydrofilowego, O-swoistego łacucha cukrowego, który jest najbardziej wyeksponowan na zewntrz czci LPS decydujc o jego swoistoci serologicznej (ryc. 2).

27 Wstp 27 Ryc. 2. Schemat struktury lipopolisacharydu w formie gładkiej S. Lipid A jest połczony, poprzez wewntrzn i zewntrzn cz oligosacharydowego rdzenia, z jedn z powtarzajcych si oligosacharydowych podjednostek tworzcych O-swoisty łacuch mogcy przybiera rón długo. Długo O-swoistego łacucha bakterii Salmonella determinowana jest przez tworzcych go podjednostek (według [335]) Fig. 2. Schematic representation of the S-form lipopolysaccharide. Lipid A is joined via inner- and outer- core oligosaccharide, to the repeating oligosaccharide that forms the O-side chain. The length of the O-side chain is variable, but between 25 and 40 units is common in Salmonella (according to [335]) LPS odpowiada za kilka cech bakterii Gram-ujemnych: 1. jest powodem istnienia wypadkowego ładunku ujemnego na powierzchni komórki bakteryjnej 2. stanowi barier utrudniajc dostp szkodliwym czsteczekom do powierzchni komórki, pełni zatem funkcje ochronne 3. długie O-swoiste łacuchy charakteryzuj si zmiennoci strukturaln i w zwizku z tym odgrywaj rol w unikaniu przez bakterie Gram-ujemne odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Lipidowy składnik endotoksyny, lipid A, osadzony w zewntrznej warstwie dwuwarstwowej błony zewntrznej bakterii, w rzeczywistoci jest głównym jej składnikiem i najbardziej konserwatywn czci LPS. Stanowi on najbardziej fascynujc składow endotoksyny. Jest on zarówno czynnikiem toksycznym endotoksyny, jak i czynnikiem powodujcym wzrost odpornoci organizmu zakaonego bakteriami. Lipid A prawie zawsze zawiera dwie czsteczki glukozaminy z przyłczon grup fosforanow (PO 4 ) i zmienn liczb kwasów tłuszczowych. Minimaln ilo składowych tworzcych ju pełnowartociow czsteczk LPS zaobserwowano u mutantów Re bakterii Salmonella. Czsteczka LPS tych mutantów składa si z lipidu A i dwóch reszt kwasu 3-deoksy-Dmanno-oktulozonowego (KDO) (ryc. 3).

28 28 Boena Dera-Tomaszewska Ryc. 3. Lipopolisacharyd prezentujcy minimalny chemotyp, wystpujcy u mutantów Re bakterii Salmonella, znany równie jako KDO 2 -lipid A. Dwie reszty KDO połczone s z acetylowanym dwucukrem glukozamin (lipid A). Połczenie KDO z glukozamin wymaga obecnoci produktu genu kdta (według [335]) Fig. 3. The minimal Re chemotype lipopolysaccharide of Salmonella, sometimes known as KDO 2 - lipid A. Two KDO residues are linked to the acetylated glucosamine disaccharide (lipid A). Linkage of the KDO to the glucosamine disaccharide involves the product of the kdta gene (according to[335]) Synteza LPS rozpoczyna si od syntezy lipidu A, do którego nastpnie przyłczany jest fragment polisacharydowy zbudowany z oligocukru rdzenia oraz powtarzajcych si podjednostek cukrowych wchodzcych w skład O-swoistego łacucha. Biosynteza lipidu A zachodzi w cytoplazmie. Tylko cztery geny bior udział w jego syntezie: lpxa, lpxb, lpxc oraz lpxd. Koduj one enzymy, które s odpowiedzialne za ostateczn posta tej składowej lipopolisacharydu. Zaburzenie struktury lipidu A powoduje niemono namnaania si bakterii. Nie znany jest powód, dla którego obecno włanie tej komponenty LPS jest niezbdna do zapewnienia bakteriom zdolnoci do ycia. Lipid A, jest bardzo toksyczny dla człowieka i dla innych ssaków [199]. Jego obecno w układzie krwiono- nym, nawet w bardzo niewielkich steniach, prowadzi do szoku toksycznego i mierci. Oligosacharydowy rdze LPS składa si z dwóch czci: wewntrznej, zwizanej z lipidem A oraz zewntrznej, zwizanej z łacuchem O-swoistym. Cz wewntrzna rdzenia zawiera rzadko wystpujce w przyrodzie czsteczki cukrów prostych, jak na przykład heptoz czy KDO. Heptoza jest siedmiowglowym cukrem, podczas gdy najbardziej typowymi s monocukry szeciowglowe. KDO, wystpujcy we wszystkich endotoksynach, stanowi ogniwo łczce O-swoisty łacuch wielocukrowy z lipidem A.

29 Wstp 29 Za biosyntez olisacharydowego rdzenia LPS bakterii Salmonella Typhimurium, odpowiedzialnych jest a 18 rónych genów [215, 335]. Prawie wszystkie zlokalizowane s w regionie waa (zwanym dawniej rfa) na chromosomie bakteryjnym (79 minuta na chromosomie S. Typhimurium LT2). Cz rdzeniowa LPS nie ma istotnego wpływu na odpowied immunologiczn organizmu w przebiegu zakaenia i tylko w wyjtkowych przypadkach (bakterie z LPS pozbawionym łacucha O) rdze staje si czynnikiem uruchamiajcym produkcj swoistych przeciwciał. Typowy łacuch O-swoisty utworzony jest przez powtarzajcych si jednostek, z których kada zawiera nie wicej ni 8 czsteczek monocukru (3 8 cukrów). Rodzaje tych monocukrów oraz ich kolejno w obrbie podstawowej jednostki, a take liczba podjednostek wchodzcych w skład łacucha czsto si róni. Łacuch O- swoisty jest najbardziej zmiennym fragmentem i t czci endotoksyny, która stymuluje wytwarzanie przeciwciał, rozpoznajcych okrelony łacuch O-swoisty, a nie rozpoznajcych innych czsteczek. Tak wic róne serowary Salmonella wytwarzaj odmienne łacuchy O-swoiste i wywołuj syntez rónych przeciwciał. Z kilkoma wyjtkami, enzymy odpowiedzialne za biosyntez tej czci LPS s kodowane przez geny zlokalizowane w regionie wba (zwanym dawniej rfb) chromosomu bakteryjnego (45 minuta na mapie genetycznej S. Typhimurium LT2), w pobliu genu his kodujcego histydyn [335]. Koduj one enzymy wymagane do syntezy cukrowych prekursorów antygenu O, ich polimeryzacji oraz transportu do miejsca ligacji. Rónorodno struktur O- polisacharydowych jest zwizana z czstym polimorfizmem regionu wba. Struktury determinowane przez geny strukturalne mog podlega rónym modyfikacjom. Geny odpowiedzialne za te modyfikacje nie s sprzone i wystpuj poza głównymi loci genów uczestniczcych w biosyntezie LPS. Do czsto spotykane modyfikacje u Salmonella to O-acetylacja abekwozy (efekt ekspresji genu oafa) wród szczepów z grupy O:4 (dawniej grupa B), powodujca zamian faktora O:4 na O:5 oraz glikozylacja galaktozy (wynik działania genu oafr) czsto obecna w grupach O:2 (dawniej grupa A), O:4 (B) i O:9 (dawniej grupa D 1 ), warunkujca pojawienie si antygenu czstkowego 12 2 (ryc. 4) [148, 236].