Tok badania bakteriologicznego. Klasyczne metody stosowane w diagnostyce bakteriologicznej. (identyfikacja bakterii i oznaczanie lekowrażliwości).

Transkrypt

1 Tok badania bakteriologicznego. Klasyczne metody stosowane w diagnostyce bakteriologicznej. (identyfikacja bakterii i oznaczanie lekowrażliwości). mgr Michał Piotrowski Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej WUM

2 DIAGNOSTYKA MIKROBIOLOGICZNA Identyfikacja czynnika etiologicznego Określenie lekowrażliwości Nadzór epidemiologiczny zakażeń

3 POBIERANIE MATERIAŁÓW DO BADANIA MIKROBIOLOGICZNEGO Materiał powinen być adekwatny do toczącego się procesu chorobowego. Ilość materiału powinna być wystarczająca do przeprowadzenia badania. Materiał powinien być pobrany przed antybiotykoterapią. Materiał powinien być oznakowany i zaopatrzony w odpowiednią dokumentację.

4 RODZAJE MATERIAŁÓW KLINICZYCH DO BADANIA Wymazy: błony śluzowe, oczy, odbyt, szyjka macicy, cewka moczowa, rany Mocz, kał Krew, płyn mózgowo-rdzeniowy Płyn opłucnowy, płyn otrzewnowy, plwocina Bioptaty, wycinki Aspiraty z ropni

5 METODY DIAGNOSTYCZNE BEZPOŚREDNIE Wykrycie drobnoustroju lub jego fragmentu POŚREDNIE Wykrycie swoistych przeciwciał w surowicy lub płynach ustrojowych HODOWLANE Wykrywanie drobnoustroju: Namnażanie, izolacja, identyfikacja, oznaczenie lekowrażliwości NIEHODOWLANE Mikroskopia bezpośrednia Wykrywanie białek, toksyn, kwasów nukleinowych

6 BADANIE MIKROSKOPOWE PREPARAT BEZPOŚREDNI - preparat wykonany bezpośrednio z materiału klinicznego pobranego od pacjenta Preparat wykonany z wyhodowanych na podłożach czystych kolonii

7 PREPARAT BEZPOŚREDNI Wykonujemy obowiązkowo z następujących materiałów klinicznych: wydzielina z kanału szyjki macicy, pochwy, cewki moczowej płyn mózgowo-rdzeniowy plwocina, BAL, aspiraty z oskrzeli i płuc wymazy z oka płyn z opłucnej, otrzewnej

8 PREPARAT BEZPOŚREDNI Nie wykonujemy z następujących materiałów klinicznych: Wymaz z gardła Wyjątek: podejrzenie anginy Plauta-Vincenta lub zakażenia grzybiczego Kał Wyjątek: kał od nowordków, Podejrzenie kampylobakteriozy lub cholery

9 ROLA PREPARATU BEZPOŚREDNIEGO Metoda szybka i tania W próbce pochodzącej z jałowych materiałów klinicznych będzie się znajdować tylko czynnik etiologiczny Możliwość różnicowania na bakterie Gram + i Gram Rozpoznanie kształtu i układu komórek bakteryjnych Można w nim zauważyć bakterie gdy ich liczba wynosi CFU/mL materiału klinicznego

10 HODOWLA DROBNOUSTROJÓW Podłoże bakteriologiczne Atmosfera gazowa: bezwzględne tlenowce, względne beztlenowce, bezwzględne beztlenowce, mikroaerofilne Temperatura 35 C-37 C, 26 C-30 C Ciśnienie osmotyczno izotoniczne 0,9% NaCl ph 6,8 7,5 Czas 24h-48h, dni, tygodnie

11 POSIEW REDUKCYJNY Jest wykonywany w celu otrzymania pojedyńczej kolonii drobnoustroju.

12 RODZAJE PODŁOŻY BAKTERIOLOGICZNYCH WYBIÓRCZO NAMNAŻAJĄCE WYBIÓRCZO RÓŻNICUJĄCE Pożywka SF Bulion z żółcią Podłoże Chapmana Podłoże MacConkeya Podłoże SS Podłoże Wilsona-Blaira

13 PODŁOŻE CHAPMANA Czynnik wybiórczy 7,5 10% NaCl Czynnik różnicujący mannitol Wskaźnik czerwień fenolowa Szczepy rozkładające mannitol zmieniają zabarwienie podłoża na żółte, szczepy nie rozkładające mannitolu nie powodują zmiany barwy pożywki.

14 PODŁOŻE MACCONKEYA Czynnik wybiórczy sole żółciowe, fiolet krystaliczny Czynnik różnicujący laktoza Wskaźnik czerwień obojętna Bakterie rozkładające laktozę tworzą różowo zabarwione kolonie, natomiast nie rozkładające pozostają niewybarwione

15 PODŁOŻE MACCONKEYA Laktozo dodatnie Np. Escherichia, Klebsiella Laktozo ujemne Np. Salmonella, Shigella

16 HODOWLA I IDENTYFIKACJA DROBNOUSTROJÓW NA PODSTAWIE CECH BIOCHEMICZNYCH Testy API Zautomatyzowany system Vitek

17 PRÓBA NA KATALAZĘ Katalaza jest enzymem, który rozkłada toksyczny dla komórki H 2 O 2 do H 2 O i tlenu. Na szkiełko podstawowe należy nanieść kroplę 3% roztworu H 2 O 2 i zawiesić w niej pobraną kolonię; pęcherzyki gazu wskazują na obecność katalazy. + Staphylococcus Micrococcus Listeria Enterobacteriacea - Streptococcus Enterococcus Lactococcus

18 METODY SEROLOGICZNE Odczyny immunologiczne: Precypitacji Aglutynacji Immunofluorescencji Immunoenzymatyczne (ELISA)

19 Przykład lateks wieloważny dla pałeczek rodzaju Salmonella Bakterie Salmonella posiadają antygeny somatyczne (O), otoczkowe (Vi) oraz rzęskowe (H). Ich identyfikacja jest niezbędna do prawidłowego serologicznego zakwalifikowania badanego szczepu.

20 Surowice zawierają przeciwciała przeciwko specyficznym antygenom somatycznym lub rzęskowym. Aglutynacja szkiełkowa przebiega na zasadzie przyłączania się przeciwciał do antygenów bakterii i tworzenia tzw. agregatów/strątów które są widoczne gołym okiem.

21 Rodzaj Salmonella podzielony jest na dwa gatunki: 1. Salmonella enterica, w obrębie którego wyróżniono sześć podgatunków (subspecies): S. enterica subsp. enterica (przykładowe serowary: Typhimurium, London, Paratyphi B, Typhi, Enteritidis, Hadar, Mbandaka, Newport) S. enterica subsp. salamae S. enterica subsp. Arizonae S. enterica subsp. diarizonae S. enterica subsp. houtenae S. enterica subsp. indica 2. Salmonella bongori.

22 Paciorkowce Grupy serologiczne wg schematu Lancefield Podział paciorkowców ze względu na wytwarzanie wielocukru C. Wielocukier ten różni się w zależności od gatunku bakterii. A - S. pyogenes, nieliczne szczepy S. anginosus i S. constelatus B - S. agalactiae C - S. dysgalactiae subsp. equisimilis D - S. bovis (=equinus), Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Paciorkowce nie wytwarzające wielocukru C to między innymi: S. pneumoniae S. mitis S. thermopohilus

23 METODA IMMUNOENZYMATYCZNA ELISA Łączenie się antygenu ze specyficznym przeciwciałem (reakcja antygen-przeciwciało) uwidacznia reakcja barwna, powstająca dzięki odpowiednim enzymom.

24 OZNACZANIE LOKOWRAŻLIWOŚCI Metoda jakościowa dyfuzyjno krążkowa

25 OZNACZANIE LOKOWRAŻLIWOŚCI Metody ilościowe: E-test Seryjne rozcieńczenia w podłożu Vitek

26 MIC - minimalne stężenie hamujące najmniejsze stężenie środka bakteriobójczego hamujące wzrost drobnoustrojów MBC - minimalne stężenie hamujące najmniejsze stężenie środka bakteriobójczego przy którym ginie 99,9% drobnoustrojów

27 METODY MOLEKULARNE Poszukiwanie kwasów nukleinowych w materiale klinicznym lub hodowli drobnoustrojów Metoda PCR

28 SPEKTROMETRIA MASOWA MALDI- TOF Impuls laserowy po dotarciu do materiału matrycy, która zawiera badana próbkę wywołuje zjawisko desorpcji i jonizacji, w wyniku czego powstają duże dodatnio naładowane jony, które oddalają się w kierunku detektora masowego. Pomiar masy cząsteczkowej analizowanego związku odbywa się w spektrometrze masowym (MS). Detektor ten został zmodyfikowany i w technice MALDI mierzy czas przelotu jonów Tof (ang. time of flight) Ostatecznym rezultatem analizy MALDI-ToF-MS jest otrzymanie widma spektrometrycznego, na którym widoczne są sygnały od mas powstałych jonów

29 SZCZEPY ALARMOWE 1. Gronkowiec złocisty (Staphylococcus aureus) oporny na metycylinę (MRSA) lub glikopeptydy (VISA lub VRSA) lub oksazolidynony. 2. Enterokoki (Enterococcus spp.) oporne na glikopeptydy (VRE) lub oksazolidynony. 3. Pałeczki Gram-ujemne Enterobacteriaceae spp. wytwarzające betalaktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym (np. ESBL,AMPc,KPC) lub oporne na karbapenemy lub inne dwie grupy leków lub polimyksyny. 4. Pałeczka ropy błękitnej (Pseudomonas aeruginosa) oporna na karbapenemy lub inne dwie grupy leków lub polimyksyny. 5. Pałeczki niefermentujące z rodzaju Acinetobacter spp. oporne na karbapenemy lub inne dwie grupy leków lub polimyksyny. 6. Szczepy chorobotwórcze laseczki beztlenowej Clostridium difficile oraz wytwarzane przez nie toksyny A i B. 7. Laseczka beztlenowa Clostridium perfringens. 8. Dwoinka zapalenie płuc (Streptococcus pneumoniae) oporna na cefalosporyny III generacji lub penicylinę.

30 9. Grzyby Candida oporne na flukonazol lub inne leki z grupy azoli lub kandyn. 10. Grzyby Aspergillus. 11. Rotawirus (rotavirus). 12. Norowirus (norovirus). 13. Wirus syncytialny (RSV) 14. Wirus zapalenia wątroby typu B 15. Wirus zapalenia wątroby typu C. 16. Wirus nabytego niedoboru odporności u ludzi (HIV). 17. Biologiczne czynniki chorobotwórcze izolowane z krwi lub płynu mózgowo-rdzeniowego, odpowiedzialne za uogólnione lub inwazyjne zakażenia