Produkcja kwasu fumarowego na drodze mikrobiologicznej oraz potencjalne możliwości jego wykorzystania

Transkrypt

1 Produkcja kwasu fumarowego na drodze mikrobiologicznej oraz potencjalne możliwości jego wykorzystania Sylwia Kowalczyk Katedra Biotechnologii, Żywienia Człowieka i Towaroznawstwa Żywności, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie Słowa kluczowe: kwas fumarowy, fermentacja, Rhizopus Wstęp W 1817 roku, dwaj niezależni naukowcy, Braconnet i Vauquelin, w wyniku przeprowadzonego procesu suchej destylacji kwasu jabłkowego, odkryli kwasy: fumarowy i maleinowy (Goldberg, Rokem i Pines, 2006). Kwas fumarowy (kwas trans-1,2-etylenodikarboksylowy; kwas (E)-2-butenodiowy) to naturalnie występujący kwas organiczny, wyizolowany po raz pierwszy z rośliny Fumaria officinalis, od której wziął swoją nazwę (Roa Engel i in., 2008). Kwas fumarowy jest czterowęglowym, nienasyconym kwasem dikarboksylowym, wytwarzanym przez wiele mikroorganizmów, jako produkt pośredni cyklu kwasu cytrynowego (cyklu Krebsa). Określany często jako fumaran, gdyż występuje zazwyczaj w postaci soli (fumaran wapnia, czy fumaran sodu) (Fu i in., 2010; Liao i in., 2008; Roa Engel i in., 2008). Kwas fumarowy charakteryzuje się niską rozpuszczalnością w wodzie (7g/kg w temperaturze 25 C; 89 g/kg w temperaturze 100 C) oraz niską wartością pk a (3,03 oraz 4,44). Powyższe właściwości mogą być wykorzystane przy odzyskiwaniu tego kwasu (Roa Engel i in., 2008). Kwas fumarowy został zidentyfikowany jako jedna z tzw. 12 substancji chemicznych, produkowanych na drodze fermentacji przemysłowej. (Yu i in., 2012; Sauer i in., 2008). Niektóre kwasy organiczne, w tym interesujący nas kwas fumarowy, wytwarzane są na skalę przemysłową przez grzyby. Zaletą wykorzystania grzybów jest przede wszystkim łatwość oddzielenia wytworzonej biomasy od płynu pohodowlanego, za pomocą nieskomplikowanych i stosunkowo niedrogich metod filtracyjnych. Wytwarzanie kwasów w skali laboratoryjnej lub przemysłowej jest wynikiem nadmiaru węglowodanów oraz pewnej dezorganizacji metabolizmu, wzmacnianej przez brak pierwiastków śladowych w podłożu wzrostowym. W wielu przypadkach, wykluczając pojedynczy pierwiastek z podłoża wzrostowego grzyba, możemy zaindukować akumulację jakiegoś związku pośredniego, np. kwasu fumarowego. Prawdopodobnie jest to spowodowane błędną regulacją metabolizmu i określane zjawiskiem metabolizmu nadmiaru (Schlegel, 2000).

2 Szlaki metaboliczne Kwas fumarowy jest związkiem pośrednim cyklu kwasu cytrynowego (TCA), nie jest to jednak główna droga jego otrzymywania. Głównym szlakiem produkcji fumaranu jest bowiem redukcyjna karboksylacja pirogronianu (pirogronian szczawiooctan maleinian fumaran) (rys. 4), a enzymy biorące w niej udział, w przeciwieństwie do mitochondrialnych enzymów cyklu Krebsa, zlokalizowane są w cytoplazmie. Alternatywny szlak umożliwia wykorzystanie czterowęglowych związków pośrednich cyklu Krebsa do biosyntezy, podczas fazy wzrostu w warunkach tlenowych. W momencie, gdy dostępność azotu jest limitowana i wzrost ustaje, metabolizm źródła węgla i wiązanie CO 2 są kontynuowane i prowadzą do akumulacji kwasów C 4 czyli m. in.: kwasu fumarowego (Roa Engel i in., 2008). Rys. 1. Szlaki metaboliczne syntezy kwasu fumarowego (Roa Engel i in., 2008)

3 Biosynteza kwasu fumarowego- fizjologia i warunki wzrostu Kwas fumarowy, podobnie jak kwas jabłkowy, nie jest syntetyzowany i akumulowany w normalnych warunkach wzrostu. Dopiero czynnik stresowy (określone warunki stresowe, np. nadmiar źródła węgla i/lub ograniczenie źródła azotu), skłania mikroorganizmy do gromadzenia pośrednich produktów cyklu Krebsa (kwasu fumarowego, jabłkowego) jako produktów końcowych (Goldberg, Rokem i Pines, 2006; Friedberg i in., 1995). Podczas właściwego procesu fermentacji, grzyby z rodzaju Rhizopus wchodzą w fazę ograniczonego wzrostu (ograniczenie źródła azotu w podłożu hodowlanym). Jeżeli ograniczenie źródła azotu nie jest pożądane, wówczas można zastosować ograniczenie źródła fosforu (Roa Engel i in., 2008; Riscaldati i in., 2000). Produkcja kwasu fumarowego na drodze fermentacji mikrobiologicznej, w neutralnym ph, prowadzi do uzyskania soli kwasu fumarowego (fumaranów). Kwas fumarowy jest precypitowany z płynu pohodowlanego (np. za pomocą węglanu wapnia), a następnie odzyskiwany przez zakwaszenie środowiska hodowlanego. Niemniej jednak proces ten prowadzi do wysokiego zużycia zasady (kontrola ph procesu fermentacji) i kwasu (odzyskiwanie produktu), a w konsekwencji do wytworzenia dużych ilości niepotrzebnych soli (Roa Engel i in., 2011; Roa Engel i in., 2008). Sytuacja może ulec poprawie, gdy proces fermentacji jest prowadzony w niższym ph, gdzie większość stanowi niezdysocjowany kwas fumarowy i jego sole monowodorowe. Niezdysocjowany kwas fumarowy ma niską rozpuszczalność, co umożliwia jego precypitację z płynu pofermentacyjnego poprzez krystalizację (Roa Engel i in., 2011). Kolejnym, równie ważnym aspektem, jest dostarczenie CO 2, który jest wykorzystywany w czasie wytwarzania kwasu fumarowego (karboksylacja pirogronianu). Zazwyczaj CO 2 jest dostarczany do podłoża w postaci soli węglanowych (np. CaCO 3, Na 2 CO 3 ) ale powszechnie wiadomo, że powietrze wzbogacone dwutlenkiem węgla również przyczynia się do produkcji kwasu fumarowego na drodze fermentacji, prowadzonej przez grzyby z rodzaju Rhizopus (Roa Engel i in., 2011; Zhou, Du i Tsao, 2000). Preferowaną formą morfologiczną grzybów z rodzaju Rhizopus, w procesach przemysłowej fermentacji, są pellety. Wielkość pelletów powinna być utrzymywana poniżej pewnej krytycznej wartości, tak by zapobiec ograniczeniom dostępu tlenu, co mogłoby przyczyniać się do obniżenia wydajności produkcji (Roa Engel i in., 2011; Zhou, Du i Tsao, 2000). Usunięcie biomasy komórkowej, po zakończonym procesie fermentacji, jest łatwiejsze jeśli mamy do czynienia z formą pelletu. Poza tym, parametry hodowli takie jak ph, warunki hydrodynamiczne (objętość robocza, szybkość wytrząsania), znacząco wpływają na formę wzrostu grzybni, a tym samym na zdolność syntezy kwasu fumarowego (Roa Engel i in., 2011). Metody otrzymywania kwasu fumarowego Produkcja kwasu fumarowego, na drodze mikrobiologicznej, funkcjonowała w Stanach Zjednoczonych w latach 40-tych. Jednak z biegiem czasu proces ten został zastąpiony przez syntezę chemiczną, przy wykorzystaniu surowców, pochodzących z przemysłu petrochemicznego.

4 Obecnie, kwas fumarowy, produkowany jest metodą chemiczną z bezwodnika kwasu maleinowego, a ten z kolei uzyskiwany jest z butanu. Rosnące ceny ropy naftowej powodują wzrost cen produktów ropopochodnych, w tym wspomnianego już bezwodnika kwasu maleinowego (Yu i in., 2012; Huang i in., 2010; Anonymous, 2007). Dlatego też wytwarzanie kwasu fumarowego, na drodze syntezy mikrobiologicznej, ponownie zaczęła wzbudzać zainteresowanie (Roa Engel i in., 2008; Goldberg, Rokem i Pines, 2006). Synteza kwasu fumarowego z udziałem mikroorganizmów Istnieje wiele aspektów determinujących wydajność produkcji kwasu fumarowego w procesie fermentacji mikrobiologicznej. Są to m.in.: typ mikroorganizmu i jego morfologia, rodzaj czynnika neutralizującego, czy zastosowany surowiec (Roa Engel i in., 2008). Kwas fumarowy produkowany jest na drodze syntezy mikrobiologicznej przez grzyby należące do Mucorales, co stanowiło i stanowi przedmiot wielu badań (Cao i in., 1997; Du i in., 1997; Gangl, Weigand i Keller, 1990; Kenealy, Zaady i Du preez, 1986). Zidentyfikowano następujące rodzaje mikroorganizmów, wytwarzających kwas fumarowy: Rhizopus, Mucor, Cunnighamella i Circinella, wśród których szczepy Rhizopus (nigricans, arrhizus, oryzae i formosa) okazały się najlepszymi producentami, zarówno w warunkach tlenowych jak i beztlenowych (Fu i in., 2010; Roa Engel i in., 2008; Carta i in., 1999; Cao i in., 1996). Uzyskana w tym procesie biomasa, charakteryzuje się stosunkowo dużą zawartością chityny (10-90%). Zatem, podczas jednego procesu produkcyjnego (procesu fermentacji), możliwa jest koprodukcja kwasu fumarowego i chityny (Liao i in., 2008). Synteza kwasu fumarowego, prowadzona przez grzyby z rodzaju Rhizopus, jest limitowana przez azot. Obecność azotu prowadzi do zwiększonego wzrostu grzybni kosztem produkcji kwasu fumarowego. Dlatego większość fermentacyjnych procesów syntezy kwasu fumarowego składa się z trzech etapów: hodowla starterowa (seed culture), hodowla biomasy grzyba na podłożu z azotem, produkcja kwasu fumarowego z ograniczonym źródłem azotu (Liao i in., 2008; Zhou i in., 2002; Kenealy i in., 1986). Jednakże zastosowanie grzybów do wytwarzania kwasu fumarowego na drodze fermentacji, niesie ze sobą pewne utrudnienia. Grzybnia Rhizopus, ma tendencję do zbijania się, porastania ścian bioreaktora i mieszadła, utrudniając wymianę i transport tlenu oraz sprawiając, że fermentacyjny proces produkcji kwasów organicznych nie przynosi zadowalających efektów (Huang i in., 2010; Yin i in., 1998). Wydajność mikrobiologicznej syntezy można poprawić poprzez dążenie do uzyskania morfologicznie korzystnej formy grzybni w formie pelletów (Huang i in., 2010; Liao i in., 2008). Czynniki neutralizujące Grzyby, jako potencjalni producenci kwasów organicznych, nie są w stanie tolerować wysokiej kwasowości środowiska hodowlanego, dlatego zarówno wzrost jak i właściwa produkcja są znacznie większe w obecności czynników neutralizujących (Zhou, Du i Tsao, 2002). Ciągła neutralizacja ph ma kluczowe znaczenie dla uzyskania optymalnej produkcji kwasu fumarowego na drodze fermentacji mikrobiologicznej. W warunkach tlenowych, w środowisku zawierającym wysokie stężenia źródła węgla, przy jednoczesnym ograniczeniu

5 ilości azotu, Rhizopus syntetyzuje duże ilości kwasu fumarowego oraz niewielkie ilości kwasu jabłkowego i bursztynowego. W momencie gdy kwaśne metabolity zaczynają gromadzić się w podłożu, ph hodowli zaczyna spadać, stopniowo hamując produkcję kwasu fumarowego. Istnieje zatem konieczność stosowania czynników neutralizujących, które zapobiegają zjawisku autoinhibicji (nagromadzony kwas fumarowy wpływa hamująco na dalsze jego wytwarzanie) (Roa Engel i in., 2008; Riscaldati i in., 2000). CaCO 3 jako czynnik neutralizujący Najczęściej stosowanym środkiem neutralizującym jest CaCO 3. Ma jednak zasadniczą wadę, mianowicie rozpuszczalność fumaranu wapnia nie jest na tyle wysoka, by można było mówić o opłacalności ekonomicznej, czyli uzyskiwaniu pożądanego stężenia tej soli. W temperaturze 30 C rozpuszczalność fumaranu wapnia wynosi 21 g/l (Zhou, Du i Tsao, 2002; Gangl, Weigand i Keller, 1990). Wytrącanie fumaranu wapnia w pożywce fermentacyjnej skutkuje zwiększeniem lepkości podłoża oraz ograniczeniem dyfuzji tlenu i substratów do wnętrza komórek grzyba. W efekcie obecność nierozpuszczalnych kryształów fumaranu wapnia zwiększa zużycie energii w późniejszych etapach fermentacji. Proces odzyskiwania kwasu fumarowego polega na dodaniu kwasu mineralnego (np. HCl lub HNO 3 ), który zapewnia uzyskanie nieorganicznej soli wapnia, oraz ogrzaniu roztworu. Kwas fumarowy krystalizuje się z pożywki fermentacyjnej. Stosowanie CaCO 3 jako czynnika neutralizującego, dodatkowo zapewnia kontrolę ph (węglan wapnia stabilizuje ph środowiska hodowlanego) (Zhou, Du i Tsao, 2002). Przeanalizowano również (Zhou i in., 2002; Riscaldati i in., 2000; Gangl, Weigand i Keller, 1990) inne związki, które mogłyby zastąpić CaCO 3 (np.: Na 2 CO 3, NaHCO 3, Ca(OH) 2, (NH 4 ) 2 CO 3 ) w procesie mikrobiologicznej fermentacji (Roa Engel i in., 2008). NaHCO 3 / Na 2 CO 3 jako czynnik neutralizujący Biosynteza kwasu fumarowego, przy zastosowaniu NaHCO 3 /Na 2 CO 3 jako czynnika neutralizującego jest znacznie niższa niż w przypadku stosowania CaCO 3. Ze względu na dobrą rozpuszczalność fumaranu sodu (fumaran sodu, ma wyższą rozpuszczalność niż fumaran wapnia), pellety grzyba mogą być łatwo oddzielone od pożywki fermentacyjnej. Poza tym grzybnia może być wykorzystana podczas następnej hodowli fermentacyjnej. Pozwala to zwiększyć wydajność całego procesu oraz ilość uzyskanego kwasu fumarowego. Ponadto, niska rozpuszczalność kwasu fumarowego (0,7% w/v) sprawia, że może być on łatwo odzyskany z soli (fumaranu) poprzez zakwaszenie. Dlatego też stosując NaHCO 3 / Na 2 CO 3, znacznie upraszczamy proces dalszej obróbki (mniej sprzętu i brak konieczności ogrzewania). Korzyści te rekompensują wady, wynikające ze stosowania NaHCO 3 / Na 2 CO 3, mianowicie nieco wyższe koszta i mniejsza wydajność wytwarzania kwasu fumarowego, w porównaniu do stosowania CaCO 3 (Zhou, Du i Tsao, 2002; Gangl, Weigand i Keller, 1990).

6 Zatem, NaHCO 3 / Na 2 CO 3 może być używany jako alternatywny środek neutralizujący i zastępować CaCO 3 w procesie produkcji kwasu fumarowego na drodze fermentacji mikrobiologicznej (Zhou, Du i Tsao, 2002). Ca(OH) 2 jako czynnik neutralizujący Wydajność produkcji kwasu fumarowego jest ok. trzykrotnie niższa w porównaniu do stosowania CaCO 3, z tego względu, że w przypadku CaCO 3, w pożywce znajduje się więcej rozpuszczonego dwutlenku węgla, dostępnego dla grzyba. To z kolei potwierdza teorię, iż stała produkcja kwasu fumarowego przez grzyby z rodzaju Rhizopus jest możliwa w obecności CO 2. Pomimo, że Ca(OH) 2 jest o wiele tańszy, nie jest dobrym zamiennikiem dla CaCO 3 (Zhou, Du i Tsao, 2002). (NH 4 ) 2 CO 3 jako czynnik neutralizujący Produkcja fumaranu amonu przy zastosowaniu (NH 4 ) 2 CO 3, jako środka neutralizującego, musi być prowadzona w podłożu z ograniczonym źródłem fosforu (ograniczenie fosforu wydaje się być kluczowym czynnikiem kontrolującym wzrost grzybni podczas produkcji fumaranu amonu) (Roa Engel i in., 2008; Riscaldati i in., 2000). Wydajność i produktywność kwasu fumarowego, uzyskana przy stosowaniu (NH 4 ) 2 CO 3 jako czynnika neutralizującego, jest porównywalna z wartościami, uzyskanymi przy użyciu CaCO 3 (Federici i in., 1993). Ponadto większa rozpuszczalność fumaranu amonu w stosunku do fumaranu wapnia nie powoduje autoinhibicji. Reasumując, (NH 4 ) 2 CO 3 jest skutecznym i wygodnym w użyciu środkiem neutralizującym do bezpośredniej syntezy fumaranu amonu (Riscaldati i in., 2000). Fermentacja, przebiegająca bez użycia środków neutralizujących, a jednocześnie zapobieganie hamowaniu własnym produktem, przyczynia się do poprawy ekonomiki omawianego procesu (Gangl, Weigand i Keller, 1990). Zastosowanie kwasu fumarowego Kwas fumarowy znalazł zastosowanie w różnych gałęziach przemysłu. Stosowany jest w przemyśle spożywczym jako naturalny środek konserwujący i zakwaszający (dodawany do wyrobów piekarniczych, deserów, rozpuszczalnych, sproszkowanych herbat, gum do żucia, napojów owocowych), oznaczony symbolem E297. Ze względu na swoją strukturę, dwie grupy karboksylowe oraz podwójne wiązanie, jest dogodnym substratem w reakcjach polimeryzacji czy estryfikacji. Zastosowanie kwasu fumarowego, jako surowca w produkcji żywic poliestrowych, papierowych, czy alkilowych, zapewnia nietoksyczność i większą twardość uzyskiwanych polimerów (Roa Engel i in., 2008; Riscaldati i in., 2000). Kwas fumarowy wykorzystywany jest również w przemyśle chemicznym do produkcji farb, lakierów, olei nawilżających, tuszów, odczynników karboksylujących czy kosmetyków. W medycynie stosowany jest do leczenia łuszczycy (choroby skóry). Osoby, cierpiące na łuszczycę nie są w stanie produkować kwasu fumarowego w swoim organizmie (co ma

7 miejsce w przypadku osób zdrowych), ze względu na pewne zaburzenia biochemiczne. Dlatego też zmuszone są przyjmować doustnie kwas fumarowy w postaci estrów monoetylowych i dimetylowych (Roa Engel i in., 2008). Estry kwasu fumarowego były stosowane w leczeniu łuszczycy już od 1959 roku. Uznawane są za bezpieczne, skuteczne i dobrze tolerowane przez ludzki organizm (Brewer i Rogers, 2007). Kwas fumarowy znalazł również zastosowanie jako dodatek do pasz dla bydła (Roa Engel i in., 2008). Ponadto wykorzystywany jest jako surowiec do produkcji kwasu asparaginowego, przy wykorzystaniu immobilizowanych komórek bakterii E.coli, o wysokiej aktywności enzymu aspartazy (kwas fumarowy, pod wpływem działania aspartazy zostaje przekształcony do kwasu L-asparaginowego). Kwas L-asparaginowy z kolei jest stosowany do otrzymywania aspartamu (peptydowego słodzika). Jest więc wysoce prawdopodobne, iż dostępność wytwarzanego metodami biotechnologicznymi kwasu fumarowego, spotkałaby się z pozytywnym odbiorem przez konsumentów jako, że aspartam byłby wówczas biologicznego pochodzenia, a to z kolei mogłoby zwiększyć jego dotychczasowe wykorzystanie (Goldberg, Rokem i Pines, 2006; Riscaldati i in., 2002; Riscaldati i in., 2000). Rys. 2. Kwas fumarowy - zastosowanie (za: Roa Engel C.A. i in., 2008) Rosnące ceny surowców kopalnianych, sprawiają, że produkcja kwasu fumarowego na drodze fermentacji mikrobiologicznej, może w niedalekiej przyszłości, stać się tańszą alternatywą,

8 W oparciu o dostępną literaturę, mikroorganizmem o najwyższej produktywności kwasu fumarowego jest Rhizopus oryzae. Mikroorganizm ten wytwarza kwas fumarowy, dzięki połączeniu cyklu kwasu cytrynowego i redukcyjnej karboksylacji pirogronianu. Zmniejszenie lub całkowite wyeliminowanie środków neutralizujących oraz zoptymalizowanie morfologii tych grzybów, mogłoby wpłynąć na poprawę wydajności produkcji kwasu fumarowego. Należy jednak pamiętać, iż zaprzestanie stosowania środka neutralizującego będzie prowadzić do pojawiania się zjawiska autoinhbicji (hamowania własnym produktem). Sposobem rozwiązania tego problemu może być usuwanie in situ kwasu fumarowego w trakcie trwania procesu fermentacji (Roa Engel i in., 2008). Literatura 1. Anonymous, Product focus : Maleic anhydride. Chem Week Brewer L., Rogers S., Fumaric acid esters in the management of severe psoriasis. Clinical and Experimental Dermatology 32, Cao N.J.,, Du J.X.,, Gong C.S., Tsao G.T., Simultaneous production and recovery of fumaric acid from immobilized Rhizopus oryzae with a rotary biofilm contactor and an adsorption column. Appl. Environ. Microbiol. 62: Cao N., Du J., Chen C., Gong C.S., Tsao G.T., Production of fumaric acid by immobilized Rhizopus using rotary biofilm contactor. Appl. Biochem. Biotechnol. 63(65): Carta F.S., Soccol C.R., Ramos L.P., Fontana J.D., Production of fumaric acid by fermentation of enzymatic hydrolysates derived from cassava bagasse. Bioresource Technol. 68: Du J., Cao N., Gong C.S., Tsao G.T., Yuan N., Fumaric acid production in airlift loop reactor with porus sparger. Appl. Biochem. Biotechnol. 63: Federici F., Moresi M., Parente E., Petruccioli M., Piccioni P., Effect of stirring rate and neutralising agent on fumaric acid production by Rhizopus arrhizus. Ital. J. Food Sci. 4: Friedberg D., Peleg Y., Monsonego A., Maissi S., Battat E., Rokem J.S., Goldberg I., The fumr gene encoding fumarase in the filamentous fungus Rhizopus oryzae: cloning, structure and expression. Gene 163:

9 9. FuY-Q., Xu Q., Li S., Chen Y., Huang H., Strain improvement of Rhizopus oryzae for over-production of fumaric acid by reducing ethanol synthesis pathway. Korean J. Chem. Eng. 27(1), Gangl I.C., Weigand W.A., Keller F.A., Economic comparison of calcium fumarate and sodium fumarate production by Rhizopus arrhizus. Appl. Biochem. Biotechnol. 24/25: Goldberg I., Rokem J. S., Pines O., Review Organic acids: old metabolites, new themes. J. Chem. Technol. Biotechnol. 81: Huang L., Wei P., Zang R., Xu Z., Cen P., High-throughput screening of highyield colonies of Rhizopus oryzae for enhanced production of fumaric acid. Ann. Microbiol. 60: Kenealy W., Zaady E., Du preez J.C., Biochemical aspects of fumaric acid accumulation by Rhizopus arrhizus. Applied and Environmental Microbiology 52, Liao W., Liu Y., Frear C., Chen S., Co-production of fumaric acid and chitin from a nitrogen-rich lignocellulosic material dairy manure using a pelletized filamentous fungus Rhizopus oryzae ATCC Bioresource Technology 99: Riscaldati E., Moresi M., Federici F., Petruccioli M., Direct ammonium fumarate production by Rhizopus arrhizus under phosphorous limitation. Biotechnology Letters 22: Riscaldati E., Moresi M., Federici F., Petruccioli M., Ammonium fumarate production by free or immobilized Rhizopus arrhizus in bench- and laboratory-scale bioreactors. J. Chem. Technol. Biotechnol. 77: Roa Engel C.A., Straathof A.J.J., Zijlmans T.W., van Gulik W.M., van der Wielen L.A.M., Fumaric acid production by fermentation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 78: Roa Engel C.A, van Gulik W.M., Marang L., van der Wielen L.A.M., Straathof A.J.J., Development of a low ph fermentation strategy for fumaric acid production by Rhizopus oryzae. Enzyme and Microbial Technology 48: Sauer M., Porro D., Mattanovich D., Branduardi P., Microbial production of organic acids: expanding the markets. Trends Biotechnol. 26,

10 20. Schlegel H.G., Mikrobiologia ogólna. PWN, Warszawa. 21. Yin P.M., Yahiro K., Ishigaki T., Park Y., Okabe M., L-(+)- lactic acid production by repeated batch culture of Rhizopus oryzae in air-lift bioreactor. Journal of Fermentation Bioengineering 85, Yu S., Huang D., Wen J., Li S., Chen Y., Jia X., Metabolic profiling of a Rhizopus oryzae fumaric acid production mutant generated by femtosecond laser irradiation. Bioresource Technology. 23. Zhou Y., Du J.X., Tsao G.T., Mycelial pellet formation by Rhizopus oryzae ATCC Appl. Biochem. Biotech : Zhou Y., Du J., Tsao G.T., Comparison of fumaric acid production by Rhizopus oryzae using different neutralizing agents. Bioprocess Biosyst. Eng. 25: