Uniwersytet Warszawski Wydział Biologii. Łukasz Michał Szafron. I. Dysrupcja genu mcma Aspergillus nidulans

Transkrypt

1 Uniwersytet Warszawski Wydział Biologii Łukasz Michał Szafron Nr albumu: I. Dysrupcja genu mcma Aspergillus nidulans II. Analiza wpływu mutacji mcma I70A na regulację katabolizmu argininy u A. nidulans Praca magisterska na kierunku Biotechnologia w zakresie Biologii Molekularnej Praca wykonana pod kierunkiem Dr Agnieszki Dzikowskiej Wydział Biologii Uniwersytetu Warszawskiego Warszawa, listopad 2005

2 Oświadczenie kierującego pracą Oświadczam, że niniejsza praca została przygotowana pod moim kierunkiem i stwierdzam, że spełnia ona warunki do przedstawienia jej w postępowaniu o nadanie tytułu zawodowego. Data Podpis kierującego pracą Oświadczenie autora pracy Świadom odpowiedzialności prawnej oświadczam, że niniejsza praca dyplomowa została napisana przez mnie samodzielnie i nie zawiera treści uzyskanych w sposób niezgodny z obowiązującymi przepisami. Oświadczam również, że przedstawiona praca nie była wcześniej przedmiotem procedur związanych z uzyskaniem tytułu zawodowego w wyższej uczelni. Oświadczam ponadto, że niniejsza wersja pracy jest identyczna z załączoną wersją elektroniczną. Data Podpis autora pracy

3 Dziękuję Panu Prof. Piotrowi Węgleńskiemu za powierzenie mi tematu niniejszej pracy. Dziękuję Pani Dr Agnieszce Dzikowskiej za opiekę promotorską, cierpliwość, fachową pomoc i cenne rady. Dziękuję Pani Danucie Ślepowrońskiej za wyrozumiałość i cierpliwość. Dziękuję wszystkim moim Koleżankom i Kolegom z Zakładu Genetyki UW za pomoc i duchowe wsparcie w chwilach zwątpienia. Szczególne, z serca płynące podziękowania składam moim kochanym rodzicom, których miłość, wsparcie i nieustająca wiara we mnie zawsze pomagały mi przezwyciężać wszelkie trudności i dodawały sił, niezbędnych do realizacji życiowych planów.

4

5 SPIS TREŚCI STRESZCZENIE... 7 WSTĘP Czynniki transkrypcyjne z domeną MADS Budowa czynników transkrypcyjnych z rodziny MADS Roślinne białka MADS stanowią dużą i bardzo różnorodną grupę czynników transkrypcyjnych Białka z domeną MADS wiążą się do specyficznych sekwencji DNA Charakterystyczną cechą czynników transkrypcyjnych typu MADS jest zdolność zaginania cząsteczki DNA Czynniki transkrypcyjne z domeną MADS pełnią w komórkach wiele różnych funkcji Czynnik Mcm1p drożdżowe białko typu MADS Czynnik Mcm1p uczestniczy w kontroli cyklu komórkowego Białko Mcm1p odgrywa kluczową rolę w procesie zmiany typu płciowego u drożdży Czynnik Mcm1p w kompleksie z białkami z grupy ArgRp reguluje metabolizm argininy Regulacja katabolizmu argininy u A. nidulans Wydajna, kilkuetapowa metoda dysrupcji genów u A. nidulans CEL PRACY MATERIAŁY Szczepy Szczepy A. nidulans Szczepy bakterii Escherichia coli Podłoża Podłoża do hodowli A. nidulans Podłoża do hodowli bakterii Antybiotyki i inne uzupełnienia Enzymy Enzymy restrykcyjne Inne enzymy Gotowe zestawy komercyjne Syntetyczne oligonukleotydy i fragmenty cdna Startery do reakcji PCR, wykonanej w celu uzyskania kasety zeo/pyrg do dysrupcji genu mcma na kosmidzie W02D Startery do amplifikacji regionu, otaczającego miejsce dysrupcji genu mcma na kosmidzie W02D Fragmenty cdna Odczynniki chemiczne Plazmidy i kosmid Standardy wielkości Inne materiały... 40

6 METODY Sprawdzanie fenotypu szczepów A. nidulans Otrzymywanie diploidalnego szczepu A. nidulans Otrzymywanie heterokarionu (metoda I) Otrzymywanie heterokarionu (metoda II) Otrzymanie szczepu diploidalnego Izolacja DNA genomowego z A. nidulans Elektroforeza Izolacja plazmidowego DNA z bakterii Precypitacja białek 2,5 M NH 4 Ac Izolacja DNA z żelu agarozowego Hybrydyzacja typu Southern (wg Sambrook i wsp., 1989) Transfer DNA z żelu na filtr nylonowy Prehybrydyzacja i hybrydyzacja Wyznakowanie sondy radioaktywnym izotopem fosforu 32 P Dysrupcja genu mcma na kosmidzie W02D Transformacja bakterii kompetentnych KS272 (pkobeg) kosmidem W02D Przygotowanie bakterii elektrokompetentnych KS272 (pkobeg + W02D09) Przygotowanie kasety zeo/pyrg do dysrupcji genu mcma z A. nidulans Oczyszczanie produktu PCR Transformacja komórek elektrokompetentnych KS272 (pkobeg + W02D09) kasetą dysrupcyjną zeo/pyrg Oznaczanie stężenia białek w ekstrakcie z grzybni A. nidulans Oznaczanie arginazy i OTA u A. nidulans Analiza komputerowa WYNIKI I. Dysrupcja genu mcma A. nidulans Uzyskanie diploidalnego szczepu A. nidulans Otrzymanie heterokarionu Otrzymanie szczepu diploidalnego Kontrola hybrydyzacyjna uzyskanego szczepu diploidalnego A. nidulans Analiza hybrydyzacyjna kosmidu W02D09, zawierającego gen mcma Dysrupcja genu mcma na kosmidzie W02D Transformacja szczepu KS272 (pkobeg) kosmidem W02D Przygotowanie kasety dysrupcyjnej zeo/pyrg Transformacja szczepu KS272 (pkobeg + W02D09) kasetą dysrupcyjną zeo/pyrg Kontrola hybrydyzacyjna kosmidu W02D09 z dysrupcją genu mcma II. Analiza wpływu mutacji mcma I70A na regulację katabolizmu argininy u A. nidulans Analiza wpływu mutacji mcma I70A na indukcję arginazy i OTA przez argininę Analiza wpływu mutacji mcma I70A na wykorzystanie różnych źródeł azotu przez A. nidulans DYSKUSJA I. Dysrupcja genu mcma A. nidulans II. Analiza wpływu mutacji mcma I70A na regulację katabolizmu argininy u A. nidulans LITERATURA... 84

7 STRESZCZENIE STRESZCZENIE Czynniki transkrypcyjne, posiadające domenę MADS, stanowią dużą rodzinę białek, zaangażowanych w regulację wielu istotnych procesów w komórkach eukariotycznych. Sekwencja aminokwasowa domeny MADS jest silnie konserwowana ewolucyjnie. Jedną z najlepiej poznanych funkcji białek MADS jest ich udział w regulacji metabolizmu argininy u drożdży (Saccharomyces cerevisiae). W regulacji tego procesu uczestniczy białkowy kompleks Mcm1p-ArgRp. Dwa z czterech białek, budujących ten kompleks (Mcm1p i ArgRIp) należą do rodziny MADS. Pozostałe dwa to: ArgRIIp (białko z domeną dwujądrowego palca cynkowego (Zn 2 Cys 6 )) oraz ArgRIIIp (spełniające rolę białka opiekuńczego, a ponadto wykazujące aktywność kinazy). W regionach promotorowych genów, związanych z metabolizmem argininy u drożdży, stwierdzono obecność swoistych sekwencji, tzw. UAS arg. Wiadomo, że do sekwencji UAS arg wiążą się białka, tworzące kompleks Mcm1p-ArgRp. U kropidlaka (Aspergillus nidulans), który, tak jak drożdże, jest przedstawicielem workowców (Ascomycetes), w promotorach genów katabolizmu argininy zauważono obecność sekwencji podobnych do UAS arg, które nazwano AnUAS arg. Wiadomo również, że aktywatorem ekspresji tych genów jest białko ARCA. Podobnie jak drożdżowe białko ArgRIIp, posiada ono domenę dwujądrowego palca cynkowego (Zn 2 Cys 6 ) i podobnie jak ArgRIIp in vitro nie wiąże się samo do DNA. W genomie A. nidulans zidentyfikowano dwa geny, kodujące białka z domeną MADS: mcma oraz rlma. Znana jest kompletna sekwencja cdna obu tych genów. Głównym celem niniejszej pracy było określenie funkcji białka MCMA poprzez dysrupcję genu mcma w haploidalnym i diploidalnym szczepie A. nidulans, a następnie określenie fenotypu szczepów z dysrupcją. Zastosowano dwuetapową metodę dysrupcji genów A. nidulans, w której najpierw otrzymuje się dysrupcję badanego genu na kosmidzie, a następnie kosmidem z dysrupcją transformuje się komórki A. nidulans. W niniejszej pracy zidentyfikowano kosmid W02D09, zawierający gen mcma oraz uzyskano dysrupcję genu mcma na tym kosmidzie. Drugim celem tej pracy była analiza wpływu mutacji mcma I70A na regulację katabolizmu argininy u A. nidulans. Wiadomo, że analogiczna mutacja w drożdżowym genie MCM1 wpływa negatywnie na funkcje aktywatorowe białka Mcm1p oraz na jego zdolność do zaginania cząsteczki DNA. Wyniki uzyskane w niniejszej pracy wskazują, że mutacja 7

8 STRESZCZENIE mcma I70A obniża aktywność właściwą arginazy o ok %, zarówno na poziomie podstawowym, jak i po indukcji argininą. Aktywność właściwa transaminazy ornitynowej (OTA) w zmutowanym szczepie również ulega obniżeniu, lecz różnice są mniejsze i nie przekraczają 15%. Ponadto zauważono, że mutacja mcma I70A wpływa negatywnie na tempo wzrostu i konidiowanie A. nidulans. Na podstawie uzyskanych wyników można wnioskować, że białko MCMA odgrywa istotną rolę w regulacji katabolizmu argininy u A. nidulans i że jest też zaangażowane w kontrolę innych procesów fizjologicznych u tego organizmu. Słowa kluczowe Aspergillus nidulans; domena MADS; metabolizm argininy; dysrupcja; gen mcma Dziedzina pracy (kody wg programu Socrates-Erasmus) 13.4 Biotechnologia 8

9 WSTĘP WSTĘP 1. Czynniki transkrypcyjne z domeną MADS Białka z domeną MADS (ang. MADS-box) to liczna rodzina czynników transkrypcyjnych, regulujących wiele ważnych procesów w komórkach eukariotycznych. Białka te są szeroko rozpowszechnione w świecie ożywionym. Można je spotkać zarówno u zwierząt, jak i u roślin i grzybów. Stwierdzono, że domena MADS, mająca kluczowe znaczenie dla aktywności tych czynników transkrypcyjnych, wykazuje duże podobieństwo sekwencji aminokwasowej u organizmów należących do wszystkich królestw eukariotycznych (Alvarez-Buylla i wsp., 2000; Shore i Sharrocks, 1995). Zatem przetrwała w postaci prawie niezmienionej ponad miliard lat ewolucji. Czynniki transkrypcyjne z domeną MADS podzielono na dwie odrębne podrodziny. Do pierwszej zalicza się m.in. ludzki czynnik odpowiedzi na surowicę krwi (SRF) i drożdżowe czynniki transkrypcyjne: Mcm1p oraz ArgRIp (Arg80p). Do tej podrodziny zaklasyfikowano również niektóre roślinne czynniki typu MADS, np. AGL34-like, AGL30 i AGL33, pochodzące z rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana) (Alvarez-Buylla i wsp., 2000). Białka te nazwano czynnikami MADS typu I (SRF-like) (Shore i Sharrocks, 1995). Do drugiej podrodziny należą liczne roślinne czynniki transkrypcyjne, a także niektóre białka zwierzęce, np. MEF2A-D. W literaturze białka te określa się wspólną nazwą MADS II (MEF2-like) (Shore i Sharrocks, 1995; Hasebe i Banks, 1997; Theissen i wsp., 1996). Niektórych czynników transkrypcyjnych, zawierających domenę MADS, nie można zaklasyfikować do żadnej z powyższych grup (Alvarez-Buylla i wsp., 2000; Johansen i wsp., 2002) Budowa czynników transkrypcyjnych z rodziny MADS Nazwa domeny MADS pochodzi od nazw 4 najwcześniej poznanych białek, posiadających tę domenę: drożdżowego Mcm1p, roślinnych AG i DEFA oraz znalezionego w komórkach zwierzęcych SRF (Shore i Sharrocks, 1995). Domena ta jest zbudowana z ok. 80 aminokwasów. Szczególnie silnie konserwowanych jest pierwszych 56 reszt aminokwasowych, licząc od końca N tzw. rdzeń domeny MADS. Wykazano, że sam rdzeń 9

10 WSTĘP domeny MADS ma cechy typowe dla czynników transkrypcyjnych, tzn. jest zdolny do oddziaływania z DNA, dimeryzacji oraz wiązania innych białek kompleksu inicjującego transkrypcję (Norman i wsp., 1988; Chai i Tarnawski, 2002). W obrębie domeny MADS można wyróżnić 2 regiony o odmiennych funkcjach. Region znajdujący się przy końcu N N MADS helisa α Gly Wiązanie DNA Region hydrofobowy Oddziaływania białko - białko Dimeryzacja Region zmienny ma budowę α-helikalną i odpowiada za Rys. 1. Schemat budowy domeny wiążącej DNA, charakterystycznej dla białek z rodziny MADS. wiązanie się czynnika do cząsteczki W regionie zmiennym, położonym na końcu C, zależnie od DNA, a region położony bliżej końca typu białka, może występować domena SAM, MEF2 lub I (szczegóły w tekście). (Rys. wg Shore i Sharrocks, 1995). C jest zbudowany z hydrofobowej β- kartki i uczestniczy w dimeryzacji dwóch białek typu MADS. W miejscu, gdzie stykają się ze sobą oba regiony, występuje silnie konserwowana reszta glicyny. Jej obecność stwierdzono we wszystkich znanych czynnikach transkrypcyjnych typu MADS (Rys. 1) (Sharrocks i wsp., 1993). Lokalizacja domeny MADS w obrębie białka jest zmienna, lecz najczęściej jest ona położona przy końcu N łańcucha aminokwasowego (Norman i wsp., 1988; Shore i Sharrocks, 1995; Chai i Tarnawski, 2002). Udowodniono, że różne białka typu MADS mogą tworzyć struktury homo- bądź heterodimeryczne, np. ludzki SRF potrafi dimeryzować z drożdżowymi czynnikami ArgRIp i Mcm1p, dając z tymi białkami trwałe kompleksy (Mueller i Nordheim, 1991). Z tego powodu region zmienny, położony za domeną MADS, charakterystyczny dla trzech wymienionych białek, nazywany jest czasami domeną SAM (Rys. 2) (Shore i Sharrocks, 1995). Jak się wydaje, precyzyjna kontrola ekspresji wielu genów jest możliwa głównie dzięki temu, że czynniki transkrypcyjne typu MADS nie oddziałują z DNA pojedynczo, lecz tworzą złożone kompleksy z innymi białkami, zwłaszcza że sekwencje DNA rozpoznawane przez różne czynniki MADS są do siebie bardzo podobne (Sprague, 1990; Dolan i Fields, 1991; Treisman i Ammerer, 1992; Mead i wsp., 2002; Dubois i Messenguy, 1991; Messenguy i Dubois, 2000). C 10

11 WSTĘP 1.2. Roślinne białka MADS stanowią dużą i bardzo różnorodną grupę czynników transkrypcyjnych Drożdże (Mcm1p, ArgRIp); Zwierzęta (SRF) Rośliny (AGL30, AGL33, AGL39) Drożdże (Rlm1p, Smp1p); Zwierzęta (MEF2) Roślinne białka: (Agamous, Apetala 1, 3) Rys. 2. Różnice w budowie białek z domeną MADS. (Rys. wg Alvarez-Buylla i wsp., 2000).? budowa domeny znajdującej się na końcu C roślinnych białek MADS typu I jest słabo poznana. Część roślinnych białek z domeną MADS zalicza się do podrodziny pierwszej (MADS I), a inne zaklasyfikowano do podrodziny MADS II. Istnieje też cała grupa czynników transkrypcyjnych, których nie sposób przypisać do żadnej z wymienionych podrodzin (Johansen i wsp., 2002; Alvarez-Buylla i wsp., 2000). Sekwencjonowanie genomu rzodkiewnika (A. thaliana) (Arabidopsis Genome Initiative, 2000), ukończone kilka lat temu, umożliwiło zidentyfikowanie w genomie tego organizmu 107 genów kodujących białka typu MADS. Funkcja 84% z nich nie jest znana (Parenicová i wsp., 2003). Roślinne białka MADS typu II są zbudowane nieco inaczej, niż opisane powyżej białka typu SRF. Przede wszystkim, oprócz domeny MADS, występuje tu często inny konserwowany motyw sekwencji, nazywany domeną K (ang. K-box). Nazwa tej domeny wynika z jej podobieństwa do domeny typu coiled coil ze zwierzęcej keratyny (Shore i Sharrocks, 1995). Domena K jest zbudowana z około 80 reszt aminokwasowych i zapewne uczestniczy w dimeryzacji roślinnych białek typu MADS (Davies i Schwarz-Sommer, 1994). Domeny MADS i K są rozdzielone krótką, 30 aminokwasową sekwencją, którą nazwano regionem I (ang. intervening region) (Rys. 2) (Alvarez-Buylla i wsp., 2000; Johansen i wsp., 2002). Domena MADS jest zwykle położona przy końcu N łańcucha aminokwasowego, domena K leży w środkowej jego części, a motyw, znajdujący się bliżej końca C łańcucha 11

12 WSTĘP aminokwasowego, pełni być może rolę domeny transaktywacyjnej (Riechmann i Meyerowitz, 1997). Ze względu na budowę, roślinnym czynnikom typu MADS nadano wspólną nazwę MIK lub MIKC (Johansen i wsp., 2002). Ostatnio wykazano, że dotychczasowa klasyfikacja roślinnych białek z domeną MADS może być niewystarczająca, dlatego też niektórzy badacze zaczęli je zaliczać do kilku różnych grup: MIKC, Mα, Mβ, Mγ i Mδ (Parenicová i wsp., 2003) Białka z domeną MADS wiążą się do specyficznych sekwencji DNA Sekwencja DNA rozpoznawana przez białka z rodziny MADS ma długość ok. 10 par zasad i znaleziono ją w regionach promotorowych i wzmacniaczach wielu różnych genów (Sprague, 1990; Dolan i Fields, 1991; Treisman, 1990). W przypadku kilku czynników transkrypcyjnych typu MADS udało się ustalić sekwencje najwyższej zgodności dla miejsc, w których wiążą się one z DNA (Pollock i Treisman, 1990; Pollock i Treisman, 1991; Wynne i Treisman, 1992). Na przykład dla SRF wspomniana sekwencja najwyższej zgodności przedstawia się następująco: Litery N w powyższych wzorach oznaczają, że w danej pozycji ze zbliżonym prawdopodobieństwem może wystąpić każdy nukleotyd. Małe litery wskazują, iż prawdopodobieństwo pojawienia się takiej zasady azotowej w opisanym położeniu wynosi 8-24%, czyli jest niższe niż prawdopodobieństwo losowe. Z kolei użycie wielkich liter świadczy o tym, że przedstawiony nukleotyd znaleziono w ponad 30% naturalnych sekwencji wiążących dane białko (Shore i Sharrocks, 1995). Niektórym sekwencjom DNA, rozpoznawanym przez czynniki typu MADS, nadano specyficzne dla nich nazwy, np. sekwencja, do której wiąże się SRF, bywa nazywana sekwencją CArG (ang. CArG-box) lub SRE (ang. Serum Response Element), zaś region wiążący Mcm1p nazwano sekwencją P (ang. P-box) (Shore i Sharrocks, 1995). Sekwencja najwyższej zgodności dla czynników typu MEF2 wygląda nieco inaczej i można ją opisać ogólnym wzorem: CTA(A/T) 4 TAG (Pollock i Treisman, 1991). 12

13 WSTĘP 1.4. Charakterystyczną cechą czynników transkrypcyjnych typu MADS jest zdolność zaginania cząsteczki DNA Zdolność zaginania cząsteczki kwasu nukleinowego zauważono dla różnych czynników transkrypcyjnych (Brown, 2001; Kerppola i Curran, 1997), w tym także dla białek typu MADS (West i wsp., 1997; West i Sharrocks, 1999). Dowiedziono, że zdolność zaginania DNA ma kluczowe znaczenie dla ich funkcji. Stwierdzono też, iż poszczególne białka MADS zaginają DNA w różnym stopniu, wykorzystując do tego celu odmienne mechanizmy (Shore i Sharrocks, 1995; West i Sharrocks, 1999). Wiadomo, że jedne białka z domeną MADS, jak SRF czy Mcm1p, zaginają DNA znacznie silniej niż inne, np. MEF2 (Pellegrini i wsp., 1995; Tan i wsp., 1988; West i wsp., 1997). Co ciekawe, o zdolności zaginania cząsteczki DNA decydują pojedyncze reszty aminokwasowe, położone w obrębie domeny MADS, np. lizyna 154 w SRF (K154) czy też reszta kwasu glutaminowego (E14) w MEF2A (West i wsp., 1997). Na uwagę zasługuje również fakt, że niektóre czynniki typu MADS, np. Mcm1p czy ArgRIp zaginają DNA w różnym stopniu, w zależności od sekwencji nukleotydowej, podczas gdy inne, np. SRF, zaginają tak samo silnie każdą cząsteczkę kwasu nukleinowego (West i Sharrocks, 1999). Jak się wydaje, ma to związek z różnym sposobem oddziaływania tych białek z DNA. Udowodniono, że pewne reszty aminokwasowe silnie konserwowane w SRF i mające kluczowe znaczenie dla jego funkcji (np. lizyna K154), w przypadku białka Mcm1p nie odgrywają tak ważnej roli, choć również występują w sekwencji domeny MADS (West i Sharrocks, 1999) Czynniki transkrypcyjne z domeną MADS pełnią w komórkach wiele różnych funkcji Ustalono, że czynniki transkrypcyjne typu MADS kontrolują proces powstawania kwiatów u roślin wyższych. W tym przypadku spełniają więc funkcję homeotyczną (Schwarz- Sommer i wsp., 1992; Bowman i Meyerowitz, 1991; Bowman i wsp., 1991; Pelaz i wsp., 2000). Inne białka tego typu, występujące u zwierząt i grzybów, są zaangażowane w kontrolę różnych procesów, niejednokrotnie o kluczowym znaczeniu dla całego organizmu (Shore i Sharrocks, 1995). Jednym z najlepiej poznanych i najszerzej opisanych czynników typu MADS jest, występujący w ludzkich komórkach, SRF (ang. Serum Response Factor), czyli czynnik 13

14 WSTĘP odpowiedzi na surowicę krwi. Nazwa upamiętnia sposób, w jaki czynnik odkryto. Było to w 1984 roku (Greenberg i Ziff, 1984; Rollins i Stiles, 1989; Chai i Tarnawski, 2002). Do dziś udało się poznać ok. 30 ssaczych genów, których ekspresja zależy od czynnika SRF. Należą do nich m.in. protoonkogeny: c-fos, fosb, junb, egr1, egr2, geny neuronalne: nurr77 i nurr1, geny kodujące: białko szoku cieplnego: HSP70, liczne białka mięśniowe, np. α-aktynę, ciężkie i lekkie łańcuchy miozynowe, SM22α, telokinę, troponinę, tropomiozynę, kalponinę, dystrofinę, hormon: natriuretyczny czynnik przedsionkowy (ANF) i wiele innych genów (Chai i Tarnawski, 2002). Kolejnym, obecnym u człowieka, białkiem typu MADS jest MEF2 (ang. Myocyte Enhancer Factor 2). W rzeczywistości jest to cała grupa białek (MEF2A-D), należących do podrodziny MADS II. Kontrolują one rozwój mięśni u ssaków (McDermott i wsp., 1993; Martin i wsp., 1994). U drożdży (S. cerevisiae) opisano 4 białka należące do rodziny MADS: Mcm1p, ArgRIp, Rlm1p oraz Smp1p. Białko Rlm1p jest czynnikiem transkrypcyjnym zaangażowanym w kontrolę integralności ściany komórkowej drożdży (Garcia i wsp., 2004), a Smp1p jest zapewne związane z regulacją odpowiedzi komórki na stres osmotyczny (de Nadal i wsp., 2003). Czynniki transkrypcyjne Rlm1p oraz Smp1p zaliczono do podrodziny Rys. 3. Procesy regulowane przez drożdżowe białka z domeną MADS (Mcm1p, ArgRIp, Rlm1p, Smp1p). (Rys. wg Messenguy i Dubois, 2003). 14

15 WSTĘP MEF2-like (Alvarez-Buylla i wsp., 2000). Białka Mcm1p i ArgRIp należą do podrodziny SRF-like i m.in. współuczestniczą w regulacji metabolizmu argininy (Rys. 3). 2. Czynnik Mcm1p drożdżowe białko typu MADS Czynnik Mcm1p pełni w komórkach drożdży wiele ważnych funkcji. Najlepiej poznane to: regulacja cyklu komórkowego (Althoefer i wsp., 1995, McInerny i wsp., 1997; Boros i wsp., 2003), kontrola zmian typu płciowego (Shore i Sharrocks, 1995; Herskowitz i wsp., 1992), utrzymywanie w komórce minichromosomów (Passmore i wsp., Helisa α ), udział w rekombinacji (Elble i Kartka β - Tye, 1992), regulacja transkrypcji DNA - retrotranspozonu Ty1 (Errede, 1993; Yu i Fassler, 1993), udział w Rys. 4. Model struktury krystalicznej kompleksu α2- procesach osmoregulacyjnych (Kuo i Mcm1p-DNA. wsp., 1997), a także regulacja Model wykonano w oparciu o dane z bazy PDB. metabolizmu argininy (Messenguy i Dubois, 2000). Mcm1p składa się z 286 aminokwasów, z czego 80, położonych przy końcu N białka, tworzy domenę MADS. Silnie konserwowany rdzeń domeny MADS jest zbudowany w sposób charakterystyczny dla wszystkich czynników, zaliczanych do tej rodziny i zawiera 56 aminokwasów (schemat budowy przedstawiono na Rys. 1). Mcm1p ma na końcu N 17- nukleotydową sekwencję, która poprzedza domenę MADS, zaś przy końcu C stwierdzono obecność regionu bogatego w reszty glutaminy. Jak się wydaje oba regiony spełniają w białku dość ważną rolę. N-końcowy fragment ulega w komórce fosforylacji, a jego mutacje lub delecje prowadzą do spowolnienia wzrostu komórek drożdży na podłożach o wysokich stężeniach soli (Kuo i wsp., 1997; Yu i Fassler, 1993). Leżący na końcu C region bogaty w glutaminę, jest zapewne zaangażowany w proces zmiany typu płciowego (Primig i wsp., 1991; Bruhn i wsp. 1992). 15

16 WSTĘP 2.1. Czynnik Mcm1p uczestniczy w kontroli cyklu komórkowego Rola białka Mcm1p w regulacji cyklu komórkowego u drożdży jest niebagatelna, ponieważ nadzoruje ono dwa ważne procesy: przejście z fazy M do G1 oraz z G2 do M (Althoefer i wsp., 1995; Oehlen i wsp., 1996; McInerny i wsp., 1997). Tab. 1. Funkcje czynnika Mcm1p i kofaktory, z którymi oddziałuje wg (Messenguy i Dubois, 2003). Białka, z którymi oddziałuje Mcm1p Cykl komórkowy Yox1, Yhp1 (oba białka posiadają homeodomenę) Fkh2p+Ndd1p Różnicowanie typu płciowego α1 α2 (białko posiadające homeodomenę) Ste12 Metabolizm argininy ArgRIp (Arg80p) białko typu MADS ArgRIIp (Arg81p) białko posiadające domenę dwujądrowego palca cynkowego (Zn 2 Cys 6 ) ArgRIIIp (Arg82p) kinaza polifosforanów inozytolu Regulowane geny Geny specyficzne dla przełomu faz M i G1: CDC6, CDC47, SWI4, CLN3 Geny specyficzne dla przełomu faz G2 i M: 26 genów, tzw. klaster CLB2 Geny specyficzne dla typu płciowego α: MFα1, STE3, SAG1, MFα2 Geny specyficzne dla typu płciowego a: MFA1, STE2, STE6, MFA2, BAR1, AGA2, DPS1, ASG7, DPS2 Geny specyficzne dla obu typów płciowych (α i a) Geny anaboliczne: ARG5,6, ARG8, ARG3, ARG1 Geny kataboliczne: CAR1, CAR2 Funkcja kofaktora represory (oba) aktywator aktywator represor aktywator aktywator lub represor 1 1) Kompleks Mcm1p ArgRIp ArgRIIp hamuje biosyntezę i aktywuje katabolizm argininy. Białko ArgRIIIp stabilizuje powstały kompleks, pełni więc rolę białka opiekuńczego. (Rys. wg Messenguy i Dubois, 2003). W komórkach drożdży opisano element promotorowy, nazwany ECB (ang. early cellcycle box), który jest obecny w promotorach 4 genów (CLN3, SWI4, CDC6 oraz CDC47). Najwyższy poziom transkrypcji tych genów zaobserwowano na przełomie faz M i G1. W regionie ECB znajduje się miejsce wiązania Mcm1p (sekwencja P) (McInerny i wsp., 1997). Udowodniono, że czynnik Mcm1p jest stale związany do ECB (Mai i wsp., 2002), a mimo to 16

17 WSTĘP ekspresja genów znajdujących się pod kontrolą tych promotorów nie jest konstytutywna. Od niedawna wiadomo, że dzieje się tak za sprawą dwóch białek: Yox1 i Yhp1 (Pramila i wsp., 2002). Oba posiadają homeodomenę, oba też wiążą się do DNA oraz oddziałują z Mcm1p, pełniąc funkcję represorów (Tab. 1). Białka Yox1 i Yhp1 wiążą się do DNA w pobliżu sekwencji P, rozpoznawanej przez Mcm1p. By nastąpiła represja, wystarczy przyłączenie jednego z tych białek do Mcm1p. Zatem wydaje się, że role obu białek się pokrywają. Czynnik Yox1 jest produkowany jedynie w pewnych fazach cyklu komórkowego. Przypuszcza się, że w przypadku Yhp1 jest podobnie. Wyniki doświadczeń skłaniają do postawienia tezy, że okresowa aktywność transkrypcyjna genów zależnych od ECB wynika wyłącznie ze skoordynowanej ekspresji genów kodujących białka Yox1 i Yhp1 (Messenguy i Dubois, 2003). Oba białka zachowują funkcję represorów nawet w przypadku usunięcia rozpoznawanych przez nie sekwencji DNA. Wykonanie szczegółowych badań dotyczących regulacji transkrypcji w genomie S. cerevisiae umożliwiło znalezienie 28 genów, których ekspresja zależy od elementów ECB i związanego z nimi czynnika Mcm1p (Pramila i wsp., 2002). Są to geny aktywne w późnej mitozie, uczestniczące w formowaniu kompleksu pre-replikacyjnego (PRC) i rozpoczynające fazę S. Ostatnio dowiedziono, że czynnik Mcm1p może również bezpośrednio regulować replikację DNA, wiążąc się w kompleksach z innymi białkami do miejsc startu replikacji (ori) (Chang i wsp., 2003). Zauważono, że w przypadku wielu ori inicjacja replikacji DNA następuje po przyłączeniu czynnika Mcm1p. Postuluje się, iż wykorzystanie miejsc startu replikacji w komórkach drożdży zależy od aktywności Mcm1p (Chang i wsp., 2004). Mcm1p, oddziałując z promotorami genów, tworzących klaster CLB2, reguluje również inny ważny etap cyklu komórkowego przejście z fazy G2 do M (Tab. 1). Klaster CLB2 to grupa 26 genów, których ekspresja jest uzależniona od obecności białka Mcm1p (Zhu i wsp., 2000). Najwyższy poziom transkrypcji genów tworzących klaster obserwuje się na przełomie faz G2 i M. Najlepiej poznanymi genami z tej grupy są CLB2 oraz SWI5. Gdy na początku lat 90-tych badano strukturę klastera CLB2, stwierdzono, że do promotorów tworzących go genów przyłącza się białko Mcm1p oraz nieznany czynnik, który nazwano SFF (ang. SWI five-factor) (Lydall i wsp., 1991; Althoefer i wsp., 1995; Maher i wsp., 1995). Dziś wiadomo, że na promotorach powstaje w rzeczywistości kompleks złożony z wielu białek kompleks SFF. Niedawno udało się zidentyfikować jeden z czynników, budujących ten kompleks, który nazwano Fkh2p (Kumar i wsp., 2000; Pic i wsp., 2000, Zhu i wsp., 2000; Boros i wsp., 2003). Dowiedziono, że białko Mcm1p w kompleksie z Fkh2p inicjuje transkrypcję genów, wchodzących w skład klastera CLB2. Ustalono też, że konieczne jest 17

18 WSTĘP wcześniejsze związanie się z kwasem nukleinowym czynnika Mcm1p, by do DNA mogło się przyłączyć białko Fkh2p (Pic i wsp., 2000). Zjawisko to nazwano kooperatywnością wiązania. Wydaje się, że do wystąpienia kooperatywności wiązania niezbędna jest sekwencja aminokwasowa w białku Fkh2p, położona przed regionem oddziałującym z DNA (Boros i wsp., 2003). Dla blisko spokrewnionego z Fkh2p czynnika Fkh1p, w którym brak wspomnianej sekwencji, nie zaobserwowano kooperatywnego wiązania z DNA (Hollenhorst i wsp., 2001). Do inicjacji transkrypcji genów w klasterze CLB2, oprócz kompleksu Fkh2p- Mcm1p, wymagana jest obecność jeszcze jednego białka Ndd1p (Koranda i wsp., 2000). Białko Fkh1p, przyłączając się do DNA, wywołuje efekt przeciwny hamuje inicjację transkrypcji genów klastera CLB2, choć udowodniono, że nie wiąże się ono z Mcm1p. Przypuszczalnie jego rola polega na osłabianiu aktywności kompleksu Fkh2p-Mcm1p-DNA na zasadzie rywalizacji z białkiem Fkh2p o miejsce wiązania w DNA (Hollenhorst i wsp., 2000; Hollenhorst i wsp., 2001). Przeprowadzone ostatnio badania, polegające na ukierunkowanej mutagenezie różnych regionów białka Fkh2p, pokazują, że czynnik ten wprawdzie nie potrafi się sam związać z cząsteczką kwasu nukleinowego, ale główną tego przyczyną nie jest brak białka Mcm1p, lecz obecność specyficznej sekwencji inhibitorowej (między 254 a 292 aminokwasem). Jej usunięcie sprawia, że Fkh2p może się wiązać z DNA, nawet wtedy, gdy brakuje czynnika Mcm1p (Boros i wsp., 2003). W toku dalszych analiz ustalono, że do wystąpienia kooperatywności wiązania są niezbędne pewne reszty aminokwasowe zarówno w jednym, jak i w drugim białku. W czynniku Mcm1p kluczową rolę odgrywają aminokwasy 1-98 (domena MADS), a w szczególności walina 69 (V69). W Fkh2p najważniejsze są niektóre aminokwasy aromatyczne z przedziału: , a zwłaszcza: tyrozyna 315 (Y315) (Shore i Sharrocks, 1995; Boros i wsp., 2003). Sekwencje DNA, wiążące Mcm1p i Fkh2p, są oddalone zaledwie o kilka nukleotydów. W regionie łączącym te sekwencje szczególnie silnie konserwowane są 2 nukleotydy (AA) (Boros i wsp., 2003). Jak wspomniano powyżej, czynnik Fkh2p musi bezpośrednio oddziaływać z Mcm1p, by mógł przyłączyć się do DNA (kooperatywność wiązania), dlatego ważne jest, by oba białka po związaniu się z DNA znajdowały się dostatecznie blisko siebie (Boros i wsp., 2003). Gdy do sekwencji łączącej motywy rozpoznawane przez białka Mcm1p i Fkh2p wprowadzono insercję 10 nukleotydów (tyle przypada na jeden skręt helisy DNA), zaobserwowano osłabienie wzajemnych interakcji obu białek, lecz kompleks nie uległ rozpadowi. Taka trwałość kompleksu ma zapewne związek ze zdolnością zaginania cząsteczki DNA przez Mcm1p (Boros i wsp., 2003). Warto zaznaczyć, 18

19 WSTĘP że sekwencja DNA rozpoznawana przez białko Fkh2p jest niesymetryczna. Zatem właściwa orientacja motywów, z którymi się wiążą białka Mcm1p oraz Fkh2p, ma duże znaczenie dla ich wzajemnych oddziaływań (Boros i wsp., 2003). Część badaczy uważa, że kompleks Fkh2p-Mcm1p-DNA spełnia rolę nieco odmienną od wyżej opisanej. Twierdzą oni, że omawiany kompleks jest stale związany z promotorami odpowiednich genów, a inicjacja transkrypcji odbywa się poprzez przyłączenie do kompleksu białka Ndd1p (Koranda i wsp., 2000). Inni dowodzą, że Fkh2p ulega fosforylacji w sposób zależny od fazy cyklu komórkowego, a znaczenie tej modyfikacji nie jest znane (Pic i wsp., 2000). Fosforylacja Fkh2p może więc odpowiadać za regulację oddziaływań białka Ndd1p z kompleksem Fkh2p-Mcm1p-DNA (Messenguy i Dubois, 2003) Białko Mcm1p odgrywa kluczową rolę w procesie zmiany typu płciowego u drożdży Drożdże, choć zwykle rozmnażają się przez pączkowanie (czyli wegetatywnie), zdolne są też do wytwarzania form generatywnych. Nie powstają jednak osobniki odmiennej płci, lecz komórki należące do 2 różnych haploidalnych typów płciowych: α i a. Na powierzchni obu typów komórek tworzą się swoiste receptory. Jednocześnie produkowane są feromony, oddziałujące na komórki odmiennego typu. Dzięki temu, w komórkach haploidalnych, wystawionych na działanie feromonów, następuje taka zmiana profilu ekspresji genów, że możliwa się staje fuzja komórek o różnym typie płciowym i wytworzenie komórek diploidalnych (α/a) (Mead i wsp., 2002). Za wykształcenie jednego lub drugiego typu płciowego odpowiada gen MAT, zlokalizowany na 3 chromosomie. Zależnie od typu płciowego komórki, w jej genomie występuje jeden z dwóch alleli genu MAT (MATα lub MATa odpowiednio w komórkach α lub a). Zmiana typu płciowego jest możliwa dlatego, że obok genu MAT w genomie S. cerevisiae obecne są też trwale wyciszone allele tego genu: HMLα i HMLa. Z tego powodu allele HMLα i HMLa nazywa się czasami milczącymi kasetami typu płciowego. Za sprawą, obecnej w komórkach drożdży, endonukleazy HO dokonuje się proces konwersji genów. W tej reakcji milczące kasety spełniają rolę matryc, na których tworzone są nowe cząsteczki genu MAT. Zmiana typu płciowego następuje, gdy nowo powstałe cząsteczki genu MAT różnią się od obecnych w genomie przed konwersją (Brown, 2001). Białko Mcm1p odgrywa 19

20 WSTĘP w opisanym procesie kluczową rolę, ponieważ odpowiada za kontrolę ekspresji genów właściwych dla każdego typu płciowego (Rys. 5). Dotychczas znaleziono 9 genów specyficznych dla typu płciowego a, które w regionach promotorowych mają sekwencje rozpoznawane przez czynnik Mcm1p (sekwencje P) (Tab. 1) (Messenguy i Dubois, 2003). Białko Mcm1p, przyłączając się do tych sekwencji, aktywuje transkrypcję odpowiednich genów (Ammerer, 1990). U typu płciowego α występują przynajmniej 4 geny, których ekspresja zależy od białka Mcm1p (Tab. 1), lecz w tym Rys. 5. Regulacja procesu zmiany typu płciowego u drożdży. przypadku regulacja przebiega nieco Białko Mcm1p, oddziałując ze swoimi kofaktorami, reguluje proces zmiany typu płciowego u drożdży (szczegóły w inaczej. By umożliwić inicjację tekście). W obecności feromonów, zarówno w komórkach α jak i a, do kompleksu inicjującego transkrypcję przyłącza się ekspresji genów α-specyficznych, do białko Ste12 (zaznaczone na rysynku linią przerywaną). Rys. wg (Messenguy i Dubois, 2003). czynnika Mcm1p musi się przyłączyć białko α1. Mcm1p wiąże się wówczas do zdegenerowanej sekwencji P, tzw. P, a α1 do sąsiadującej z nią sekwencji Q. Dzięki temu ekspresja genów typu α staje się możliwa. Ponadto w komórkach typu α oraz w diploidalnych komórkach α/a tworzy się kompleks α2- Mcm1p-α2, który przyłącza się do promotorów genów specyficznych dla typu płciowego a. Do powstałego kompleksu wiążą się następnie białka Ssn6-Tup1, co powoduje zahamowanie ekspresji genów a-specyficznych (Rys. 5). Białka α1 i α2 nie występują w komórkach typu a. U drożdży poddanych działaniu feromonów dochodzi do charakterystycznych zmian morfologicznych. Zmiany te zapoczątkowuje pobudzenie receptorów powierzchniowych STE2 i STE3 przez feromony. Potem następuje aktywacja szlaku przekazywania sygnału z powierzchni komórki do jądra. Wywołana zostaje kaskada reakcji, która prowadzi do powstania białka Ste12. W komórkach typu a białko Ste12 wiąże się do specyficznych sekwencji DNA (PRE) i do Mcm1p, a w komórkach typu α oddziałuje z α1. W rezultacie 20

21 WSTĘP następuje zatrzymanie podziałów komórkowych, fuzja komórek i wytworzenie form diploidalnych α/a (Rys. 5) (Oehlen i wsp., 1996; Messenguy i Dubois, 2003). Rys. 6. Rola aminokwasów, tworzących domenę MADS, w oddziaływaniu białka Mcm1p z DNA. Na rysunku zaznaczono położenie poszczególnych struktur drugorzędowych, a pod spodem zamieszczono odpowiadający im fragment sekwencji aminokwasowej. Różnymi figurami geometrycznymi oznaczono reszty aminokwasowe kontaktujące się z DNA, wiążące się do DNA i zaangażowane w proces zaginania cząsteczki kwasu nukleinowego (patrz: legenda). Kwadratami zaznaczono aminokwasy o kluczowym znaczeniu dla życia komórki. Letalny efekt niektórych substytucji może być zniesiony przez nadekspresję białka Mcm1p (jasne kwadraty). Warto zauważyć, że reszty aminokwasowe, kontaktujące się z cząsteczką kwasu nukleinowego i niezbędne do wytworzenia kompleksu Mcm1p-DNA, zlokalizowane są w obrębie N- końcowego regionu sekwencji oraz w helisie α I. Powstawanie zagięcia cząsteczki DNA również zależy głównie od reszt aminokwasowych budujących helisę α I. Dane pochodzą z prac: (Acton i wsp., 1997, 2000; Mead i wsp., 2002). (Rys. wg Messenguy i Dubois, 2003). By w pełni zrozumieć, jak czynnik Mcm1p oddziałuje z DNA i z innymi białkami (kofaktorami), wykonano szereg substytucji aminokwasów w sekwencji Mcm1p, a następnie przebadano efekty fenotypowe in vitro oraz in vivo (Acton i wsp., 2000; Jamai i wsp., 2002; Mead i wsp., 2002). Udowodniono, że Mcm1p (podobnie jak SRF), przyłączając się do cząsteczki kwasu nukleinowego, wywołuje jej silne zagięcie (Acton i wsp., 1997; West i wsp., 1997). Dowiedziono też, że stopień zagięcia zależy od sekwencji DNA (West i Sharrocks, 1999). Wykonując liczne substytucje reszt aminokwasowych w białku Mcm1p, udało się zidentyfikować 6 o krytycznym znaczeniu dla procesu zaginania DNA: K29, V34, S37, K40, T66 oraz L68 (Rys. 6) (Acton i wsp., 2000; Lim i wsp., 2003). Zaburzenia tego procesu skutkowały takimi efektami fenotypowymi, jak problemy z transkrypcją czy spowolniony wzrost komórek. Wyniki te sugerują, że zagięcie DNA, wywołane 21

22 WSTĘP przyłączeniem się do niego białka Mcm1p, ma duże znaczenie dla zachowania prawidłowej funkcji Mcm1p w komórce. Rys. 7. Rola aminokwasów, tworzących domenę MADS, w oddziaływaniu białka Mcm1p z kofaktorami. Figurami geometrycznymi zaznaczono reszty aminokwasowe, uczestniczące w oddziaływaniach z kofaktorami (patrz: legenda). Kwadratami oznaczono aminokwasy, oddziałujące z α2 w kompleksie α2- Mcm1p-DNA. Znana jest dokładna struktura krystaliczna tego kompleksu (Rys. 4) (Tan i Richmond, 1998). Ciemne gwiazdki wskazują reszty aminokwasowe, niezbędne białku Mcm1p do utworzenia aktywnego kompleksu z Ste12, a jasne gwiazdki reszty, które po wprowadzeniu do SRF, pozwalają mu oddziaływać z Ste12 (Mueller i Nordheim, 1991). Do sporządzenia schematu wykorzystano dane z prac: (El Bakkoury i wsp., 2000; Mead i wsp., 2002). (Rys. wg Messenguy i Dubois, 2003). Przyczyną opisanych zaburzeń może być brak możliwości utworzenia tzw. kompleksu potrójnego (ang. ternary complex), w którym dwa białka wiążą się ze sobą i z DNA, np. kompleks α1-mcm1p-dna. W tym przypadku rola Mcm1p polega zapewne na takim odkształceniu łańcucha DNA, by umożliwić obu białkom oddziaływanie ze sobą (Lim i wsp., 2003). Udowodniono, że tworzenie kompleksów Mcm1p z białkami α1 i Ste12 rzeczywiście zależy od obecności zagięć w DNA i że pojedyncze mutacje punktowe, w regionach odpowiedzialnych za powstawanie zagięć, wyraźnie wpływają na aktywność wspomnianych kompleksów (Rys. 7). W przypadku kompleksu α2-mcm1p-dna nie stwierdzono, by pojedyncze mutacje punktowe w opisywanych regionach miały nań jakikolwiek wpływ. Dopiero zmutowanie dwóch kluczowych aminokwasów (R87F, S51F lub R87F, V69F) 22

23 WSTĘP wywoływało oczekiwany efekt osłabienie aktywności kompleksu α2-mcm1p-dna. Wyniki te wyraźnie wskazują, że różne kofaktory odmienne oddziałują z białkiem Mcm1p, pomimo iż przyłączają się do tej samej domeny MADS (Messenguy i Dubois, 2003). Ostatnio udało się ustalić funkcję, jaką spełnia białko α1 w kompleksie z Mcm1p. Stwierdzono, że przy braku białka α1 czynnik Mcm1p zbyt słabo zagina cząsteczkę kwasu nukleinowego, by było możliwe utworzenie aktywnego kompleksu inicjacji transkrypcji (Carr i wsp., 2004). Jest to kolejny dowód na to, że zaginanie DNA ma kluczowe znaczenie dla aktywności białek z domeną MADS Czynnik Mcm1p w kompleksie z białkami z grupy ArgRp reguluje metabolizm argininy Kontrola metabolizmu argininy u drożdży jest procesem bardzo złożonym i wielokierunkowym (Rys. 8). Ustalono, że zarówno anabolizm, jak i katabolizm argininy podlegają specyficznej regulacji, zależnej od dostępności tego aminokwasu. Oba procesy są również regulowane przez mechanizmy ogólne. Anabolizm argininy jest powiązany z odpowiedzią komórki na głód aminokwasowy. Dowiedziono, że wysokie stężenie argininy w komórce hamuje ekspresję genów, kodujących dwa pierwsze enzymy szlaku jej biosyntezy. Anabolizm Arginina Katabolizm ARG5,6 ARG3 ARG8 ARG1 ARG2 ARG7 ARG4 CPA1 CPA2 + Gcn4 dostępność aminokwasu Represja peptyd liderowy + oraz arginina Upf1 Upf2 Upf3 + + Arg81 Arg80 Mcm1 Arg82 + Aktywacja + CAR2 CAR1 Ume6 Sin3 Rpd3 + + Nil1 Ure2 Gln3 najlepsze źródło azotu dostępność azotu Dal81 + Dal82 + sól kwasu allofanowego (ang. allophanate) Rys. 8. Sieć zależności między różnymi czynnikami regulującymi metabolizm argininy w komórkach drożdży. (Rys. wg Messenguy i Dubois, 2000). 23

24 WSTĘP Katabolizm argininy jest uzależniony od obecności argininy oraz braku w podłożu łatwiej przyswajalnych źródeł azotu, takich jak: amoniak, asparagina czy glutamina. W przypadku, gdy są dostępne łatwiej przyswajalne źródła azotu, hamowana jest ekspresja genów CAR1 i CAR2, kodujących odpowiednio arginazę i transaminazę ornitynową (OTA). Zjawisko to, nazywane represją kataboliczną azotową, jest zależne od czynników Gln3p, Nil1p, Ure2p (Courchesne i Magasanik, 1988; Stanbrough i wsp., 1995; Coffman i wsp., 1996; Smart i wsp., 1996; Dubois i Messenguy, 1997), od kompleksu białkowego Ume6(CargRI)-Sin3(CargRII)-Rpd3(CargRIII) (Messenguy i wsp., 2000), a także od białek Dal81p i Dal82p (Park i wsp., 1999) (Rys. 8). Precyzyjną koordynację katabolizmu i anabolizmu argininy u drożdży zapewnia kompleks czterech białek: Mcm1p-ArgRIp-ArgRIIp-ArgRIIIp. Czynniki ArgRIp i ArgRIIp są specyficzne tylko dla tego procesu, podczas gdy ArgRIIIp i Mcm1p pełnią w komórce wiele różnych funkcji. Dotychczas nie stwierdzono, by omawiane białka wzajemnie regulowały swoją ekspresję (Bercy i wsp., 1987). Czynnik ArgRIp (Arg80p) jest zbudowany ze 177 aminokwasów. Podobnie jak Mcm1p należy do pierwszej podrodziny białek z domeną MADS (SRF-like), lecz w przeciwieństwie do niego, wiąże się do DNA z bardzo niskim powinowactwem, przez co nie jest w stanie sam aktywować transkrypcji genów (Qiu i wsp., 1990; Jamai i wsp., 2002). Poza tym jest zaangażowany jedynie w regulację metabolizmu argininy i nie uczestniczy w regulacji innych procesów, czym również różni się od Mcm1p. Także półokresy życia obu białek bardzo się różnią i wynoszą odpowiednio: kilka minut dla ArgRIp i kilka godzin dla Mcm1p (El Bakkoury i wsp., 2000). Podobieństwo domen MADS obu czynników jest znaczne (56 identycznych aminokwasów z 81), mimo to każdy pełni w komórce odmienne funkcje (Qiu i wsp., 1990; Bruhn i wsp., 1992). W cząsteczce ArgRIp znaleziono kilka reszt aminokwasowych o kluczowym znaczeniu dla oddziaływania czynnika z jego kofaktorami (Y87, Y110, A118, N119, T135). Ich zastąpienie powoduje poważne zaburzenia w aktywności białka. Ponadto zidentyfikowano dwa regiony, które mogą służyć czynnikowi ArgRIp do wiązania się z kofaktorami: hydrofobową kieszeń na powierzchni białka oraz bruzdę, powstającą na styku dwóch podjednostek, tworzących dimer z Mcm1p. Wydaje się, że niektóre z reszt aminokwasowych, wymienionych powyżej, mogą być częścią jednej i drugiej struktury. Istnienie dwóch regionów oddziaływania, pozwalałoby czynnikowi ArgRIp wiązać się jednocześnie z dwoma kofaktorami, co ułatwiałoby tworzenie kompleksów złożonych z wielu białek (Jamai i wsp., 2002). 24

25 WSTĘP Białko ArgRIIp (Arg81p) jest czynnikiem transkrypcyjnym, posiadającym domenę dwujądrowego palca cynkowego Zn 2 Cys 6, złożonym z 880 aminokwasów. ArgRIIp, w przeciwieństwie do innych białek z tej rodziny, nie tworzy homodimerów, a do związania z DNA wymaga obecności czynników Mcm1p i ArgRIp. W kompleksie Mcm1p-ArgRp spełnia rolę czujnika argininy (Messenguy i Dubois, 2000). Białko ArgRIIIp (Arg82p) (kinaza polifosforanów inozytolu) jest zbudowane z 355 aminokwasów. W komórkach drożdży uczestniczy w regulacji wielu procesów, takich jak: zmiana typu płciowego, wzrost komórek i sporulacja (Dubois i wsp., 1987; Dubois i Messenguy, 1994). W przeciwieństwie do trzech pozostałych białek, ArgRIIIp nie ma zdolności wiązania się z DNA, a w procesie regulacji metabolizmu argininy pełni rolę białka opiekuńczego, stabilizującego heterodimer dwóch białek MADS: ArgRIp-Mcm1p. Jego aktywność kinazowa nie odgrywa w tym żadnej roli, jest jednak niezbędna do prawidłowego przebiegu innych procesów zależnych od ArgRIIIp: transportu mrna z jądra do cytoplazmy, odporności na stres osmotyczny, zachowania ciągłości ściany komórkowej, formowania wodniczek, remodelowania chromatyny, i kontroli procesów metabolicznych komórki, w zależności od stężenia fosforanów i źródła azotu w podłożu (York i wsp., 1999; Dubois i wsp., 2002; El Alami i wsp., 2003; Steger i wsp., 2003). Udowodniono, że po wywołaniu nadekspresji białka Mcm1p lub ArgRIp obecność czynnika ArgRIIIp, podczas tworzenia heterodimeru Mcm1p-ArgRIp, staje się zbędna, tak in vitro, jak in vivo (El Bakkoury i wsp., 2000). Przypuszcza się, że białka z grupy ArgRp i czynnik Mcm1p mogą ze sobą nawzajem oddziaływać w jądrze komórkowym w sposób niezależny od obecności argininy. Sekwencję zdarzeń, która prowadzi do powstania kompleksu Mcm1p-ArgRp, przedstawiono na Rys. 9. Kompleks Mcm1p-ArgRp hamuje ekspresję genów związanych z biosyntezą argininy (ARG1, ARG3, ARG5,6 oraz ARG8) oraz aktywuje ekspresję genów zaangażowanych w katabolizm tego aminokwasu (CAR1 i CAR2) (Tab. 1) (Béchet i wsp., 1970; Messenguy i Dubois, 1993; Messenguy i Dubois, 2000). Dzięki zastosowaniu mutagenezy ukierunkowanej, w regionach promotorowych każdego genu, regulowanego przez kompleks Mcm1p-ArgRp, udało się zlokalizować dwa motywy sekwencji homologiczne do rozpoznawanej przez Mcm1p sekwencji P, które nazwano arginine box. W genach katabolicznych: CAR1, CAR2, jak również w genie anabolicznym ARG1, sekwencje arginine box są położone powyżej sekwencji TATA. Z kolei w pozostałych genach anabolicznych: ARG5,6, ARG3, ARG8 znaleziono je poniżej sekwencji TATA (Messenguy i wsp., 1991; DeRijcke i wsp., 1992; Crabeel i wsp., 1995; 25

26 WSTĘP Dubois i Messenguy, 1997). Oznacza to, że położenie arginine box względem sekwencji TATA nie decyduje o represji bądź indukcji genu. Pomiędzy dwiema sekwencjami typu arginine box stwierdzono obecność regionu bogatego w pary G-C. Przypuszcza się, że z tym regionem oddziałuje białko ArgRIIp i dlatego jest on niezbędny do właściwej regulacji ekspresji genów (Dubois i Messenguy, 1997). Obszar złożony z dwóch sekwencji argininebox połączonych regionem bogatym w G-C nazwano UAS arg (ang. Upstream Activation Sequence) lub URS (ang. arg Upstream Repression Sequence), zależnie od spełnianej funkcji. Co ciekawe, w promotorze genu ARG8 jest obecna tylko jedna sekwencja typu arginine box (Messenguy i Dubois, 2000). arg Rys. 9. Kompleks Mcm1p-ArgRIp(Arg80)-ArgRIIp(Arg81)-DNA, regulujący metabolizm argininy u drożdży, powstaje w kilku etapach (szczegóły w tekście). (Rys. wg Messenguy i Dubois, 2000). Kompleks białek ArgRp-Mcm1p powstaje w kilku etapach (Rys. 9): Tworzy się heterodimer dwóch białek z domeną MADS (ArgRIp-Mcm1p) stabilizowany przez czynnik ArgRIIIp. Pewne badania wskazują, że heterodimer może być cały czas związany z sekwencją URS arg genu ARG1 (Yoon i wsp., 2004). Ustabilizowany heterodimer łączy się z ArgRIIp czujnikiem argininy. Białko ArgRIIIp odłącza się. 26

27 WSTĘP Gdy stężenie argininy w komórce jest wysokie, powstały kompleks 3 białek wiąże się z sekwencjami UAS arg i URS arg odpowiednich genów, aktywując lub reprymując ich ekspresję. Rola białek typu MADS polega zapewne na takim zagięciu cząsteczki kwasu nukleinowego, by w obecności argininy powstawał stabilny kompleks białka-dna, w którym czynnik ArgRIIp może się związać z regionem bogatym w pary G-C i pełnić funkcję czujnika argininowego. Ponadto stwierdzono, że żadne z białek, budujących opisany kompleks, nie potrafi się osobno związać do UAS arg lub URS arg (Messenguy i Dubois, 2000). Zastanawiający jest fakt, że kontrola metabolizmu argininy u drożdży jest jedynym znanym procesem u tych organizmów, którego regulacja uzależniona jest od dwóch białek z domeną MADS. Wydaje się, że może to mieć związek z możliwością tworzenia heterodimerów Mcm1p-ArgRIp in vivo. Dzięki badaniom struktury krystalicznej powstających kompleksów i wykorzystaniu metody dwuhybrydowej wiadomo, iż Mcm1p z łatwością tworzy homo- i heterodimery z innymi białkami typu MADS (Tan i Richmond, 1998; El Bakkoury i wsp., 2000). Co prawda nie zaobserwowano, by czynnik ArgRIp tworzył homodimery in vivo, lecz w pewnych warunkach udało się in vitro uzyskać heterodimery ArgRIp z białkami SRF oraz Mcm1p (Mueller i Nordheim, 1991). Przypuszcza się, że powstały dimer białek ArgRIp i Mcm1p może wydajniej i z większą specyficznością oddziaływać z ArgRIIp i DNA niż pojedyncze białka. Niektóre badania in vitro zdają się potwierdzać to założenie (Amar i wsp., 2000). Teoria o powstawaniu heterodimerów wyjaśniałaby, dlaczego do regulacji metabolizmu argininy u drożdży są niezbędne aż dwa czynniki typu MADS (Messenguy i Dubois, 2003). Jednym z lepiej poznanych genów biosyntezy argininy jest ARG1. W przypadku niedoboru argininy, transkrypcja tego genu jest aktywowana przez czynnik Gcn4p. Białko to powstaje w warunkach głodu aminokwasowego (Hinnebusch, 1992). Regulacja aktywacji transkrypcji genu ARG1 polega na tym, że czynnik Gcn4p przyłącza lub odłącza od jego promotora kompleks Mcm1p-ArgRIp-ArgRIIp-ArgRIIIp. Najnowsze badania wykazały, że heterodimer Mcm1p-ArgRIp jest stale związany z sekwencją promotora genu ARG1. W takiej postaci jest jednak nieaktywny i dopiero dołączenie do niego białek ArgRIIp i ArgRIIIp przywraca kompleksowi pełną funkcjonalność. Gdy stężenie argininy w komórce jest wysokie, czynnik Gcn4p przyłącza białka ArgRIIp i ArgRIIIp do heterodimeru Mcm1p- ArgRIp, hamując w ten sposób syntezę argininy (Yoon i wsp., 2004). Przedstawiony powyżej mechanizm stanowi wyraźne potwierdzenie tezy, zakładającej możliwość powstawania heterodimerów Mcm1p-ArgRIp w komórkach drożdży. 27

28 WSTĘP 3. Regulacja katabolizmu argininy u A. nidulans Kropidlak (A. nidulans), tak jak drożdże, jest przedstawicielem workowców (Ascomycetes). Wiele procesów metabolicznych, w tym biosynteza i katabolizm argininy, przebiega u obu gatunków bardzo podobnie (Griffin, 1994; Cybis i wsp., 1972) (Rys. 10). ARGININA arginaza mocznik ORNITYNA OTA γ-semialdehyd kwasu glutaminowego argininobursztynian kwas Δ 1 pirolino-5-karboksylowy ORNITYNA PROLINA PROLINA kwas Δ 1 pirolino- 5-karboksylowy ORNITYNA OTC CP CPS-A Glu Glu CYTRULINA CYTRULINA Glu Gln mitochondrium cytoplazma Rys. 10. Szlaki przemian argininy u grzybów nitkowatych, np. A. nidulans. U drożdży (S. cerevisiae) zachodzą takie same przemiany metaboliczne, a różnica polega na cytoplazmatycznej lokalizacji enzymów OTC i CPS-A (Davis, 1986; Griffin, 1994). Użyte oznaczenia: OTA transaminaza ornitynowa, Glu glutaminian, Gln glutamina, CP karbamoilofosforan, CPS-A syntetaza karbamoilofosforanu, OTC karbamoilotransferaza ornitynowa. 28