(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2015/21 EP B1 (13) (51) T3 Int.Cl. A61K 31/416 ( ) A61K 31/4184 ( ) A61K 45/06 ( ) A61P 3/10 ( ) A61P 5/50 ( ) A61P 9/12 ( ) (54) Tytuł wynalazku: Zastosowanie antagonistów receptora angiotensyny II do podwyższania wrażliwości na insulinę (30) Pierwszeństwo: DE DE DE (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2009/47 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2015/10 (73) Uprawniony z patentu: BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GMBH, Ingelheim am Rhein, DE (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 THOMAS UNGER, Berlin, DE ULRICH KINTSCHER, Berlin, DE MICHAEL SCHUPP, Philadelphia, US STEFAN KAUSCHKE, Biberach, DE MICHAEL MARK, Biberach, DE (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Eliza Stypińska LDS ŁAZEWSKI DEPO I WSPÓLNICY SP. K. ul. Okopowa 58/ Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 1 EP B1 Z 13481/15 Zastosowanie antagonistów receptora angiotensyny II do podwyższania wrażliwości na insulinę Opis [0001] Wynalazek obejmuje dziedzinę antagonistów receptora angiotensyny II i dotyczy zastosowania antagonistów receptora angiotensyny II irbesartanu i telmisartanu do leczenia osób, u których zdiagnozowano cukrzycę typu 2 albo istnieje podejrzenie stanu przedcukrzycowego, albo do zapobiegania cukrzycy. [0002] Cukrzyca typu 2 jest objawem dwóch patofizjologicznych zjawisk, a mianowicie zmniejszonego wydzielania insuliny przez komórki beta trzustki i oporności wobec insuliny docelowych narządów wątroby, mięśni szkieletowych i tkanki tłuszczowej. Na ogół występują kompleksowe zaburzenia obydwu składników. Schorzenie diagnozuje się jako hiperglikemię na czczo, to jest stężenie cukru we krwi po godzinach poszczenia leży powyżej wartości granicznej 125 mg glukozy na dl osocza. Celowane leczenie objawowej cukrzycy typu 2 możliwe przez związki klasy substancji tiazolidynodionów (glitazonów). Związki te polepszają wykorzystanie krążącej insuliny i prowadzą do obniżenia wartości cukru we krwi (uczulacze insulinowe). Równocześnie za pomocą mechanizmów sprzężenia zwrotnego zmniejsza się podwyższony poziom insuliny i w związku z tym odciąża się trzustkę. Uczulacze insulinowe, takie jak troglitazon, rosiglitazon lub pioglitazon, rozwijają to działanie przez wiązanie do określonych receptorów jądrowych, zwanymi PPAR gamma (ang. Peroxisomal Proliferator Activated Receptor receptor aktywowany przez proliferator peroksysomów). Działają one jako regulatory transkrypcji szeregu genów, które mają znaczenie w przypadku metabolizmu glukozy i lipidów. Dzięki tej funkcji ligandy PPAR gamma, takie jak prostaglandyny lub syntetyczne tiazolidynodiony (glitazony), mogą przyczyniać się do leczenia cukrzycy typu 2. Jednym z głównych mechanizmów obniżania poziomu glukozy przez ligandy PPAR gamma jest indukcja różnicowania adipocytów. Wzmocnione różnicowanie adipocytów i przemodelowanie tkanki tłuszczowej wywołane przez ligandy PPAR gamma prowadzi do przekierowania względnie przemieszczenia wolnych kwasów tłuszczowych z mięśni szkieletowych do tkanki tłuszczowej i podwyższa przez to metabolizm glukozy w mięśniach.

3 2 [0003] Ponieważ w momencie diagnozy np. co drugi pacjent z cukrzycą typu 2 wykazuje oznaki wieńcowej choroby serca, coraz częściej przyczyny cukrzycy upatruje się w kompleksowym zaburzeniu metabolizmu, które może się objawiać szeregiem czynników ryzyka, takich jak zaburzona tolerancja glukozy, podwyższony poziom cukru we krwi na czczo, oporność wobec insuliny, wysokie ciśnienie krwi, dyslipidemia lub otyłość. Szczególnie zaznaczona jest przewaga oporności wobec insuliny u pacjentów z hipertriglicerydemią i niskim poziomem cholesterolu HDL. Mówi się tu o przed cukrzycy typu 2, zespole metabolicznym, zespole X albo zespole oporności na insuliny. W pierwszej fazie zmniejszona odpowiedź wobec insuliny narządu docelowego warunkuje podwyższenie trzustkowego wydzielania insuliny, aby poziom cukru we krwi utrzymać w normie. Po kilku latach podwyższonej względnie zwiększającej się produkcji insuliny dochodzi do tego, że wydzielania insuliny przez komórki beta trzustki nie można już dalej zwiększać. Wtedy zaczyna się faza zaburzonej tolerancji na glukozę. Organizm nie może już dość szybko wychwytywać szczytowych wartości glukozy. Gdy cukier we krwi na czczo utrzymuje się wreszcie na wysokim poziomie w sposób ciągły, cukrzyca staje się objawowa. [0004] Opis WO 95/06410 ujawnia zastosowanie antagonistów receptora angiotensyny II do leczenia przewlekłych schorzeń zapalnych, włączając ogólnoustrojowe schorzenia autoimmunologiczne. Jako jeden z licznych przykładów ogólnoustrojowych schorzeń autoimmunologicznych wymienia się cukrzycę. Do schorzeń autoimmunologicznych zalicza się cukrzycę typu 1, która najczęściej występuje u młodocianych poniżej 30 lat, przy czym przy odpowiedniej dyspozycji genetycznej pod wpływem różnych czynników dochodzi do zapalenia wysp trzustkowych z następnym zniszczeniem komórek B, tak że trzustka produkuje insulinę w bardzo małej ilości albo wcale. Cukrzycy typu 2 nie uważa się za schorzenie autoimmunologiczne. [0005] Antagonisty receptora angiotensyny II stosuje się do leczenia wysokiego ciśnienia krwi oraz szkodliwych następstw w sercowonaczyniowych narządach końcowych, które mają związek z wysokim ciśnieniem krwi. W literaturze fachowej określa się je na ogół jako metabolicznie obojętne. O polepszaniu wrażliwości na insulinę w modelach na zwierzętach przez substancję czynną irbesartan donoszą Henriksen i inni (Hypertension 38 : , 2001). [0006] Shama i inni w Hypertension 40(5): , 2001, stawiają hipotezę, że blokada układu reniny angiotensyny sprzyja włączaniu preadipocytów, przez co zwiększa się liczba

4 3 małych insulino wrażliwych adipocytów. Przemieszczanie lipidów z mięśni i innych tkanek do tkanki tłuszczowej skutkowałoby wtedy polepszoną opornością wobec insuliny. [0007] Asmar i inni w American Journal of Hypertension 14(4): 114A, 2001, donosi, że telmisartan zmniejsza sztywność tętnic u nadciśnieniowych pacjentów z cukrzycą typu 2.. [0008] Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie środków leczniczych, które można stosować zarówno do leczenia objawowej cukrzycy typu 2, jak i do leczenia pierwszych objawów kompleksowych zaburzeń metabolizmu stanu przedcukrzycowego i w związku z tym do zapobiegania cukrzycy typu 2. W ramach niniejszego wynalazku obecnie niespodziewanie stwierdzono, że antagonisty receptora angiotensyny II irbesartan i telmisartan oraz ich sole, obok znanego działania obniżającego ciśnienie krwi w układzie komórkowym, mogą również podwyższać ekspresję genów, których transkrypcja wiadomo, że jest regulowana przez receptor PPARgamma. Otwiera to nowe terapeutyczne możliwości w leczeniu i zapobieganiu cukrzycy typu 2, zespołu metabolicznego i oporności wobec insuliny. Aby zapewnić porównywalne warunki, działanie to w ramach niniejszego wynalazku obserwuje się i kwantyfikuje za pomocą linii komórkowej poddanej stabilnej transformacji (porównaj przykład 2). Chodzi przy tym o komórki CHO, które przedstawiają wynik transformacji za pomocą dwóch konstruktów genowych. Pierwszy z tych konstruktów koduje gen lucyferazy z Photinus pyralis (de Wet JR, Mol Cell Biol (1987) 7 : 725) pod kontrolą syntetycznego promotora z pięciokrotnym powtórzeniem miejsca wiązania GaI4 drożdży (porównaj sekwencję Genbank AF058756). Drugi konstrukt koduje białko fuzyjne składające się z domeny wiązania ligandów ludzkiego czynnika transkrypcji PPARgamma2 (porównaj sekwencję Genbank U79012) oraz domeny wiązania DNA GAL4 drożdży (aminokwasy 1 147; Sadowski I, Nucleic Acids Res (1989) 17:7539). [0009] Znane jest wywoływanie transkrypcji genów regulowanych przez PPARgamma za pomocą tiazolidynodionów (np. rosiglitazon) stosowanych jako środki przeciwcukrzycowe i prowadzi się to przez ich wiązanie z receptorem PPARgamma i jego aktywowanie. W ramach stosowanego tu systemu testów działanie to można kwantyfikować jako wzbudzoną aktywność lucyferazy transformowanej linii komórkowej. To samo wzbudzanie czynności lucyferazy, wbrew oczekiwaniu, następuje w przypadku antagonistów receptora angiotensyny II nie przez wiązanie substancji czynnej z receptorem PPARgamma. Wzbudzanie to jest szczególnie widoczne w przypadku

5 4 substancji czynnej telmisartan. Wiązanie np. telmisartanu z receptorem PPARgamma nie możne być wykazane w różnych systemach testowych. Zakłada się więc, że podwyższanie powinowactwa białek kofaktorowych do PPARgamma przez antagonisty receptora angiotensyny II, takie jak telmisartan, prowadzi do rekrutacji białek kofaktorowych również wtedy, gdy nie występują syntetyczne ligandy PPARgamma o wysokim powinowactwie. Wywołuje to wtedy powodowane przez te kofaktory aktywowanie transkrypcji genów, które jest regulowane przez receptor PPARgamma. Ponieważ teraz wzbudzanie tych genów odpowiedzialne jest za przeciwcukrzycowe działanie tiazolidynodionów, można wychodzić z tego, że wzbudzanie tych samych genów przez antagonisty receptora angiotensyny II, takie jak telmisartan, będzie rozwijać porównywalne działanie przeciwcukrzycowe. Tak więc te substancje czynne nadają się nie tylko do leczenia wysokiego ciśnienia krwi, lecz także do leczenia i zapobiegania w przypadku cukrzycy typu 2. [0010] Odkrycie tego nowego działania terapeutycznego antagonistów receptora angiotensyny II irbesartanu i telmisartanu oraz ich soli oznacza, że można je stosować do wytwarzania środka leczniczego do leczenia osób, u których zdiagnozowano cukrzycę typu 2, albo osób z podejrzeniem stanu przedcukrzycowego, albo do zapobiegania cukrzycy. Nadają się one przede wszystkim do leczenia i zapobiegania cukrzycy typu 2 i przedcukrzycy typu 2. Włącza się tu też leczenie i zapobieganie w przypadku zespołu metabolicznego, zespołu X względnie zespołu oporności wobec insuliny. Gdy w ramach niniejszego wynalazku mowa jest o traktowanych osobach, to w pierwszym rzędzie chodzi co prawda o leczenie względnie zapobieganie u ludzi, stosowane substancje czynne i kombinacje substancji czynnych można jednak odpowiednio stosować też w weterynarii dla ssaków. [0011] Cukrzyca typu 2 objawia się wartością cukru we krwi na czczo przewyższającą 125 mg glukozy na dl osocza, przy czym oznaczanie wartości glukozy we krwi jest standardowym zabiegiem w rutynowej analityce medycznej. Gdy prowadzi się test na tolerancję glukozy, to w 2 godziny po przyjęciu na czczo 75 g glukozy wartość cukru we krwi cukrzyka wynosi ponad 200 mg glukozy na dl osocza. W teście na tolerancję glukozy badanej osobie po godzinnym poszczeniu podaje się doustnie 75 g glukozy i oznacza się wartość cukru we krwi bezpośrednio przed przyjęciem oraz w 1 względnie 2 godziny po przyjęciu glukozy. U zdrowego osobnika wartość cukru we krwi przed przyjęciem wynosi pomiędzy 60 i 110 mg na dl osocza, po jednej godzinie po przyjęciu

6 5 poniżej 200 mg na dl i po 2 godzinach poniżej 140 mg na dl. Jeżeli wartość ta po 2 godzinach wynosi pomiędzy 140 i 200 mg, to mówi się o zakłóconej tolerancji glukozy. [0012] Szczególnie silnym wskaźnikiem występowania stanu przedcukrzycowego jest to, gdy można wykazać oporność wobec insuliny. Może być tak, że osoba dla utrzymania homeostazy glukozy potrzebuje 2 3 krotnej ilości insuliny w porównaniu z inną osobą, przy czym nie ma to bezpośredniego patologicznego znaczenia. Jako najbardziej znaczącą metodę oznaczania oporności wobec insuliny uważa się euglikemiczniehiperinsulinemiczny test Clamp (klamrowy). Stosunek insuliny do glukozy oznacza się w ramach kombinowanej insulino glukozowej techniki infuzyjnej. O oporności wobec insuliny mówi się, gdy pobór glukozy wynosi poniżej 25 percentyli badanej populacji tła (definicja WHO). Wymagające nieco mniej nakładów niż badanie Clamp są tak zwane modele minimalne, podczas których w dożylnych testach na tolerancję glukozy w czasowo określonych odstępach mierzy się stężenie insuliny i glukozy we krwi i na tej podstawie oblicza oporność wobec insuliny. Innym sposobem oznaczania jest matematyczny model HOMA. Oporność wobec insuliny oblicza się poprzez stężenie glukozy w osoczu na czczo i stężenie insuliny na czczo. W ramach tej metody nie można rozróżnić pomiędzy wątrobową i obwodową opornością wobec insuliny. Do określania oporności wobec insuliny w codziennej praktyce sposoby te są mało odpowiednie. W klinicznej codzienności do oceny oporności wobec insuliny na ogół stosuje się inne parametry. Korzystne są tu np. stężenia triglicerydów pacjenta, ponieważ podwyższony poziom triglicerydów występuje znacząco w korelacji z opornością wobec insuliny. W praktyce w sposób nieco uproszczony wychodzi się z tego, że osoby są wtedy oporne wobec insuliny, gdy wykazują przynajmniej 2 spośród następujących cech: 1) nadwaga lub otyłość 2) wysokie ciśnienie krwi 3) dyslipidemia (zmieniona zawartość całkowitej ilości lipidów we krwi) 4) przynajmniej jeden krewny pierwszego stopnia, u którego zdiagnozowano zaburzoną tolerancję glukozy albo cukrzycę typu 2. Nadwaga oznacza tu, że wskaźnik masy ciała (BMI) wynosi pomiędzy 25 i 30 kg/m 2, przy czym BMI stanowi iloraz wagi ciała w kg i kwadratu wielkości ciała (wysokości) w metrach. Przy otyłości BMI jest większy niż 30 kg/m 2.

7 6 Z powyższej definicji oporności wobec insuliny wynika bezpośrednio, że do jej leczenia środki obniżające ciśnienie krwi są wtedy odpowiednie i wskazane, gdy u pacjenta stwierdza się między innymi wysokie ciśnienie krwi. I tak leczenie cukrzyków typu 2 telmisartanem można równocześnie stosować do leczenia lub traktowania podtrzymującego w przypadku dyslipidemii. Zwykle stosowane dawki telmisartanu powodują znaczące zmniejszenie wartości w osoczu cholesterolu LDL, cholesterolu całkowitego i/lub trójglicerydów. [0013] Ponieważ oporność wobec insuliny uważa się za stan, który powoduje stopniowe zwiększanie ciśnienia krwi, jej leczenie telmisartanem, pomimo normalnych wartości ciśnienia krwi, można uważać za zapobieganie wysokiemu ciśnieniu krwi. [0014] Podobnym wskaźnikiem dla stanu przedcukrzycowego jest to, gdy spełnione są warunki dla zespołu metabolicznego, którego główną cechą jest oporność wobec insuliny. Według wskazań ATP IHINCEP (Executive Summary of the Third Report of the National Cholesterol Education Program (NCEP) w Journal of the American Medical Association 285: , 2001) o zespole metabolicznym mówi się wtedy, gdy pacjent wykazuje przynajmniej 3 spośród następujących cech: 1) otyłość brzuszna, określana jako objętość talii > 40 cali lub 102 cm u mężczyzn i > 35 cali lub 94 cm u kobiet 2) wartość trójglicerydów > 150 mg/dl 3) wartość cholesterolu HDL < 40 mg/dl u mężczyzn 4) wysokie ciśnienie krwi > 130/ > 85 mm Hg 5) cukier we krwi na czczo > 110 mg/dl Z tej definicji zespołu metabolicznego wynika bezpośrednio, że do jego leczenia środki obniżające ciśnienie krwi są odpowiednie wtedy, gdy u pacjenta stwierdza się między innymi wysokie ciśnienie krwi. [0015] Ponieważ także zespół metaboliczny uważa się za stan, który powoduje stopniowe zwiększanie ciśnienia krwi, jego leczenie telmisartanem pomimo normalnych wartości ciśnienia krwi można również uważać za zapobieganie wysokiemu ciśnieniu krwi. [0016] Podejrzenie stanu przedcukrzycowego występuje też wtedy, gdy wartość cukru we krwi na czczo leży powyżej maksymalnej wartości normalnej 110 mg glukozy na dl osocza, lecz nie przekracza wartości granicznej odpowiadającej cukrzycy wynoszącej 125 mg glukozy na dl osocza. Innym wskaźnikiem dla stanu przedcukrzycowego jest zaburzenie

8 7 tolerancji glukozy, to jest wartość cukru we krwi wynosząca mg glukozy na dl osocza w 2 godziny po przyjęciu na czczo 75 g glukozy w ramach testu tolerancji glukozy. [0017] Również wartość trójglicerydów we krwi wynosząca więcej niż 150 mg/dl pozwala na podejrzewanie stanu przedcukrzycowego. Podejrzenie to wzmacniają niskie wartości cholesterolu HDL we krwi. U kobiet wartości poniżej 40 mg na dl osocza, u mężczyzn wartości poniżej 50 mg na dl osocza uważa się za zbyt niskie. Oznaczanie trójglicerydów i cholesterolu HDL we krwi należy również do standardowych metod analityki medycznej i opisane jest np. w Thomas L (wydawca): Labor und Diagnose, TH Books Verlagsgesellschaft mbh, Frankfurt nad Menem, Ponadto podejrzenie stanu przedcukrzycowego wzmacnia się wtedy, gdy równocześnie wartości cukru we krwi na czczo przekraczają 110 mg glukozy na dl osocza. Jeżeli zmierzone wartości we krwi mieszczą się w ramach wartości granicznych, to jako dodatkową pomoc w decyzji można przyjąć stosunek obwodu w talii do obwodu w biodrach. Jeżeli stosunek ten przekracza wartość 0,8 u kobiet względnie wartość 1 u mężczyzn, to leczenie jest wskazane. [0018] Szczególnie wskazane do leczenia cukrzycy względnie podejrzewanego stanu przedcukrzycowego są antagonisty receptora angiotensyny II irbesartan i telmisartan wtedy, gdy trzeba również leczyć nadciśnienie. Jest to ten przypadek, gdy skurczowe ciśnienie krwi przewyższa wartość 140 mm Hg, a rozkurczowe ciśnienie krwi przewyższa wartość 90 mm Hg. Gdy pacjent cierpi już na cukrzycę objawową, zaleca się dziś obniżenie skurczowego ciśnienia krwi do wartości poniżej 130 mm Hg i rozkurczowego ciśnienia krwi do wartości poniżej 80 mm Hg. Aby osiągnąć te wartości można od czasu do czasu stosować kombinację antagonisty receptora angiotensyny II ze środkiem moczopędnym lub antagonistą wapnia. Pojęcie środek moczopędny obejmuje tiazydy względnie analogi tiazydów, takie jak hydrochlorotiazyd (HCTZ), klopamid, ksipamid lub chlorotalidon, antagoniści aldosteronu, takie jak spironolakton lub eplerenon, jak też inne środki moczopędne, które nadają się do leczenia podwyższonego ciśnienia krwi, takie jak furosemid i piretanid, oraz ich kombinacje z amiloridem i triamterem. [0019] Wynalazek niniejszy oznacza, że dla osób, które są leczone na podwyższone ciśnienie krwi, antagonisty receptora angiotensyny II irbesartan i telmisartan są wskazane zawsze wtedy, gdy należy zapobiegać rozwojowi cukrzycy względnie w przypadku cukrzycy objawowej. [0020] Tylko u 10 procent wszystkich przypadków podwyższonego ciśnienia krwi (nadciśnienie wtórne) można ustalić przyczynę, taką jak np. schorzenie nerek. Wskutek

9 8 leczenia i wyeliminowania przyczyny na ogół można usunąć nadciśnienie wtórne. U prawie 90 procent wszystkich przypadków chodzi jednak o nadciśnienie pierwotne, których dokładna przyczyna nie jest znana i bezpośrednie leczenie nie jest więc możliwe. Ujemne skutki podwyższonego ciśnienia krwi można zmniejszać przez zmianę trybu życia i właściwe leczenie. Zgranie różnych względnie równoczesne występowanie poszczególnych czynników ryzyka wydaje się powodować wysokie ciśnienie krwi. Przede wszystkim obserwuje się równoczesne występowanie wysokiego ciśnienia krwi z zaburzeniami tłuszczowej i cukrowej przemiany materii. Te zaburzenia pozostają początkowo niezauważone, można je jednak rozpoznać na podstawie podwyższonej wartości trójglicerydów i glukozy we krwi oraz obniżonych wartości cholesterolu HDL we krwi. W bardziej rozwiniętym stadium można je dodatkowo rozpoznać w powoli zwiększającej się otyłości. Zaburzenia te można wytłumaczyć zwiększającą się opornością wobec insuliny. Im mniej aktywna jest insulina, tym więcej występuje zaburzeń w tłuszczowej i cukrowej przemianie materii. Kombinacja wszystkich tych zaburzeń podwyższa ostatecznie prawdopodobieństwo występowania cukrzycy i możliwości przedwczesnej śmierci z powodu schorzenia serca lub naczyń krwionośnych. [0021] Szacuje się, że około jedna trzecia dorosłych osób w rejonach Ziemi o nadmiarze żywności dotknięta jest połączeniem podwyższonego ciśnienia krwi z zaburzeniami tłuszczowej i cukrowej przemiany materii, i że ta liczba będzie jeszcze wzrastać. Skutkiem tego jest zapotrzebowanie na leki, które będą w stanie zwalniać postęp wymienionych zaburzeń przemiany materii w możliwie wczesnej fazie albo je zatrzymywać i równocześnie zapobiegać szkodliwym dla zdrowia działaniom podwyższonego ciśnienia krwi. [0022] Wynalazek niniejszy ujawnia też środek leczniczy, który można stosować zarówno do leczenia nadciśnienia jak i do leczenia objawowej cukrzycy typu 2 względnie pierwszych oznak kompleksowych zaburzeń przemiany materii stanu przedcukrzycowego. Tak więc wynalazek niniejszy obejmuje też zapobieganie cukrzycy u pacjentów, których leczy się ze względu na podwyższone ciśnienie krwi. Jeżeli więc jeden z antagonistów receptora angiotensyny II irbesartan i telmisartan jest stosowany do kontroli ciśnienia krwi zaraz po tym, gdy pojawi się jeden z wymienionych objawów stanu przedcukrzycowego, to dzięki temu można opóźnić lub zapobiec wystąpieniu objawowej cukrzycy typu 2.

10 9 [0023] W przypadku odpowiednich w ramach niniejszego wynalazku antagonistów receptora angiotensyny II irbesartanu i telmisartanu chodzi o związki, dla których można wykluczyć za pomocą testów in vitro (porównaj przykład 1) wiązanie z domeną wiązania ligandów PPARgamma, podczas gdy one komórkowo, to znaczy po dodaniu do pożywki hodowlanej poddanej stabilnej transformacji linii komórkowej reportera PPARgamma, aktywują również ekspresję poddanego również stabilnej transfekcji genu lucyferazy (porównaj przykład 3). [0024] Irbesartan i telmisartan więc nie wykazują in vitro wiązania z domeną wiązania ligandów ludzkiego receptora PPARgamma, lecz prowadzą do wzbudzenia czynności lucyferazy, jeżeli są dodane do pożywki hodowlanej poddanej stabilnej transformacji reporterowej linii komórkowej PPARgamma, która a) wykazuje ekspresję białka fuzyjnego składającego się z domeny wiązania ligandów ludzkiego czynnika transkrypcji PPARgamma oraz domeny wiązania DNA GAL4 drożdży i b) zawiera gen lucyferazy pod kontrolą pięciokrotnie powtórzonego miejsca wiązania Gal4 drożdży. Wytwarzanie takiej linii komórkowej reportera PPARgamma opisane jest w przykładzie 2. [0025] Wiązanie in vitro do domeny wiązania ligandów ludzkiego receptora PPARgamma2 nie występuje wtedy, gdy nie można tego wykryć w teście AlphaScreen (Ullmann EF i inni, Proc Natl Acad Sci USA (1994) 91: ). Zamiast testu Alpha Screen można też stosować test SPA Assay (Mukherjee R i inni, J Steroid Biochem Mol Biol (2002) 81: ) albo badanie NMR (Johnson BA i inni, J Mol Biol (2000) 298: ). Na ogół za pomocą żadnego z tych sposobów nie można wykryć wiązania z receptorem. [0026] Antagonistami receptora angiotensyny II w ramach niniejszego wynalazku są irbesartan i telmisartan. Najlepsze wyniki uzyskuje się wyraźnie z telmisartanem i jego solami. Wytworzone postacie do podawania zawierają równoważnik mg, korzystnie 20, 40, 80, 120, 160 lub 200 mg wolnego kwasu substancji czynnej. Jeżeli substancję czynną zestawia się z HCTZ lub chlorotalidonem, to postać do podawania zawiera mg, korzystnie 50, 25 lub 12,5 mg środka moczopędnego. [0027] Ujawnione w ramach niniejszego wynalazku korzystne działanie antagonistów angiotensyny II irbesartanu i telmisartanu jest szczególnie widoczne dla telmisartanu. Jeżeli kombinowane stosowanie blokera receptora angiotensyny II z jednym lub więcej innymi terapeutycznymi substancjami czynnymi wydaje się sensowne lub konieczne, to

11 10 telmisartan stanowi korzystny bloker receptora angiotensyny II, ponieważ on w jednej jedynej substancji czynnej łączy działanie obniżające ciśnienie krwi z działaniem metabolicznym, np. działaniem przeciwcukrzycowym, co przyczynia się również do zapobiegania cukrzycy. [0028] Z tego względu uprzednio formułowane kombinacje substancji czynnych telmisartanu z inhibitorami reduktazy HMG CoA, takimi jak simwastatyna lub atorwastatyna, stanowią dalszy rozwój w terapii chorób sercowonaczyniowych, sercowopłucnych, płucnych lub nerkowych, ale także w leczeniu dyslipidemii, osteoporozy lub choroby Alzheimera. Dotyczy to również kombinacji substancji czynnych telmisartanu z rosiglitazonem, albo pioglitazonem, albo repaglinidem, albo metforminą, albo inhibitorem DPP4 w terapii cukrzycowej. Również w leczeniu wysokiego ciśnienia krwi za pomocą inhibitorów układu renina angiotensyna (RAS) w kombinacji z antagonistami wapnia, takimi jak amlodypina lub nifedypina albo antagonistami aldosteronu, takimi jak spironolakton lub eplerenon, należy rozpatrywać telmisartan jako korzystny inhibitor RAS. Kombinacja z antagonistą aldosteronu, takim jak eplerenon, stanowi także znaczący dalszy rozwój w leczeniu względnie zapobieganiu przy osłabieniu serca lub zawale serca. Obok podwyższonego ciśnienia krwi również zaburzenia tłuszczowej przemiany materii (dyslipidemie) i cukrzyca oznaczają podwyższone ryzyko udaru, tak że telmisartan także w zestawieniu z inhibitorami agregacji trombocytów, takimi jak klopidogrel lub dipirydamol, również dodatkowo w kombinacji z kwasem acetylosalicylowym (ASA) jest korzystnym partnerem kombinacji przede wszystkim w profilaktyce udaru. Dipirydamol można w tym celu stosować w dawce 50 do 750 mg, korzystnie 100 do 500 mg, a zwłaszcza 200 do 450 mg. ASA można stosować w dawce 10 do 200 mg, korzystnie 25 do 100 mg, a w szczególności 30 do 75 mg. [0029] Odpowiednie kompozycje farmaceutyczne obejmują telmisartan albo jedną z jego soli w kombinacji z amlodypiną lub nifedypiną, eplerenonem lub spironolaktonem, simwastatyną lub atorwastatyną, rosiglitazonem albo pioglitazonem albo repaglinidem albo metforminą, dipirydamolem albo klopidogrelem, ewentualnie w kombinacji z kwasem acetylosalicylowym, sulfonylomocznikiem,

12 11 antagonistą aldosteronu, inhibitorem reduktazy HMG CoA, inhibitorem DPP4 albo inhibitorem agregacji trombocytów. Te wstępnie formułowane kombinacje substancji czynnych miesza się zazwyczaj z jednym lub więcej środkiem pomocniczym, takim jak mannitol, sorbitol, ksylit, sacharoza, węglan wapnia, fosforan wapnia, laktoza, sól sodowa kroskarmelozy (sól sodowa eteru karboksymetylowego celulozy, poprzecznie usieciowana), krospowidon, sodowy glikolan skrobi, hydroksypropyloceluloza (niskopodstawiona), skrobia kukurydziana, poliwinylopirolidon, kopolimery winylopirolidonu z innymi pochodnymi winylowymi (kopowidony), hydroksypropyloceluloza, hydroksypropylometyloceluloza, mikrokrystaliczna celuloza lub skrobia, stearynian magnezu, stearylofumaran sodu, talk, hydroksypropylometyloceluloza, karboksymetyloceluloza, octanoftalan celulozy, octan poliwinylu, woda, woda/etanol, woda/gliceryna, woda/sorbit, woda/glikol polietylenowy, glikol propylenowy, alkohol cetylostearylowy, karboksymetyloceluloza albo substancje zawierające tłuszcz, takie jak tłuszcz utwardzony albo jego odpowiednie mieszaniny, i przerabia na znane preparaty galenowe, takie jak tabletki, drażetki, kapsułki, proszki, zawiesiny lub czopki. [0030] Tabletki otrzymuje się np. przez mieszanie jednej lub więcej substancji czynnych z jednym lub więcej środkami pomocniczymi i następne prasowanie. Tabletki mogą też składać się z kilku warstw. Przykładami substancji pomocniczych są obojętne rozcieńczalniki, takie jak mannitol, sorbitol, ksylit, sacharoza, węglan wapnia, fosforan wapnia i laktoza; środki rozkruszające, takie jak sodowa sól kroskarmelozy (sól sodowa eteru karboksymetylowego celulozy, poprzecznie usieciowana), krospowidon, sodowy glikolan skrobi, hydroksypropyloceluloza (niskopodstawiona) i skrobia kukurydziana; środki wiążące, takie jak poliwinylopirolidon, kopolimery winylopirolidonu z innymi pochodnymi winylowymi (kopowidony), hydroksypropyloceluloza, hydroksypropylometyloceluloza, mikrokrystaliczna celuloza lub skrobia; środki marne, takie jak stearynian magnezu, stearylofumaran sodu i talk; środki do uzyskania efektu opóźnionego działania, takie jak hydroksypropylometyloceluloza, karboksymetyloceluloza, octanoftalan celulozy i octan poliwinylu; i

13 12 farmaceutycznie dopuszczalne barwniki, takie jak barwne tlenki żelaza. Blokada aldosteronu zmniejsza śmiertelność i zachorowalność u pacjentów ze zwiększoną słabością serca. Gdy pacjenci, którzy ze względu na objawową słabość serca i niewydolność lewokomorową są leczeni inhibitorem ACE, antagonistami receptora angiotensyny, środkiem moczopędnym lub beta blokerem, doznają zawału mięśnia sercowego, to można było wykazać, że dodatkowe leczenie selektywnym blokerem aldosteronu eplerenonem polepsza szanse ich przeżycia i prowadzi do zmniejszenia późniejszych hospitalizacji (NEJM 348: , 2003). W badanej grupie pacjentów ujęto również pacjentów cukrzycowych, u których występowała co prawda niewydolność lewokomorowa, lecz nie występowała objawowa słabość serca, ponieważ dla tej grupy pacjentów ryzyko incydentu sercowonaczyniowego jest porównywalnie tak duże jak u pacjentów z niewydolnością lewokomorową i objawową słabością serca. Jeżeli weźmie się to pod uwagę, to ujawnione tu odkrycie przeciwcukrzycowego działania blokera receptora angiotensyny II telmisartanu oznacza, że kombinacja z eplerenonem przy leczeniu po zawale mięśnia sercowego wskazana jest przede wszystkim u pacjentów, którzy już cierpią na cukrzycę i ewentualnie cukrzycową proteinurię, albo u których występuje podejrzenie stanu przedcukrzycowego. Farmaceutyczne postacie do podawania, w których w postaci kombinacji występują obydwie substancje czynne telmisartan i eplerenon, mogą zawierać na przykład równoważnik mg, korzystnie 80 albo 160 mg telmisartanu i równoważnik mg, korzystnie 25 albo 50 mg eplerenonu. Korzystną postacią do podawania są tabletki dwuwarstwowe. Do leczenia takich pacjentów z równoczesnymi oznakami dyslipidemii (np. hipertriglicerydemii lub hipercholesterolemii) często korzystna jest dodatkowa kombinacja z substancją obniżającą poziom lipidów, taką jak simwastatyna lub atorwastatyna, w zwykle stosowanych dawkach 2,5 40 mg, korzystnie 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 lub 40 mg. Odpowiednią postać do podawania telmisartanu, eplerenonu i atorwastatyny lub simwastatyny można wytwarzać np. jako tabletkę trójwarstwową. Substancję czynną eplerenon stosuje się przede wszystkim w postaci mikronizowanej o wielkości cząstek D 90 wynoszącej mikronów (porównaj WO 00/33847). [0031] Metformina jest uznanym środkiem przeciwcukrzycowym, którego główne działanie polega na obniżaniu podwyższonej produkcji glukozy przez wątrobę cukrzyka. W obserwowaniu terapii cukrzycy szczególne znaczenie ma wartość HbA1c, produktu nieenzymatycznego glikowania łańcucha B hemoglobiny. Ponieważ jego tworzenie zależy w

14 13 zasadzie od poziomu cukru we krwi i okresu życia erytrocytów, HbA1c w myśl pamięci poziomu cukru we krwi odwzorowuje średni poziom cukru we krwi ubiegłych 4 6 tygodni. Pacjenci cukrzycowi, których wartość HbA1c jest trwale dobrze ustawiona wskutek intensywnej terapii cukrzycowej (to jest < 6,5% całkowitej hemoglobiny w próbce), są wyraźnie lepiej chronieni przed cukrzycową mikroangiopatią. Sama metformina osiąga u cukrzyków średnie polepszenie wartości HbA1c rzędu wielkości 1,0 1,5%. To zmniejszenie wartości HbA1C nie u wszystkich cukrzyków jest wystarczające, aby uzyskać żądany zakres docelowy < 6,5%, a korzystnie < 6% HbA1c. Dlatego potrzebne są dodatkowe środki terapeutyczne, aby wzmocnić działanie metforminy. [0032] W ramach niniejszego wynalazku niespodziewanie stwierdzono, że telmisartan działa jako aktywator PPAR gamma. Tak więc telmisartan posiada potencjał podwyższania wrażliwości na insulinę tkanki tłuszczowej, mięśniowej i wątrobowej i uzyskiwania na tej drodze obniżania ciśnienia krwi. Czyni to telmisartan szczególnie odpowiednim partnerem kombinacji dla środków przeciwcukrzycowych, takich jak metformina lub repaglinid (przyspiesza uwalnianie insuliny z komórek B trzustki), ponieważ jego czynność polega na innej zasadzie działania i w ten sposób korzystnie wzmacnia sposób działania tych substancji czynnych. Postacie do podawania kombinacji repaglinidu i telmisartanu zawierają na przykład równoważnik 0,25 do 5 mg, korzystnie 0,25 do 2 mg, a szczególnie korzystnie 0,5 albo 1 albo 2 mg repaglinidu i równoważnik mg, korzystnie 80 albo 160 mg telmisartanu. [0033] Kombinacja telmisartanu i metforminy nadaje się szczególnie do stosowania w przypadku otyłych cukrzyków typu 2, ponieważ z jednej strony metformina w odróżnieniu od innych doustnych środków przeciwcukrzycowych nie prowadzi do podwyższenia wagi ciała, a z drugiej strony telmisartan zmniejsza oporność wobec insuliny jako ważną cechę i przyczynę podwyższonego poziomu cukru we krwi u tych cukrzyków typu 2. U większości otyłych cukrzyków typu 2, jak i u przedcukrzyków stwierdza się podwyższenie ciśnienia krwi, co należy również do kryteriów zespołu metabolicznego. Dla tej grupy pacjentów telmisartan stanowi korzystny środek przeciw nadciśnieniu, którego dodatkowe właściwości jako uczulacza insulinowego korzystnie współgrają z uznanym środkiem przeciwcukrzycowym, takim jak metformina, aby równocześnie i w równym stopniu leczyć różne aspekty schorzeń cukrzycy typu 2, stanu przedcukrzycowego typu 2 albo zespołu metabolicznego albo oporności wobec insuliny. Przez uzupełniające podawanie telmisartanu można uzyskać dodatkowe polepszenie wartości HbA1c rzędu wielkości

15 14 0,25 2%, korzystnie 0,25 1%, a szczególnie korzystnie 0,25 0,5%. Również polepszenie wartości HbA1c mniejsze niż 0,25% całkowitej hemoglobiny oznacza znaczące przyczynienie się do leczenia cukrzyków typu 2; nie jest to jednak dotychczas mierzalne w godny zaufania sposób. Jak wykazuje badanie UKPDS (United Kingdom Prospective Diabetes Study), zmniejszenie podwyższonego ciśnienia krwi działa tak samo, jak terapia obniżająca ciśnienie krwi, aby u cukrzyków typu 2 zmniejszać powikłania wtórne, takie jak nefropatia, neuropatia, retynopatia, jak też wszelkie powikłania makronaczyniowe. Tak więc zaproponowana kombinacja telmisartanu i metforminy oznacza istotny przyczynek dla zmniejszenia albo nawet nie dopuszczenia do poważnych następstw cukrzycy. [0034] Postacie do podawania kombinacji metforminy i telmisartanu zawierają na przykład równoważnik mg, korzystnie 500 albo 850 mg metforminy i równoważnik mg, korzystnie 80 albo 160 mg telmisartanu. Chlorowodorek metforminy jest dobrze rozpuszczalny i można go formułować bezproblemowo z substancjami pomocniczymi, takimi jak środki wiążące i środki smarne. Korzystną postacią do podawania są tabletki dwuwarstwowe. Kombinacja korzystnych ilości substancji czynnych i substancji pomocniczych jest następująca: Chlorowodorek metforminy (odpowiada 500 mg względnie 850 mg metforminy) Substancje pomocnicze (środki wiążące i środki smarne) co najmniej Telmisartan SD granulat (odpowiada 80 mg telmisartanu) Substancje pomocnicze z macierzy tabletek telmisartanu (sorbitol i środki smarne) Tabela 1: Tabletki z 80 mg telmisartanu Telmisartan/Metformina 80/500 mg 80/850 mg 643 mg 1094 mg 27 mg 46 mg 135 mg 135 mg 345 mg 345 mg Suma tabletki (co najmniej) 1150 mg 1620 mg

16 Chlorowodorek metforminy (odpowiada 500 mg względnie 850 mg metforminy) Substancje pomocnicze (środki wiążące i środki smarne) co najmniej Telmisartan SD granulat (odpowiada 160 mg telmisartanu) Substancje pomocnicze z macierzy tabletek telmisartanu (sorbitol i środki smarne) 15 Tabletka 2: Tabletki z 160 mg telmisartanu Telmisartan/Metformina 160/500 mg 160/850 mg 643 mg 1094 mg 27 mg 46 mg 270 mg 270 mg 690 mg 690 mg Suma tabletki (co najmniej) 1630 mg 2100 mg [0035] Postacie do podawania kombinacji repaglinidu i telmisartanu zawierają na przykład równoważnik 0,25 do 5 mg, korzystnie 0,25 do 2 mg, a szczególnie korzystnie 0,5 albo 1 albo 2 mg repaglinidu i równoważnik mg, korzystnie 80 albo 160 mg telmisartanu. Przykłady: Przykład 1: Telmisartan, losartan* i irbesartan nie wiążą się in vitro z domeną wiązania ligandów PPARgamma (*Przykład porównawczy) [0036] Białko zawierające domenę wiązania ligandów ludzkich PPARgamma (LBD) wytwarza się jako białko fuzyjne GST w E. coli i oczyszcza drogą chromatografii powinowactwa. W tym celu odcinek DNA, który koduje aminokwasy ludzkiego czynnika transkrypcji PPARgamma2 (porównaj wpis Genbank U79012), przez dodatkowo wprowadzone restrykcyjne miejsca cięcia BamH I i Xho I poddaje się subklonowaniu do wektora ekspresji pgex 4T 1 (Amersham) i kontroluje sekwencję odcinka. Ekspresja białka fuzyjnego następuje w zalecanym dla wektorów pgex szczepie E. coli BL21 (DE3) po indukcji za pomocą 0,2 mm IPTG w ciągu 4 godzin w temperaturze 25 0 C. Bakterie po zakończeniu indukcji peletkuje się i zamraża porcjami w PBS, ph 7,4. Po roztworzeniu w French Press rozpuszczone białko fuzyjne GST PPARgamma LBD oczyszcza się za pomocą kolumny

17 16 GSTrap (Pharmacia). Eluowanie prowadzi się przez dodawanie 20 mm zredukowanego glutationu. Frakcje białka GST PPARgamma LBD poddaje się odsalaniu za pomocą kolumny odsalającej HiTrap (Pharmacia) i określa się stężenie białka za pomocą standardowego testu. [0037] Białko zawierające domenę wiązania ligandów ludzkich RXRalfa (LBD) wytwarza się jako białko fuzyjne His tag w E. coli i oczyszcza drogą chromatografii powinowactwa. W tym celu odcinek DNA, który koduje aminokwasy ludzkiego czynnika transkrypcji RXRalfa (porównaj wpis Genbank NM002957, nr ), przez dodatkowo wprowadzone restrykcyjne miejsca cięcia BamH I i Not I poddaje się subklonowaniu do wektora ekspresji pet28c (Novagen) i kontroluje sekwencję odcinka. Ekspresja białka fuzyjnego następuje w zalecanym dla wektorów pet szczepie E. coli BL21 (DE3) po indukcji za pomocą 0,2 mm IPTG w ciągu 4 godzin w temperaturze 25 0 C. Bakterie po zakończeniu ekspresji peletkuje się i zamraża porcjami w PBS, ph 7,4. Po roztworzeniu w French Press rozpuszczone białko fuzyjne His RXRalfa oczyszcza się za pomocą kolumny chelatującej HiTrap (Pharmacia). Eluowanie prowadzi się przez etap 500 mm imidazolu. Frakcje białka His RXRalfa LBD poddaje się odsalaniu za pomocą kolumny odsalającej HiTrap (Pharmacia) i określa się stężenie białka za pomocą standardowego testu. a) Test AlphaScreen [0038] Testy Alpha Screen opisano po raz pierwszy w Ullmann EF i inni, Proc Natl Acad Sci USA (1994) 91: Pomiary przeprowadzone w ramach tego przykładu prowadzono w sposób opisany przez Glickman JF i inni, J Biomol Screen (2002) 7:3 10. Bufor testowy składa się z 25 mm Hepes ph 7,4, 100 mm NaCI, 1 mm DTT, 0,1% Tween 20, 0,1% BSA. 3 nm białka fuzyjnego GST PPARgamma LBD, 15 nm biotynylowanego peptydu LXXLL kofaktora CBP (odpowiednio do ujawnionego na stronie 218 Mukherjee R i inni, J Steroid Biochem Mol Biol (2002) 81: peptydu z dodatkową N końcową cysteiną) i każdorazowo 10 μg/ml kuleczek anty GST akceptora względnie kuleczek donora streptawidyny (Applied Biosystems) w łącznej objętości 12,5 μl w obecności różnych stężeń testowanej substancji (w DMSO) poddaje się inkubacji w ciągu 4 godzin w temperaturze pokojowej. Końcowe stężenie DMSO w teście wynosi 1% (v/v). Jako kontrolę tła (NSB) stosuje się 1% owy roztwór DMSO. Pomiar prowadzi się w urządzeniu do pomiaru fuzji Packard.

18 17 Stężenie/M Telmisartan Rosiglitazon MW SD MW SD NSB ,00E ,00E ,00E ,00E ,00E ,00E ,00E ,00E [0039] W przeciwieństwie do rosiglitazonu, znanego z literatury agonisty PPARgamma z wiązaniem w LBD, wraz ze wzrastającym stężeniem telmisartanu, losartanu i irbesartanu (stężenia do 50 μm) nie występuje żadne bezpośrednie aktywowanie PPARgamma LBD i w związku z tym żadna znacząca rekrutacja peptydu LXXLL. b) Test SPA [0040] Opis testu SPA znajduje się w Mukheriee R i inni, J Steroid Biochem Mol Biol (2002) 81: Bufor testowy składa się z 20 mm Tris ph 7,5, 25 mm KCI, 10 mm DTT i 0,2% Triton X nm białka fuzyjnego GST PPARgamma LBD, 30 nm His RXRalfa LBD, przeciwciała anty GST (1:600, Amersham Pharmacia), 0,25 mg kuleczek wiążących przeciwciała SPA PVT białka A (Amersham Pharmacia), 30 nm 3 H znaczonego rosiglitazonu w łącznej objętości 100 μl poddaje się inkubacji z rozcieńczeniami testowanej substancji w ciągu 5 godzin w temperaturze pokojowej. Jako kontrolę tła (NSB) dodaje się 10 μm nieznaczonego rosiglitazonu zamiast radioaktywnego rosiglitazonu, jako wartość maksymalną (Bmax) zamiast testowanej substancji dodaje się stosowany rozpuszczalnik, np. DMSO. [0041] Po inkubacji testowane mieszaniny odwirowuje się w ciągu 5 minut przy 2000 Upm w wirówce Hettich Universal 30Rf i dokonuje pomiaru w urządzeniu Packard TopCount NXT.

19 18 Stężenie/M Telmisartan Irbesartan Losartan MW SD MW SD MW SD NSB Bmax ,00E ,00E ,00E ,00E ,00E ,00E ,00E [0042] W przeciwieństwie do bezpośrednich agonistów PPARgamma, które wiążą się do PPARgamma LBD, również przy bardzo wysokich nadmiarach telmisartanu, losartanu lub irbesartanu nie występuje zależne od stężenia wypieranie radioaktywnego rosiglitazonu z kieszeni wiązania. c) Badania NMR [0043] W przeciwieństwie do bezpośredniego ligandu PPARgamma, np. rosiglitazonu, podczas pomiaru zakresu 15 N widma TROSY PPARgamma LBD w obecności testowanej substancji telmisartanu nie występuje wzajemne oddziaływanie testowanej substancji z aminokwasami kieszeni wiązania. Aminokwasy kieszeni wiązania w obecności testowanych substancji wykazują takie samo pozycjonowanie, jak w nieobecności ligandu. Przykład 2: Wytwarzanie stabilnie transformowanej linii komórkowej reportera PPARgamma [0044] Odcinek DNA, który koduje aminokwasy czynnika transkrypcji ludzkich PPARgamma2 (odpowiednio do nukleotydów sekwencji Genbank U79012), wbudowuje się przez dodatkowo wprowadzone restrykcyjne miejsca cięcia BamH I i Hind Ill do Multiple Cloning Site (miejsca wielokrotnego klonowania) wektora pfa CMV (Stratagene) i sekwencję weryfikuje się. Uzyskany plazmid pfa CMV/hPPARgamma2 LBD koduje N końcowo PPARgamma LBD w tej samej siatce odczytu domenę wiązania DNA Gal4. Dodatkowo plazmid koduje oporność na neomycynę.

20 19 [0045] Linię komórkową CHO K1 (ATCC CCL 61) poddaje się kotransfekcji z plazmidami pfa CMV/hPPARgamma2 LBD i pfr Luc (Stratagene). pfr Luc koduje gen lucyferazy pod kontrolą pięciokrotnie powtórzonego miejsca wiązania Gal4 drożdży. Transfekcję prowadzi się za pomocą lipofektaminy 2000 według danych dotyczących wytwarzania. Po transfekcji komórki hoduje się w pożywce (Ham F12 z 10% płodowej surowicy cielęcej) w obecności 0,5 mg/ml G 418. Po sześciodniowym hodowaniu komórki pasażuje się i utrzymuje w ciągu dalszych 10 dni w hodowli. Uzyskane kolonie oporne wobec neomycyny pikuje się pod mikroskopem i przenosi pojedynczo do płytek o 96 zagłębieniach i hoduje się. Otrzymuje się różne transformowane linie komórkowe z uzyskanymi plazmidami (np. klon nr 10, 11, 13 itp.), które dalej utrzymuje się w pożywce hodowlanej. [0046] Linie komórkowe bada się pod kątem zdolności do indukowania genu lucyferazy przez agonistę PPARgamma, np. rosiglitazon, i reagują one wzmożonym sygnałem lucyferazy na stymulowanie przez agonistę PPARgamma. Przykład 3: Telmisartan, losartan* i irbesartan aktywują PPARgamma komórkowo (*Przykład porównawczy) [0047] Wywodzącą się z transformowanego klonu 11 z przykładu 2 linię komórkową CHO K1 wysiewa się do płytki o płaskim dnie i 96 zagłębieniach z gęstością 3x10 4 komórek/200 μl/zagłębienie i hoduje przez noc w pożywce Ham F 12 z 10% płodowej surowicy cielęcej i 0,5 mg/ml G 418. Po upływie 24 godzin pożywkę wymienia się na pożywkę bez dodatku G 418. Testowane substancje za pomocą odpowiedniego rozpuszczalnika, np. DMSO, doprowadza się do 100 krotności żądanego stężenia i rozcieńcza się pożywką stosowaną na płytce do hodowli komórek w stosunku 1:100. Jako kontrolę tła stosuje się stosowany rozpuszczalnik, np. DMSO, w takim samym stężeniu. Po upływie 24 godzin po dodaniu substancji ciecz znad osadu odrzuca się i komórki przemywa się każdorazowo dwukrotnie 150 μl buforu do przemywania (25 mm tricyny, 16,3 mm MgSO 4, ph 7,8). Po przemywaniu do każdej testowanej mieszaniny dodaje się 50 μl buforu do przemywania z 150 μl lucyferazowego buforu testowego (25 mm tricyny, 0,5 mm EDTA, 0,54 mm NaTPP, 16,3 mm MgSO 4, 1,2 mm ATP, 0,05 mm lucyferyny, 56,8 mm 2 merkaptoetanolu, 0,1% Trition X 100, ph 7,8). Pomiar luminescencji prowadzi się po pięciominutowym odczekaniu na urządzeniu Packard TopCount NXT. Aktywność

21 20 lucyferazy uzyskuje się przez całkowanie względnych jednostek lucyferazy (RLU) w pierwszych dziesięciu sekundach po rozpoczęciu pomiaru. Stężenie/M Telmisartan Irbesartan Losartan Rosiglitazon MW SD MW SD MW SD MW SD NSB ,00E ,00E ,00E ,00E ,00E ,00E ,00E ,00E ,00E [0048] Za pomocą antagonisty receptora angiotensyny II telmisartanu następuje szczególnie silne aktywowanie szlaków PPARgamma w linii komórkowej reportera PPARgamma. Aktywowanie przez inne antagonisty receptora angiotensyny II, takie jak losartan i irbesartan, występuje dopiero przy wyższych stężeniach testowych i w mniejszymn wymiarze. Przykład 4: Doświadczenia z adipocytami 3T3 L1 i komórkami PC12W [0049] Mysie komórki preadipocytów 3T3 L1 hoduje się w pożywce DMEM (Dulbecco's modified eagle medium) z 10% płodowej surowicy cielęcej (FBS). Komórki PC12W hoduje się w pożywce DMEM z 5% FBS i 10% surowicy końskiej. W obydwu przypadkach media zawierają 1% penicyliny/streptomycyny. Różnicowanie adipocytów wywołuje się 2 3 dni po zlaniu komórek przez dodanie roztworu różnicującego. Zawiera on 1 μmol/l deksametazonu, 0,5 mmola/l 3 izobutylo 1 metyloksantyny, 1,67 μmoli/l insuliny i 10% FBS.

22 21 Dla porównania, różnicowanie wywołuje się również za pomocą roztworu różnicującego, który dodatkowo zawiera telmisartan. Po 48 godzniach (dzień 2) pożywkę zastępuje się przez pożywkę DMEM zawierającą 10% FBS i 1,67 μmoli/l insuliny względnie 10% FBS i 1,67 μmoli/l insuliny oraz telmisartan. Następnie komórki stymuluje się w ciągu dalszych 48 godzin, po czym ostatecznie poddaje się je analizie (dzień 4). Akumulacja lipidów w adipocytach 3T3 L1 [0050] Komórki przemywa się PBS i utrwala w ciągu 2 minut 3,7% owym roztworem formaldehydu. Po utrwaleniu komórki w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej zabarwia się rozcieńczonym 3:2 wodą 0,5% owym roztworem zapasowym Oil Red O w izopropanolu. Po przemyciu komórki bada się pod mikroskopem optycznym. 10 μmoli/l telmisartanu powoduje wzmożoną akumulację lipidów, która staje się widoczna wskutek zwiększonego zabarwienia przez Oil Red O. Telmisartan wpływa więc korzystnie na różnicowanie adipocytów 3T3 L1. Stymulowanie ekspresji ap2 w komórkach 3T3 L1 [0051] Wyodrębnianie RNA, odwrotną transkrypcję i kwantyfikację ekspresji genu prowadzi się w układzie wykrywania sekwencji AB 7000 dla PCR w czasie rzeczywistym (opisano w Janke i inni, Diabetes 51: , 2002). Jako endogenną kontrolę dla czasu rzeczywistego PCR stosuje się geny konstytutywnie eksprymowane 18S rrna i fosforybozylo transferazę hipoksantyny guaniny (hprt). Obserwowana indukcja zależna jest od stosowanego stężenia telmisartanu. 10 μmoli/l telmisartanu stymuluje ekspresję adipogennego markera genu otyłości białka 2 (ap2) w komórkach 3T3 L1 o 3,1±0,3 krotność (p < 0,01). Dla porównania stężenie 10 μmoli/l ligandu PPARgamma pioglitazonu stymuluje ekspresję ap2 o 4,5±1 krotność (p < 0,01). Testowanie reportera transkrypcji [0052] Dla zbadania, czy wywoływanie adipogenezy przez telmisartan jest wynikiem stymulowania czynności PPARgamma, prowadzi się doświadczenia transfekcji z konstruktami reportera PPRE (PPAR Response Element). Przejściowa transfekcja i stosowane testy lucyferazy opisane są w Kintscher i inni, Circ Res. 91:e35 44, Adipocyty 3T3 L1 (dzień 4) względnie komórki PC12W poddaje się transfekcji za pomocą lipofektaminy 2000 (Invitrogen) w obecności 1 μg (dla komórek 3T3 L1) względnie 50 ng (dla komórek PC12W) konstruktu reportera, wektora ekspresji PPARgamma2 i RXRalfa oraz 10 ng wektora kontrolnego reportera lucyferazy Renilla. W przypadku konstruktu reportera chodzi o fuzję elementu odpowiedzi PPAR (PPRE) oksydazy 3xAcylo CoA z Tk

23 22 lucyferazą. Stosowane wektory ekspresji PPARgamma2 i RXRalfa odpowiadają wektorom opisanym w Elbrecht i inni, Biochem Biophys Res Com 224: , 1996 i Joseph i inni, J Biol Chem 277 (13): , W przypadku wektora kontrolnego reportera lucyferazy chodzi o plazmid prl CMV (Promega). Po upływie 4 godzin pożywkę transfekcyjną zastępuje się pożywką DMEM z 10% FBS, która dodatkowo zawiera telmisartan, pioglitazon albo nośnik DMSO. Aktywność lucyferazy mierzy się po upływie 24 godzin. [0053] Traktowanie 3T3 L1 adipocytów za pomocą 10 μmoli/l telmisartanu prowadzi do indukcji aktywności transkrypcyjnej PPARgamma o 3,4±0,9 krotność (p < 0,05) w porównaniu z indukcją o 5,2±1,1 krotność przez 10 μmoli/l pioglitazonu. [0054] Komórki PC12W wykazują deficyt receptora AT 1. PPARgamma 2 i jego heterodimeryczny partner RXRalfa wykazują nadekspresję w komórkach PC12W i mierzy się zależną od PPARgamma transkrypcję w obecności względnie nieobecności 10 μmoli/l telmisartanu względnie pioglitazonu. Ponieważ komórki PC12W nie wykazują ekspresji PPARgamma, w nieobecności egzogennego PPARgamma2/RXRalfa nie mierzy się regulacji czynności PPARgamma. Przy nadekspresji heterodimeru PPARgamma 2/RXRalfa telmisartan indukuje jednak też w komórkach PC12W z deficytem receptora AT 1 czynność PPARgamma o 1,9±0,4 krotność (p < 0,05). W porównaniu z tym pioglitazon indukuje czynność PPARgamma o 4,2±1,4 krotność (p < 0,01). Dowodzi to, że aktywowanie czynności PPARgamma przez telmisartan następuje niezależnie od blokowania receptora AT 1. [0055] Dane te oznaczają także, że stężenia telmisartanu, które są niezbędne do stymulowania czynności PPARgamma, można uzyskać w osoczu krwi pacjentów, którzy są leczeni telmisartanem przeciw nadciśnieniu. Oznacza to, że leczenie wysokiego ciśnienia krwi za pomocą telmisartanu dodatkowo może polepszać wrażliwość na insulinę, co działa pozytywnie na poziom cukru we krwi. Przykład 5: Przykłady preparatów [0056] Tabletka 1 Przez bezpośrednie prasowanie soli sodowej telmisartanu z substancjami pomocniczymi i stearynianem magnezu otrzymuje się tabletki o następującym składzie: