QUANTA Lite Intrinsic Factor ELISA Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka

Transkrypt

1 QUANTA Lite Intrinsic Factor ELISA Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka Przeznaczenie QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA jest to immunoenzymatyczny test (ELISA) do półilościowego wykrywania przeciwciał przeciwko czynnikowi wewnętrznemu w surowicy człowieka. Obecność przeciwciał przeciwko czynnikowi wewnętrznemu może być stosowana w połączeniu z objawami klinicznymi i innymi badaniami laboratoryjnymi w celu pomocy w diagnostyce niedokrwistości złośliwej. Podsumowanie i wyjaśnienie testu Niedokrwistość złośliwa (niedokrwistość Addisona-Biermera) jest chorobą przewlekłą i stanowi ostatnie stadium przewlekłego (autoimmunologicznego) zanikowego zapalenia błony śluzowej żołądka typu A. Typ A ma charakter autoimmunologiczny i wiąże się z niedokrwistością złośliwą. Typ B (nieautoimmunologiczny) wiąże się z infekcją drobnoustrojem H. pylori 1,2,3 W rozwoju przewlekłego zanikowego zapalenia błony śluzowej żołądka typu A, komórki ścienne żołądka produkujące czynnik wewnętrzny i HCl oraz komórki główne żołądka, produkujące pepsynogen, ulegają zniszczeniu a wytwarzanie czynnika wewnętrznego (Intrinsic Factor, IF) i HCl ustaje. Czynnik wewnętrzny jest niezbędny do wchłaniania witaminy B 12 z jelita a jego brak prowadzi do niedoboru witaminy B 12 i niedokrwistości megaloblastycznej. Diagnoza niedokrwistości złośliwej jest istotna dla leczenia niedokrwistości jako takiej i zapobieżenia nieodwracalnemu uszkodzeniu układu nerwowego. 1,4 Wykazano, że u pacjentów z niedokrwistością złośliwą występuje trzykrotnie większe ryzyko raka żołądka i trzynastokrotnie większe ryzyko rakowiaka żołądka oraz podwyższone ryzyko raka kolczystokomórkowego przełyku. 5-7 Krążące przeciwciała przeciwko czynnikowi wewnętrznemu są wysoko swoiste i można je wykryć u >50% pacjentów z niedokrwistością złośliwą. 1,3 Przeciwciała te są dwojakiego typu: Typ 1, przeciwciała blokujące, które uniemożliwiają związanie się witaminy B 12 z cząsteczką IF oraz typ 2, przeciwciała, które mogą zakłócać wiązanie się kompleksu IF-witamina B 12 z receptorem w krętnicy. 1,8 Test QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA, inaczej niż inne metody oparte na teście radioimmunologicznym, wykrywa zarówno przeciwciało typu 1 jak i 2. Wraz z innymi danymi klinicznymi i laboratoryjnymi, pozytywny wynik badania na obecność przeciwciał przeciwko czynnikowi wewnętrznemu może pomóc odróżnić autoimmunologiczną niedokrwistość złośliwą od innych niedokrwistości megaloblastycznych, jak również odróżnić zanikowe zapalenie błony śluzowej żołądka typu A od innych form niespecyficznego potwierdzonego histologicznie zapalenia żołądka. 1,3,9 Zasada badania Oczyszczony zrekombinowany ludzki antygen czynnika wewnętrznego pełnej długości wiąże się z dołkami płytki polistyrenowej w warunkach, które zabezpieczają antygen w jego natywnym stanie. Wstępnie rozcieńczone kontrole i rozcieńczone surowice pacjentów są dodawane do oddzielnych dołków, umożliwiając obecnym przeciwciałom przeciwko czynnikowi wewnętrznemu związanie się z unieruchomionym antygenem. Niezwiązana próbka jest wypłukiwana i do każdego dołka dodawany jest koniugat znakowanego enzymem przeciwciała przeciw-ludzkiego IgG. Druga inkubacja umożliwia przeciwciałom przeciw-ludzkim IgG znakowanym enzymem związać się z dowolnymi przeciwciałami pacjenta, które zostały przytwierdzone do mikrodołków. Po wypłukaniu wszelkich niezwiązanych przeciwciał przeciw-ludzkich IgG znakowanych enzymem, aktywność pozostałego enzymu bada się dodając substrat chromogeniczny i mierząc intensywność powstałej barwy. Badanie może zostać ocenione spektrofotometrycznie, poprzez zmierzenie i porównanie intensywności barwy, która powstaje w dołkach z próbkami od pacjenta z barwą dołków kontrolnych. Odczynniki 1. Polistyrenowa płytka z mikrodołkami ELISA pokryta oczyszczonym antygenem ludzkiego czynnika wewnętrznego (12-1 x 8 dołków), z uchwytem, w torebce foliowej zawierającej osuszacze 2. Kontrola negatywna ELISA, 1 fiolka buforu zawiera konserwant i surowicę ludzką bez ludzkich przeciwciał przeciwko antygenowi czynnika wewnętrznego, wstępnie rozcieńczona, gotowa do użycia, 1,2 ml 3. Słabo pozytywna kontrola testu Intrinsic Factor ELISA, 1 fiolka buforu zawiera konserwant i przeciwciała surowicy ludzkiej przeciwko antygenowi czynnika wewnętrznego, wstępnie rozcieńczona, gotowa do użycia 1,2 ml 4. Silnie pozytywna kontrola testu Intrinsic Factor ELISA, 1 fiolka buforu zawiera konserwant i przeciwciała surowicy ludzkiej przeciwko antygenowi czynnika wewnętrznego, wstępnie rozcieńczona, gotowa do użycia 1,2 ml 5. Rozcieńczalnik do próbek HRP, 1 fiolka zabarwienie różowe, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS, Tween 20, stabilizatory białka i konserwant, 50 ml 6. Koncentrat do płukania HRP, 1 fiolka koncentratu 40x zabarwienie czerwone, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS i Tween 20, 25 ml. Instrukcje dotyczące rozcieńczania można znaleźć w sekcji Metody. 7. Koniugat HRP IgG, (kozie), przeciw-ludzkie IgG, 1 fiolka zabarwienie niebieskie, zawiera bufor, stabilizatory białka i konserwant, 10 ml 8. Chromogen TMB, 1 fiolka zawierająca stabilizatory, 10 ml 9. Roztwór zatrzymujący HRP, kwas siarkowy 0,344M, 1 fiolka bezbarwny, 10 ml 1

2 Ostrzeżenia 1. OSTRZEŻENIE: Ten produkt zawiera substancję chemiczną (chloramfenikol 0,02%) w rozcieńczalniku do próbek, kontrolach i koniugacie, która według stanu Kalifornii wywołuje raka. 2. Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowywaniu kontroli dla tego produktu zostały przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA stwierdzono że nie zawierają przeciwciał przeciwko HIV, HBsAg i HCV. Jednak żadna metoda testowania nie może całkowicie zagwarantować braku obecności HIV, HBV, HCV lub innych czynników zakaźnych. Z tego też względu słabo pozytywną kontrolę testu Intrinsic Factor ELISA, silnie pozytywną kontrolę testu Intrinsic Factor ELISA oraz kontrolę negatywną ELISA należy użytkować w ten sam sposób, jak materiał potencjalnie zakaźny Jako konserwant stosowany jest azydek sodu. Azydek sodu jest trucizną i może być toksyczny w przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Azydek sodu może wchodzić w reakcję z ołowianą lub miedzianą instalacją wodociągową, tworząc potencjalnie wybuchowe azydki metali. Jeśli do usuwania odczynników używane są zlewy, należy przepłukiwać je dużą ilością wody, aby nie dopuścić do gromadzenia się azydku. 4. Koniugat HRP zawiera rozcieńczoną trującą/korozyjną substancję chemiczną, która może być toksyczna w przypadku spożycia w dużej ilości. Aby uniknąć potencjalnych oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 5. Chromogen TMB zawiera środek drażniący, w który może być szkodliwy w przypadku wdychania, spożycia lub wchłonięcia przez skórę. Aby uniknąć urazów, należy unikać wdychania, spożycia lub kontaktu ze skórą i oczami. 6. Roztwór zatrzymujący HRP składa się z rozcieńczonego roztworu kwasu siarkowego. Unikać wystawienia na działanie zasad, metali lub innych związków, które mogą wchodzić w reakcje z kwasami. Kwas siarkowy jest trucizną i ma właściwości korozyjne. W razie połknięcia może być toksyczny. Aby uniknąć oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 7. Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej. 8. Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych i lokalnych przepisów w zakresie utylizacji odpadów. Środki ostrożności 1. Ten produkt jest przeznaczony do zastosowań diagnostycznych in vitro. 2. Zastąpienie składników dostarczonych w tym systemie innymi składnikami może skutkować osiągnięciem niespójnych wyników. 3. Niepełne lub nieprawidłowe płukanie i niewystarczające usunięcie płynu z płytek z dołkami ELISA wpłynie negatywnie na precyzję badań i/lub spowoduje wysoki poziom tła. 4. Dostosowanie tego badania do stosowania ze zautomatyzowanymi analizatorami próbek oraz innymi urządzeniami do pracy z płynami, w całości lub w części, może skutkować rozbieżnością wyników w stosunku do badań przeprowadzanych ręcznie. Obowiązkiem każdego laboratorium jest potwierdzenie, że wyniki testów uzyskanych na podstawie zautomatyzowanych badań mieszczą się w akceptowalnych limitach. 5. Na wyniki analizy wpływa wiele różnych czynników. Obejmują one temperaturę początkową odczynników, temperaturę otoczenia, dokładność i powtarzalność techniki pipetowania, dokładność płukania i usuwania płynu z dołków płytek ELISA, fotometr użyty do analizy wyników oraz czasy trwania inkubacji podczas badania. Uzyskanie dokładnych i powtarzalnych wyników wymaga staranności i precyzji. 6. Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury testowej. 7. Niedokładne zamknięcie torebki z zamknięciem strunowym, zawierającej płytki z mikrodołkami i osuszaczami, spowoduje degradację antygenu i brak precyzji badania. 8. Dwukrotne lub wielokrotne użycie koniugatu HRP z jednej butelki w pewnym okresie czasu może spowodować niedopuszczalnie niski poziom absorbancji. Aby nie dopuścić do takiej sytuacji istotne jest przestrzeganie wszystkich zaleceń dotyczących procedur pracy z koniugatem HRP. 9. Zanieczyszczenie chemiczne koniugatu HRP może być spowodowane nieprawidłowym czyszczeniem lub płukaniem sprzętu lub narzędzi. Pozostałości typowych laboratoryjnych substancji chemicznych, takich jak formalina, substancja wybielająca, etanol lub detergent, z czasem spowodują degradację koniugatu HRP. Po użyciu chemicznych substancji czyszczących/dezynfekujących dokładnie wypłukać cały sprzęt i wszystkie narzędzia. Warunki przechowywania 1. Wszystkie odczynniki z zestawu przechowywać w temperaturze 2-8 C. Nie zamrażać. Odczynniki są trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używane zgodnie z instrukcjami. 2. Nieużyte płytki z mikrodołkami pokrytymi antygenem powinny być starannie zamknięte w torebce foliowej z osuszaczami i przechowywane w temperaturze 2-8 C. 3. Rozcieńczony bufor do płukania zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2-8 C. 2

3 Pobieranie próbek Ta procedura powinna być wykonana z próbką surowicy. Dodanie azydku lub innych konserwantów do próbek analitycznych może mieć negatywny wpływ na wyniki. Nie używać próbek zawierających widoczne zanieczyszczenia, skażonych bakteryjnie lub podgrzanych. Należy unikać całkowicie zhemolizowanej lub lipemicznej surowicy albo próbek. Po pobraniu surowica powinna być oddzielona od skrzepu. Dokument CLSI (NCCLS) H18-A3 zaleca następujące warunki przechowywania próbek: 1) Przechowywać próbki w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 8 godzin. 2) Jeśli badanie nie zostanie zakończone w ciągu 8 godzin, schłodzić próbkę do temperatury 2-8 C. 3) Jeśli badanie nie zostanie ukończone w ciągu 48 godzin lub w przypadku transportu próbki, należy zamrozić ją w temperaturze -20 C lub niższej. Zamrożone próbki po rozmrożeniu i przed badaniem muszą zostać dobrze wymieszane. 11 Badanie Dostarczone materiały 1 Płytka z mikrodołkami testu Intrinsic Factor ELISA (12-1 x 8 dołków), z uchwytem 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej testu ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu Intrinsic Factor ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej silnie pozytywnej kontroli testu Intrinsic Factor ELISA 1 50 ml rozcieńczalnika do próbek HRP 1 25 ml koncentratu do płukania HRP, koncentrat 40x 1 10 ml koniugatu IgG HRP, (kozi) 1 10 ml chromogenu TMB 1 10 ml roztworu zatrzymującego HRP, kwas siarkowy 0,344M Wymagane materiały nie dołączone do zestawu Mikropipety na 5, 100, i 500 µl Jednorazowe końcówki mikropipet Probówki do roztworów próbek pochodzących od pacjenta, 4 ml objętości Woda destylowana lub dejonizowana Naczynie o objętości 1 l do rozcieńczonego koncentratu HRP do płukania Czytnik płytek z mikrodołkami umożliwiający pomiar gęstości optycznej przy 450 nm (i przy 620 nm dla odczytów przy dwóch długościach fali) Sposób przygotowania Przed rozpoczęciem 1. Doprowadzić wszystkie odczynniki i próbki do temperatury pokojowej (20-26 o C) i dobrze wymieszać. 2. Rozcieńczyć koncentrat do płukania HRP w stosunku 1:40, dodając zawartość butelki koncentratu do płukania HRP do 975 ml wody destylowanej lub dejonizowanej. Jeśli cała płytka nie zostanie przetworzona w tym czasie, można przygotować mniejszą ilość. W tym celu należy dodać 2,0 ml koncentratu do 78 ml wody destylowanej lub dejonizowanej na każde 16 dołków, które będą użyte. Rozcieńczony bufor zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 o C. 3. Przygotować roztwór 1:101 każdej próbki pobranej od pacjenta, dodając 5 µl próbki do 500 µl rozcieńczalnika do próbek HRP. Rozcieńczone próbki muszą być użyte w ciągu 8 godzin od przygotowania. NIE ROZCIEŃCZAĆ słabo pozytywnej kontroli testu Intrinsic Factor ELISA, silnie pozytywnej kontroli testu Intrinsic Factor ELISA oraz negatywnej kontroli ELISA. 4. Ustalenie obecności lub nieobecności przeciwciał przeciwko czynnikowi wewnętrznemu z zastosowaniem jednostek umownych wymaga dwóch dołków dla każdej z trzech kontroli oraz jednego lub dwóch dołków dla każdej próbki od pacjenta. Zalecane jest wykonanie duplikatów próbek. Procedura badania 1. WSZYSTKIE ODCZYNNIKI PRZED ROZPOCZĘCIEM BADANIA MUSZĄ BYĆ DOPROWADZONE DO TEMPERATURY POKOJOWEJ (20 26 C). Umieścić wymaganą liczbę mikrodołków/pasków w uchwycie. Natychmiast umieścić nieużywane płytki w torebce foliowej zawierającej osuszacz i dobrze ją zamknąć, aby ograniczyć kontakt z parą wodną. 2. Do dołków dodać 100 µl wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu Intrinsic Factor ELISA, silnie pozytywnej kontroli testu Intrinsic Factor ELISA, kontroli negatywnej testu ELISA i rozcieńczone próbki pochodzące od pacjentów. Przykryć dołki i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na równej powierzchni. Czas inkubacji rozpoczyna się po dodaniu ostatniej próbki. 3. Etap płukania: Odessać całkowicie zawartość każdego dołka. Dodać µl rozcieńczonego buforu do płukania HRP do wszystkich dołków, a następnie odessać. Powtórzyć tę sekwencję jeszcze dwukrotnie, aby łącznie przeprowadzić trzy płukania. Odwrócić płytkę i postukać w nią na materiale pochłaniającym w celu usunięcia pozostałości płynu po ostatnim płukaniu. Ważne jest, aby całkowicie opróżnić każdy dołek po każdym etapie płukania. Zachować tę samą sekwencję odsysania, jak w przypadku dodawania próbki. 3

4 4. Do każdego dołka dodać 100 μl koniugatu IgG HRP. Koniugat powinien być usunięty z butelek z zastosowaniem standardowych warunków aseptycznych oraz zalecanych technik laboratoryjnych. Pobrać z butelki jedynie wymaganą do analizy ilość koniugatu. ABY UNIKNĄĆ POTENCJALNEGO ZANIECZYSZCZENIA BAKTERYJNEGO I/LUB CHEMICZNEGO, NIE WOLNO WLEWAĆ NIEUŻYTEGO KONIUGATU Z POWROTEM DO BUTELKI. Inkubować dołki przez 30 minut jak w etapie Etap płukania: Powtórzyć etap Dodać 100 µl chromogenu TMB do każdego dołka i inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej. 7. do każdego dołka dodać 100 µl roztworu zatrzymującego HRP. Zachować tę samą sekwencję i czas dodawania roztworu zatrzymującego HRP, jak w przypadku chromogenu TMB. Delikatnie postukać płytkę palcem, aby dokładnie wymieszać zawartość dołków. 8. W ciągu jednej godziny od zatrzymania reakcji odczytać absorbancję (gęstość optyczną) każdego dołka przy długości fali 450 nm. Jeśli wymagane są pomiary bichromatyczne, referencyjną długością fali może być długość 620 nm. Kontrola jakości 1. Aby upewnić się, że wszystkie odczynniki i procedury funkcjonują prawidłowo, każdą serię próbek należy testować wraz ze słabo pozytywną kontrolą testu Intrinsic Factor ELISA, silnie pozytywną kontrolą testu Intrinsic Factor ELISA i kontrolą negatywną testu ELISA. 2. Należy zauważyć, że ponieważ słabo pozytywna kontrola testu Intrinsic Factor ELISA, silnie pozytywna kontrola testu Intrinsic Factor ELISA i kontrola negatywna testu ELISA są już wstępnie rozcieńczone, to nie będą one stanowić kontroli w przypadku procedur związanych z rozcieńczaniem próbek. 3. Dodatkowe kontrole mogą być przebadane zgodnie z wytycznymi lub wymaganiami lokalnych i/lub krajowych przepisów lub organów normalizacyjnych. Dodatkowe odpowiednie surowice kontrolne można przygotować, dzieląc połączone próbki surowicy ludzkiej i przechowując je w temperaturze - 20 C. 4. Aby wyniki badania mogły być uznane jako ważne, muszą zostać spełnione wszystkie poniższe kryteria. Jeśli jakiekolwiek kryterium nie będzie spełnione, badanie powinno być traktowane jako nieważne i powinno zostać powtórzone. a. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej silnie pozytywnej kontroli testu Intrinsic Factor ELISA musi być większa niż absorbancja wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu Intrinsic Factor ELISA, która z kolei musi być większa niż absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA. b. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej silnie pozytywnej kontroli testu Intrinsic Factor ELISA musi być większa niż 1,0, natomiast absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA nie może przekroczyć 0,2. c. Absorbancja słabo pozytywnej kontroli testu Intrinsic Factor ELISA musi być przynajmniej dwukrotnie wyższa od absorbancji kontroli negatywnej testu ELISA lub przekraczać 0,25. d. Kontrola negatywna testu ELISA i silnie pozytywna kontrola testu Intrinsic Factor ELISA mają za zadanie wykazać ewentualne istotne nieprawidłowe działanie odczynnika. Silnie pozytywna kontrola testu Intrinsic Factor ELISA nie zapewni dokładności przy wartości granicznej badania. e. Dodatkowe wytyczne dotyczące odpowiednich praktyk QC można znaleźć w dokumencie CLSI (NCCLS) C24-A2. 12 Obliczanie wyników W pierwszej kolejności jest określana średnia gęstość optyczna każdego zestawu duplikatów. Reaktywność każdej próbki można następnie wyliczyć, dzieląc średnią gęstość optyczną próbki przez średnią gęstość optyczną słabo pozytywnej kontroli testu Intrinsic Factor ELISA. Otrzymany wynik mnoży się przez liczbę jednostek przypisanych do słabo pozytywnej kontroli testu Intrinsic Factor ELISA, którą można znaleźć na etykiecie. Wartość próbki = (jednostki) Gęstość optyczna próbki gęstość optyczna słabo pozytywnej kontroli testu Intrinsic Factor ELISA x słabo pozytywna kontrola testu Intrinsic Factor ELISA (jednostki) Reaktywność w sposób nieliniowy zależy od ilości obecnych przeciwciał. Wzrosty i spadki stężeń przeciwciał u pacjenta będą odzwierciedlone w analogicznym wzroście lub spadku reaktywności, jednak zmiana ta nie jest proporcjonalna (tzn. podwojenie stężenia przeciwciał nie oznacza podwojenia reaktywności). Jeśli wymagane jest dokładniejsze oszacowanie ilości przeciwciał pacjenta, należy przeprowadzić seryjne badanie próbek otrzymanych od pacjenta i ostatnie rozcieńczenie w ramach badania z wynikiem pozytywnym powinno być zaraportowane jako miano przeciwciał pacjenta. 4

5 Interpretacja wyników Badanie ELISA jest bardzo wrażliwe na technikę i jest w stanie wychwycić nawet najdrobniejsze różnice w populacjach pacjentów. Poniższe wartości są jedynie wartościami sugerowanymi. Każde laboratorium powinno ustalić własny normalny zakres na podstawie własnych technik, kontroli, sprzętu i populacji pacjentów, zgodnie z własnymi ustalonymi procedurami. Próbka następnie może być sklasyfikowana jako negatywna, niejednoznaczna lub pozytywna, zgodnie z poniższą tabelą. Jednostki Negatywna 20 Niejednoznaczne 20,1-24,9 Pozytywne Wynik pozytywny wskazuje na obecność przeciwciał przeciwko czynnikowi wewnętrznemu i sugeruje możliwość wystąpienia niedokrwistości złośliwej. 2. Wynik negatywny świadczy o tym, że nie występują przeciwciała przeciwko czynnikowi wewnętrznemu, lub że ich poziom jest poniżej dolnej wartości granicznej badania. 3. Negatywny wynik na obecność przeciwciała przeciwko czynnikowi wewnętrznemu nie wyklucza niedokrwistości złośliwej, gdyż jedynie u 60% pacjentów z niedokrwistością złośliwą występują te przeciwciała Próbka z niejednoznacznymi poziomami przeciwciał nie może być oznaczona pod kątem statusu przeciwciał. Jeśli wyniki nadal są niejednoznaczne po powtórzonym badaniu, wynik należy zaraportować jako niejednoznaczny i/lub pobrać później dodatkową próbkę. 5. Występowanie przeciwciał skierowanych przeciwko komórkom ściennym żołądka może lub nie musi iść w parze występowaniem przeciwciał przeciwko czynnikowi wewnętrznemu a ich miano, dodatkowo, lub w połączeniu z mianem przeciwciał przeciwko czynnikowi wewnętrznemu, może wspomóc diagnozowanie pacjentów z podejrzeniem niedokrwistości złośliwej Zalecane jest, aby wyniki raportowane przez laboratorium zawierały oświadczenie: Poniższe wyniki zostały uzyskane przy użyciu zestawu INOVA QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA. Nie można stosować zamiennie wartości przeciwciał przeciwko czynnikowi wewnętrznemu uzyskanych przy zastosowaniu metod testowych innych producentów. Rząd wielkości poziomów raportowanego IgG nie może być skorelowany z mianem punktu końcowego. Ograniczenia badania 1. Obecność kompleksów immunologicznych lub innych agregatów immunoglobuliny w próbce pochodzącej od pacjenta może powodować podwyższony poziom nieswoistego wiązania i wytwarzać fałszywe pozytywne wyniki w tym badaniu. 2 Wyniki tego badania powinny być użyte w powiązaniu z wynikami klinicznymi i innymi badaniami serologicznymi. Pacjenci z niedokrwistością złośliwą mogą mieć przeciwciała przeciwko czynnikowi wewnętrznemu i/lub komórkom ściennym żołądka. Chociaż występowanie dwóch typów przeciwciał uwiarygodnia diagnozę niedokrwistości złośliwej, to u pacjentów z niedokrwistością złośliwą występować może tylko jeden typ przeciwciał. 1,9 3. Charakterystyka wyników badania nie została ustanowiona dla podłoża innego niż surowica. Spodziewane wartości Normalny zakres Przy użyciu zestawu QUANTA Lite Intrinsic Factor ELISA przebadano 476 próbek pochodzących od zdrowych osób nie wykazujących żadnych objawów. Zakres wiekowy wynosił od 14 do 78 lat (mediana=43). Spośród 276 próbek, dla których dostępne były dane na temat płci i wieku dawców, 150 pochodziło od mężczyzn i 126 od kobiet. Z 476 próbek, jedna dała wynik silnie pozytywny (103,2 jednostki), 1 dała wynik pozytywny (wynik graniczny - 25,5 jednostki) a jedna dała wynik niejednoznaczny (wynik graniczny - 20,2 jednostki). Swoistość badania wyniosła 99,4% (473/476). Częstość występowania niedokrwistości złośliwej oceniono na 0,1-0,2%. Z wyłączeniem jednego izolowanego wyniku silnie pozytywnego wartości średnie i mediany dla grupy kontrolnej złożonej ze zdrowych osób wynosiły odpowiednio 5,7 jednostki and 5,0 jednostek. Specyficzna charakterystyka wyników Aby ocenić czułość i swoistość testu QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA przebadano ogółem 177 próbek pochodzących od pacjentów z podejrzeniem, założeniem lub potwierdzeniem niedokrwistości złośliwej, jak to opisano poniżej w części Badania kliniczne i 499 próbek pochodzących od stanowiących kontrolę osób zdrowych (476) i chorych (23). Wartości średniej i mediany dla grupy nie cierpiącej na niedokrwistość złośliwą wynosiły odpowiednio 5,9 i 4,9 jednostki. 5

6 Badania kliniczne Próbki podzielono na 3 kategorie odzwierciadlające stopień pewności diagnozy niedokrwistości złośliwej: 1) Podejrzenie niedokrwistości złośliwej - występują przeciwciała przeciwko komórkom ściennym żołądka i/lub małe stężenie witaminy B 12, lecz wyniki przeciwciał przeciwko czynnikowi wewnętrznemu są niejednoznaczne; 2) Zakładana niedokrwistość złośliwa wyniki laboratoryjne potwierdzają niedokrwistość złośliwą, występują przeciwciała przeciwko komórkom ściennym żołądka i małe stężenie witaminy B 12 zwiększona średnia objętość krwinki czerwonej (typowy objaw niedokrwistości złośliwej); 3) Potwierdzona niedokrwistość złośliwa wyniki laboratoryjne potwierdzają niedokrwistość złośliwą, występują przeciwciała przeciwko komórkom ściennym żołądka i małe stężenie witaminy B 12, zwiększona średnia objętość krwinki czerwonej (typowy objaw niedokrwistości złośliwej) a badania hematologiczne potwierdzają niedokrwistość megaloblastyczną. Czułość testu obliczono w sposób następujący: 1) licząc próbki z potwierdzeniem lub założeniem niedokrwistości złośliwej jako potwierdzające chorobę a próbki z podejrzeniem niedokrwistości złośliwej jako niepotwierdzające chorobę i 2) licząc próbki z potwierdzeniem, założeniem i podejrzeniem niedokrwistością złośliwej jako potwierdzające chorobę. Żadna z próbek z podejrzeniem niedokrwistości nie dała wyniku pozytywnego na obecność przeciwciał przeciwko czynnikowi wewnętrznemu. Tabela 1: Swoistość i czułość testu QUANTA Lite Intrinsic Factor ELISA n= pozyt. niejedn negat. Potwierdzenie (n=43) i założenie (n=55) niedokrwistości złośliwej* Wszystkie próbki od pacjentów z niedokrwistością złośliwą** Podejrzenie (n=79), założenie (n=55) i potwierdzenie niedokrwistości złośliwej (n=43) Niedokrwistość inna niż niedokrwistość złośliwa (stanowiące kontrolę osoby zdrowe i chore) * próbki z podejrzeniem niedokrwistości złośliwej liczone jako próbki niewykazujące choroby ** próbki z podejrzeniem niedokrwistości złośliwej liczone jako próbki potwierdzające chorobę Wrażliwość 1) Włączone grupy z założeniem i potwierdzeniem niedokrwistości złośliwej jako potwierdzające chorobę: 93,9% (92/98); 95% Przedział ufności (CI): 87,1%- 97,7% Uwaga: W analizie tej wyniki niejednoznaczne uznano za negatywne 2) Włączone grupy z podejrzeniem, założeniem i potwierdzeniem niedokrwistości złośliwej jako potwierdzające chorobę: 52,0% (92/177); 95% Przedział ufności (CI): 44,4%- 59,5% Uwaga: W analizie tej wyniki niejednoznaczne uznano za negatywne Swoistość 99,6% (497/499); 95% Przedział ufności (CI): 98,8-100% Uwaga: W analizie tej wyniki niejednoznaczne uznano za negatywne Skuteczność 1) Włączone grupy z założeniem i potwierdzeniem niedokrwistości złośliwej jako potwierdzające chorobę: 98,7% 2) Włączone grupy z podejrzeniem, założeniem i potwierdzeniem niedokrwistości złośliwej jako potwierdzające chorobę: 87,1% Porównanie z urządzeniami predykatowymi Test QUANTA Lite Intrinsic Factor ELISA porównano z zatwierdzonym przez FDA testem ELISA do wykrywania przeciwciał przeciwko komórkom ściennym żołądka (GPA) i testem RIA na obecność przeciwciał przeciwko czynnikowi wewnętrznemu (IF). Procentowa zgodność wyników negatywnych wynosiła dla wszystkich trzech testów od 97,5 do 100%. Procentowa zgodność wyników pozytywnych między testem QUANTA Lite Intrinsic Factor ELISA a testem IF RIA przeprowadzanym w laboratorium 1 wynosiła 93,3%, lecz w laboratorium 2 wynosiła ona 30,3%. Wszystkie pozytywne wyniki uzyskane w teście RIA w laboratorium 1 uzyskano dla próbek pochodzących od osób z wynikami badań hematologicznych potwierdzającymi niedokrwistość złośliwą. Laboratorium 2 nie posiadało informacji klinicznych dotyczących badanych próbek. Tabela 2: Zgodność wyników uzyskanych w teście QUANTA Lite Intrinsic Factor ELISA i testach predykatowych Predykatowy test GPA ELISA Lab. 1, test predykatowy Lab. 2, test predykatowy Test QUANTA Lite TM Intrinsic Factor Antibody ELISA Intrinsic Factor RIA Intrinsic Factor RIA % zgodności wyników pozytywnych 29,7% (22/74) 93,2% (41/44) 30,3% (24/79) % zgodności wyników negatywnych 97,5% (193/198) 100% (25/25) 100% (26/26) Ogólna zgodność 49,1% (220/278) 95,6% (66/69) 63,3% (50/79) 6

7 Reaktywność krzyżowa W celu określenia reaktywności krzyżowej przebadano surowice pochodzące od 23 pacjentów z różnymi chorobami autoimmunologicznymi lub zakaźnymi z występującymi w nich przeciwciałami przeciwko H. pylori, mitochondrialnemu M2, wirusowi cytomegalii, wirusowi opryszczki pospolitej, ASCA, RNP, SS-A, SS-B, Scl- 70, dsdna, transglutaminazie tkankowej i błonie podstawnej kłębuszka nerkowego, wykorzystując do tego celu test QUANTA Lite Intrinsic Factor ELISA. Żadna z tych próbek nie dała w teście QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA wyniku pozytywnego. Precyzja i powtarzalność Wydajność w obrębie badania oceniono badając 7 próbek oraz silnie pozytywną kontrolę stanowiącą element zestawu (HPC), łącznie po 5 razy każdą. Tabela 3: Wyniki w ramach badania dla testu QUANTA Lite Intrinsic Factor ELISA Próbka A (HPC) Próbka B Próbka C Próbka D Próbka E Próbka F Próbka G Próbka H Jednostki średnie 108,1 45,4 115,2 108,7 21,3 17,1 10,6 13,4 SD 2,1 0,8 2,5 3,4 1,7 0,8 0,4 0,7 CV % 1,9 1,8 2,2 3,2 8,0 5,0 4,0 5,3 Precyzję w obrębie badania oceniono, badając w dwóch powtórzeniach 5 próbek, dołączoną do zestawu kontrolę wysoko pozytywną (HPC) i kontrolę negatywną (NC) dwa razy dziennie (raz rano i raz po południu) przez 3 dni. Tabela 4: Wyniki pomiędzy badaniami dla testu QUANTA Lite Intrinsic Factor ELISA HPC NC Próbka 1 Próbka 2 Próbka 3 Próbka 4 Próbka 5 Jednostki średnie 109,1 1,1 107,9 47,4 13,9 108,0 29,2 SD 6,0 0,2 4,8 1,7 0,7 5,4 2,4 CV % 5,5 14,4 4,5 3,6 5,0 5,0 8,2 7

8 PIŚMIENNICTWO 1. Toh, B. H. & Alderuccio, F. Pernicious anaemia. Autoimmunity 37, (2004). 2. Gleeson, P. A. & Toh, B. H. Molecular targets in pernicious anaemia. Immunol Today 12, (1991). 3. Toh, B. H., van Driel, I. R. & Gleeson, P. A. Pernicious anemia. N Engl J Med 337, 1448 (1997). 4. Tefferi, A. Anemia in adults: a contemporary approach to diagnosis. Mayo Clin Proc 78, (2003). 5. Ye, W. & Nyren, O. Risk of cancers of the oesophagus and stomach by histology or subsite in patients hospitalised for pernicious anaemia. Gut 52, (2003). 6. Hsing, A. W. et al. Pernicious anemia and subsequent cancer. A population-based cohort study. Cancer 71, (1993). 7. Mellemkjaer, L. et al. Pernicious anaemia and cancer risk in Denmark. Br J Cancer 73, (1996). 8. Waters, H. M., Smith, C., Howarth, J. E., Dawson, D. W. & Delamore, I. W. New enzyme immunoassay for detecting total, type I, and type II intrinsic factor antibodies. J Clin Pathol 42, (1989). 9. ASCIA. (Australian Society of Clinical Immunology and Allergy in conjunction with the Royal Australian College of Pathologists); November, Consensus Guidelines on Anti-Intrinsic Factor Antibody Testing. 10. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (Fourth Edition), CDC/NIH, (HHS Pub#(CDC) ) CLSI (NCCLS). Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens; Approved Guidline-Third Edition. CLSI Document H18-A3, Vol 24(38) CLSI (NCCLS). Feb Statistical quality control: Principles and definitions; Approved Guideline- 2 nd edition NCCLS Document C24-A2, Vol. 19(5) QUANTA Lite i INOVA Diagnostics, Inc. są zastrzeżonym znakiem handlowym firmy Copyright Wszelkie prawa zastrzeżone Wyprodukowano przez: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA Stany Zjednoczone Ameryki Pomoc techniczna (tylko na terenie Stanów Zjednoczonych i Kanady): Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych): support@inovadx.com Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Niemcy Tel.: Faks.: POL Sierpień 2011 Wersja 0 8