Biosynteza izoenzymów aminotransferazy asparaginianowej u pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum L.)

Transkrypt

1 Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego W Warszawie Wydział Rolnictwa i Biologii Marcin Maciąga Biosynteza izoenzymów aminotransferazy asparaginianowej u pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum L.) Biosynthesis of aspartate aminotransferase isozymes from common wheat (Triticum aestivum L.) Praca doktorska Doctoral thesis Praca wykonana pod kierunkiem dr. hab. prof. SGGW Andrzeja Paszkowskiego Katedra Biochemii, Wydział Rolnictwa i Biologii, SGGW Warszawa, 2009

2 2

3 Oświadczenie promotora pracy Oświadczam, Ŝe niniejsza praca została przygotowana pod moim kierunkiem i stwierdzam, Ŝe spełnia ona warunki do przedstawienia jej w postępowaniu o nadanie stopnia naukowego. Data... Podpis promotora pracy... Oświadczenie autora pracy Świadom odpowiedzialności prawnej oświadczam, Ŝe niniejsza praca doktorska została napisana przeze mnie samodzielnie i nie zawiera treści uzyskanych w sposób niezgodny z obowiązującymi przepisami. Oświadczam równie, Ŝe przedstawiona praca nie była wcześniej przedmiotem procedur związanych z uzyskaniem stopnia naukowego w wyŝszej uczelni. Oświadczam ponadto, Ŝe niniejsza wersja pracy jest identyczna z załączoną wersją elektroniczną. Data... Podpis autora pracy... 3

4 4

5 Streszczenie Biosynteza izoenzymów aminotransferazy asparaginianowej u pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum L.) Niniejsza praca dotyczy sposobu biosyntezy alloenzymów aminotransferazy asparaginianowej (EC ; AAT) z siewek pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum L.) oraz ich niektórych właściwości molekularnych i kinetycznych. Za pomocą metody Southerna stwierdzono, Ŝe geny kodujące cytoplazmatyczne, chloroplastowe i mitochondrialne alloenzymy AAT u pszenicy występują tylko w 3 loci. Z wykorzystaniem analizy porównawczej zymogramów AAT z ekstraktów z linii delecyjnych pszenicy zawęŝono lokalizację chromosomalną 3 genów cytoplazmatycznych AAT: 3AL (0,42 0,61), 3BL (0,38 0,41), 3DL (0,23 0,81) oraz 1 chloroplastowego: 6AS (0,35 0,65). Wykonanie analizy porównawczej zymogramów i ilościowego PCR z zastosowaniem linii aneuploidalnych pszenicy umoŝliwiło pozytywne zweryfikowanie wcześniej wysuniętej hipotezy wg której udział diploidalnego genomu A przewyŝsza blisko 3-krotnie udział z osobna diploidalnych genomów B i D w syntezie podjednostek tworzących cytoplazmatyczne alloenzymy AAT. Opracowano 5-cio etapową procedurę oczyszczania 3 chloroplastowych i 3 cytoplazmatycznych alloenzymów AAT. Wyznaczona masa cząsteczkowa AAT w warunkach natywnych na kolumnie z Ŝelu Sephadex G-150 wyniosła 72,4 ± 3,6 kda, natomiast masy cząsteczkowe chloroplastowych i cytoplazmatycznych alloenzymów AAT oznaczone metodą elektroforezy w Ŝelu poliakryloamidowym z SDS wyniosły odpowiednio: 45,3 kda i 43,7 kda. Dla 6-ciu oczyszczonych alloenzymów AAT wyznaczono wartości stałej K m wobec 4 substratów, V max w obydwu kierunkach, k cat i k cat /K m. Porównanie kojarzonych z centrum aktywnym enzymu fragmentów sekwencji aminokwasowych alloenzymów chloroplastowych i cytoplazmatycznych z pszenicy z 8 analogicznymi sekwencjami aminokwasowymi z 4 wybranych roślin umoŝliwiło przedstawienie hipotez na temat przyczyn obserwowanych róŝnic w wydajności katalitycznej między alloenzymami z obydwu badanych pasm. Słowa kluczowe: alloenzymy (izoenzymy), aminotransferaza asparaginianowa, centrum aktywne, ekspresja genów, lokalizacja chromosomalna genów, właściwości kinetyczne i molekularne. 5

6 Abstract Biosynthesis of aspartate aminotransferase isozymes from common wheat (Triticum aestivum L.) The aim of this research was to study the way the biosynthesis of the aspartate aminotransferase (EC ; AAT) isozymes from common wheat (Triticum aestivum L.) is performed. Besides, some of their kinetic and molecular properties were investigated. It was found by Southern blot analysis that genes encoding chloroplastic, cytoplasmatic, and mitochondrial AAT isozymes from wheat appear only in 3 loci. Applying AAT zymograme technique for deletion lines of wheat the chromosomal localization of 3 cytoplasmatic and 1 chloroplastic AAT genes were narrowed to: 3AL (0,42 0,61), 3BL (0,38 0,41), 3DL (0,23 0,81), and 6AS (0,35 0,65), respectively. Earlier formulated hypothesis assuming 3 more times higher level of cytoplasmatic AAT subunits biosynthesis oencoded by diploid A genome than separately by B or D genomes was positively verified applying AAT zymograme technique and quantatative PCR analysis for aneuploid lines of wheat. 3 chloroplastic and 3 cytoplasmatic AAT allozymes were purified by 5-step procedure. The molecular mass of AAT estimated by molecular sieving on Sephadex G-150 column under non-denaturating conditions was 72.4 ± 3.6 kda. The molecular mass of chloroplastic and cytoplasmatic isozymes was estimated by SDS-PAGE at 45.3 kda and 43.7 kda respectively, indicating that AAT molecule consists of 2 subunits as the active form with high axial ratio. The apparent K m values estimated for 4 substrates for 6 AAT allozymes were comparable to values from other cereal plants. Each of the studied allozymes was equally efficient in the forward and reverse reaction. The turnover number (k cat ) and the ratio of k cat /K m were 17 times higher for chloroplastic than cytoplasmatic AAT allozymes. Partial sequences of cdna encoding chloroplastic and cytoplasmatic isozymes from wheat were obtained by RT- PCR technique. The comparison of active site regions from 10 different AAT amino acids sequences from 5 plants showed 5 non-conservative substitutions which might possibly have an impact on the observed differences in the catalytic efficiency between chloroplastic and cytoplasmatic allozymes from common wheat. Keywords: active site, allozymes (isozymes), aspartate aminotransferase, chromosomal gene localization, gene expression, kinetic and molecular properties. 6

7 Składam serdeczne podziękowania Panu Profesorowi Andrzejowi Paszkowskiego oraz Rodzicom 7

8 Praca częściowo finansowana przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa WyŜszego (grant promotorski nr N /3498). This work was partially supported by a grant (N /3498) from the Polish State Committee for Scientific Research. 8

9 Spis treści 1. Wykaz stosowanych skrótów Wstęp Klasyfikacja AAT Lokalizacja chromosomalna genów kodujących AAT u pszenicy Ekspresja genów kodujących AAT u pszenicy Lokalizacja wewnątrzkomórkowa izoenzymów AAT Właściwości molekularne AAT Centrum aktywne AAT Właściwości kinetyczne AAT Funkcje metaboliczne AAT u roślin Cel Materiał i metody Materiał doświadczalny Oczyszczanie alloenzymów AAT Wyznaczanie masy cząsteczkowej AAT w warunkach natywnych Spektrofotometryczny pomiar aktywności AAT i oznaczanie stęŝenia białka Elektroforeza w warunkach niedenaturujących i sporządzanie zymogramów AAT Elektroforeza w warunkach denaturujących Ekstrakcja RNA Synteza pierwszej nici cdna PCR Elektroforeza DNA Ligacja DNA do wektora Transfer plazmidów do komórek kompetentnych Izolacja DNA plazmidowego PCR z analizą przyrostu ilości produktu w czasie rzeczywistym Southern blot Wyniki Całkowita liczba genów kodujących izoenzymy AAT Lokalizacja chromosomalna genów kodujących AAT Częstotliwość występowania podjednostek α i β Fragmenty sekwencji cdna genów kodujących izoenzymy AAT

10 5.5. Preparatyka chloroplastowych i cytoplazmatycznych alloenzymów AAT Wyznaczanie masy cząsteczkowej AAT w warunkach natywnych Identyfikacja alloenzymów AAT metodą spektrometrii mas i wyznaczanie ich mas cząsteczkowych w warunkach denaturujących Wyznaczanie parametrów kinetycznych alloenzymów AAT Dyskusja Wnioski Literatura

11 1. Wykaz stosowanych skrótów AAT AAT-1/2/3 AAT-1/2/3a/b/c BCIP EDTA EST HPLC IPTG PLP m-pms MTT NBT SDS TEMED Tris X-gal Aminotransferaza asparaginianowa Pasma enzymatyczne AAT (na zymogramie); AAT-1 pasmo mitochondrialne, AAT-2 pasmo chloroplastowe, AAT-3 pasmo cytoplazmatyczne Alloenzymy AAT; AAT-1a/b/c alloenzymy z pasma mitochondrialnego, AAT-2a/b/c alloenzymy z pasma chloroplastowego, AAT-3a/b/c alloenzymy z pasma cytoplazmatycznego Fosforan 5-bromo-4-chloro-3-indoksylu Kwas etylenodiaminotetraoctowy Sekwencja ulegająca ekspresji (ang. expressed sequence tags, EST) Wysokosprawna chromatografia cieczowa Izopropylogalaktozyd 5`-fosforan pirydoksalu N-metylofenazyno metasulfonian 3-[4,5-dimetyltiazol-2-yl]-2,5-difenyl tetrazolium bromidyny Błękit nitrotetrazoliowy Dodecylosiarczan sodu N,N,N`,N`-tetrametylenoetylenodiamina Tris (hydroksymetylo) aminometan 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-galaktopiranozyd 11

12 2. Wstęp 2.1. Klasyfikacja AAT Aminotransferazę asparaginianową (ang. aspartate aminotransferase, AAT) pod względem typu katalizowanej reakcji zalicza się do klasy transferaz, podklasy enzymów przenoszących grupy zawierające azot, podpodklasy transaminaz katalizujących przeniesienie grupy aminowej z donora, tj. najczęściej aminokwasu na akceptor, którym zwykle jest 2-oksokwas. AAT (EC ) katalizuje odwracalną reakcję przeniesienie grupy aminowej z L-asparaginianu na 2-oksoglutaran z równoczesnym utworzeniem szczawiooctanu i L-glutaminianu ( Biorąc pod uwagę kryterium struktury przestrzennej enzymu, AAT zalicza się do jednego z 11 zespołów (ang. fold) zawierających białka typu α i β ( W jego obrębie wyróŝniamy 141 superrodzin białek (ang. superfamily) z interesującą nas superrodziną pod nazwą transferazy zaleŝne od fosforanu pirydoksalu (PLP) (ang. PLP-dependent transferases). W tej superrodzinie sklasyfikowano 8 rodzin białek (ang. families) w tym rodzinę enzymy podobne do AAT (ang. AAT-like enzymes), do której naleŝy AAT ( MoŜliwa jest jeszcze inna klasyfikacja AAT, oparta na sekwencji aminokwasowej. W bazie Pfam AAT występuje w obrębie enzymów zaleŝnych od PLP, którym przypisano w sumie 15 spośród wszystkich 9318 (wydanie 22 bazy) opisanych dotychczas domen białkowych ( Jedną z takich domen jest aminotran I_II. Białka z tą domeną dzieli się na podstawie podobieństwa sekwencji na 6 grup (Jensen i Gu, 1996). AAT wspólnie z aminotransferazą tyrozynową zalicza się do grupy Iα (rys. 1). Sekwencje aminokwasowe białek z domeną aminotran I_II z grupy Iα, niezaleŝnie od tego skąd pochodzą, obejmują 6 typów sekwencji, tj. aminotransferazy aromatycznej, AAT pochodzenia bakteryjnego, izoenzymów cytoplazmatycznych AAT pochodzenia roślinnego oraz zwierzęcego, izoenzymów chloroplastowych i mitochondrialnych AAT (rys. 1). Charakteryzują się one minimum 30% stopniem podobieństwa między sobą, zwłaszcza między sekwencjami aminotransferazy aromatycznej a dowolną sekwencją AAT. Natomiast między izoenzymami cytoplazmatycznymi, chloroplastowymi i mitochondrialnymi AAT (niezaleŝnie od ich pochodzenia) wskaźniki kształtują się na poziomie 60%, zaś sekwencje w obrębie 12

13 danego typu izoenzymu np. cytoplazmatycznego pochodzącego od róŝnych organizmów wynoszą około 90%. Aminotransferaza aromatyczna Sekwencje bakteryjne AAT Izoenzymy cytoplazmatyczne roślinne AAT Izoenzymy chloroplastowe AAT Izoenzymy mitochondrialne AAT Izoenzymy cytoplazmatyczne zwierzęce AAT Rys. 1. Drzewko filogenetyczne białek z domeną aminotran I_II z grupy Iα. W obrębie białek z domeną aminotran I_II z grupy Iα pochodzących z róŝnych organizmów zwierzęcych, roślinnych i bakteryjnych wyróŝnić moŝna 6 typów sekwencji aminokwasowych, tj. sekwencje aminotransferazy aromatycznej, aminotransferazy asparaginianowej (AAT) pochodzenia bakteryjnego, izoenzymów cytoplazmatycznych pochodzenia roślinnego oraz zwierzęcego, izoenzymów chloroplastowych i mitochondrialnych AAT Lokalizacja chromosomalna genów kodujących AAT u pszenicy Materiał genetyczny pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum) zgromadzony jest w jądrze komórkowym oraz w genomie chloroplastowym i mitochondrialnym. W 2000 r. zsekwencjonowano genom chloroplastowy z pszenicy odmiany Chinese Spring (Ogihara i współ., 2000). Występuje on w postaci kolistej, dwuniciowej cząsteczki DNA o długości 134,540 Mpz tworzących 133 geny, w tym 86 genów związanych z procesem transkrypcji i translacji, 31 genów odpowiedzialnych za kodowanie białek związanych z fotosyntezą, 11 genów kodujących dehydrogenazy współdziałające z NADH oraz 5 sekwencji nukleotydowych, które są konserwatywne w rodzinie traw, ale ich funkcji dotychczas nie poznano (Ogihara i współ., 2000). W 2005 r. dobiegł końca podobny projekt dla genomu mitochondrialnego pochodzącego z tej samej odmiany pszenicy (Ogihara i współ., 2005). Jest on równieŝ kolistą cząsteczką DNA tyle, Ŝe ponad 3-krotnie większą, bo zbudowaną z 452,528 Mpz. Genom mitochondrialny zawiera zaledwie 55 geny, które kodują 3 rodzaje rrna, 17 rodzajów trna oraz 35 róŝnych białek, wśród których nie ma genów 13

14 odpowiadających za kodowanie aminotransferazy asparaginianowej (AAT). Generalnie rzecz biorąc w genomie chloroplastowym znajduje się informacja dotycząca fotosyntezy, a ta z genomu mitochondrialnego związana jest z cyklem Krebsa i fosforylacją oksydacyjną. Oznacza to, Ŝe zdecydowana większość białek pszenicy (w tym AAT) jest kodowana przez DNA jądrowe. Wielkość jądrowego genomu pszenicy szacuje się na około 16 Gpz (Gill i współ., 2004). A zatem, wielkość genomu chloroplastowego w porównaniu z genomem jądrowym stanowi zaledwie 0,001%, natomiast genomu mitochondrialnego 0,003%. Formułę genetyczną jądrowego genomu pszenicy przedstawia się jako AABBDD. W kaŝdym haploidalnym genomie A, B lub D znajduje się po 7 chromosomów, czyli łącznie w całym heksaploidalnym genomie pszenicy występują 42 chromosomy. Chromosomy pochodzące z tego samego diploidalnego genomu są względem siebie homologiczne, a te pochodzące z róŝnych genomów są homeologiczne. W 2003 r. zainicjowano projekt zsekwencjonowania całego genomu pszenicy (Gill i współ., 2004), jednak z uwagi na jego rozmiary, szanse na zakończenie tego projektu w najbliŝszym czasie są nikłe. Bardziej realne wydaje się zsekwencjonowanie tylko jednego genomu D, dla którego opracowano dotychczas bardzo dokładne mapy fizyczne (Gill i współ., 2004). Genom pszenicy jest olbrzymich rozmiarów, jednak to nie wielkość genomu decyduje o stopniu złoŝoności danego organizmu, co określa się mianem paradoksu wartości C ( Szacuje się, Ŝe całkowita liczba genów u rzodkiewnika, rośliny, której genom jako pierwszy zsekwencjonowano, wynosi nieco ponad 30 tys. ( U ryŝu wszystkich genów jest około 40 tys. ( zaś u kukurydzy około 50 tys. ( MoŜna zatem przypuszczać, Ŝe u pszenicy w jednym haploidalnym genomie występuje zbliŝona liczba genów około tys., z czego co najmniej 3 kodują izoenzymy AAT: cytoplazmatyczny, chloroplastowy i mitochondrialny. W badaniach nad lokalizacją chromosomalną genów AAT bardzo waŝną rolę odegrały linie aneuploidalne pszenicy wyprowadzone w latach 50-tych przez Searsa (1954). Termin aneuploid oznacza, Ŝe organizm ma dodatkowy (trisomik) lub brak mu jednego (monosomik) lub dwóch (nullisomik) chromosomów. Do aneuploidów zalicza się takŝe ditelosomiki (brak krótkich lub długich ramion z danej pary chromosomów), czy teŝ nulli-tetrasomiki (ramiona jednej pary chromosomów homologicznych zostały zastąpione ramionami z innej pary chromosomów). Hart (1983) jako pierwszy ustalił 14

15 za pomocą analizy porównawczej zymogramów AAT z linii aneuploidalnych pszenicy zwyczajnej, Ŝe geny odpowiedzialne za biosyntezę izoenzymów tej aminotransferazy znajdują się w trzech homeologicznych loci, tj. na długich ramionach (ang. long, L) 3-ciej pary 3AL, 3BL i 3DL; na długich ramionach 6-tej pary 6AL, 6BL, 6DL oraz na krótkich (ang. short, S) ramionach 6-tej pary chromosomów 6AS, 6BS, 6DS. Ponadto, wysunął on przypuszczenie o istnieniu dwóch kolejnych loci dla genów AAT (Hart, 1983). W naszym laboratorium na zymogramie AAT z homogenatu z liści pszenicy zaobserwowaliśmy 3 pasma enzymatyczne (Maciąga i Paszkowski, 2004) podobnie jak Taniguchi i współ. (1995) badający blisko spokrewnione z pszenicą proso (Panicum miliaceum). W pewnym sensie sytuacja moŝe przypominać tę zastaną u Arabidopsis. Na zymogramie AAT z homogenatu liści Arabidopsis obserwuje się tylko 3 izoenzymy (Schultz i Coruzzi, 1995), a zidentyfikowano 5 róŝnych genów AAT (Wilkie i współ., 1996; Liepman i Olsen, 2004). Jeśli w genomie pszenicy dla genów AAT rzeczywiście istnieją loci 4 i 5, to najprawdopodobniej geny te charakteryzują się niskim poziomem ekspresji i za pomocą zymogramów nie ma praktycznej moŝliwości ustalenia ich lokalizacji chromosomalnej. Jedynie zastosowanie metody hybrydyzacji Southerna daje nadzieję na uzyskanie jednoznacznej odpowiedzi na pytanie dotyczące ogólnej liczby genów kierujących biosyntezą AAT u pszenicy. Pod koniec ubiegłego wieku Endo i Gill (1996) otrzymali szereg linii delecyjnych pszenicy. Są one pozbawione róŝnej wielkości fragmentów chromatyny z określonych chromosomów, dzięki czemu umoŝliwiają dokładniejszą lokalizację chromosomalną genów, aniŝeli pozwalały na to wcześniej linie aneuploidalne pszenicy. Qi i współ. (2004) wykorzystując linie delecyjne pszenicy ustalili lokalizację 7104 sekwencji ulegających ekspresji (ang. expressed sequence tags, EST) w tym 2 odpowiadających AAT ( Pierwszy EST o numerze BF to fragment sekwencji o wysokim stopniu identyczności z sekwencją genów kodujących izoenzymy cytoplazmatyczne AAT u róŝnych roślin. Zmapowano go na 3AL (0,42 0,78), 3BS (0,57 1,00) i 3DS (0,24 1,00), gdzie liczby w nawiasach oznaczają część ramienia chromosomu, w której występuje dany fragment zmapowanej sekwencji nukleotydowej. Drugi EST o numerze BE moŝna określić jako homolog jądrowych genów chloroplastowych i został on umiejscowiony na 6BS-Sat ( NaleŜy podkreślić, Ŝe dane na temat lokalizacji chromosomalnej genów AAT zawierają pewne wymagające wyjaśnienia sprzeczności. Zdaniem Harta (1983) geny kodujące 15

16 izoenzymy cytoplazmatyczne znajdują się na 3AL, 3BL i 3DL, natomiast metodą mapowania EST-ów zlokalizowano je na 3AL (0,42 0,78), 3BS (0,57 1,00) i 3DS (0,24 1,00) ( Z kolei zmapowanie EST-u o numerze BE na 6BS-Sat ( nie potwierdza wyników Harta (1983), który podaje, Ŝe geny chloroplastowe znajdują się na 6AL, 6BL i 6DL. Dodatkowych informacji na temat lokalizacji chromosomalnej genów AAT u pszenicy mogą dostarczyć genomowe mapy porównawcze pomiędzy tą rośliną a innymi blisko spokrewnionymi gatunkami. Dla przykładu, gen kodujący izoenzym cytoplazmatyczny znajduje się na chromosomie 1 u ryŝu (Song i współ., 1996), natomiast u pszenicy występuje on na chromosomie 3 (Hart, 1983). Tę pozorną sprzeczność wyjaśnia fakt, Ŝe obydwa chromosomy są homologiczne względem siebie, tzn. poszczególne segmenty chromosomu u jednego z nich mają swoje odpowiedniki u drugiego (Munkvold i współ., 2004). A zatem, znając lokalizację chromosomalną genów AAT u ryŝu (Song i współ., 1996), czy Arabidopsis (Liepman i Olsen, 2004) moŝna wnioskować o ich lokalizacji u pszenicy Ekspresja genów kodujących AAT u pszenicy Zgodnie z rekomendacją Komitetu Nomenklatury Biochemicznej (1976) termin izoenzym powinien być stosowany w odniesieniu do form jednego enzymu zróŝnicowanych genetycznie, czyli wykazujących róŝnice w strukturze pierwszorzędowej. W szczególnym przypadku, kiedy izoenzymy powstały z połączenia podjednostek kodowanych przez geny alleliczne nazywamy je alloenzymami. Na zymogramie otrzymanym dla aminotransferazy asparaginianowej (AAT) z pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum) obserwuje się 9 prąŝków (izoenzymów), które są pogrupowane po 3 alloenzymy w tzw. pasma enzymatyczne (rys. 2). Na podstawie porównania zymogramów AAT z frakcji subkomórkowych wyizolowanych z siewek pszenicy stwierdzono, Ŝe pasmo AAT-1 o największej ruchliwości elektroforetycznej w kierunku anody utworzone jest z alloenzymów mitochondrialnych, pasmo AAT-2 o pośredniej ruchliwości elektroforetycznej z alloenzymów chloroplastowych, zaś pasmo AAT-3 o najmniejszej ruchliwości elektroforetycznej z alloenzymów cytoplazmatycznych (Maciąga i Paszkowski, 2004). Przy porównywaniu zymogramów AAT dla róŝnych gatunków naleŝy zachować ostroŝność, poniewaŝ często poszczególnym pasmom enzymatycznym u róŝnych roślin odpowiadają inne przedziały 16

17 subkomórkowe i tak na przykład pasmu AAT-1 u fasoli odpowiada izoenzym glioksysomalny (Wadsworth i współ., 1995), w łubinie izoenzym cytoplazmatyczny (Gregerson i współ., 1994), natomiast u Arabidopsis i kukurydzy izoenzym mitochondrialny (Schultz i Coruzzi, 1995; Scandalios i współ., 1975). Wydaje się jednak wysoce prawdopodobnym, Ŝe pasma enzymatyczne AAT mają podobną lokalizację subkomórkową u róŝnych gatunków pszenicy (Jaaska, 1976; Karcicio i Izbirak, 2003), a takŝe róŝnych roślin z rodziny traw, jak np. proso (Taniguchi i współ., 1995), czy ryŝ (Song i współ., 1996) z uwagi na występowanie u tych roślin blisko spokrewnionych typów genomów. - AAT-3c AAT-3b AAT-3a Pasmo cytoplazmatyczne (AAT-3) AAT-2c AAT-2b AAT-2a Pasmo chloroplastowe (AAT-2) AAT-1c AAT-1b + AAT-1a Pasmo mitochondrialne (AAT-1) Rys. 2. Schematyczne przedstawienie zymogramu aminotransferazy asparaginianowej (AAT) z pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum). Na zymogramach AAT z pszenicy widoczne są 3 pasma enzymatyczne w obrębie których występują po 3 alloenzymy. Pasmo AAT-1 o największej ruchliwości w kierunku anody utworzone jest z alloenzymów mitochondrialnych, AAT-2 z alloenzymów chloroplastowych, zaś pasmo AAT-3 z alloenzymów cytoplazmatycznych. Alloenzymy w obrębie pasm róŝnią się między sobą intensywnościa zabarwienia. Wyjaśnienie sposobu kodowania alloenzymów AAT u heksaploidalnej pszenicy znajduje się w tekście. Zymogramy AAT z pszenicy róŝnią się nie tylko ilością prąŝków, ale równieŝ intensywnością zabarwienia poszczególnych alloenzymów w obrębie pasm enzymatycznych, co przy załoŝeniu podobnej wydajności katalitycznej w ramach jednego pasma wskazywało na róŝny poziom ich biosyntezy. Hart i współ. (1976) jako pierwsi poddali dokładniejszej analizie alloenzymy z pasma cytoplazmatycznego (AAT-3) najlepiej rozdzielające się na zymogramie. Stwierdzili oni, Ŝe geny kodujące pasmo AAT-3 zlokalizowane w diploidalnym genomie A odpowiadają za syntezę podjednostki α enzymu, geny z diploidalnego genomu B podjednostki β, natomiast geny 17

18 z diploidalnego genomu D podjednostki δ, przy czym według Harta i współ., (1976) podjednostki AAT wytwarzane przez genomy B i D są na tyle podobne do siebie, Ŝe moŝna było je uznać za toŝsame. Hart zaproponował następujący skład podjednostkowy alloenzymów z pasma AAT-3: prąŝek w pozycji AAT-3a utworzony jest z dimerów ββ (AAT jest aktywna enzymatycznie wyłącznie pod postacią dimeru), AAT-3b αβ, zaś AAT-3c αα (rys. 2). Rozkład intensywności zabarwienia tych alloenzymów był jak 4 ββ : 4 αβ : 1 αα. PrąŜki w pozycjach AAT-3a i AAT-3b były najintensywniejsze, co wskazywało wg Harta i współ. (1976), Ŝe podjednostek β kodowanych przez genomy B i D było dwa razy więcej od podjednostek α kodowanych tylko przez genom A. Hart przeprowadził równieŝ doświadczenia dysocjacji i reasocjacji podjednostek α i β (Hart i Langston, 1977), co ostatecznie potwierdziło zaproponowany przez niego model składu podjednostkowego alloenzymów w obrębie pasma AAT-3. NaleŜy podkreślić, Ŝe rozkład alloenzymów AAT w paśmie cytoplazmatycznym T. aestivum był oceniany przez Harta jedynie jakościowo. Maciąga i Paszkowski (2004) znając skład podjednostkowy alloenzymów w paśmie AAT-3 z T. aestivum i przyjmując, Ŝe jest on analogiczny u T. durum oraz zakładając jednakową wydajność katalityczną alloenzymów podjęli próbę dokładniejszego określenia częstotliwości występowania podjednostek α i β w obu tych gatunkach. Posługując się modelem matematycznym oraz programem komputerowym do mierzenia intensywności prąŝków na zeskanowanych zymogramach wyliczono, Ŝe częstotliwości występowania podjednostek α i β u T. durum wynoszą 54% i 46%, zaś u T. aestivum 62% i 38% (Maciąga i Paszkowski, 2004). Oznacza to, Ŝe podjednostka α kodowana przez genom A (około 58%) jest syntetyzowana blisko trzykrotnie częściej od podjednostki β osobno kodowanej przez genom B, czy D (po około 21%). Jedyną wątpliwością nasuwającą się podczas krytycznej analizy tych wyników jest fakt, Ŝe w doświadczeniach uŝyto tylko dwóch gatunków pszenicy T. durum i T. aestivum, kiedy obecnie dostępne są róŝne linie aneuploidalne pszenicy, np. monosomik, nullitetrasomiki, trisomik, itp. oraz linie pszenicy o szerokim spektrum kombinacji chromosomów z 3-ciej pary chromosomów homeologicznych, na których znajdują się geny kodujące podjednostki α i β Lokalizacja wewnątrzkomórkowa izoenzymów AAT Ciekawych wyników na temat lokalizacji wewnątrzkomórkowej dostarczyły badania histochemiczne nad rozmieszczeniem aktywności aminotransferazy 18

19 asparaginianowej (AAT) u szarłatu (Amaranthus hybridus) rośliny typu C 4 (Rex, 1987). Enzym obserwowano w chloroplastach, mitochondriach oraz w cytoplazmie komórek mezofilu i komórek pochwy okołowiązkowej a takŝe w błonie mikrociałek (Rex, 1987). Ponadto AAT występowała w połączeniach między komórkami mezofilu i komórkami pochwy okołowiązkowej oraz w plazmodesmach między tymi ostatnimi a komórkami tkanki przewodzącej. Podczas barwienia na aktywność AAT najintensywniej barwiły się mitochondria a zwłaszcza matriks mitochondrialna, z kolei w chloroplastach enzym znajdował się głównie na obrzeŝach tych organelli (Rex, 1987). Badania histochemiczne nad rozmieszczeniem aktywności AAT u szarłatu (Rex, 1987) znajdują potwierdzenie równieŝ w presekwencjach aminokwasowych, które decydują o skierowaniu danego białka do odpowiedniego przedziału komórkowego. U izoenzymów chloroplastowych AAT znajdujemy charakterystyczną dla róŝnych białek z róŝnych gatunków roślin presekwencję liczącą około 30 reszt aminokwasowych, z czego pierwszych 10 wykazuje tendencję do tworzenia układu helikalnego (Schulz i Coruzzi, 1995), podczas gdy u izoenzymów mitochondrialnych AAT występuje presekwencja składająca się z około 20 reszt aminokwasowych w całości uformowana w postaci α-helisy (Behra i Christen, 1986; Schulz i Coruzzi, 1995). W przypadku izoenzymów cytoplazmatycznych AAT w zasadzie nie powinna występować Ŝadna presekwencja. W rzeczywistości okazuje się, Ŝe w presekwencjach tych izoenzymów z róŝnych roślin występuje jeden z dwóch rodzajów sygnałów PTS (ang. peroxisome target signal, PTS), które decydują o transporcie nowopowstałych białek z aparatu Golgiego do peroksysomów. Dla białek z rzodkiewnika, sygnał PTSI charakteryzuje się motywem 3 reszt aminokwasowych: SRL, SRM, SRI, SKL, SKM, ARL, ARM, AKL, PRL, SKI, PRM, PKL, CRL, CKL, SRV, SNL, SNM, SML, SSM, ANL, SHL lub AHL, które występują na C- lub N- końcu właściwej sekwencji białka, podczas gdy sygnał PTSII składa się z 9 reszt aminokwasowych, z których pierwsze dwie i ostatnie dwie są najistotniejsze: RL-X5-HL RI-X5-HL, RQ-X5-HL, RT-X5-HL, RM-X5-HL, RA-X5-HL, RV-X5-HL, RL-X5-HI, RL-X5-HF, RI-X5-HI lub RA-X5-HI (Reumann, 2004). Wymienione motywy dotyczą białek peroksysomalnych z rzodkiewnika, ale w presekwencjach cytoplazmatycznych izoenzymów AAT z róŝnych roślin równieŝ moŝna znaleźć charakterystyczny sygnał PTSII (rys. 3). 19

20 Pszenica MPTANVRAAQPGADRRLSTLVRHLLPSSPRTSAATATSADSSLQPFPTMASPSVFAGIAQGPEDPIL Soja MRPPVILKTTTSLLDSSSSSPPCDRRLNTLARHFLPQMASHDSISASPTSASDSVFNHLVRAPEDPIL Lucerna MRPPVILESTTTFYSSSPDRRLNTIAKHFLDVNDQNQMASQNITPSPTASSDSVFAHLVRAPEDPIL Łubin MRPQSNTTTTYINTFSDPSSSSVDRRITTLSNHLLNHQMASVNQSVSVSPTASSDSVFAHLLPAPEDPIL Sorgum MAPANVRAAQAPSADRRLSTLVRHLLPSSPRRTAAEAAADASATLESFPTMASQGSSVFAALAQAPEDPIL RyŜ MPSANVRGAQPSADRRLSTLVRHLLPSSARTATTTSTSSSAADADSSLQAFPTMASSSVFAGLAQAPEDPIL Proso MAPASVRAAQAQQQAREPSPSPSADRRLSTLARHLLPSSPRRTAAADTSATLESFPTMASQVASVFAGIAQAPEDPIL Rzodkiewnik MKTTHFSSSSSSDRRIGALLRHLNSGSDSDNLSSLYASPTSGGTGGSVFSHLVQAPEDPIL Ziemniak MHTQQSPSPSADRRLSVLARHLEPSSVAVEGHSNHSIVGAPTSGNDGKQSVFSHIVRAPEDPIL Słonecznik MKSSSSSRGDRRLSILSGHLAPRTIDKEGSGIFCSPTSAADSVFANVLRAPEDPIL Rys. 3. Presekwencje aminokwasowe izoenzymów cytoplazmatycznych aminotransferazy asparaginianowej pochodzące z róŝnych organizmów roślinnych. Presekwencje cytoplazmatycznych izoenzymów AAT niezaleŝnie od pochodzenia są bogate w serynę i wyróŝnić w nich moŝna motyw 9 reszt aminokwasowych, z których najbardziej charakterystyczne to pierwsze dwie i ostatnie dwie (kolor czerwony). Kolorem niebieskim zaznaczono reszty tworzące właściwe białko, przy czym nie dokonano tego w przypadku sekwencji AAT z rzodkiewnika, ziemniaka i słonecznika, poniewaŝ brakuje w nich metioniny, której odpowiada kodon AUG inicjujący proces translacji. Porównanie presekwencji cytoplazmatycznych izoenzymów AAT pochodzących z róŝnych roślin jednoznacznie wskazuje, Ŝe występuje tu charakterystyczny motyw 9 reszt aminokwasowych (rys. 3) podobny do obserwowanego u peroksysomalnych białek z rzodkiewnika (Reumann, 2004). Ponadto w przypadku sekwencji aminokwasowej AAT z rzodkiewnika, ziemniaka i słonecznika w rejonie, w którym zaczyna się właściwa sekwencja izoenzymów z pszenicy, soji, lucerny, łubinu, sorga, ryŝu, czy prosa brakuje metioniny (rys. 3). Aminokwasowi temu odpowiada kodon AUG od którego zaczyna się proces translacji. Oznaczałoby to, Ŝe sekwencje aminokwasowe izoenzymów cytoplazmatycznych AAT z rzodkiewnika, ziemniaka i słonecznika są o około 40 reszt aminokwasowych dłuŝsze niŝ sekwencje aminokwasowe z pozostałych roślin. Przypuszczalnie u tych roślin występuje dodatkowy izoenzym cytoplazmatyczny AAT, który ulega ekspresji wyłącznie w peroksysomach, tak jak np. u rzodkiewnika (Schultz i Corruzzi, 1995) lub w glioksysomach, np. u kukurydzy (Scandalios i współ., 1975) i soji (Gebhardt i współ., 1998) Właściwości molekularne AAT Masa cząsteczkowa aminotransferazy asparaginianowej (AAT) z pszenicy wyznaczona przez Verjee`ego i Evered`a (1969) w warunkach natywnych za pomocą metody sączenia molekularnego na kolumnie z Ŝelu Sephadex G-100 wyniosła 75 kda. Dla enzymu z innej rośliny zboŝowej prosa olbrzymiego (Panicum maximum) Numazawa i współ. (1989) otrzymali wartość 100 kda stosując kolumnę z Ŝelu Sephadex G-200. Taniguchi i Sugiyama (1990) dla AAT z prosa afrykańskiego (Eleusine coracana) uzyskali wartość 80 kda po zastosowaniu kolumny z Ŝelu Superose 12. Masę cząsteczkową w warunkach denaturujących dla enzymów z prosa 20

21 afrykańskiego oraz zwyczajnego wyznaczyli odpowiednio Taniguchi i Sugiyama (1990) oraz Taniguchi i współ. (1995) przy pomocy metody elektroforezy w Ŝelu poliakryloamidowym z SDS. W obu przypadkach wyniosła ona 40 kda. Numazawa i współ. (1989) stosując tę samą metodę otrzymali wartość 42 kda dla AAT z prosa olbrzymiego. Wyznaczone masy cząsteczkowe w warunkach natywnych i denaturujących dla AAT z roślin zboŝowych znajdują potwierdzenie w wynikach oznaczeń dla AAT zwłaszcza pochodzenia zwierzęcego ( Wszystkie one wskazują, Ŝe aktywny enzym tworzą dwie zasocjowane podjednostki, które osobno są nieczynne katalitycznie (Kirsch i współ., 1984) Centrum aktywne AAT Sekwencja aminokwasowa podjednostki izoenzymu cytoplazmatycznego aminotransferazy asparaginianowej (AAT) z rzodkiewnika utworzona jest z 405 reszt aminokwasowych, izoenzymu chloroplastowego z 410, zaś izoenzymu mitochondrialnego z 402 reszt (rys. 4). Stopień podobieństwa sekwencji między tymi trzema izoenzymami wynosi około 60%, jednak w niektórych rejonach polipeptydu w ściśle określonych pozycjach zawsze występują te same aminokwasy, tzw. aminokwasy konserwatywne (rys. 4). 21

22 A_thaliana_cyt -----MDSVFSNVARAPEDPILGVTVAYNNDPSPVKINLGVGAYRTEEGK 45 A_thaliana_chl MTVAVKPSRFEGITMAPPDPILGVSEAFKADTNGMKLNLGVGAYRTEELQ 50 A_thaliana_mt -----MSSWWKSVEPAPKDPILGVTEAFLADPSPEKVNVGVGAYRDDNGK 45 * ** ****** * * * * ****** A_thaliana_cyt PLVLDVVRKAEQQLVNDPSRVKEYIPIVGISDFNKLSAKLILGADSPAIT 95 A_thaliana_chl PYVLNVVKKAENLMLER-GDNKEYLPIEGLAAFNKATAELLFGAGHPVIK 99 A_thaliana_mt PVVLECVREAEKRLAGS--TFMEYLPMGGSAKMVDLTLKLAYGDNSEFIK 93 * ** * ** ** * * * * * A_thaliana_cyt ESRVTTVQCLSGTGSLRVGAEFLKTHYHQSVIYIPKPTWGNHPKVFNLAG 145 A_thaliana_chl EQRVATIQGLSGTGSLRLAAALIERYFPGAKVVISSPTWGNHKNIFNDAK 149 A_thaliana_mt DKRIAAVQTLSGTGACRLFADFQKRFSPGSQIYIPVPTWSNHHNIWKDAQ 143 * * ***** * * *** ** A_thaliana_cyt LSVEYFRYYDPATRGLDFKGLLEDLGAAPSGAIVLLHACAHNPTGVDPTS 195 A_thaliana_chl VPWSEYRYYDPKTIGLDFEGMIADIKEAPEGSFILLHGCAHNPTGIDPTP 199 A_thaliana_mt VPQKTYHYYHPETKGLDFSALMDDVKNAPEGSFFLLHACAHNPTGVDPTE 193 ** * * **** * **** *** ******* *** A_thaliana_cyt EQWEQIRQLMRSKSLLPFFDSAYQGFASGSLDTDAQSVRTFVADGGECLI 245 A_thaliana_chl EQWVKIADVIQEKNHIPFFDVAYQGFASGSLDEDAASVRLFAERGMEFFV 249 A_thaliana_mt EQWREISQLFKAKKHFAFFDMAYQGFASGDPARDAKSIRIFLEDGHHIGI 243 *** * * *** ******** ** * * * * A_thaliana_cyt AQSYAKNMGLYGERVGALSIVCKSADVASKVESQVKLVVRPMYSSPPIHG 295 A_thaliana_chl AQSYSKNLGLYAERIGAINVVCSSADAATRVKSQLKRIARPMYSNPPVHG 299 A_thaliana_mt SQSYAKNMGLYGQRVGCLSVLCEDPKQAVAVKSQLQQLARPMYSNPPLHG 293 *** ** *** * * * * * ** ***** ** ** A_thaliana_cyt ASIVATILKSSDMYNNWTIELKEMADRIKSMRQQLFEAIQARGTPG-DWS 344 A_thaliana_chl ARIVANVVGDVTMFSEWKAEMEMMAGRIKTVRQELYDSLVSKDKSGKDWS 349 A_thaliana_mt AQLVSTILEDPELKSLWLKEVKVMADRIIGMRTTLRESLEKLGSPL-SWE 342 * * * * ** ** * * * A_thaliana_cyt HIIKQIGMFTFTGLNKEQVEFMTKEFHIYMTSDGRISMAGLSSKTVPHLA 394 A_thaliana_chl FILKQIGMFSFTGLNKAQSDNMTDKWHVYMTKDGRISLAGLSLAKCEYLA 399 A_thaliana_mt HVTKQIGMFCYSGLTPEQVDRLTSEYHIYMTRNGRISMAGVTTGNVGYLA 392 ****** ** * * * *** *** ** ** A_thaliana_cyt DAMHAAVTRLG 405 A_thaliana_chl DAIIDSYHNVS 410 A_thaliana_mt NAIHEVTKSS- 402 * Rys. 4. Zestawienie sekwencji aminokwasowych izoenzymu cytoplazmatycznego, chloroplastowego i mitochondrialnego aminotransferazy asparaginianowej (AAT) z rzodkiewnika. Konserwatywne reszty aminokwasowe oznaczono gwiazdką. Aminokwasy w pozycjach: Tyr70, SerGlyThr , Trp140, Asn194, Asp222, Tyr225, Ser255, Lys258 i Arg266 tworzące centra aktywne AAT oznaczono pogrubioną czcionką. Badania z zastosowaniem krystalografii rentgenowskiej AAT z Escherichia coli (Jager i współ., 1994), kury (Malashkevich i współ., 1995), czy świni (Arnone i współ., 1985) w połączeniu ze wcześniejszymi badaniami chemicznymi, kinetycznymi i spektroskopowymi (Christen i Metzler, 1985) oraz stosunkowo nowszymi badaniami z zastosowaniem ukierunkowanej mutagenezy (Hayashi i współ., 1989; Vacca i współ., 1997) pozwoliły na wyjaśnienie roli jaką pełnią niektóre aminokwasy konserwatywne w przebiegu katalizy enzymatycznej AAT. Ustalono w tych badaniach m.in., Ŝe reszty aminokwasów konserwatywnych: *Tyr70 (gwiazdka oznacza, Ŝe reszta pochodzi z drugiej podjednostki), SerGlyThr , Asn194, Ser255 i Arg266 poprzez wiązania wodorowe łączą się z grupą ortofosforanową kofaktora 5`-fosforanu pirydoksalu 22

23 (PLP), Trp140 przez oddziaływania hydrofobowe z pierścieniem PLP; Asp222 oddziałuje elektrostatycznie z N + w pierścieniu PLP, Tyr225 przez wiązanie wodorowe z OH w PLP, Lys258 wiąŝe się kowalencyjnie z grupą karbonylową PLP w sytuacji, kiedy substrat nie jest związany z enzymem, zaś reszty aminokwasowe *Arg292 i Arg386 uczestniczą w wiązaniu grup karboksylowych substratu (Kirsch i współ., 1984; John, 1995; Jensen i Gu, 1996). Rozpatrywane reszty zajmują identyczne pozycje w sekwencjach AAT pochodzących z róŝnych źródeł i razem z resztami w ich najbliŝszym sąsiedztwie tworzą centra aktywne AAT (rys. 5). NH O H 2 N *Lys 68 *Asn 69 H 2 N NH O O O NH NH O *Arg 292 O - OC *Tyr 70 OH NH NH NH 2 NH 2 Lys 258 COO - HN NH 2 NH Arg 386 NH O Glu O OC O NH HN O NH H 2 N Arg 266 NH O O NH O - NHHO O P Thr 109 NH H CH 3 Gly 110 O - O - O OC NH N + H N Asp 222 O O OH NH 2 O NH Tyr 225 CH 2 R H H 2 N N NH NH Asn 194 Pro 195 Xyz 196 Gly 197 O O O O Rys. 5. Model przestrzenny centrum aktywnego aminotransferazy asparaginianowej. Kolorem fioletowym i niebieskim zaznaczono obydwie podjednostki enzymu, które w swoich centrach aktywnych łączą się z kofaktorem 5`-fosforanem pirydoksalu (PLP) (kolor czarny). Grupa ortofosforanowa PLP jest połączona z apoenzymem poprzez wiązania wodorowe aminokwasów: *Tyr70 (gwiazdką oznaczono aminokwasy pochodzące z drugiej podjednostki), SerGlyThr , Asn194, Ser255 i Arg266, przez wiązanie hydrofobowe Trp140 z pierścieniem PLP, oddziaływania elektrostatyczne Asp222 z N + w pierścieniu PLP, wiązanie wodorowe Tyr225 z OH w PLP oraz połączenie kowalencyjne Lys258 z grupą karbonylową PLP w sytuacji, kiedy substrat (kolor czerwony) nie jest związany z enzymem. Rozpatrywane reszty zajmują identyczne pozycje w sekwencjach AAT pochodzących z róŝnych źródeł i razem z resztami w ich najbliŝszym sąsiedztwie tworzą centra aktywne AAT. O Wielu autorów stosując głównie metody ukierunkowanej mutagenezy udowodniło ponadto, Ŝe takie reszty aminokwasowe jak: His143 (Yano i współ., 1991), Cys191 (Jeffery i współ., 2000), *Lys68 i Glu265 (Deu i współ., 2002) są równieŝ istotne dla przebiegu katalizy z udziałem AAT mimo, Ŝe nie łączą się bezpośrednio ani z PLP, ani z cząsteczką substratu, ale występują w sąsiedztwie reszt odpowiedzialnych za te funkcje. Uzasadnione wydaje się stwierdzenie, Ŝe w róŝnicach w obrębie fragmentów peptydowych obejmujących te właśnie reszty naleŝy upatrywać przyczyn otrzymywania odmiennych wartości dla parametrów kinetycznych takich jak: V max, K m, k cat, czy k cat /K m 23

24 dla AAT pochodzenia bakteryjnego (Nobe i współ., 1998; Deu i współ., 2002; Kim i współ., 2003; Chow i współ., 2004), zwierzęcego (Campos-Cavieres i Munn, 1973; Azzariti i współ. 1998), czy roślinnego (Wilkie i Warren, 1998) Właściwości kinetyczne AAT Aminotransferaza asparaginianowa (AAT, EC ) jest aktywna katalitycznie wyłącznie jako dimer (Kirsch i współ., 1984). W centrum aktywnym występuje silnie związany z apoenzymem kofaktor 5`-fosforan pirydoksalu (PLP), a enzym działa zgodnie z mechanizmem zwanym Ping Pong Bi Bi. Najbardziej charakterystyczną cechą tego mechanizmu jest to, Ŝe odłączenie pierwszego produktu reakcji następuje przed przyłączeniem drugiego substratu przez enzym. AAT katalizuje reakcję przeniesienia grupy aminowej z L-asparaginianu (rys. 6) na węgiel karbonylowy 2-oksoglutaranu lub z L-glutaminianu (rys. 6) na taki węgiel w szczawiooctanie, w wyniku czego powstaje odpowiednia 2-oksokwasowa pochodna L-aminokwasu, który był dawcą grupy aminowej oraz nowy L-aminokwas. Reakcja jest w pełni odwracalna. Ponadto L-sulfinylocysteinian (rys. 6), który jest intermediatem w szlaku biosyntezy cysteiny ( moŝe równieŝ być dawcą grupy aminowej w reakcji katalizowanej przez AAT. To właśnie na reakcji transaminacji z udziałem L-sulfinylocysteinianu i 2-oksoglutaranu opiera się najczęściej stosowana metoda wywoływania aktywności AAT na zymogramie (Yagi i współ., 1981; Stejskal, 1994). L-asparaginian L-sulfinylocysteinian L-glutaminian Rys. 6. Modele przestrzenne substratów będącymi dawcami grupy aminowej w reakcji katalizowanej przez aminotransferaze asparaginianową: L-asparaginianu, L-sulfinylocysteinianu i L-glutaminianu. Taniguchi i Sugiyama (1990) oznaczyli wartości stałej K m wobec 4 substratów: asparaginianu, glutaminianu, 2-oksoglutaranu i szczawiooctanu dla dwóch pasm AAT-1 i AAT-3 (bez rozdzielenia alloenzymów) z liści prosa afrykańskiego (Eleusine 24

25 coracana). Poszczególne pasma tylko w niewielkim stopniu róŝniły się wartościami tej stałej. Wyraźniejsze róŝnice w stałej K m zaobserwowano między izoenzymami z 3 pasm (po 3 alloenzymy cytoplazmatyczne i chloroplastowe oraz 1 mitochondrialny) z liści prosa zwyczajnego (Panicum miliaceum) (Taniguchi i współ., 1995). Mitochondrialny izoenzym charakteryzował się niŝszymi wartościami K m wobec substratów aminokwasowych w porównaniu z sześcioma pozostałymi (ibid.). Z kolei 3 formy chloroplastowe AAT wykazywały znacznie wyŝsze powinowactwo do oksokwasów niŝ ich homologi pochodzące z innych przedziałów komórkowych (ibid.). Pomimo, Ŝe AAT naleŝy do grona najlepiej poznanych enzymów, to wartości parametrów kinetycznych k cat i k cat /K m dla natywnego enzymu pochodzą z zaledwie czterech źródeł: owcy (Campos-Cavieres i Munn, 1973), Thermus thermophilus (Nobe i współ. 1998), Escherichia coli (Deu i współ., 2002) i Pharmidium lapideum (Kim i współ., 2003). Zdecydowaną większość parametrów kinetycznych otrzymano dla rekombinowanych form AAT ( róŝnego pochodzenia (Hayashi i współ., 1989; Azzariti i współ., 1998; Vacca i współ., 1997; Wilkie i Warren, 1998; Chow i współ., 2004) Funkcje metaboliczne AAT u roślin Substraty lub produkty reakcji katalizowanej przez aminotransferazę asparaginianową (asparaginian, glutaminian, 2-oksoglutaran i szczawiooctan) zaliczamy do podstawowych związków niezbędnych dla prawidłowego funkcjonowania kaŝdej Ŝywej komórki. Stąd enzymowi wpływającemu na ich poziom w organizmie przypisuje się najrozmaitsze funkcje. I tak u roślin uwaŝa się, Ŝe AAT bierze udział w asymilacji azotu dostarczając substratu tj. 2-oksoglutaranu do cyklu syntetazy glutaminowej i syntazy glutaminianowej (tzw. cykl GS/GOGAT) (Taiz i Zeiger, 1991). Reakcja katalizowana przez AAT stanowi główne źródło asparaginianu, który jest związkiem wyjściowym w syntezie asparaginy i ureidów uczestniczących w transporcie związków azotowych w całych roślinach oraz prekursorem w biosyntezie metioniny i lizyny aminokwasów niezbędnych do syntezy białek (Schubert, 1986). AAT bierze udział w międzykomórkowym transporcie metabolitów pomiędzy komórkami mezofilu a komórkami pochwy okołowiązkowej u dwóch z trzech rodzajów roślin typu C 4 (Burnell i Hatch, 1988). W pierwszym rodzaju w uwolnieniu CO 2 uczestniczy enzym jabłczanowy współdziałający z NADP +, w drugim enzym jabłczanowy współdziałający z NAD + a w trzecim karboksykinaza fosfoenolopirogranianowa (ibid.). We wszystkich 25

26 tych roślinach CO 2 wbudowywany jest do czterowęglowego kwasu szczawiooctowego w komórkach mezofilu i transportowany do komórek pochwy okołowiązkowej, gdzie po dekarboksylacji końcowej postaci związku transportującego zostaje włączany do cyklu Calvina (ibid.). W pierwszym rodzaju roślin C 4 główną formę przenośnikową CO 2 do komórek pochwy okołowiązkowej stanowi jabłczan, natomiast w dwóch pozostałych substrat AAT asparaginian (ibid.). AAT uczestniczy w wewnątrzkomórkowym jabłczanowo-asparaginianowym systemie wahadłowym przenoszącym równowaŝniki redukcyjne w poprzek błony mitochondrialnej (Hanning i Heldt, 1993), chloroplastowej (Heber, 1974) i peroksysomalnej (Tolbert i współ., 1969). Czółenko jabłczanowo-asparaginianowe funkcjonuje równieŝ w brodawkach korzeniowych transportując równowaŝniki redukcyjne z komórek gospodarza do endofitu (Appels i Haaker, 1991). Enzym odgrywa waŝną rolę w reakcji transaminacji prowadzącej do usuwania azotu z aminokwasów i w ten sposób dostarczania 2-oksokwasów do cyklu Krebsa oraz w transporcie szczawiooctanu (jako substratu glukoneogenezy) z mitochondriów do cytoplazmy (Voet i Voet, 1995). Ponadto niektórzy autorzy ( proponują udział AAT w metabolizmie cysteiny, tj. katalizowanie reakcji transaminacji z sulfinylocysteinianem jako donorem grupy aminowej. 26

27 3. Cel Celem niniejszej pracy doktorskiej było określenie całkowitej liczby genów kodujących aminotransferazę asparaginianową (AAT) u pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum L.) oraz ich lokalizacja chromosomalna, poznanie sekwencji nukleotydowych tych genów na poziomie cdna, pomiar ich ekspresji na poziomie mrna oraz zbadanie właściwości biochemicznych kodowanych przez nie izoenzymów. W zamyśle autora uzyskane wyniki miały wzbogacić dotychczasową wiedzę na temat przebiegu biosyntezy AAT u roślin poliploidalnych oraz stanowić naturalne uzupełnienie rozpoczętego w 2003 r. projektu zmierzającego do zsekwencjonowania genomu tej waŝnej z gospodarczego punktu widzenia rośliny. 27

28 4. Materiał i metody 4.1. Materiał doświadczalny Nasiona pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum L.) odmiany Jasna pochodziły od Jana Torby z przedsiębiorstwa nasiennego Kobierzyce ( Nasiona pszenicy odmiany Chinese Spring z liniami aneuploidalnymi (monosomiki: M3A, M3B; ditelosomiki: Dt3AL, Dt3AS, Dt3BS; nulli-tetrasomiki: NT3B-3A) oraz liniami delecyjnymi (3AL-01 6, -7; 3BL-01 4, ; 3DL-01, -03) otrzymano od prof. Takashi Endo z Uniwersytetu w Kyoto (Japonia) w ramach projektu ang. National BioResources Project Wheat ( Wszystkie rodzaje nasion uprawiano w kuwetach ( cm) w uniwersalnej glebie do kwiatów doniczkowych (ph 6,5) przez 14 dni w fitotronie z cyklem światło (400 µe)/ciemność 16 godz./8 godz., temp. 25 C przy 80% wilgotności w atmosferze. Do oczyszczania enzymu, jak równieŝ do izolacji kwasów nukleinowych pobierano zielone części 14 dniowych siewek Oczyszczanie alloenzymów AAT KaŜdorazowo do oczyszczania 6-ciu alloenzymów aminotransferazy asparaginianowej (AAT) (po 3 alloenzymy z pasma AAT-2 i AAT-3) pobierano po około 500 g zielonych części 14 dniowych siewek pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum L.) odmiany Jasna. Rośliny homogenizowano w 100 mm buforze Tris-HCl ph 7,5, a otrzymany ekstrakt po przesączeniu przez dwie warstwy gazy lekarskiej wysalano siarczanem amonowym w zakresie od 40% do 80% nasycenia roztworu solą. Osad rozpuszczano w jak najmniejszej objętości 10 mm buforu Tris-HCl ph 7,5, który stosowano w kolejnych etapach oczyszczania jako bufor kolumny, odwirowywano przez 30 min przy g i klarowny roztwór nanoszono w objętości około 40 ml na kolumnę Sephadex G-150 (2,6 95 cm). Kolumnę przemywano buforem kolumny z szybkością 27 ml/godz. zbierając do kolektora frakcje o objętości 9 ml. Frakcje wykazujące najwyŝszą aktywność AAT łączono ze sobą i całość nanoszono na kolumnę z DEAE-celulozy (2,6 10 cm) podłączoną do zestawu do chromatografii niskociśnieniowej Bio-Logic firmy Bio-Rad. Związany ze złoŝem enzym wymywano z szybkością 1,5 ml/min we wzrastającym liniowym gradiencie KCl od 0 do 250 mm w buforze kolumny o objętości 240 ml. Zbierane do kolektora 4,5 ml frakcje odpowiadające aktywnościom alloenzymów AAT z pasma chloroplastowego (AAT-2) 28

29 lub cytoplazmatycznego (AAT-3) łączono, po czym osobno zagęszczano w aparacie Amicon 8010 na membranie PM-30 (Millipore). Po tym etapie alloenzymy z pasma AAT-2 dodatkowo poddawano oczyszczaniu na kolumnie L-ornityna-Sepharose 4B (0,8 8 cm). Związane na tej kolumnie alloenzymy z pasma AAT-2 wymywano z szybkością 1,5 ml/min we wzrastającym liniowym gradiencie KCl od 20 do 120 mm w buforze kolumny o objętości 240 ml. Następnie, częściowo oczyszczone alloenzymy z pasma AAT-2 i AAT-3 osobno poddawano chromatografii anionowymiennej na kolumnie Protein-Pak Q 8HR (1 10 cm) podłączonej do zestawu HPLC (Waters). Alloenzymy związane ze złoŝem wymywano z szybkością 1,5 ml/min we wzrastającym liniowym gradiencie od 20 do 100 mm KCl (AAT-3) i od 120 do 195 mm KCl (AAT- 2) w buforze kolumny o objętości 240 ml. KaŜdą z 4,5 ml frakcji zawierającą wyłącznie jedne z 6-ciu alloenzymów wyczerpująco dializowano wobec 10 mm buforu Tris-HCl ph 7,5 i zagęszczano w aparacie Amicon (membrana PM-30). Wszystkie etapy z wyjątkiem HPLC przeprowadzono w temp. 4 C. Preparaty wykazujące aktywność AAT przechowywane w temp. 4 C traciły kaŝdego dnia średnio 5% swojej całkowitej aktywności. Oczyszczone preparaty AAT po podzieleniu na porcje i dodaniu sorbitolu do stęŝenia 10% przechowywano w zamraŝarce w temp. -20 C. KaŜdorazowe rozmroŝenie wiązało się z około 10% utratą wyjściowej aktywności. Kolumny wypełnione DEAE-celulozą i L-ornityna-Sepharose 4B po kaŝdym uŝyciu regenerowano roztworami: 0,5 M KCl w 0,1 M KOH, 0,5 M KCl i 0,5 M KCl w 0,1 M HCl. Kolumny przechowywano w 10 mm buforze Tris-HCl ph 7,5 z dodatkiem 0,04% azydku sodu Wyznaczanie masy cząsteczkowej AAT w warunkach natywnych Masę cząsteczkową aminotransferazy asparaginianowej w warunkach natywnych wyznaczono na kolumnie z Ŝelu Sephadex G-150 (2,6 85 cm) wykalibrowanej przy pomocy następujących białek wzorcowych: 30 mg dehydrogenazy alkoholowej (150 kda), 11 mg dimeru (134 kda) i monomeru (67 kda) albuminy z surowicy wołowej, 4,5 mg owoalbuminy (43 kda) i 4,9 mg chymotrypsynogenu (25 kda). Objętość zerową kolumny wyznaczono przy pomocy 2 mg błękitu dekstranowego (2 MDa). Na kolumnę wyrównowaŝoną 10 mm buforem Tris-HCl ph 7,5 nanoszono preparat po etapie wysalania siarczanem amonowym. Szybkość elucji wynosiła 9 ml/godz., zaś objętość zbieranych frakcji 3 ml. W zebranych do kolektora 3 ml frakcjach zawartość błękitu dekstranowego oznaczano metodą spektrofotometryczną przy długości fali 625 nm, natomiast białek wzorcowych przy 280 nm. 29

30 4.4. Spektrofotometryczny pomiar aktywności AAT i oznaczanie stęŝenia białka W spektrofotometrycznej metodzie oznaczania aktywności aminotransferazy asparaginianowej (AAT) reakcję enzymatyczną prowadzono w temp. 25 C w 100 mm buforze Tris-HCl ph 7,5 zawierającym 200 mm L-asparaginian, 10 mm 2-oksoglutaran, 0,12 mm NADH (roztwór wyjściowy w 0,06% NaHCO 3 ) i 0,4 U/ml dehydrogenazy jabłczanowej (Bergmayer i Bernt, 1974). W reakcji odwrotnej, w kierunku powstawania asparaginianu, uŝyto tego samego buforu 100 mm Tris-HCl ph 7,5, ale zawierającego 15 mm L-glutaminian, 1 mm szczawiooctan, 3 mm NH 4 Cl, 0,12 mm NADH i 3 U/ml dehydrogenazy glutaminianowej (Wilkie i Warren, 1998). W obydwu oznaczeniach jako jednostkę aktywności enzymu (1 U) przyjęto tę jego ilość, która katalizuje powstanie 1 µmola NAD + w ciągu 1 min w opisanych warunkach przebiegu reakcji enzymatycznej. Ilość jednostek aktywności wyliczano ze wzoru: gdzie: A 340 zmiana absorbancji; Α r 1 U= ε NADH t 340 r rozcieńczenie, czyli stosunek objętości mieszaniny reakcyjnej do objętości dodanego preparatu; NADH ε 340 = 6220 molowy współczynnik absorbcji dla NADH przy 340 nm; t czas trwania reakcji w minutach. StęŜenie białka oznaczano metodą Bradford (1976) stosując jako standard albuminę z surowicy wołowej. Aktywność właściwą wyraŝano jako 1 U w przeliczeniu na 1 mg białka w preparacie. Względną zawartość białka w zebranych do kolektora frakcjach oznaczano spektrofotometrycznie przy długości fali wynoszącej 280 nm Elektroforeza w warunkach niedenaturujących i sporządzanie zymogramów AAT Elektroforezę natywną prowadzono w 4% (Ŝel zageszczający) i 7,5% Ŝelu poliakryloamidowym (Ŝel rozdzielający) w 50 mm buforze Tris-glicyna ph 9,1, w aparacie Mini-PROTEAN II (Bio-Rad), przy stałym napięciu 100 V przez 240 min. 30

31 Po zakończeniu elektroforezy, Ŝele barwiono na aktywność aminotransferazy asparaginianowej według oryginalnej metody opracowanej przez Yagi i współ. (1981) z późniejszymi modyfikacjami (Stejskal 1994). śele inkubowano w 100 mm buforze Tris-HCl ph 7,5 z substratami enzymu: 8 mm L-sulfinylocysteinianem i 5 mm 2-oksoglutaranem oraz przenośnikami elektronów: 0,5 mm bromkiem 3-[4,5- dimetyltiazol-2-yl]-2,5-difenylo-tetrazolowym (MTT) i 0,16 mm N-metylofenazyno metasulfonianem (m-pms) odpowiedzialnymi za powstanie w Ŝelu barwnego produktu o natęŝeniu barwy wprost proporcjonalnej do aktywności enzymu. śele nie wymagały inkubacji w ciemności, jak równieŝ dodawania do mieszaniny reakcyjnej fosforanu pirydoksalu jak to opisano wcześniej (Stejskal, 1994) Elektroforeza w warunkach denaturujących Rozdziały prowadzono w Ŝelu poliakryloamidowym przygotowanym zgodnie z procedurą Laemmli`ego (1970) w układzie nieciągłym z 4% Ŝelem zagęszczającym i 15% Ŝelem rozdzielającym, buforze elektrodowym Tris-glicyna ph 8,3 z 1% SDS. Elektroforezę powadzono w aparacie Mini-PROTEAN II (Bio-Rad) przy stałym napięciu 200 V przez około 1 godz. Przed naniesieniem próbek mieszano je w stosunku 2 do 1 z 0,1 M buforem próby Tris-HCl ph 6,8 z dodatkiem 3% dodecylosiarczanu sodu. Po dodaniu do probówek Eppendorfa 2 µl 14,2 M 2-merkaptoetanolu, probówki z otworem w wieczku przetrzymywano w małym naczynku we wrzącej łaźni wodnej przez 5 min, a następnie dodawano do kaŝdej z nich po jednym kryształku sacharozy i 3 µl 1% błękitu bromofenolowego. UŜywano następujących wzorców mas cząsteczkowych: lizozym (14,4 kda), sojowy inhibitor trypsyny (21,5 kda), anhydraza węglanowa (31,0 kda), owoalbumina (45,0 kda), albumina (66,2 kda) i fosforylaza b (97,4 kda) (Bio-Rad). PrąŜki białkowe barwiono metodą Bluma i współ. (1987). Barwienie obejmowało następujące etapy: utrwalania w 50% etanolu, 12% kwasie octowym i 0,5% aldehydzie mrówkowym przez co najmniej 1 godz.; impregnacji w 0,01% tiosiarczanie sodowym (Na 2 S 2 O 3 5 H 2 O) przez 1 min; barwienia w 0,1% azotanie srebra i 0,074% aldehydzie mrówkowym przez 20 min i etapu wywoływania w 3% węglanie sodowym, 0,05% aldehydzie mrówkowym i 0,002% tiosiarczanie sodowym przez 30 s. Reakcje zatrzymywano przy pomocy nasyconego roztworu EDTA. W razie potrzeby była moŝliwość odbarwienia Ŝelu w roztworze 2% Ŝelazocyjanku potasowego z 0,2% tiosiarczanem sodowym. PrąŜki na Ŝelu dokumentowano elektronicznie, pomiarów densytometrycznych dokonywano 31

32 za pomocą programu komputerowego NIH Image ( Wybarwione azotanem srebra prąŝki białkowe wycinano pęsetą z Ŝelu i po umieszczeniu w probówce Eppendorfa dostarczano do Środowiskowego Laboratorium Spektrometrii Mas w Instytucie Biochemii i Biofizyki PAN ( gdzie po hydrolizie z udziałem trypsyny otrzymane peptydy analizowano w spektometrze mas ESI-FTICR (ang. electrospray ionization Fourier transform ion cyklotron resonance, ESI-FTICR). Wyniki posłuŝyły do przeszukiwania baz danych dla białek za pomocą programu Mascot ( Ekstrakcja RNA Materiał roślinny (~100 mg) ucierano w ciekłym azocie, po czym RNA ekstrahowano metodą Trizolową (TRI Reagent, Sigma-Aldrich). Czystość oraz stęŝenie wyizolowanego RNA oznaczano spektrofotometrycznie mierząc absorbancję RNA względem wody przy 3 długościach fal, tj. 230 nm dla węglowodanów, 260 nm dla kwasów nukleinowych oraz 280 nm dla białka. Jeśli współczynnik A 260 /A 280 oraz A 260 /A 230 wynosił 1,8 lub więcej, to oznaczało, Ŝe preparat był dobrze oczyszczony i uŝywano go do dalszych etapów. StęŜenie RNA w próbie liczono ze wzoru: [RNA µg/µl] = A 260 0,04 µg/µl rozcieńczenie Synteza pierwszej nici cdna Syntezę pierwszej nici cdna wykonano stosując odczynniki z zestawu RevertAid TM First Strand cdna Synthesis Kit (Fermentas). 5 µg RNA w objętości 60 µl mieszano w probówce do PCR z 5 µl oligonukleotydów (dt) 18, następnie inkubowano w termocyklerze przez 5 min w temp. 70 C, a po schłodzeniu mieszaniny do 25 C dodawano 20 µl buforu reakcyjnego (5-krotnie stęŝonego), 5 µl inhibitora rybonukleazy RiboLock TM, 10 µl mieszaniny trifosforanów deoksyrybonukleozydów (10 mm) i 5 µl odwrotnej transkryptazy (200 U/µl) RevertAid TM M-MuLV, po czym całość inkubowano przez 10 min w temp. 25 C, 60 min w 42 C i 10 min w 70 C PCR PCR prowadzono w specjalnych probówkach do PCR w objętości 30 µl, z czego 15 µl stanowił bufor 2 PCR Master Mix (Fermentas), 2 µl cdna i 4 µl para starterów (400 nm). Startery syntetyzowano w Laboratorium Sekwencjonowania DNA i Syntezy Oligonukleotydów w Instytucie Biochemii i Biofizyki PAN ( 32

33 Stosowano następujący program: 94 C/1 min; 35 (94 C/45 s, ~50 C/30 s, 72 C/1 min) Elektroforeza DNA Rozdzielanie fragmentów DNA prowadzono w 1,5% Ŝelach agarozowych w buforze TAE (40 mm Tris, 20 mm kw. octowy, 1 mm EDTA, ph 8,0). Przed zastygnięciem Ŝelu dodawano 4 µl 1% bromku etydyny. Próbki DNA, czy teŝ marker (Gene Ruler TM 100 bp DNA Ladder Plus, Fermentas) nanoszono do studzienek w Ŝelu po uprzednim zmieszaniu z barwnikiem (6 Loading Dye Solution, Fermentas). Elektroforezę prowadzono przy napięciu 100 V (~60 ma) przez około 1 godz. Do elucji DNA z Ŝelu agarozowego prąŝków stosowano gotowy do uŝycia zestaw do ekstrakcji DNA (DNA Extraction Kit, Fermentas). Wydajność elucji była sprawdzana w 1,2% Ŝelu agarozowym Ligacja DNA do wektora Oczyszczone produkty PCR ligowano do wektora stosując zestaw pgem -T Easy vector firmy Promega. Do probówki Eppendorfa dodawano następujące składniki: ~5 µl 2 stęŝ. buforu ligacyjnego, 1 µl wektora pgem -T Easy, ~5 µl produktu PCR po elucji z Ŝelu, 1 µl ligazy DNA T4. Całość inkubowano w temp. 4 C przez noc dla uzyskania maksymalnej ilości transformantów Transfer plazmidów do komórek kompetentnych Do 2 µl mieszaniny ligacyjnej w probówce Eppendorfa dodawano 50 µl roztworu komórek Escherichia coli (Promega). Komórki kompetentne trzymano przez kilka minut na lodzie, po czym poddawano je szokowi termicznemu w łaźni wodnej o temp. 42 C przez 45 s. Po schłodzeniu, do probówek dodawano 1 ml roztworu SOC ph 7,5 o składzie: 2% pepton, 6% ekstrakt droŝdŝowy, 100 mm NaCl, 25 mm KCl, 100 mm MgCl 2, 100 mm MgSO 4, 200 mm glukoza i całość inkubowano w temp. 37 C przez 1,5 godz. z wytrząsaniem. Po upływie tego czasu, na płytkę Petriego z podłoŝem stałym Luria-Bertani (LB) ph 8,0 o składzie: 5% NaCl, 2,5% ekstrakt droŝdŝowy, 5% pepton trypton, 7,5% agar, 500 µl ampicylina (100 mg/ml) wcierano za pomocą głaszczki 200 µl roztworu 1% 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-galaktopiranozydu (Xgal) i 50 mm izopropylogalaktozydu (IPTG), a następnie 100 µl kultury 33

34 transformacyjnej. Odwrócone płytki inkubowano przez noc, a do dalszych etapów wybierano białe kolonie, które przenoszono do probówek o objętości 3 ml z poŝywką płynną LB (bez agaru) i inkubowano w temp. 37 C z wytrząsaniem przez noc Izolacja DNA plazmidowego DNA plazmidowe izolowano metodą lizy alkalicznej. Hodowle bakterii o objętości około 4 ml wirowano w probówkach Eppendorfa o objętości 2 ml, a powstały osad bakterii zawieszano w 25 mm buforze Tris-HCl ph 8,0 z 50 mm glukozą i 10 mm EDTA. Następnie dodawano po 200 µl roztworu 0,2 M NaOH i 1% SDS w celu dokonania lizy komórek. Po upływie 5 min dodawano CH 3 COONH 4 do uzyskania stęŝenia 7,5 M. Po odwirowaniu, supernatant przenoszono do następnej probówki, dodawano 5 µl rybonukleazy (Sigma) i całość inkubowano przez kilka minut w temperaturze pokojowej. DNA plazmidowe wytrącano najpierw 96%, a następnie 70% etanolem. Uzyskany osad po osuszeniu rozpuszczano w objętości około 20 µl wody. Ilość i jakość DNA plazmidowego sprawdzano w 1,2% Ŝelu agarozowym z uŝyciem enzymów restrykcyjnych Eco RI i Hind III z serii Fast Digest (Fermentas). Plazmidy poddawano bezpośrednio sekwencjonowaniu w Laboratorium Sekwencjonowania DNA i Syntezy Oligonukleotydów w Instytucie Biochemii i Biofizyki PAN ( lub stanowiły one matrycę do przygotowaniu sond do metody Southerna za pomocą metody PCR PCR z analizą przyrostu ilości produktu w czasie rzeczywistym RNA wyizolowane metodą Trizolową (TRI Reagent, Sigma-Aldrich) posłuŝyło do zsyntetyzowania cdna z uŝyciem mieszaniny starterów oligo(dt) 18 i heksamerów (RevertAid TM First Strand cdna Synthesis Kit, Fermentas). Dla genu kodującego izoenzym cytoplazmatyczny aminotransferazy asparaginianowej (AAT) uŝyto pary starterów: 5`-CCTGGAGATTGGTCCCACATC-3` ( ) i 5`- GCCATGCTGATCCTCCCATC-3` ( ), zaś dla genu referencyjnego kodującego podjednostkę 18S rrna: 5`-GCGCGCAAATTACCCAATC-3` ( ) i 5`- AGACTTGCCCTCCAATGGATC-3` ( ). Amplifikowane fragmenty DNA wynosiły po 131 pz. Startery zaprojektowano na podstawie sekwencji zdeponowanych w bazie TGI dla pszenicy ( i zsyntetyzowano je w Laboratorium Sekwencjonowania DNA i Syntezy Oligonukleotydów w Instytucie Biochemii i Biofizyki PAN 34

35 ( Ilościowe pomiary poziomu ekspresji wykonano na aparacie Light Cycler w Zakładzie Genetycznie Modyfikowanych Organizmów w Instytucie Biochemii i Biofizyki PAN ( stosując technologię SYBR Green I (Roche). Zastosowano następujący program: 95 C/3 min; 45 (95 C/30 s, 65 C/15 s, 72 C/1 min). Po reakcji PCR wykonano krzywą topnienia w zakresie temperatur od 60 do 90 C z pomiarem fluorescencji co 15 s. Do wyznaczenia krzywej wzorcowej uŝyto stęŝeń: 40, 160, 320 i 640 ng cdna, zaś do pomiarów właściwych genu kodującego 18S rrna: 40 i 160 ng cdna oraz dla genu kodującego izoenzym cytoplazmatyczny AAT: 1920 i 3840 ng cdna. Pozorną liczbę kopii badanego genu liczono zgodnie z modelem matematycznym opracowanym przez Livaka (1997) Southern blot W celu przygotowania 3 sond odpowiadających genom kodującym izoenzymy: cytoplazmatyczny, chloroplastowy i mitochondrialny aminotransferazy asparaginianowej (AAT) wyizolowano całkowite RNA z pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum) odmiany Chinese Spring metodą Trizolową (TRI Reagent, Sigma- Aldrich). Następnie zsyntetyzowano cdna stosując oligo(dt) 18 (RevertAid TM First Strand cdna Synthesis Kit, Fermentas) i na matrycy tego cdna za pomocą metody PCR (95 C/3 min; 30 (95 C/30 s, 55 C/30 s, 72 C/1 min) stosując parę starterów: 5`-GGACTCTTAGAAGACCTCAGTT-3` ( ), 5`-TAAGCACTGTCAAAGAATGG- 3` ( ) dla genu cytoplazmatycznego zamplifikowano fragment o długości 159 pz, z kolei po uŝyciu starterów: 5`-ATGGCACTTGCAGTAGACGC-3` ( ) i 5`- CTTCTTGACAACATTGAGGA-3` ( ) dla genu chloroplastowego zamplifikowano fragment o długości 176 pz i w końcu po zastosowaniu pary: 5`- GGGAGTATCCACATGATTGA-3` ( ) i 5`-CCAAGTTGGTGTAGGTATGT-3` ( ) dla genu mitochondrialnego AAT zamplifikowano fragment o długości 182 pz. Amplifikowane fragmenty DNA na matrycy cdna w całości odpowiadały sekwencji jednego egzona w jądrowym DNA. Odrzucenia sekwencji intronowych dokonano na podstawie dostępnych sekwencji jądrowego DNA i cdna z rzodkiewnika oraz porównaniu tych sekwencji z sekwencjami zdeponowanymi w bazie TGI dla pszenicy ( Startery zsyntetyzowano w Laboratorium Sekwencjonowania i Syntezy Oligonukleotydów w Instytucie Biochemii i Biofizyki PAN ( 35

36 Powielone fragmenty DNA z Ŝelu eluowano, oczyszczano (DNA Extraction Kit, Fermentas), poddawano ligacji a powstałym konstruktem transformowano komórki kompetentne Escherichia coli (pgem -T Easy vector, Promega). Plazmidy otrzymane metodą lizy alkalicznej z hodowli bakteryjnej słuŝyły jako matryca do ponownego PCR w tych samych warunkach. Nieradioaktywne znakowanie sond zostało przeprowadzone z uŝyciem zestawu do znakowania DIG-High Prime (Roche). Wydajność znakowania sond sprawdzano zgodnie z zaleceniami zawartymi w instrukcji DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I (Roche). DNA jądrowe ekstrahowano z 14 dniowych siewek pszenicy ucieranych w ciekłym azocie z uŝyciem odczynnika CTAB (Graham i współ., 1994). DNA poddawano 24 godz. działaniu enzymów restrykcyjnych: EcoRI i HindIII (FastDigest, Fermentas) stosując 5 U enzymu na 1 µg DNA. Rozdział fragmentów restrykcyjnych DNA w ilości 10 µg na studzienkę prowadzony był w 0,8% Ŝelu agarozowym (8 10 cm) w buforze TBE (100 mm Tris, 100 mm kwas borowy, 20 mm EDTA) przy stałym napięciu 60 V do wyjścia z Ŝelu znacznika. Jako markera wielkości rozdzielanych fragmentów DNA uŝyto Gene Ruler TM 1 kb DNA Ladder (Fermentas). Po zakończeniu elektroforezy Ŝel zanurzano w 0,25 M HCl (depurynacja DNA) na okres 15 min, w 1 M NaCl w 0,4 M NaOH równieŝ na okres 15 min (denaturacja DNA) i neutralizowano go w 0,5 M buforze Tris-HCl ph 7,5 z dodatkiem 1 M NaCl. Transfer DNA z Ŝelu na dodatnio naładowaną membranę nylonową (Roche Applied Science) prowadzono techniką od dołu w 0,4 M NaOH z dodatkiem 1 M NaCl przez 3 godz. Po zakończeniu transferu membranę nylonową neutralizowano w 0,3 M buforze chlorku sodu ph 7,0 z dodatkiem 30 mm cytrynianu sodu, a następnie zapiekano w 80 C przez 2 godz. Membranę inkubowano ze znakowanymi digoksygeniną sondami (10 ng/ml) w temp. 38 C przez noc, po czym inkubowano ją w roztworze zawierającym 0,1 M kwas maleinowy, 0,15 M NaCl ph 7,5 i 0,3% Tween-20 (DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I, Roche). Następnie membranę zalewano buforem blokującym i dodawano przeciwciała swoiste dla digoksygeniny sprzęŝonej z fosfatazą alkaliczną (DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I, Roche). Po przepłukaniu membrany w 0,1 M buforze Tris-HCl ph 9,5 z dodatkiem 0,1 M NaCl pozostawiono ją w roztworze zawierającym substraty do barwnej reakcji z fosforanem 5-bromo-4-chloro-3-indoksylu (BCIP) i błękitem nitrotetrazoliowym (NBT) na okres kilku godzin w ciemności, do momentu pojawienia się prąŝków na membranie. 36

37 5. Wyniki 5.1. Całkowita liczba genów kodujących izoenzymy AAT W celu określenia całkowitej liczby genów kodujących izoenzymy aminotransferazy asparaginianowej (AAT) u pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum) odmiany Jasna zastosowano metodę Southerna. Sondy do hybrydyzacji z DNA jądrowym odpowiadające genom AAT uzyskano amplifikując odpowiedniej długości fragmenty na matrycy cdna za pomocą PCR. Amplifikowane fragmenty DNA w całości odpowiadały sekwencji jednego egzona w DNA jądrowym. Informację o tym, w których miejscach znajdują się introny uzyskano pośrednio poprzez porówanie sekwencji genów AAT na poziomie DNA jądrowego i cdna z rzodkiewnika z sekwencjami AAT z pszenicy zamieszczonymi w bazie TGI ( Otrzymane po amplifikacji fragmenty wyeluowano z Ŝelu i wklonowano do wektora, po czym namnaŝano w plazmidach. Na matrycy plazmidów przeprowadzono ponowną amplifikację tych fragmentów DNA z tymi samymi starterami. Etap ten był niezbędny by uzyskać maksymalnie duŝo DNA specyficznego dla badanych genów. Uzyskano fragmenty DNA o długości 159 pz dla genu cytoplazmatycznego, 176 pz dla genu chloroplastowego i 182 pz dla genu mitochondrialnego (rys. 7). M Rys. 7. Przygotowanie sond do Southern blot. Za pomocą PCR na matrycy plazmidów z insertami specyficznymi dla genów AAT zamplifikowano fragmenty DNA o długości 159 pz dla genu cytoplazmatycznego (studzienka 1 i 2), 176 pz dla genu chloroplastowego (studzienka 3 i 4) i 182 pz dla genu mitochondrialnego (studzienka 5 i 6). W studzience oznaczonej jako M naniesiono wzorce długości łańcuchów DNA od 0,1 do 3 kpz. Mieszaninę reakcyjną po PCR wykonanym na matrycy DNA plazmidowego dla kaŝdej z 3 sond znakowano metodą ang. random priming z uŝyciem digoksygeniny. Wydajność znakowania sond sprawdzono na membranie nylonowej, na którą nakroplono w objętości 1 µl 5 róŝnych rozcieńczeń DNA kontrolnego w ilości od 0,1 pg do 1 ng (rys. 8) 37

38 Rys. 8. Test na wydajność znakowania sond specyficznych dla genów kodujących chloroplastowe, cytoplazmatyczne i mitochondrialne izoenzymy aminotransferazy asparaginianowej. Na membranę nylonową nakroplono w objętości 1 µl 5 róŝnych rozcieńczeń kaŝdej z 3 sond oraz DNA kontrolnego w ilości od 0,1 pg do 1 ng. Do wywołania reakcji uŝyto przeciwciał swoistych dla digoksygeniny sprzęŝonej z fosfatazą alkaliczną i substratami do barwnej reakcji: fosforanem 5-bromo-4-chloro-3- indoksylu i błękitem nitrotetrazoliowym. Na podstawie testu na wydajność znakowania sond, po uwzględnieniu zastosowanych rozcieńczeń ustalono, Ŝe kaŝdej sondy jest po 2,5 ng. Po przygotowaniu sond do hybrydyzacji ustalono warunki rozdziału jądrowego DNA poddanego hydrolizie z udziałem enzymów restrykcyjnych: EcoRI i Hind III (rys. 9). E H E H E H M1 M2 Rys. 9. Rozdział jądrowego DNA pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum) odmiany Jasna po hydrolizie z udziałem enzymów restrykcyjnych: EcoRI (E) i HindIII (H). W studzienkach M1 i M2 znajdują się wzorce długości łańcuchów nukleotydowych odpowiednio od 0,1 do 10 kpz i od 0,1 do 3 kpz. Jądrowe DNA po hydrolizie z udziałem enzymów restrykcyjnych rozdzielało się prawidłowo na Ŝelu agarozowym w postaci smugi (rys. 9). Hydrolizat DNA poddano transferowi kapilarnemu na membranę nylonową, a potem hybrydyzacji z uprzednio wyznakowanymi sondami DNA odpowiadającymi fragmentom sekwencji kodujących 3 izoenzymy AAT i wybarwiono z uŝyciem przeciwciał swoistych dla digoksygeniny 38

39 sprzęŝonej z fosfatazą alkaliczną i substratami do barwnej reakcji: fosforanem 5-bromo- 4-chloro-3-indoksylu i błękitem nitrotetrazoliowym (rys. 10). E H E H E H M cyt chl mt Rys. 10. Southern blot jądrowego DNA pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum) odmiany Jasna z sondami odpowiadającymi sekwencjom genów kodujących izoenzym cytoplazmatyczny, chloroplastowy i mitochondrialny aminotransferazy asparaginianowej. KaŜdą z sond hybrydyzowano na membranie nylonowej z jądrowym DNA po hydrolizie z udziałem enzymów restrykcyjnych: EcoRI (E) i HindIII (H). Kreskami oznaczono rozmieszczenie poszczególnych wzorców długości łańcuchów nukleotydowych. Na membranie nylonowej po barwieniu, dla kaŝdej z 3 sond w studzienkach, w których rozdzielane było jądrowe DNA po hydrolizie z udziałem enzymu restrykcyjnego EcoRI, pojawił się pojedynczy prąŝek, podczas gdy dla hydrolizatu enzymu HindIII nie pojawił się Ŝaden prąŝek (rys. 10). PrąŜki były rozmieszczone na róŝnych wysokościach. Ten odpowiadający sondzie genu cytoplazmatycznego znajdował się na wysokości fragmentu jądrowego DNA o wielkości 6 kpz (rys. 10). Sonda genu chloroplastowego (chlaat) zhybrydyzowała z fragmentem jądrowego DNA o wielkości około 4,5 kpz, zaś sonda genu mitochondrialnego z fragmentem o wielkości około 3,5 kpz (rys. 10). MoŜna przyjąć, Ŝe kaŝdy z genów AAT z pszenicy z diploidalnych genomów: A, B i D uległ hydrolizie z udziałem EcoRI na fragmenty o tej samej wielkości w ramach jednego genomu. Wynik moŝe zatem stanowić podstawę do stwierdzenia, Ŝe geny AAT występują tylko w 3 loci. W jednym lokus znajdują się geny kodujące podjednostki AAT izoenzymu cytoplazmatycznego, w drugim chloroplastowego a w trzecim izoenzymu mitochondrialnego. 39

40 5.2. Lokalizacja chromosomalna genów kodujących AAT W kolejnym etapie badań przy pomocy zymogramów aminotransferazy asparaginianowej (AAT) i linii delecyjnych pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum) odmiany Chinese Spring podjęto próbę doprecyzowania lokalizacji chromosomalnej genów kodujących cytoplazmatyczne i chloroplastowe alloenzymy tego enzymu. Linie delecyjne pszenicy pozbawione są określonej wielkości fragmentu chromatyny z danego chromosomu (Endo i Gill, 1996), co pozwala bardziej zawęzić umiejscowienie genów, aniŝeli stosowane przez Harta (1983) linie aneuploidalne pszenicy (Sears, 1954). Hart (1983) ustalił, Ŝe geny AAT znajdują się w trzech homeologicznych loci, tj. na długich ramionach (ang. long, L) 3-ciej pary 3AL, 3BL i 3DL (geny cytoplazmatyczne AAT); na długich ramionach 6-tej pary 6AL, 6BL, 6DL (geny chloroplastowe AAT) oraz na krótkich (ang. short, S) ramionach 6-tej pary chromosomów 6AS, 6BS, 6DS (geny mitochondrialne AAT). Przyjmując jako wyjściową przybliŝoną lokalizację genów AAT proponowaną przez Harta (1983) wykonano zymogramy enzymu z róŝnych linii delecyjnych dotyczących chromosomów, na których mogą znajdować się geny kodujące alloenzymy AAT (rys ) Rys. 11. Zymogramy pasma cytoplazmatycznego (AAT-3) aminotransferazy asparaginianowej uzyskane dla linii delecyjnych na długich ramionach 3 pary chromosomów homologicznych w obrębie diploidalnego genomu A pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum) odmiany Chinese Spring. Do studzienek nanoszono po 50 mu AAT z ekstraktów z siewek linii: 1, 3AL-01 (0,26); 2, 3AL-03 (0,42); 3, 3AL-04 (0,61); 4, 3AL-05 (0,78); 5, 3AL-06 (0,21); 6, 3AL-08 (0,85). Liczby w nawiasach oznaczają część chromatyny pozostałej na chromosomie linii delecyjnej. Na ideogramie długiego ramienia chromosomów z 3 pary diploidalnego genomu A (po prawej stronie) zaznaczono czerwonym kolorem lokalizację chromosomalną genu podjednostki α. W diploidalnych genomach A, B i D pszenicy, geny kodujące cytoplazmatyczne alloenzymy AAT znajdują się na długich ramionach 3 pary chromosomów homeologicznych. W tym lokus kodowane są dwa rodzaje podjednostek: α (kodowana tylko w genomie A) i β (kodowana w genomach B i D), które łącząc się ze sobą na trzy róŝne sposoby tworzą aktywne katalitycznie dimery cytoplazmatycznych alloenzymów 40

41 AAT. Na zymogramie AAT prąŝek (alloenzym) w pozycji AAT-3a o największej ruchliwości w kierunku anody utworzony jest z podjednostek ββ, AAT-3b αβ, zaś prąŝek w pozycji AAT-3c o najmniejszej ruchliwości elektroforetycznej w kierunku anody utworzony jest z podjednostek αα (Hart, 1983). Linie delecyjne pszenicy: 3AL- 01 (0,26), 3AL-03 (0,42) i 3AL-06 (0,21), gdzie liczby w nawiasach oznaczają część pozostałej na chromosomie chromatyny są pozbawione tej partii chromosomu, na której występują geny kodujące podjednostkę α i kodują tylko podjednostki β. W rezultacie na zymogramach AAT tych linii pojawia się jeden prąŝek w pozycji AAT-3a (rys. 11; studzienki: 1, 2 i 5). W pozostałych liniach delecyjnych pszenicy: 3AL-04 (0,61), 3AL- 05 (0,78) i 3AL-08 (0,85) występują chromosomy bez części chromatyny, ale jeszcze z genami kodującymi podjednostkę α. Wytwarzane są zatem dwa rodzaje podjednostek i na zymogramach odpowiadającym tym liniom widoczne są trzy prąŝki (rys. 11; studzienki: 3, 4 i 6). Konkludując, geny kodujące podjednostkę α cytoplazmatycznych alloenzymów AAT znajdują się na długich ramionach 3 pary chromosomów z genomu A między częścią chromatyny 0,42 (3AL-03) a 0,61 (3AL-04) (rys. 11) Rys. 12. Zymogramy pasma cytoplazmatycznego (AAT-3) aminotransferazy asparaginianowej uzyskane dla linii delecyjnych na długich ramionach 3 pary chromosomów homologicznych w obrębie diploidalnego genomu B pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum) odmiany Chinese Spring. Do studzienek nanoszono po 50 mu AAT z ekstraktów z siewek linii: 1, 3BL-01 (0,31); 2, 3BL-02 (0,22); 3, 3BL-03 (0,41); 4, 3BL-04 (0,07); 5, 3BL-06 (0,54); 6, 3BL-07 (0,63); 7, 3BL-08 (0,28); 8, 3BL-09 (0,38); 9, 3BL-10 (0,50); 10, 3BL-11 (0,81). Liczby w nawiasach oznaczają część chromatyny pozostałej na chromosomie linii delecyjnej. Na ideogramie długiego ramienia chromosomów z 3 pary diploidalnego genomu B (po prawej stronie) zaznaczono czerwonym kolorem lokalizację chromosomalną genu podjednostki β. Dokładna lokalizacja genów kodujących podjednostkę β na długich ramionach 3- ciej pary chromosomów homologicznych z diploidalnego genomu B okazuje się być trudniejsza, albowiem na zymogramie dla kaŝdej linii delecyjnej w obrębie pasma cytoplazmatycznego AAT występują 3 prąŝki, które róŝnią się jedynie intensywnością zabarwienia (rys. 12). Linie delecyjne pszenicy: 3BL-01 (0,31), 3BL-02 (0,22), 3BL-04 41

42 (0,07), 3BL-08 (0,28) pozbawione są części chromatyny z długiego ramienia chromosomu z 3 pary, na której występują geny kodujące podjednostkę β, zatem kodują one biosyntezę tylko dwóch podjednostek α i dwóch podjednostek β. Rozkład prąŝków na zymogramie powinien być 1:2:1, poniewaŝ jednak podjednostka α kodowana przez genom A jest biosyntetyzowana w większej ilości (Maciąga i Paszkowski, 2004), to prąŝki na zymogramie w pozycjach AAT-3c i AAT-3b są intensywniejsze (rys. 12; studzienki: 1, 2, 4, 7 i 8). Dla pozostałych linii delecyjnych pszenicy: 3BL-03 (0,41), 3BL-06 (0,54), 3BL-07 (0,63), 3BL-10 (0,50) i 3BL-11 (0,81) na dwie biosyntetyzowane podjednostki α kodowane przez genom A przypadają cztery kodowane przez geny z diploidalnych genomów B i D. Na zymogramie prąŝki w pozycjach AAT-3a (ββ) i AAT-3b (αβ) są intensywniej zabarwione (rys. 12; studzienki: 3, 5, 6, 9 i 10). Reasumując, geny kodujące podjednostkę β cytoplazmatycznych alloenzymów AAT znajdują się na długich ramionach 3 pary chromosomów z genomu B między częścią chromatyny 0,38 (3BL-09) a 0,41 (3BL-03) (rys. 12). 1 2 Rys. 13. Zymogramy pasma cytoplazmatycznego (AAT-3) aminotransferazy asparaginianowej uzyskane dla linii delecyjnych na długich ramionach 3 pary chromosomów homologicznych w obrębie diploidalnego genomu D pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum) odmiany Chinese Spring. Do studzienek nanoszono po 50 mu AAT z ekstraktów z siewek linii: 1, 3DL-01 (0,23); 2, 3DL-03 (0,81). Liczby w nawiasach oznaczają część chromatyny pozostałej na chromosomie linii delecyjnej. Na ideogramie długiego ramienia chromosomów z 3 pary diploidalnego genomu D (po prawej stronie) zaznaczono czerwonym kolorem lokalizację chromosomalną genu podjednostki β. Istnieją zaledwie 2 linie delecyjne pszenicy dotyczące długich ramion z 3 pary chromosomów homologicznych z genomu D. Linia 3DL-01 (0,23) biosyntetyzuje po dwie podjednostki α i β, dlatego prąŝki w pozycjach AAT-3b i AAT-3c są intensywniejsze (rys. 13; studzienka 1), podczas gdy linia 3DL-03 (0,81) wytwarza na kaŝde dwie podjednostki α, cztery podjednostki β, co sprawia Ŝe prąŝki AAT-3a i AAT-3b są intensywniej zabarwione (rys. 13; studzienka 2). Geny kodujące podjednostkę β cytoplazmatycznych alloenzymów AAT znajdują się na długich 42

43 ramionach 3 pary chromosomów z diploidalnego genomu D w rejonie obejmującym od 0,23 (3DL-01) do 0,81 (3DL-03) chromatyny (rys. 13). 1 2 Pasmo AAT-3 Pasmo AAT-2 Rys. 14. Zymogramy pasma chloroplastowego (AAT-2) aminotransferazy asparaginianowej uzyskane dla linii delecyjnych na krótkich ramionach z 6 pary chromosomów homologicznych w obrębie diploidalnego genomu A pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum) odmiany Chinese Spring. Do studzienek nanoszono po 50 mu AAT z ekstraktów z siewek linii: 1, 6AS-01 (0,35); 2, 6AS-05 (0,65). Liczby w nawiasach oznaczają część chromatyny pozostałej na chromosomie linii delecyjnej. Na ideogramie krótkiego ramienia chromosomów z 6 pary z diploidalnego genomu A (po prawej stronie) zaznaczono niebieskim kolorem lokalizację chromosomalną genu podjednostki chloroplastowego alloenzymu AAT. Za pomocą zymogramów AAT dla linii delecyjnych moŝliwe było teŝ ustalenie lokalizacji chromosomalnej genu kodującego podjednostkę, z której utworzone są alloenzymy z pasma chloroplastowego. Dla linii delecyjnej pszenicy 6AS-01 (0,35) w pozycji AAT-2c pojawił się pojedynczy prąŝek (moŝliwe, Ŝe są 3) (rys. 14; studzienka 1), podczas gdy dla linii 6AS-05 (0,65) 3 prąŝki (rys. 14; studzienka 2). Oznacza to, Ŝe geny kodujące podjednostkę chloroplastowych alloenzymów AAT znajdują się na krótkich ramionach 6 pary chromosomów z diploidalnego genomu A w rejonie obejmującym od 0,35 (6AS-01) do 0,65 (6AS-05) chromatyny (rys. 14). Hart (1983) umiejscowił geny chloroplastowe AAT na długich ramionach 6 pary chromosomów homeologicznych w diploidalnych genomach A, B i D. Warto jednak zwrócić uwagę, Ŝe między zymogramami AAT wykonanymi dla linii delecyjnych pozbawionych krótkich ramion z 6 pary chromosomów homeologicznych z diploidalnych genomów B i D oraz długich ramion z 6 pary z genomów A, B i D, gdzie winny znajdować się geny kodujące alloenzymy odpowiednio z pasma chloroplastowego i mitochondrialnego, co przeczy tezie Harta (1983), nie obserwowano Ŝadnych róŝnic (wyniki niepokazane). 43

44 5.3. Częstotliwość występowania podjednostek α i β W kolejnym etapie badań podjęto próbę dokładnego wyjaśnienia natury zaleŝności między ilością genów kodujących podjednostki α i β a rozkładem intensywności zabarwienia na zymogramach cytoplazmatycznych alloenzymów aminotransferazy asparaginianowej (AAT-3) utworzonych z tych podjednostek. W tym celu sporządzono zymogramy pasma AAT-3 uzyskane dla róŝnych linii aneuploidalnych pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum) odmiany Chinese Spring, które zawierają modyfikacje w obrębie 3 pary chromosomów homologicznych z diploidalnych genomów A, B i D, gdzie umiejscowione są geny kodujące podjednostki α i β (rys. 15). Warto przy tym dodać, Ŝe alloenzym w pozycji AAT-3a utworzony jest z dimerów ββ, AAT-3b αβ a alloenzym w pozycji AAT-3c z dimerów αα Rys. 15. Zymogramy alloenzymów aminotransferazy asparaginianowej z pasma cytoplazmatycznego (AAT-3) uzyskane dla róŝnych linii aneuploidalnych pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum) odmiany Chinese Spring. Do studzienek nanoszono po 50 mu AAT z ekstraktów z siewek linii ditelosomicznych (Dt), monosomicznych (M) oraz nulli-tetrasomicznych (NT): 1, Dt3AS; 2, M3A; 3, M3B; 4, Dt3AL; 5, Dt3BS; 6, NT3B-3A. Dt3AS to linia ditelosomiczna pozbawiona długich ramion z 3 pary chromosomów homologicznych z diploidalnego genomu A, na których występują geny kodujące podjednostki α. Roślina ta syntetyzuje wyłącznie podjednostki β, dlatego na zymogramie dla tej linii w obrębie pasma cytoplazmatycznego (AAT-3) obserwuje się wyłącznie jeden prąŝek w pozycji AAT-3a (rys. 15, studzienka 1). Pozostałe linie aneuploidalne pszenicy wytwarzają obydwa rodzaje podjednostek α i β, z tym jednak, Ŝe są one syntetyzowane w róŝnych proporcjach i na zymogramie w obrębie pasma AAT-3 rozkład intensywności zabarwienia alloenzymów dla kaŝdej linii wygląda nieco inaczej (rys. 15). Linia monosomiczna M3A jest pozbawiona jednego chromosomu z 3 pary chromosomów z genomu A i na 1 podjednostkę α syntetyzuje 4 β, co po zastosowaniu formuły (1α + 4β) 2 (Hart, 1983) daje teoretyczny rozkład intensywności 44

45 zabarwienia alloenzymów w pasmie AAT-3: 1 AAT-3c (αα) : 8 AAT-3b (αβ) : 16 AAT-3a (ββ) (rys. 15, studzienka 2). Analogiczna sytuacja występuje w przypadku pozostałych linii aneuploidalnych pszenicy. Linia M3B to linia pozbawiona jednego chromosomu z 3 pary chromosomów z diploidalnego genomu B i na 2 podjednostki α syntetyzuje 3 podjednostki β, co daje teoretyczny rozkład alloenzymów w obrębie pasma AAT-3: 4 AAT-3c : 12 AAT-3b : 9 AAT-3a (rys. 15, studzienka 3); Dt3AL to linia pozbawiona krótkich ramion chromosomów z 3 pary z diploidalnego genomu A, na których nie występują geny AAT, czyli dla 2α + 4β rozkład na zymogramie winien się przedstawiać jak: 1 AAT-3c : 4 AAT-3b : 4 AAT-3a (rys. 15, studzienka 4); w linii Dt3BS nie występują długie ramiona z 3 pary chromosomów homologicznych z diploidalnego genomu B, a zatem dla 2α i 2β naleŝy się spodziewać zymogramu: 1 AAT-3c : 2 AAT-3b : 1 AAT-3a (rys. 15, studzienka 5); linia nulli-tetrasomiczna NT3B-3A charakteryzuje się brakiem 3 pary chromosomów z diploidalnego genomu B, które zastąpiono homeologiczną parą chromosomów z diploidalnego genomu A, czyli dla 4α i 2β winien powstać zymogram o rozkładzie intensywności zabarwienia: 4 AAT- 3c : 4 AAT-3b : 1 AAT-3a (rys. 15, studzienka 6). Przy obliczaniu teoretycznych rozkładów alloenzymów AAT z pasma cytoplazmatycznego przyjęto, Ŝe podjednostki α i β tworzące alloenzymy tego pasma, są syntetyzowane z tą samą częstotliwością. Jednak na zymogramie dla linii aneuploidalnych: Dt3BS (rys. 15, studzienka 5) i NT3B-3A (rys. 15, studzienka 6) dla których teoretyczne rozkłady wynoszą odpowiednio: 1 AAT-3c (αα) : 2 AAT-3b (αβ) : 1 AAT-3a (ββ) oraz 4 AAT-3c (αα) : 4 AAT-3b (αβ) : 1 AAT-3a (ββ) wyraźnie widać, Ŝe prąŝki w pozycjach AAT-3b i AAT-3c są intensywniej zabarwione. W tab. 1 przedstawiono teoretyczne rozkłady intensywności zabarwienia prąŝków w obrębie pasma AAT-3, jakich naleŝy spodziewać się przy załoŝeniu, Ŝe podjednostki α i β są wytwarzane z tą samą częstotliwością wynoszącą po 50% i róŝną, tzn. kiedy α = 59%, zaś β = 41%. 45

46 Tabela 1. Teoretyczne rozkłady intensywności zabarwienia alloenzymów aminotransferazy asparaginianowej z pasma cytoplazmatycznego (AAT-3) dla róŝnych linii aneuploidalnych pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum) odmiany Chinese Spring. Teoretyczne rozkłady intensywności zabarwienia prąŝków na zymogramie w obrębie pasma AAT-3 wyliczono dla linii ditelosomicznych (Dt), monosomicznych (M) i nulli-tetrasomicznych (NT), które syntetyzują podjednostki α i β z tą samą częstotliwością po 50% i róŝną, kiedy α = 59% i β = 41%. Alloenzymy Linie aneuploidalne pszenicy Dt3AS M3A M3B Dt3AL Dt3BS NT3B-3A (0α + 4β) 2 (1α + 4β) 2 (2α + 3β) 2 (2α + 4β) 2 (2α + 2β) 2 (4α + 2β) 2 α = β = 50% AAT-3c 0,0 4,0 16,0 11,0 25,0 44,5 AAT-3b 0,0 32,0 48,0 44,5 50,0 44,5 AAT-3a 100,0 64,0 36,0 44,5 25,0 11,0 α = 59%; β = 41% AAT-3c 0,0 5,6 18,0 17,5 34,8 55,0 AAT-3b 0,0 31,4 53,9 48,6 48,5 38,3 AAT-3a 100,0 64,0 28,1 33,9 16,7 6,7 Porównując teoretyczne rozkłady intensywności zabarwienia alloenzymów AAT z pasma cytoplazmatycznego uzyskane dla róŝnych linii aneuploidalnych pszenicy (tab. 1) z obrazem na zymogramie dla tych roślin (rys. 15) moŝna zauwaŝyć, Ŝe zdecydowanie lepiej odpowiadają temu obrazowi rozkłady, w których do obliczeń uwzględniono α równe 59% i β 41%. To spostrzeŝenie zostało poparte wynikami pomiarów densytometrycznych (wyniki niepokazane). Jego słuszność moŝna zaobserwować szczególnie wyraźnie w przypadku linii Dt3BS (rys. 15, studzienka 5 i tab. 1) i NT3B-3A (rys. 15, studzienka 6 i tab. 1). Sumując, jeśli przyjmiemy, Ŝe u pszenicy podjednostki β kodowane w diploidalnych genomach B i D są syntetyzowane z tą samą częstotliwością wynoszącą po 20,5% (2 20,5% = 41%), to podjednostka α kodowana w diploidalnym genomie A jest syntetyzowana z częstotliwością równą 59%, czyli blisko 3-krotnie częściej aniŝeli podjednostka β w genomie B lub D! Innymi słowy, udział diploidalnego genomu A w syntezie cytoplazmatycznych form AAT wyraźnie przewyŝsza wspólny udział obydwu diploidalnych genomów B i D. Pomiar intensywności alloenzymów z pasma cytoplazmatycznego ma charakter poziomy, gdyŝ kaŝdy z 3 alloenzymów w obrębie pasma AAT-3 (alloenzymy są utworzone z dwóch rodzajów podjednostek: α i β o stopniu podobieństwa w sekwencji około 90%) mógł być poddany pomiarowi densytometrycznemu na zymogramie. Natomiast pomiar poziomu ekspresji cytoplazmatycznych genów AAT 46

47 za pomoca PCR z analizą przyrostu produktu w czasie rzeczywistym ma charakter pionowy, gdyŝ nie sposób przygotować na tyle specyficzne startery dla genów kodujących podjednostki α i β by mogły one pozwolić za pomocą tej metody rozróŝnić cdna właściwe dla obydwu tych podjednostek. Na rys. 16 przedstawiono wyniki pomiaru poziomu ekspresji genów kodujących cytoplazmatyczne alloenzymy AAT u róŝnych linii aneuploidalnych pszenicy za pomocą PCR z analizą przyrostu ilości produktu w czasie rzeczywistym. 0,0006 Względny poziom ekspresji genów AAT 0,0000 NT3B-3A NT3D-3A Dt3BL NT3B-3D M3B M3D Dt3BS M3A Dt3DS Dt3AS 4α + 2β 4α + 2β 2α + 4β 2α + 4β 2α + 3β 2α + 3β 2α + 2β 1α + 4β 2α + 2β 0α + 4β Rys. 16. Wyniki pomiaru poziomu ekspresji genów kodujących cytoplazmatyczne alloenzymy aminotransferazy asparaginianowej (AAT) u róŝnych linii aneuploidalnych pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum) odmiany Chinese Spring za pomocą PCR z analizą przyrostu ilości produktu w czasie rzeczywistym. Względny poziom ekspresji genów AAT określono dla linii ditelosomicznych (Dt), nulli-tetrasomicznych (NT) i monosomicznych (M). Linie aneuploidalne pszenicy umieszczono na wykresie kolejno od lewej do prawej strony zgodnie z malejącą ilością kopii genów kodujących podjednostkę α. Jako kontroli poziomu RNA uŝyto genu metabolizmu podstawowego kodującego podjednostkę 18S rrna. Zgodnie z wynikami analizy porównawczej zymogramów, podjednostka α kodowana w diploidalnym genomie A jest 3-krotnie częściej syntetyzowana od podjednostki β kodowanej w diploidalnych genomach B i D. Zgodnie z tym załoŝeniem, linie aneuploidalne pszenicy posiadające więcej kopii genów kodujących podjednostki α winny charakteryzować się zwiększonym poziomem ekspresji genów kodujących cytoplazmatyczne alloenzymy AAT. By lepiej to zobrazować, linie aneuploidalne pszenicy umieszczono na wykresie kolejno od lewej do prawej strony 47

48 zgodnie z malejącą ilością kopii genów kodujących podjednostkę α (rys. 16). Na podstawie uzyskanych wyników z wyjątkiem wyników dla linii NT3D-3A, NT3B- 3D i Dt3DS stwierdzić moŝna, Ŝe ekspresja genów AAT na poziomie mrna odpowiada w przybliŝeniu (uwzględniając odchylenie standardowe) ekspresji na poziomie białka Fragmenty sekwencji cdna genów kodujących izoenzymy AAT Korzystając z sekwencji właściwych dla izoenzymów chloroplastowych i cytoplazmatycznych aminotransferazy asparaginianowej (AAT) zdeponowanych w bazie TGI ( dla pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum) odmiany Chinese Spring moŝliwe było zaprojektowanie specyficznych starterów do zamplifikowania obydwu sekwencji z pszenicy odmiany Jasna (rys. 17 i 18). Celem tych zabiegów nie było pozyskanie całych sekwencji nukleotydowych kodujących obydwa izoenzymy, ale przede wszystkim tych fragmentów, które kodują aminokwasy wchodzące w skład centrum aktywnego AAT. W załoŝeniu miało to pomóc w interpretacji oznaczeń kinetycznych alloenzymów AAT z pasma chloroplastowego i cytoplazmatycznego. ATGGCGTCGCCCTCCGTCTTCGCCGGGATCGCGCAGGGCCCGGAGGACCCCATCCTCGGGGTGACGGT CGCGTACAACAAGGATCCCAGCCCCGTCAAGGTCAACCTCGGCGTCGGCGCCTACCGGACCGAG GAAGGGAAGCCCCTCGTGCTGAATGTGGTCAGGCGCGCCGAGCAGATGCTGATCCAAAACGAGT CACGTGTTAAGGAGTACTTGCCGATCACTGGATTGGCCGATTTCAACAAGTTGAGTGCTAAGCTT ATCTTCGGTGCTGACAGTCCTGCTATTCAGGAGAATAGGGTGGCTACAGTGCAGTGCTTATCAGG AACTGGTTCCCTACGAGTGGGAGGTGAATTTCTTGCAAGGCACTATCATGAACGCACTATCTACA TCCCCCAGCCAACCTGGGGGAATCACCCAAAAGTCTTCACTTTAGCTGGCCTGACTGCTAGGAGT TACCGGTACTATGATCCTGCAACTCGTGGACTGGATTTCCAAGGACTCTTAGAAGACCTCAGTTC AGCTCCCTCAGGCGCAATTGTACTGCTTCATGCATGTGCCCACAACCCTACTGGTGTCGACCCAA CCTTGGAACAGTGGGAACAGATCAGGCAGCTGATGAGATCAAAAGCATTGCTGCCATTCTTTGAC AGTGCTTATCAAGGATTTGCAAGCGGAAGCCTTGACAAAGATGCCCAATCAGTGCGCATGTTCGT CGCTGATGGTGGTGAATTGCTCATGGCTCAAAGCTATGCCAAGAACATGGGATTGTATGGAGAGC GTGTTGGTGCTTTAAGCATCGTTTGTGGGAGTGCTGATATAGCTGTTAAGGTTGAAAGTCAACTT AAGCTTGTAATTAGGCCTATGTATTCGAACCCTCCTCTTCATGGTGCTTCTATCGTGGCTACCATA CTTAAGGACAGTGCTATGTTCGACGAATGGACTCTGGAGCTGAAGGCCATGGCTGATAGGATAAT TAGCATGAGGGAGCAGCTTTTTAATGCGCTGAAAATCAGAGAAACACCTGGAGATTGGTCCCACA TCATTAAGCAGATTGGGATGTTTACTTTCACTGGGCTCAACAGTGATCAAGTAGCCTTCATGAGG CAAGAATATCACATTTACATGACATCTGATGGGAGGATCAGCATGGCCGGTTTGAGCTCCAGGAC TGTACCCCATCTTGCAGATGCCATACATGCTGCAGTTACAAAACTGAAG Rys. 17. Sekwencja nukleotydowa genu kodującego izoenzym cytoplazmatyczny aminotransferazy asparaginianowej z pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum) odmiany Jasna. Na bazie sekwencji z bazy TGI (TC ) zaprojektowano startery do PCR za pomocą których zamplifikowano fragment sekwencji 1,140 kpz (pogrubiona czcionka), co stanowi 93,4% całej sekwencji kodującej białko wynoszącej 1,221 kpz. Zastosowane startery do reakcji PCR podkreślono. 48

49 ATGGCACTTGCAGTAGACGCTTCTCGCTTTGAAGGAGTGCCGATGGCCCCTCCAGACCCGATTCTTGGG GTTTCGGAAGCATTTAAAGCTGATACAAGTGATCTGAAGCTCAACCTTGGTGTTGGTGCCTATAGAA CGGAAGAGCTACAGCCCGCTGTCCTCAATGTTGTCAAGAAGGCTGAAAAACTTATGTTGGAGAAA GGAGAAAACAAGGAGTATCTGCCTATTGAAGGCTTCGCTGCATTTAACAAAGCAACTGCAGATCT ATTGCTTGGAGCTGACAATCCTGTCATCAAGCAAGGACGGGTTGCTACTCTTCAGTCTCTCTCAG GGACTGGATCATTACGCCTTGCTGCAGCTTTTATTCAGAGATACTTCCCTGATTCAAAAGTACTTA TATCATCTCCCACATGGGGAAACCACAAAAACATATTCAATGATGCCAGGGTACCATGGTCAGAA TACCGGTATTATGATCCCAAGACTGTTGGGCTGGATTTTGAGGGAATGATAGCTGACATACAGGC TGCCCCAGAGGGGTCTTTTGTTCTGCTACATGGTTGTGCTCACAATCCAACTGGAATAGACCCAA CTCCTGAACAGTGGGAGAAACTGGCAGATGTGATTGAAGAGAAAAAACATATGCCTTTCTTTGAT GTTGCCTATCAGGGTTTTGCCAGTGGAAGCCTTGATGAAGATGCATCTTCTGTCAGGCTTTTTGT TAAGCGTGGCCTGGAAGTGTTTGTTGCACAGTCTTACAGCAAGAACCTTGGTCTATATGCAGAAA GGATCGGTGCGATAAGTGTCATTTGCTCAGCACCGGAAGTTGCAGATAGGGTGAAGAGCCAGTT GAAGCGATTGGCACGGCCCATGTACTCAAACCCACCTATTCACGGTGCCAAGATCGTCGCCAACG TTGTTGGAGACCCTACCATGTTCGGTGAGTGGAAAGAAGAGATGGAACAAATGGCCGGTCGGAT CAAGAACGTTCGGCAGAAGCTTTACGATAGCTTGACTGCAAAGGATCAGTCTGGCAAGGACTGGT CTTTCATTCTGAGCCAGATAGGCATGTTCTCCTTCACGGGCTTGAACAGACCCCAGAGCGATAAC ATGACCGATAAATGGCACATATACATGACCAAGGACGGGAGGATTTCGTTGGCAGGGTTGAACCT GGCGAAGTGCGAGTACCTTGCCGATGCCATCATCGA Rys. 18. Sekwencja nukleotydowa genu kodującego izoenzym chloroplastowy aminotransferazy asparaginianowej z pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum) odmiany Jasna. Na bazie sekwencji z bazy TGI (TC ) zaprojektowano startery do PCR za pomocą których zamplifikowano fragment sekwencji 1,107 kpz (pogrubiona czcionka), co stanowi 91,4% całej sekwencji kodującej białko wynoszącej 1,211 kpz. Zastosowane startery do reakcji PCR podkreślono. Uzyskana sekwencja nukleotydowa genu kodującego izoenzym cytoplazmatyczny AAT u pszenicy odmiany Jasna o długości 1,140 kpz stanowiła 93,4% sekwencji genu TC dostępnej w bazie TGI dla pszenicy odmiany Chinese Spring, podczas gdy sklonowany fragment genu kodującego izoenzym chloroplastowy o długości 1,107 kpz stanowił 91,4% analogicznej sekwencji (TC ) z tej samej bazy. KaŜda z tych sekwencji uzyskanych dla pszenicy odmiany Jasna wykazywała wysoki stopień podobieństwa wynoszący około 98% do sekwencji zrekonstruowanych na podstawie EST-ów i zdeponowanych w bazie TGI Preparatyka chloroplastowych i cytoplazmatycznych alloenzymów AAT Charakterystyka izoenzymów aminotransferazy asparaginianowej (AAT) z pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum) odmiany Jasna wymagała uzyskania wysoko oczyszczonych preparatów tego enzymu, co wiązało się z opracowaniem optymalnej metody ich rozdzielenia i oczyszczenia. Jako materiału wyjściowego uŝyto zielonych części 14 dniowych siewek. Pierwsze etapy oczyszczania, tj. wysalanie siarczanem amonu w zakresie od 40 do 80% nasycenia roztworu solą i chromatografia na kolumnie z Ŝelu Sephadex G-150 miały na celu głównie pozbycie się białek balastowych oraz barwnych zanieczyszczeń. Szczególnie wysoką wydajnością charakteryzowała się chromatografia na kolumnie z Ŝelu Sephadex G-150. Pozwoliła ona na oddzielenie duŝej ilości białek zanieczyszczających, w tym tych związanych z barwnikami. Nastąpił blisko 4-krotny przyrost aktywności właściwej (tab. 2). Następnie podczyszczone 49

50 preparaty AAT nanoszono na kolumnę z DEAE-celulozy, na której związane ze złoŝem alloenzymy wymywano we wzrastającym liniowym gradiencie soli (rys. 19). Aktywność połączonych po kolumnie frakcji zawierających alloenzymy chloroplastowe (AAT-2) stanowiła około 97% całkowitej aktywności AAT, zaś frakcje z alloenzymami cytoplazmatycznymi (AAT-3) pozostałe 3% (tab. 2). Aktywności alloenzymów z pasma mitochondrialnego nie moŝna było w ogóle stwierdzić we frakcjach po rozdziale na kolumnie z DEAE-celulozy Rys. 19. Zymogramy preparatów aminotransferazy asparaginianowej (AAT) z siewek pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum) odmiany Jasna po rozdziale na kolumnie z DEAE-celulozą. Do studzienek naniesiono po 50 mu AAT: 1, homogenat oraz 2 10, kolejne frakcje po rozdziale na DEAE-celulozie, które wypływały z kolumny we wzrastającym liniowym gradiencie soli. Połączone i zagęszczone frakcje po kolumnie z DEAE-celulozy zawierające alloenzymy z pasma AAT-2 dodatkowo poddawano oczyszczaniu na kolumnie L-ornityna-Sepharose 4B (wyniki niepokazane). Po tym etapie, alloenzymy z obydwu preparatów pasm AAT-2 i AAT-3 osobno rozdzielano na kolumnie anionowymiennej Protein-Pak Q 8HR podłączonej do zestawu HPLC (rys. 20). Aktywność enzymatyczna µmol/min KCl (mm) Aktywność enzymatyczna µmol/min KCl (mm) Numer frakcji Numer frakcji Rys. 20. Rozdział alloenzymów z pasma chloroplastowego (AAT-2) i cytoplazmatycznego (AAT-3) aminotransferazy asparaginianowej z siewek pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum) odmiany Jasna na anionowymiennej kolumnie Protein-Pak Q 8HR. (A) Chromatogram alloenzymów z pasma cytoplazmatycznego (AAT-3); (B) chromatogram alloenzymów z pasma chloroplastowego (AAT-2). Alloenzymy: AAT-2a, -2b, -2c i AAT-3a, -3b, -3c oznaczono zgodnie z malejącą ruchliwością elektroforetyczną w kierunku anody. 50

51 W wyniku zastosowania opracowanej procedury oczyszczania uzyskano po trzy preparaty cytoplazmatycznych i chloroplastowych alloenzymów AAT (rys. 21). Rys. 21. Zymogramy aminotransferazy asparaginianowej (AAT) z siewek pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum) odmiany Jasna w wyjściowym homogenacie i preparatach chloroplastowych (AAT-2) i cytoplazmatycznych (AAT-3) alloenzymów uzyskanych po końcowym etapie oczyszczania na kolumnie Protein-Pak Q 8HR. Do studzienek nanoszono po 50 mu AAT: 1, homogenat; 2, AAT-2a; 3, AAT-2b; 4, AAT-2c; 5, AAT-3a; 6, AAT-3b; 7, AAT-3c. W tabeli 2 przedstawiono całościowe wyniki oczyszczania chloroplastowych i cytoplazmatycznych alloenzymów AAT z siewek pszenicy. Do obliczenia wydajności oraz stopnia oczyszczenia końcowych preparatów AAT wzięto pod uwagę wyniki densytometrycznej analizy zymogramów AAT homogenatu (rys. 21). Za 87% całkowitej aktywności AAT w homogenacie odpowiadały alloenzymy z pasma AAT-2, zaś za pozostałe 13% alloenzymy cytoplazmatyczne (rys. 21). Ponadto, w obliczeniach uwzględniono fakt, Ŝe szybkość biosyntezy podjednostki α jest większa niŝ β i wynosi odpowiednio 59% i 41%, a względny stosunek między alloenzymami AAT-3a (ββ), AAT-3b (αβ) i AAT-3c (αα) wynosi 30,3% : 49,5% : 20,2%. Te same wartości w odwrotnej kolejności przyjęto dla alloenzymów z pasma AAT-2, tj. AAT-2a: 20,2%; AAT-2b: 49,5% i AAT-2c: 30,3%, bowiem na zymogramie AAT prąŝki w pozycjach AAT-2b i AAT-2c w obrębie pasma chloroplastowego były najintensywniej zabarwione (rys. 21). 51

52 Tabela 2. Podsumowanie wyników oczyszczania chloroplastowych (AAT-2a, AAT-2b, AAT-2c) i cytoplazmatycznych (AAT-3a, AAT-3b, AAT-3c) alloenzymów aminotransferazy asparaginianowej z siewek pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum) odmiany Jasna. Etap oczyszczania Wydajność Aktywność całkowita Całkowita zawartość białka Aktywność właściwa Stopień oczyszczenia (U) (mg) (U/mg) (%) ( ) Homogenat 1529, ,68 100,0 1,0 0 Siarczan amonu 701,50 710,00 0,99 45,9 1,5 0 Sephadex G ,00 64,35 4,97 20,9 7,3 0 DEAE-celuloza AAT-2 150,26 10,93 13,75 11,3 1 23,3 2 AAT-3 5,10 2,40 2,13 2,6 1 23,7 2 L-ornityna-Sepharose 4B AAT-2 110,45 5,40 20,45 8,3 1 34,7 2 Protein-Pak Q 8HR AAT-2a 2,26 0,13 17,39 0, ,9 2 AAT-2b 7,88 0,20 39,40 1, ,9 2 AAT-2c 2,87 0,10 28,70 0, ,4 2 AAT-3a 0,48 0,15 3,20 0, ,7 2 AAT-3b 0,72 0,15 4,80 0, ,0 2 AAT-3c 0,38 0,13 2,92 0, ,0 2 1 Przyjęto, Ŝe w homogenacie aktywność całkowita całego pasma i poszczególnych alloenzymów aminotransferazy asparaginianowej w jego obrębie wynosi: 1331,01 U (pasmo AAT-2), 198,89 U (AAT- 3); U (alloenzym AAT-2a), 658,85 U (AAT-2b), 403,30 U (AAT-2c), 60,26 U (AAT-3a ), 98,45 U (AAT-3b) i U (AAT-3c). 2 Przyjęto, Ŝe w homogenacie aktywność właściwa całego pasma i poszczególnych alloenzymów aminotransferazy asparaginianowej w jego obrębie wynosi: 0,59 U/mg (pasmo AAT-2), 0,09 U/mg (AAT-3); 0,12 U/mg (alloenzym AAT-2a), 0,29 U/mg (AAT-2b), 0,18 U/mg (AAT-2c), 0,03 U/mg (AAT-3a), 0,04 U/mg (AAT-3b) i 0,02 U/mg (AAT-3c) Wyznaczanie masy cząsteczkowej AAT w warunkach natywnych Objętość zerową kolumny z Ŝelu Sephadex G-150 (2,6 cm 85 cm) wyznaczono przy pomocy błękitu dekstranowego (2 MDa), który wypływał z kolumny w 102,5 ml buforu kolumny. Objętości elucyjne białek wzorcowych wyniosły: dehydrogenaza alkoholowa (150 kda) 104,5 ml, dimer albuminy (134 kda) 118,8 ml, monomer albuminy (67 kda) 182,5 ml, owoalbumina (43 kda) 228,0 ml i chymotrypsynogen (25 kda) 286,5 ml. Na podstawie zmierzonej objętości zerowej kolumny oraz uzyskanych objętości elucyjnych białek wzorcowych i wartości log 10 ich masy cząsteczkowej sporządzono krzywą kalibracyjną (rys. 22). 52

53 Log masy cząsteczkowej V e/v 0 Rys. 22. Krzywa kalibracyjna do wyznaczenia masy cząsteczkowej aminotransferazy asparaginianowej (AAT) z pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum) odmiany Jasna w warunkach natywnych. Do kalibrowania kolumny z Ŝelu Sephadex G-150 (2,6 85 cm) uŝyto następujących białek wzorcowych ( ): dehydrogenaza alkoholowa (150 kda), dimer albuminy (134 kda), monomer albuminy (67 kda), owoalbumina (43 kda) i chymotrypsynogen A (25 kda). Na kolumnę nanoszono w 3 oddzielnych doświadczeniach preparat AAT ( ) po etapie wysalania siarczanem amonowym. Objętość zerową kolumny wyznaczono przy uŝyciu błękitu dekstranowego (2 MDa). V e /V 0 oznacza stosunek objętości elucyjnej do objętości zerowej kolumny. Na kolumnę nanoszono preparat aminotransferazy asparaginianowej po etapie wysalania siarczanem amonu o aktywności 10 U i zawartości białka 20 mg. Enzym wypływał z kolumny w objętości 177 ml tuŝ przed monomerem albuminy (182,5 ml). Masa cząsteczkowa AAT w warunkach natywnych wyznaczona w 3 oddzielnych doświadczeniach za pomocą metody sączenia molekularnego na kolumnie z Ŝelu Sephadex G-150 wyniosła 72,4 ± 3,6 kda (rys. 22) Identyfikacja alloenzymów AAT metodą spektrometrii mas i wyznaczanie ich mas cząsteczkowych w warunkach denaturujących Oczyszczone preparaty alloenzymów aminotransferazy asparaginianowej (AAT) poddano elektroforezie w Ŝelu poliakryloamidowym z SDS (SDS-PAGE) (rys. 23). 53

54 Rys. 23. Elektroforeza w Ŝelu poliakryloamidowym z SDS oczyszczonych preparatów alloenzymów aminotransferazy asparaginianowej z pasma chloroplastowego (AAT-2) i cytoplazmatycznego (AAT-3) z pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum) odmiany Jasna uzyskanych po chromatografii na kolumnie Protein Pak Q 8HR. Po lewej stronie przedstawiono wyniki rozdziału preparatów alloenzymów z pasma AAT-2, po prawej preparatów alloenzymów z pasma AAT-3. Do kaŝdej studzienki naniesiono po 2 µg białka oczyszczonych preparatów; M, markery mas cząsteczkowych. Wyniki densytometrycznych analiz obrazów elektroforetycznych preparatów alloenzymów wskazywały, Ŝe zawierały one następujące procentowe zawartości czystego białka odpowiedniego alloenzymu: AAT- 2a 15,9%, AAT-2b 31,4%, AAT-2c 26,5%, AAT-3a 53,6%, AAT-3b 55,7% i AAT-3c 50,6%. Wskazane na rys. 23 prąŝki otrzymane dla: AAT-2a, AAT-2c, AAT-3a i AAT-3c na Ŝelu po SDS-PAGE odpowiadające homodimerom form: chloroplastowej i cytoplazmatycznej wycięto z Ŝelu i poddano analizie w spektometrze mas (rys. 24 i 25). Dla prąŝków AAT-2a i AAT-2c uzyskano w sumie 29 oligopeptydów o łącznej długości 166 reszt aminokwasowych, co stanowi 41% pokrycia całej sekwencji (rys. 24), podczas gdy dla prąŝków AAT-3a i AAT-3c uzyskano 9 oligopeptydów o łącznej długości 130 reszt aminokwasowych, co stanowi 32% pokrycia całej sekwencji (bez presekwencji) (rys. 25). Zidentyfikowane w spektometrze mas fragmenty sekwencji aminokwasowych chloroplastowych i cytoplazmatycznych alloenzymów AAT z pszenicy odmiany Jasna były odpowiednio w 97% i 100% zgodne z sekwencjami odpowiadającymi tym alloenzymom ustalonymi przy pomocy EST-ów z bazy TGI ( dla pszenicy odmiany Chinese Spring. Stopień ich przyporządkowania ang. score kształtował się w granicach od 417 do

55 Podjednostka chloroplastowa M A L A V D A S R F E G V P M A P P D P I L G V S E A F K A D T S D L K L N L G V G A Y R T E E L Q P A V L N V V K K A E K L M L E K G E N K E Y L P I E G F A A F N K A T A D L L L G A D N P V I K Q G R V A T L Q S L S G T G S L R L A A A F I Q R Y F P D A K V L I S S P T W G N H K N I F N D A R V P W S E Y R Y Y D P K T V G L D F E G M I A D I Q A A P E G S F V L L H G C A H N P T G I D P T P E Q W E K L A D V I E E K K H M P F F D V A Y Q G F A S G S L D E D A S S V R L F V K R G L E V F V A Q S Y S K N L G L Y A E R I G A I N V I C S A P E V A D R V K S Q L K R L A R P M Y S N P P I H G A K I V A N V V G D P T M F G E W K E E M E Q M A G R I K N V R Q K L Y D S L T A K D Q S G K D W S F I L S Q I G M F S F T G L N R P Q S D N M T D K W H I Y M T K D G R I S L A G L N L A K C E Y L A D 410 A I I D S F H N V N Rys. 24. Wyniki identyfikacji metodą spektrometrii mas prąŝków białkowych odpowiadających homodimerom alloenzymów chloroplastowych aminotransferazy asparaginianowej (AAT-2) z pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum) odmiany Jasna. Zidentyfikowane po analizie w spektometrze mas fragmenty prąŝków białkowych dla AAT-2a i AAT-2c oznaczono ramkami. Sekwencję aminokwasową podjednostki chloroplastowej AAT ustalono przy uŝyciu ESTów z bazy TGI ( dla pszenicy zwyczajnej odmiany Chinese Spring (TC ). Reszty aminokwasowe zidentyfikowane po analizie w spektometrze mas niezgodne z sekwencją aminokwasową oznaczono pogrubioną czcionką.

56 Podjednostka cytoplazmatyczna M A S P S V F A G I A Q G P E D P I L G V T V A Y N K D P S P V K V N L G V G A Y R T E E G K P L V L N V V R R A E Q M L I Q N E S R V K E Y L P I T G L A D F N K L S A K L I F G A D S P A I Q E N R V A T V Q C L S G T G S L R V G G E F L A R H Y H E R T I Y I P Q P T W G N H P K V F T L A G L T A R S Y R Y Y D P A T R G L D F Q G L L E D L S S A P S G A I V L L H A C A H N P T G V D P T L E Q W E Q I R Q L M R S K A L L P F F D S A Y Q G F A S G S L D K D A Q S V R M F V A D G G E L L M A Q S Y A K N M G L Y G E R V G A L S I V C G S A D I A V K V E S Q L K L V I R P M Y S N P P L H G A S I V A T I L K D S A M F D E W T L E L K A M A D R I I S M R E Q L F N A L K I R E T P G D W S H I I K Q I G M F T F T G L N S D Q V A F M R Q E Y H I Y M T S D G R I S M A G L S S R T V P H L A D A I H 407 A A V T K L K Rys. 25. Wyniki identyfikacji metodą spektrometrii mas prąŝków białkowych odpowiadających homodimerom alloenzymów cytoplazmatycznych aminotransferazy asparaginianowej (AAT-3) z pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum) odmiany Jasna. Zidentyfikowane po analizie w spektometrze mas fragmenty prąŝków białkowych dla AAT-3a i AAT-3c oznaczono ramkami. Sekwencję aminokwasową podjednostki cytoplazmatycznej AAT ustalono przy uŝyciu EST-ów z bazy TGI ( dla pszenicy zwyczajnej odmiany Chinese Spring (TC ). 56

57 Po zidentyfikowaniu prąŝków białkowych na Ŝelu z SDS odpowiadających alloenzymom AAT wyznaczono ich masy cząsteczkowe w warunkach denaturujących. Alloenzymy z pasma AAT-2, jak równieŝ z pasma AAT-3 migrowały w Ŝelu z podobną szybkością (rys. 23). Na podstawie wzorców mas cząsteczkowych wyliczono, Ŝe masa cząsteczkowa alloenzymów AAT z pasma chloroplastowego w warunkach denaturujących (masa podjednostki) wynosi 45,3 kda, zaś tych z pasma cytoplazmatycznego 43,7 kda. Stopień czystości końcowych preparatów poszczególnych alloenzymów wyliczono na podstawie wyników pomiarów densytometrycznych. Dla alloenzymów z pasma chloroplastowego wyniósł on: AAT-2a 15,9%, AAT-2b 31,4%, AAT-2c 26,5%, zaś dla alloenzymów z pasma cytoplazmatycznego: AAT-3a 53,6%, AAT-3b 55,7% i AAT-3c 50,6% (rys. 23) Wyznaczanie parametrów kinetycznych alloenzymów AAT Dla kaŝdego z 6-ciu rozdzielonych i częściowo oczyszczonych alloenzymów aminotransferazy asparaginianowej z pasma chloroplastowego (AAT-2) i cytoplazmatycznego (AAT-3) wyznaczono wartości pozornej stałej Michaelisa (dalej nazywanej stałą K m ) wobec asparaginianu, 2-oksoglutaranu, glutaminianu i szczawiooctanu, szybkość maksymalną (V max ), stosunek szybkości maksymalnej w kierunku tworzenia glutaminianu do tej szybkości w reakcji odwrotnej (V max(asp+2- OXO)/V max(glu+oaa) ), liczbę obrotów (k cat ) oraz wyliczono wartość stosunku k cat /K m (tab. 3). Tabela 3. Parametry kinetyczne 6-ciu alloenzymów aminotransferazy asparaginianowej z pasma chloroplastowego (AAT-2) i cytoplazmatycznego (AAT-3) z pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum) odmiany Jasna. Stałą K m wobec asparaginianu (Asp), 2-oksoglutaranu (2-OXO), glutaminianu (Glu) i szczawiooctanu (OAA) oraz stosunek V max(asp+2-oxo) /V max(glu+oaa) wyznaczono z wykresu Lineweavera-Burka. Wartości V max obliczono z równania Michaelisa-Menten. Stałą k cat i współczynnik k cat /K m obliczono dla reakcji przebiegającej w kierunku tworzenia glutaminianu z uwzględnieniem masy cząsteczkowej 45,3 kda dla alloenzymów z pasma AAT-2 i 43,7 kda dla alloenzymów z pasma AAT-3 oraz czystości stosowanych preparatów wyliczonych na podstawie wyników pomiarów densytometrycznych po SDS-PAGE, które wyniosły: AAT-2a 15,9%; AAT-2b 31,4%; AAT-2c 26,5%; AAT-3a 53,6%; AAT-3b 55,7%; AAT-3c 50,6% (rys. 23). Alloenzymy K m V max(asp+2-oxo) /V max(glu+oaa) V max(asp+2-oxo) k cat k cat /K m (mm) ( ) (U/mg) (s -1 ) (s -1 M -1 ) Asp 2-OXO Glu OAA AAT-2a 8,3 0,17 12,0 0,052 0,8 18,85 89, AAT-2b 9,9 0,13 8,2 0,039 1,3 43,30 103, AAT-2c 8,5 0,13 16,0 0,057 0,9 31,10 88, AAT-3a 9,3 0,13 8,3 0,037 1,0 3,50 4,9 527 AAT-3b 10,0 0,25 17,0 0,057 1,3 5,28 7,0 700 AAT-3c 7,1 0,18 14,0 0,043 1,3 3,13 4,6 648

58 Wartości stałej K m wyznaczono dla reakcji w kierunku powstawania glutaminianu (asparaginian, 2-oksoglutaran) jak i w odwrotnym powstawania asparaginianu (glutaminian, szczawiooctan) stosując wykres Lineweavera-Burka. Uzyskane wartości stałej K m wobec 4 substratów dla kaŝdego z 6-ciu alloenzymów AAT były podobne do siebie, stała K m dla asparaginianu oscylowała wokół wartości 9 mm, dla 2-oksoglutaranu 0,15 mm, dla glutaminianu 13 mm, zaś dla szczawioctanu 0,050 mm (tab. 3). RównieŜ uzyskane z wykresu Lineweavera-Burka wartości stosunku V max(asp+2- OXO)/V max(glu+oaa) dla kaŝdego z 6-ciu alloenzymów były podobne do siebie i wynosiły przeciętnie 1,1, co oznacza Ŝe reakcja w kierunku powstawania glutaminianu w warunkach nasycenia enzymu substratem przebiega z nieco większą szybkością (tab. 3). Wartości V max policzono teŝ posługując się równaniem Michaelisa-Menten. Wyniosły one dla alloenzymów z pasma chloroplastowego: od 18,85 do 43,30 U/mg i znacznie przewyŝszały te uzyskane dla alloenzymów z pasma cytoplazmatycznego: od 3,13 do 5,28 U/mg (tab. 3). Do wyliczenia stałej k cat uwzględniono masę cząsteczkową uzyskaną za pomocą SDS-PAGE (rys. 23), która dla alloenzymów chloroplastowych wyniosła 45,3 kda, zaś dla alloenzymów cytoplazmatycnych 43,7 kda oraz wzięto pod uwagę wyniki pomiarów densytometrycznych preparatów AAT wybarwionych AgNO 3 po rozdziale elektroforetycznym w Ŝelu poliakryloamidowym z SDS, które wskazywały na procentową zawartość czystego białka enzymatycznego w kaŝdym ze stosowanych preparatów alloenzymów (rys. 23). Stała k cat, jak i współczynnik k cat /K m (dla reakcji przebiegającej w kierunku tworzenia glutaminianu) dla alloenzymów z tego samego pasma niewiele róŝniły się między sobą, natomiast przy porównaniu tych wartości dla alloenzymów z dwóch pasm, te dla alloenzymów z pasma AAT-2 okazywały się przeciętnie około 17 razy wyŝsze (tab. 3). 58

59 6. Dyskusja 6.1. Liczba loci z genami kodującymi izoenzymy AAT Na zymogramach aminotransferazy asparaginianowej (AAT) z pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum) obserwuje się na ogół tylko 3 pasma enzymatyczne (Jaaska, 1976; Karcicio i Izbirak, 2003; Maciąga i Paszkowski, 2004) podobnie jak dla blisko spokrewnionego z pszenicą prosa (Taniguchi i współ., 1995). Pasmo AAT-1 o największej ruchliwości elektroforetycznej w kierunku anody utworzone jest z alloenzymów mitochondrialnych, pasmo AAT-2 chloroplastowych, zaś AAT-3 z alloenzymów cytoplazmatycznych (Maciąga i Paszkowski, 2004). KaŜde z tych pasm kodowane jest w 3 róŝnych loci przez 6 genów allelicznych pochodzących z homeologicznych diploidalnych genomów A, B i D heksaploidalnej pszenicy (Hart, 1983). Poza tymi 3 loci, Hart (1983) na podstawie analizy zymogramów AAT wysunął przypuszczenie o istnieniu jeszcze dwóch kolejnych loci (w sumie 5-ciu) dla genów AAT. W pewnym sensie sytuacja przypomina tę stwierdzoną u Arabidopsis. Na zymogramie AAT z homogenatu liści Arabidopsis widoczne są tylko 3 izoenzymy (Schultz i Coruzzi, 1995), a w roślinie zidentyfikowano 5 róŝnych genów AAT (Wilkie i współ., 1996; Liepman i Olsen, 2004). Jeśli w genomie pszenicy rzeczywiście istnieją loci 4 i 5, to najprawdopodobniej geny tam znajdujące się charakteryzują się niskim poziomem ekspresji i za pomocą zymogramów nie ma praktycznej moŝliwości jednoznacznego stwierdzenia ich obecności. Dlatego w pracy podjęto próbę uzyskania odpowiedzi na pytanie o faktyczną ilość loci z genami AAT za pomocą metody Southerna. Dla kaŝdej z przygotowanych sond odpowiadającej izoenzymowi cytoplazmatycznemu, chloroplastowemu i mitochondrialnemu AAT na membranie pojawił się pojedynczy prąŝek, kaŝdy na innej wysokości. Świadczy to o tym, Ŝe dla kaŝdego rodzaju genów AAT mamy do czynienia tylko z jednym lokus. Zatem u pszenicy geny AAT występują tylko w 3 loci, co jest o tyle ciekawe, Ŝe w o wiele mniejszych genomach od genomu pszenicy, np. u ryŝu wszystkich loci jest 4, gdyŝ geny mitochondrialne AAT wystepują w 2 loci (Song i współ., 1996), zaś u rzodkiewnika takich loci jest 5 z czego w 3 z nich występują geny cytoplazmatyczne AAT (Schultz i Coruzzi, 1995; Wilkie i współ., 1996; Liepman i Olsen, 2004). 59

60 *** 6.2. Lokalizacja chromosomalna genów kodujących izoenzymy AAT W kaŝdym z 3 loci z genami cytoplazmatycznymi, chloroplastowymi i mitochondrialnymi aminotransferazy asparaginianowej (AAT) występuje po 6 genów allelicznych pochodzących z homeologicznych, diploidalnych genomów A, B i D heksaploidalnej pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum; 2n = 6x = 42, AABBDD). Najlepiej poznano geny kodujące alloenzymy cytoplazmatyczne, które są kodowane przez dwa rodzaje podjednostek α w genomie A i β w genomach B i D (Hart, 1983). Za pomocą analizy porównawczej zymogramów AAT linii aneuploidalnych pszenicy Hart (1983) ustalił, Ŝe podjednostki α i β znajdują się na długich ramionach 3-ciej pary chromosomów homeologicznych 3AL, 3BL i 3DL (rys. 26a, geny cytoplazmatyczne zaznaczono na rysunku kolorem czerwonym). Z kolei Qi i współ. (2004) zmapowali fragment EST-u (rys. 25b) o numerze BF473016, który charakteryzuje się wysokim stopniem identyczności z sekwencją genów cytoplazmatycznych AAT u innych roślin na 3AL (0,42 0,78), 3BS (0,57 1,00) i 3DS (0,24 1,00) ( Uzyskane w niniejszej pracy wyniki (rys. 25c) pozwalają sądzić, Ŝe geny cytoplazmatyczne na chromosomach z genomu A umiejscowione są na długich ramionach w rejonie od 0,42 do 0,61, z genomu B od 0,38 do 0,41 a z genomu D od 0,23 do 0,81. Potwierdza to w całości lokalizację genów cytoplazmatycznych AAT na długich ramionach 3 pary chromosomów homeologicznych podaną przez Harta (1983) (rys. 25a). a b c Rys. 25. Porównanie wyników lokalizacji chromosomalnej genów kodujących aminotransferazę asparaginianową (AAT) u pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum) uzyskanych przez róŝnych autorów za pomocą róŝnych metod. a) Analiza porównawcza zymogramów linii aneuploidalnych (Hart, 1983); b) mapowanie EST-ów metodą Southerna z wykorzystaniem linii delecyjnych (Qi i współ., 2004); c) analiza porównawcza zymogramów linii delecyjnych pszenicy. Kolorem czerwonym zaznaczono lokalizację genów kodujących izoenzymy cytoplazmatyczne, kolorem niebieskim izoenzymy chloroplastowe, zaś kolorem zielonym izoenzymy mitochondrialne AAT. 60