R E C E N Z J A pracy doktorskiej mgr. Wojciecha Zalewskiego pt. Wyciszanie ekspresji genów HvCKX1 i HvCKX2 jęczmienia i analiza ich funkcji

Transkrypt

1 Poznań, 7 maja 2013 r. R E C E N Z J A pracy doktorskiej mgr. Wojciecha Zalewskiego pt. Wyciszanie ekspresji genów HvCKX1 i HvCKX2 jęczmienia i analiza ich funkcji Rozwiązywana w pracy problematyka dotyczy poznawania funkcji dwóch genów kodujących dehydrogenazy cytokininowe u jęczmienia (Hordeum vulgare L). Jak sama nazwa wskazuje, enzym dehydrogenaza cytokininowa, CKX, uczestniczy w metabolizmie fitohormonu cytokininy. Ze względu na fakt, że cytokininy regulują wiele procesów związanych ze wzrostem, rozwojem i reakcją na bodźce środowiskowe, dalsze poznawanie roli CKX w funkcjonowaniu biologicznym cytokinin jest zadaniem ważnym. Idąc dalej, w ślad za tym zadaniem badawczym, także kontrolowana zmiana ekspresji genów kodujących CKX powinna okazać się interesującą z punktu widzenia genetyki molekularnej, ale także hodowli i biotechnologii. Zatem z dużym prawdopodobieństwem można było założyć, że manipulacja genami CKX (tu: ich ekspresją) może pozwolić na pełniejsze poznanie ich funkcji, a także określić interesujące zmiany w cechach ilościowych i jakościowych kształtujących się podczas rozwoju tego ważnego gatunku uprawnego roślin. Dlatego uważam problematykę podjętą w tej pracy doktorskiej za ważną, bowiem dotychczas słabo poznano efekty fizjologiczne i genetyczne wynikające z aktywności CKX u zbóż. Kontekst kontrolowanego udziału cytokinin w rozwoju jęczmienia czynią pracę tym bardziej interesującą, czy nawet intrygującą, ze względu na szczególny aspekt aplikacyjny możliwy w przypadku efektów wynikających ze zmiany poziomu tego fitohormonu. Podejściem zastosowanym do zmiany ekspresji badanych genów była najnowsza strategia kierowania ekspresją genów, znana jako interferencja RNA, prowadząca do wyciszenia ekspresji wybranych genów na poziomie posttranskrypcyjnym (PTGS). Tak zaplanowany projekt ocenianej pracy doktorskiej został zrealizowany w Zakładzie Genomiki Funkcjonalnej Instytutu Hodowli i Aklimatyzacji Roślin PIB w Radzikowie pod kierunkiem prof. dr hab. Anny Nadolskiej-Orczyk. Zespół ten był znakomicie przygotowany do przeprowadzenia tego typu badań. W ostatnich latach zarówno model jęczmienia browarnego, podstawy jego produktywności, jak i wprowadzone metody kultur in vitro, także podejścia genetyczne i molekularne, w tym strategia wyciszania ekspresji genów z wykorzystaniem zjawiska RNAi, 1

2 były polem dobrze widocznej aktywności naukowej tego Zespołu. Do badań wytypowano dwie odmiany: podatną na agrotransformację Golden Promise (Trifonowa i wsp. 2001) i mniej podatną Scarlett (testowaną wcześniej w ramach badań własnych Zespołu). Ocena merytoryczna Przystępując do oceny najważniejszych wyników, trzeba rozpocząć od stwierdzenia, że dwa wybrane geny, HvCK1 i HvCKX2, z dużej rodziny 9 genów kodujących dehydrogenazy cytokininowe u jęczmienia, dostarczyły bardzo ciekawych informacji w odniesieniu do plastyczności genetycznej roślin podczas wzrostu i rozwoju. Jak ustalono, ulegają one częściowo zróżnicowanej indukcji lub/i hamowaniu transkrypcyjnemu, demonstrując dość specyficzną ekspresję w różnych organach roślin kontrolnych (dzikich) począwszy od najwcześniejszych stadiów rozwojowych. Pokazano podobieństwo w ekspresji w ziarniakach podczas rozwoju i różnice w przypadku indukcji ekspresji w liściach (HvCKX2) i korzeni (HvCKX1). Transgeniczne rośliny z wyciszoną ekspresją badanych genów (szczególnie HvCKX1) charakteryzowały się wyraźnie niższym poziomem aktywności dehydrogenazy cytokininowej w badanych organach i stadiach rozwojowych. Obniżenie poziomu enzymu CKX u obu badanych odmian jęczmienia było skorelowane z podwyższoną produktywnością na poziomie liczby nasion, masy ziaren, oraz masy 1000 ziaren (MTZ). Efekty te obserwowano do pokolenia T 3, co wskazuje na stabilność procesu wyciszenia badanych CKX i efektywność wprowadzonej metody RNAi. Można sądzić, że homologi HvCKX1 i HvCKX2 wybrane do badań czy to przez wcześniejszych autorów, czy to przez Autora tej pracy, odgrywają kluczową rolę w rozwoju organów generatywnych w powiązaniu z wynikami wcześniejszych badań wskazujących na silną zależność między obniżonym/podwyższonym poziomem aktywności CKX a (odpowiednio) podwyższonym/obniżonym poziomem cytokinin (silna negatywna korelacja). Należy jednak żałować, że Autor nie określił poziomu hormonu w badanych organach - przynajmniej w niektórych przypadkach; stanowiło by to kontrolę i jednocześnie pozwoliłoby na poparcie założeń i tez stawianych w pracy. Tu muszę przyznać, że z powodu nie podjęcia odpowiedniego badania dotyczącego oznaczenia poziomu cytokinin, stwierdzone w pracy zmiany w cechach odnosi Autor do zmienionego poziomu CKX, a nie bezpośrednio do potencjalnie zmieniającego się poziomu cytokinin. Jest to zgodne ze stanem faktycznym badań. Idąc dalej w ocenie analizy funkcji dwóch homologów genowych HvCKX, ta swoista dominacja ekspresji badanych homologów w obrębie puli 9 homologów genowych, stanowiących rodzinę genów HvCKX u jęczmienia, została określona poprzez stwierdzenie 2

3 silnej korelacji pomiędzy poziomem transkryptu HvCKX1 czy HvCKX2 a łączną aktywnością enzymatyczną kodowanych izoenzymów. Choć, trzeba zauważyć, że bez identyfikacji i określenia poziomu transkrypcyjnego pozostałych homologów rodziny CKX, nie można wykluczyć ich niekontrolowanego wyciszenia, a więc współudziału w obserwowanym podniesieniu produktywności. Tym bardziej, że zastosowane długie sekwencje wyciszające prowadzić mogły do powstania licznych drugorzędowych sirna, których część mogła znaleźć swoje cele (ang. targets) w przypadku obecności mniej specyficznych mrna pochodzących z innych sekwencji kodujących CKX (a prawdopodobnie posiadających rejony kodujące o 100% podobieństwie do HvCKX1 i HvCKX2). Chciałbym poznać stanowisko Autora w tej sprawie. W uzupełnieniu do tego fragmentu oceny muszę dodać, że zdecydowanie zabrakło mi w Wynikach porównania sekwencji kodujących HvCKX1 i HvCKX2 i wskazania rejonów o mniejszym i większym podobieństwie sekwencji. Praca miała dodatkowy cel metodyczny, ciągle aktualny w biotechnologii roślin, a mianowicie porównanie efektów transformacji wykonanej dwoma technikami: agrotransformacją i biolistyczną. Wyniki świadczą o zdecydowanie negatywnym wpływie mikrowstrzeliwania i nieprzewidywalności tego podejścia. Pamiętamy, że jeszcze kilka lat temu uważano tę technikę za przyszłościową w transgenezie zbóż ze względu na trudności z efektywną transformacją zbóż z wykorzystaniem agrobakterii. Porównanie tych dwóch metod wprowadzania transgenów zostało bardzo dobrze zaplanowane i udokumentowane. Wydajność selekcji roślin transgenicznych uzyskanych w wyniku agrotransformacji wyniosła 6,3% i 4,4% dla odmiany Golden Promise oraz 0,16% i 0,12% dla odmiany Scarlett. Natomiast wydajność transformantów odmiany Golden Promise uzyskanych z pomocą techniki biolistycznej była dwukrotnie niższa w porównaniu do agrotransformacji. Autor podsumowując efekty tej części pracy stwierdza, że wydajność selekcji była silnie zależna od genotypu i to niezależnie od techniki transformacji zarodków. Niewątpliwie, transgeneza roślin uprawnych jest technologią, która powinna odegrać znaczną rolę w zwiększeniu produktywności roślin, szczególnie po lepszym poznaniu i przeciwdziałaniu możliwym skutkom ekologicznym, także ekonomiczno-społecznym. Abstrahując od tej ogólnej uwagi, chciałbym wrócić do wydajności transformacji i selekcji transformantów. Od początku stosowania technik transformacji genetycznej obserwowano zróżnicowaną wydajność transformacji u różnych linii czy odmian tego samego gatunku. Zresztą, obserwacja ta dotyczy także efektywności pozyskiwania stabilnych kultur in vitro, które wyprowadzano dla różnych genotypów z bardzo różną wydajnością. Obecna wiedza pozwala lepiej dostrzec podstawy biochemiczno-fizjologiczno-cytologiczne tych różnic. 3

4 Byłoby interesującym poznać opinię Autora tej pracy w przedstawionej kwestii. Można być pewnym, że zastanawiał Autora fakt tak różnej efektywności pozyskiwania transformantów w dla wybranych i dość szeroko badanych przez niego i Zespół dwóch znanych odmian jęczmienia jarego. Ocena formalna Przystępując do formalnej oceny poszczególnych rozdziałów pracy doktorskiej, trzeba zauważyć, że praca odznacza się nieco odmiennym układem od standardowych prac doktorskich, a mianowicie Streszczenie i Wykaz skrótów występują dość dyskusyjnie przed Spisem Treści. Następnie Wstęp to łącznie 3 strony z wkomponowanym Celem pracy. Dopiero po nim pojawia się 17-stronicowy Przegląd Literatury, a następnie kolejne rozdziały w układzie tradycyjnym. Zmiany te nie przeszkadzały mi w odbiorze całościowym pracy, a wyeksponowany krótki Wstęp z Celami badań szybko wprowadza czytelnika w problematykę pracy. Założenia i hipotezy zostały w dość naturalny sposób wyłożone we Wstępie i częściowo w Przeglądzie Literatury, ale zabrakło mi pełniejszego ich sformułowania i przedstawienia. Całość została napisana w sposób interesujący i wyczerpujący. We Wstępie znakomicie omówiono zagadnienia podrozdziałach takich jak Cytokininy: funkcja i metabolizm, czy Charakterystyka genów CKX. Także ciekawie przedstawiono kwestie funkcjonalne związane ze stosowaniem strategii RNAi. Wyniki zostały przedstawione klarownie i starannie. Dokumentacja jest czytelna i dobrej jakości. Wyniki przedstawiono w formie perfekcyjnie wykonanych rysunków, zdjęć i tabel. Opis wyników dotyczy jedynie analizy otrzymanych danych, bez próby szerszego omawiania, czy dyskusji, co jest też warte podkreślenia. Dyskusja wyników została opracowana w sposób wyczerpujący wszystkie istotne aspekty związane Wynikami, z dużą znajomością problematyki i literatury nawiązującej do zadań. Nie wszystkie z siedmiu Wniosków mają właściwy charakter. I tak, wnioski nr 2, 3, 5, 6 i 7 stanowią jedynie podsumowanie wyników; natomiast pozostałe dwa wnioski są trafne i, co ważne, stanowią perspektywę dla dalszych badań. Stronę redakcyjną oceniam także pozytywnie. Dostrzegłem szereg drobnych usterek redakcyjnych, które nie utrudniały jednak zrozumienia tekstu. Ocena końcowa Chcę zaznaczyć, że krytyka niektórych elementów metodycznych czy redakcyjnych, w moim rozumieniu, nie jest znacząca i nie obniża specjalnie mojej bardzo pozytywnej oceny pracy. Stwierdzam, że praca doktorska Pana Magistra Wojciecha Zalewskiego odznacza się 4

5 nowymi, oryginalnymi wynikami, wnoszącymi postęp do badań w zakresie genetyki molekularnej i biotechnologii jęczmienia jarego. Otrzymane wyniki ekspresji badanych genów HvCKX1 i HvCKX2 stanowią obiecującą perspektywę wprowadzenia ich kontroli, a także kontroli samych cytokinin, w ukierunkowanej hodowli jęczmienia jarego. Wyniki uzyskane w ramach ocenianej pracy doktorskiej dowodzą możliwości szerokiego wykorzystania zjawiska interferencji RNA, a także transformacji genetycznej jęczmienia przy wykorzystaniu Agrobacterium tumefaciens. Co ważne, przedstawiona strategia opierająca się na technologii RNAi okazuje się wydajnym i efektywnym narzędziem w analizie funkcjonalnej genów odpowiedzialnych za rozwój rośliny. Metody te, mogą być z powodzeniem wykorzystane w celu ulepszania odmian zbóż. Omawiana praca spełnia wszystkie wymogi stawiane rozprawie doktorskiej. W związku z powyższym wnoszę do Rady Naukowej Instytutu Hodowli i Aklimatyzacji Roślin PIB w Radzikowie o dopuszczenie Pana Mgra Wojciecha Zalewskiego do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Jednocześnie, doceniając szczególnie ważne rezultaty tej pracy związane z opracowaniem i wprowadzeniem technologii RNAi, jako efektywnego narzędzia w doskonaleniu ważnych cech decydujących o produktywności zbóż, wnoszę do Wysokiej Rady o wyróżnienie pracy doktorskiej Wojciecha Zalewskiego. Prof. dr hab. Jan Sadowski 5