Dako LSAB2 System-HRP. Nr kat. K ml Nr kat. K ml Nr kat. K ml. Przeznaczenie Do stosowania w diagnostyce in vitro.

Transkrypt

1 Dako LSAB2 System-HRP Nr kat. K ml Nr kat. K ml Nr kat. K ml Przeznaczenie Do stosowania w diagnostyce in vitro. Instrukcje dotyczą uniwersalnego systemu Dako Labelled Streptavidin-Biotin2 System, Horseradish Peroxidase (LSAB2 System, HRP). Niniejszy system jest przeznaczony do stosowania z pierwotnymi przeciwciałami mysimi lub króliczymi wybranymi przez uŝytkownika, w celu jakościowej identyfikacji antygenów w preparatach tkanek prawidłowych i zmienionych chorobowo, zatapianych w parafinie, preparatach mroŝakowych lub cytologicznych, jako pomoc w diagnostyce zmian patologicznych. Identyfikację prowadzi się w mikroskopie świetlnym. MoŜna uŝywać tkanek przygotowanych za pomocą róŝnych środków utrwalających, w tym etanolu, B-5, płynu Bouina, formaliny z cynkiem oraz obojętnego roztworu buforowanej formaliny. Zobacz dokument Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych firmy Dako lub następujące części instrukcji do systemu detekcji IHC: 1) Zasady procedury, 2) Materiały wymagane, ale niedostarczone z zestawem, 3) Przechowywanie, 4) Przygotowanie preparatu, 5) Wykonanie odczynu, 6) Kontrola jakości, 7) Rozwiązywanie problemów, 8) Interpretacja wyniku odczynu, 9) Ograniczenia metody. Streszczenie i informacje ogólne LSAB2 System, HRP oparty jest na zmodyfikowanej technice znakowania awidyną-biotyną (labelled avidin-biotin, LAB), w której biotynylowane przeciwciało drugorzędowe tworzy kompleks z cząstkami streptawidyny skoniugowanej z peroksydazą. 1 W porównaniu z metodą ABC, metoda LAB/LSAB wykazuje od czterech do ośmiu razy większą czułość. 2 Giorno, et al, 2 przypisują tę zwiększoną czułość mniejszej wielkości kompleksu znakowanej enzymatycznie (strept)awidyny w metodzie LAB/LSAB, w porównaniu z kompleksem enzymatycznym awidyny-biotyny w metodzie ABC. Interpretacja kliniczna dodatniego lub ujemnego odczynu powinna być uzupełniona przez badania morfologiczne i histologiczne oraz wykonanie odpowiednich prób kontrolnych. Ocena wyniku musi być dokonywana z uwzględnieniem historii choroby pacjenta i wyników innych badań diagnostycznych, przez wykwalifikowanego patologa. Zasady procedury LSAB2 System, HRP jest to czuła i wszechstronna procedura IHC, która pozwala na jednoczesne badanie wielu próbek z króliczymi lub mysimi przeciwciałami pierwotnymi, w czasie krótszym niŝ jedna godzina. Endogenna aktywność peroksydazy jest wyeliminowana przez inkubację próbki przez 5 minut w 3% nadtlenku wodoru. Następnie próbka poddawana jest inkubacji z odpowiednimi króliczymi lub mysimi pezeciwciałami pierwotnymi we właściwym rozcieńczeniu, a później sekwencyjnym 10-minutowym inkubacjom z biotynylowanym przeciwciałem wiąŝącym (skierowanym przeciwko białkom króliczym i przeciwko białkom mysim) oraz streptawidyną znakowaną peroksydazą. Ostatnim etapem barwienia jest inkubacja z kompleksem substrat-chromogen (AEC lub DAB). Dla AEC w K0672 jest to 10- minutowa inkubacja z systemem substrat-chromogen w postaci 3-amino-9-etylokarbazolu (AEC), w wyniku której w miejscu występowania antygenu wytrąca się precypitat o czerwonym zabarwieniu. Dla DAB w K0673 jest to 5 10-minutowa inkubacja z systemem substratchromogen w postaci 3-3 -diaminobenzydyny (DAB), w wyniku której w miejscu występowania antygenu wytrąca się precypitat o brązowym zabarwieniu. Dostarczane odczynniki Nr kat. K0672 Opisywany zestaw zawiera następujące materiały wystarczające do barwienia 150 skrawków tkankowych, przy załoŝeniu, Ŝe na jeden skrawek zuŝywane będzie 100 µl odczynnika: Ilość Opis Odczynnik blokujący peroksydazę 3% roztwór nadtlenku wodoru w wodzie. Przeciwciało wiąŝące Biotynylowane immunoglobuliny kozie skierowane przeciwko przeciwciałom króliczym i mysim, izolowane ze względu na powinowactwo, w buforze fosforanowym (PBS) z dodatkiem białek stabilizujących i azydku sodu o stęŝeniu 0,015 mol/l. Streptawidyna-HRP Streptawidyna skoniugowana z peroksydazą chrzanową w roztworze PBS z dodatkiem białka stabilizującego oraz czynników przeciwbakteryjnych. ( ) PL_001 p. 1/9

2 System substrat-chromogen AEC AEC w buforze N,N-dimetyloformamidu (DMF) i octanu, ph 5,0, z dodatkiem nadtlenku wodoru, substancji stabilizujących, wzmacniających i czynnika przeciwbakteryjnego. Przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nr kat. K0673 Opisywany zestaw zawiera następujące materiały wystarczające do barwienia 150 skrawków tkankowych, przy załoŝeniu, Ŝe na jeden skrawek zuŝywane będzie 100 µl odczynnika: Ilość Opis Odczynnik blokujący peroksydazę 3% roztwór nadtlenku wodoru w wodzie. Biotynylowane przeciwciało wiąŝące Biotynylowane immunoglobuliny kozie skierowane przeciwko przeciwciałom króliczym i mysim, izolowane ze względu na powinowactwo, w buforze fosforanowym (PBS) z dodatkiem białek stabilizujących i azydku sodu o stęŝeniu 0,015 mol/l. Streptawidyna-HRP Streptawidyna skoniugowana z peroksydazą chrzanową w roztworze PBS z dodatkiem białka stabilizującego oraz czynników przeciwbakteryjnych. Substrat 1x18 ml Bufor imidazol-hcl, ph 7,5, zawierający nadtlenek wodoru oraz czynnik przeciwbakteryjny. DAB Chromogen 1x1 ml Roztwór chromogenu, 3,3'-diaminobenzydyny. Akcesoria 1 Kalibrowana probówka 1 Plastikowa pipeta typu Pasteur Nr kat. K0675(11) Opisywany zestaw zawiera następujące materiały wystarczające do barwienia 1100 skrawków tkankowych, przy załoŝeniu, Ŝe na jeden skrawek zuŝywane będzie 100 µl odczynnika: Ilość 1x110 ml Opis Biotynylowane przeciwciało wiąŝące Biotynylowane immunoglobuliny kozie skierowane przeciwko przeciwciałom króliczym i mysim, izolowane ze względu na powinowactwo, w buforze fosforanowym (PBS) z dodatkiem białek stabilizujących i azydku sodu o stęŝeniu 0,015 mol/l. 1x110 ml Streptawidyna-HRP Streptawidyna skoniugowana z peroksydazą chrzanową w roztworze PBS z dodatkiem białka stabilizującego oraz czynników przeciwbakteryjnych. ( ) PL_001 p. 2/9

3 Nr kat. K0675(89) W skład zestawu wchodzą niŝej wymienione materiały, przygotowane do stosowania z urządzeniem Dako Autostainer (nr kat. S3400): Ilość 10x11 ml Opis Biotynylowane przeciwciało wiąŝące Biotynylowane immunoglobuliny kozie skierowane przeciwko przeciwciałom króliczym i mysim, izolowane ze względu na powinowactwo, w buforze fosforanowym (PBS) z dodatkiem białek stabilizujących i azydku sodu o stęŝeniu 0,015 mol/l. 10x11 ml Streptawidyna-HRP Streptawidyna skoniugowana z peroksydazą chrzanową w roztworze PBS z dodatkiem białka stabilizującego oraz czynników przeciwbakteryjnych. Materiały wymagane, ale niedostarczane Ściereczki wchłaniające Przeciwciała: Gotowe do uŝytku przeciwciała serii N lub stęŝone przeciwciała rozcieńczone w Antibody Diluent (nr kat. S0809 lub S3022) Antibody Diluent (nr kat. S0809 or S3022) Tkanki kontrolne, kontrola dodatnia i ujemna Barwienie kontrastowe; środek oparty na roztworze wodnym, np. Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin (hematoksylina Mayera w modyfikacji Lillie) (nr kat. S3309) Szkiełka nakrywkowe Woda destylowana Suszarka umoŝliwiająca utrzymanie temperatury 60 C lub niŝszej. Etanol absolutny i roztwór o stęŝeniu 95% Mikroskop świetlny (20x 800x) Środki do zatapiania, takie jak Faramount (nr kat. S3025) lub Glycergel (nr kat. C0563) Odczynnik do kontroli ujemnej Szkiełka powlekane poli-l-lizyną lub szkiełka silanizowane Silanized Slides (nr kat. S3003) Naczynia lub łaźnia do barwienia Minutnik (dokonujący pomiarów w odstępach 2-10 minut) Butelki z roztworem płuczącym Roztwór buforu płuczącego Ksylen, toluen lub substytuty ksylenu Dla systemu K0675 LSAB2 (110 ml), oprócz wyŝej wymienionych odczynników potrzebne są dodatkowo: Nadtlenek wodoru, roztwór 3% lub odczynnik blokujący peroksydazę Peroxidase Block (nr kat. S2001) Roztwór systemu substrat-chromogen taki jak AEC Substrate-Chromogen (nr kat. K3464, 110 ml, gotowy do uŝytku) lub Liquid DAB (nr kat. K3466) Materiały opcjonalne, niedostarczone Bufory: Bufor płuczący Wash buffer (nr kat. S3006) do stosowania automatycznego i ręcznego Phosphate buffered saline (nr kat. S3024) Tris-buffered saline (nr kat. S3001 lub S1968) Enzymy proteolityczne: Pepsin (nr kat. S3002) Proteinase K (nr kat. S3004 lub S3020) Proteolytic Enzyme, RTU (nr kat. S3007) Pozostałe: Szkiełka kontroli dodatniej (dostępne w Dako) Target Retrieval Solution (nr kat. S1699 lub S1700) Target Retrieval Solution, High ph (nr kat. S3307 lub S3308). Target Retrieval Solution, ph 9 (nr kat. S2367 lub S2368) Komora nawilŝająca Roztwór wodorotlenku amonu o stęŝeniu 15 mol/l rozcieńczony do 0,037 mol/l Środki ostroŝności Dotyczące opisywanego produktu 1. Odczynniki są przeznaczone dla przeszkolonych uŝytkowników. 2. Opisywany produkt zawiera silnie toksyczny związek azydek sodu (NaN 3), w czystej postaci. StęŜenie NaN 3 występujące w produkcie nie jest klasyfikowane jako niebezpieczne, jednak w wyniku reakcji NaN 3 z ołowiem lub miedzią, wchodzącymi w skład instalacji kanalizacyjnych, mogą powstawać silnie wybuchowe azydki metali. Przy usuwaniu resztek odczynników naleŝy uŝywać duŝych ilości wody do przepłukiwania, aby uniknąć gromadzenia się azydku w instalacji kanalizacyjnej. 3,4 3. Systemy substrat-chromogen AEC oraz DAB są wraŝliwe na zanieczyszczenie róŝnymi czynnikami utleniającymi, takimi jak metale, bakterie, pył i typowe szkło laboratoryjne. Aby uniknąć zanieczyszczenia i konieczności przedwczesnego wycofania odczynnika z uŝycia, naleŝy unikać naraŝania roztworów AEC lub DAB na kontakt z potencjalnymi źródłami zanieczyszczenia i nie ( ) PL_001 p. 3/9

4 naleŝy pipetować go bezpośrednio z butelki. Wlać potrzebną ilość do czystego pojemnika i stamtąd pipetować. Nie wlewać nadmiaru roztworu AEC lub DAB z powrotem do głównego pojemnika. 4. Dostarczone odczynniki są optymalnie rozcieńczone. Zwiększanie rozcieńczenia moŝe powodować utratę odczynu antygenów. KaŜda taka zmiana musi być zweryfikowana przez uŝytkownika. RóŜnice w metodach obróbki tkanek i procedurach technicznych stosowanych w laboratorium uŝytkownika mogą powodować istotne róŝnice wyników, wymagające regularnego wykonywania wewnętrznej kontroli jakości. 5. Nie naleŝy zastępować odczynników produktami pochodzącymi z innych partii lub z zestawów innych producentów. 6. Stosowanie innych od opisanych parametrów czasu inkubacji lub temperatur moŝe powodować błędne wyniki badania. Wszystkie zmiany tego rodzaju muszą zostać zweryfikowane przez uŝytkownika. 7. W przypadku ekspozycji na silne światło jakość odczynników enzymatycznych i chromogenów moŝe ulec pogorszeniu. Nie naleŝy przechowywać składników zestawu ani wykonywać barwienia w silnym oświetleniu, takim jak bezpośrednie światło słoneczne. Ogólne 1. Podobnie jak w przypadku kaŝdego produktu otrzymywanego z materiału biologicznego, naleŝy stosować odpowiednie procedury postępowania. 2. NaleŜy unikać skaŝenia mikrobiologicznego odczynników, gdyŝ moŝe ono doprowadzić do uzyskania błędnych wyników. 3. Unikać rozpryskiwania odczynników oraz tworzenia aerozoli. 4. Jako zasadę naleŝy przyjąć zakaz pracy z produktem przez osoby w wieku poniŝej 18 lat. UŜytkowników naleŝy starannie poinstruować co do właściwych procedur pracy, niebezpiecznych własności produktu i środków ostroŝności. 5. NaleŜy stosować właściwe wyposaŝenie ochronne, zabezpieczające przed kontaktem odczynnika ze skórą bądź oczyma. Niewykorzystane odczynniki naleŝy usuwać zgodnie ze stosownymi przepisami lokalnymi i ogólnokrajowymi. 6. Karta Charakterystyki Substancji Niebezpiecznej jest dostępna na Ŝądanie. ZagroŜenia i warunki bezpiecznego stosowania K Gotowy do uŝytku system substrat-chromogen AEC: 1-<10% N,N-Dimetyloformamid / Symbol zagroŝenia: Toksyczne R61 S35 S45 S53 MoŜe powodować uszkodzenia płodu. Niniejszy materiał wraz z opakowaniem musi być usuwany z zachowaniem zasad bezpieczeństwa. JeŜeli dojdzie do wypadku lub jeŝeli uŝytkownik źle się poczuje, naleŝy niezwłocznie zasięgnąć porady lekarza (jeŝeli jest to moŝliwe, naleŝy pokazać etykietę). Unikać naraŝenia na kontakt przed uŝyciem uzyskać instrukcje specjalne. Produkt dostępny tylko dla przeszkolonych uŝytkowników. K DAB Chromogen: czterochlorek bifenylo-3,3,4,4 -tetrailotetraamonowy w stęŝeniu 1-5% / Symbol zagroŝenia: Szkodliwe R40 Ograniczone dowody działania rakotwórczego. R43 MoŜe powodować uczulenie przez kontakt ze skórą. R68 MoŜliwe ryzyko powstania nieodwracalnych zmian. S35 Niniejszy materiał wraz z opakowaniem musi być usuwany z zachowaniem zasad bezpieczeństwa. S36/37 Nosić odpowiednią odzieŝ ochronną i rękawice. Przechowywanie Odczynniki systemu LSAB2 System, HRP naleŝy przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nie zamraŝać. Nie naleŝy uŝywać produktów po upływie daty waŝności wydrukowanej na fiolkach odczynników i etykiecie zestawu. Jeśli odczynniki przechowywane są w warunkach innych niŝ określone powyŝej, powinny one zostać zweryfikowane przez uŝytkownika. 5 Roztwory substrat-chromogen AEC i DAB są niestabilne w temperaturze wyŝszej niŝ 8 C. Roztwory substrat-chromogen AEC i DAB naleŝy stosować i przechowywać w zalecanym zakresie temperatur 2 8 C. Tych roztwo rów moŝna uŝywać bezpośrednio po wyjęciu z chłodziarki. Po uŝyciu jak najszybciej z powrotem umieścić w temperaturze 2 8 C. Nie ma jednoznacznych oznak świadczących o niestabilności tych odczynników, dlatego równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów, naleŝy wykonywać dodatnie i ujemne próby kontrolne. W razie uzyskania nieoczekiwanego wyniku odczynu, którego nie moŝna wyjaśnić róŝnicami w procedurach laboratoryjnych, jeŝeli podejrzewa się problem z zestawem, naleŝy się skontaktować z działem pomocy technicznej firmy Dako. Przygotowanie odczynnika Dla wygody, przed rozpoczęciem barwienia zaleca się przygotowanie następujących odczynników. Roztwór buforu płuczącego Zalecanym buforem płuczącym do diagnostyki IHC metodą ręczną i automatyczną jest preparat TBST, Tris Buffered Saline with Tween (nr kat. S3006) o stęŝeniu 0,05 mol/l. Do barwienia metodą ręczną moŝna równieŝ stosować bufory płuczące TBS, Tris Buffered Saline (nr kat. S1968) o stęŝeniu 0,05 mol/l i PBS, Phosphate Buffered Saline (nr kat. S3024) o stęŝeniu 0,02 mol/l. Nie zaleca się stosowania roztworów buforów płuczących zawierających azydek sodu. Azydek sodu powoduje inaktywację peroksydazy chrzanowej (HRP), powodując ujemny wynik barwienia. NieuŜywany bufor przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nie uŝywać buforu, jeśli wystąpiło jego zmętnienie. Do spłukiwania nadtlenku wodoru, roztworu substrat-chromogen i barwnika kontrastowego moŝna stosować wodę destylowaną. Przeciwciała pierwotne Do systemów LSAB2 dostępny jest szeroki zakres gotowych do uŝytku przeciwciał pierwotnych serii N oraz odczynników kontroli ujemnej. Dostępne są równieŝ stęŝone przeciwciała firmy Dako, ale optymalne rozcieńczenia muszą zostać ustalone eksperymentalnie przez uŝytkownika. Rozcieńczenia naleŝy przygotowywać przy uŝyciu preparatu Antibody Diluent (nr kat. S0809) lub rozcieńczalnika zawierającego bufor Tris-HCI o stęŝeniu 0,05 mol/l, ph 7,2-7,6 z 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA). BSA blokuje białka i eliminuje potrzebę oddzielnej inkubacji z odczynnikiem blokującym białka. Jako rozcieńczalnik stosować moŝna równieŝ odczynnik Antibody Diluent with Background Reducing Components (nr kat. S3022). Nie zaleca się stosowania rozcieńczalnika bez nośnika białkowego. ( ) PL_001 p. 4/9

5 W przypadku większości przeciwciał pierwotnych stosowanych z systemami LSAB2 wystarczająca jest inkubacja trwająca 10 minut. Odczynnik do kontroli ujemnej W idealnych warunkach odczynnik do kontroli ujemnej zawiera przeciwciała, które nie wykazują swoistej reaktywności z tkankami ludzkimi w takim samym materiale/roztworze, co przeciwciała pierwotne. Przeciwciała niewykazujące reaktywności z tkankami ludzkimi powinny być tej samej klasy i pochodzić od tego samego gatunku zwierzęcia, co przeciwciała pierwotne, i powinny być rozcieńczone do takiego samego stęŝenia immunoglobulin lub białek, co przeciwciała pierwotne, w tym samym rozcieńczalniku. W zaleŝności od rodzaju stosowanego przeciwciała pierwotnego, do uŝycia moŝe nadawać się normalna nie-immunogenna surowica pochodząca od tego samego gatunku zwierząt co przeciwciało pierwotne i o stęŝeniu białek równowaŝnym do rozcieńczonego przeciwciała pierwotnego, w tym samym rozcieńczalniku. Czas inkubacji odczynnika do kontroli ujemnej powinien odpowiadać czasowi stosowanemu w przypadku przeciwciał pierwotnych. Podczas stosowania gotowych do uŝytku przeciwciał firmy Dako serii N, zaleca się kontrolę ujemną przy uŝyciu odczynnika Universal Negative Control(s). Odczynnik ten jest zoptymalizowany do stosowania zarówno z mysimi (nr kat. N1698), jak i króliczymi (nr kat. N1699), gotowymi do uŝycia, przeciwciałami serii N. Roztwór substrat-chromogen System K0672 LSAB2 zawiera gotowy do uŝycia roztwór AEC, który moŝna nanosić na próbki tkanek lub komórek. System K0673 LSAB2 zawiera DAB, który przygotowuje się w następujący sposób: Dodać 1 kroplę (lub 20 µl) chromogenu DAB na ml buforu substratu. Stosować dostarczoną probówkę z podziałką, aby odmierzyć potrzebną ilość buforu substratu. Dobrze wymieszać i nanieść roztwór stosując dostarczoną pipetę transferową. Po uŝyciu dokładnie wypłukać probówkę z podziałką i pipetę wodą destylowaną. Niewykorzystany roztwór roboczy DAB pozostaje stabilny przez dwa tygodnie, jeŝeli jest przechowywany w temperaturze 2 8 C. W razie powstania precypitatów, przed uŝyciem dobrze wymieszać. Z systemem LSAB2 System, HRP, 110 ml (nr kat. K0675) zaleca się stosowanie roztworów Ready-to-use AEC Substrate-Chromogen Solution (nr kat. K3464, 110 ml) lub Liquid DAB (nr kat. K3466). Susbstrat-chromogen naleŝy przygotowywać zgodnie z instrukcjami dostarczonymi z kaŝdym systemem substrat-chromogen. Barwnik kontrastowy Po zastosowaniu chromogenu DAB powstaje produkt końcowy nierozpuszczalny w alkoholu, który moŝna stosować z alkoholowym roztworem hematoksyliny. JeŜeli stosuje się substrat-chromogen AEC, powstaje barwny, rozpuszczalny w alkoholu produkt końcowy. W takim przypadku naleŝy stosować środki do barwienia kontrastowego oparte na roztworze wodnym, np. hematoksylinę Mayera. Po wykonaniu barwienia kontrastowego hematoksyliną naleŝy wykonać dokładne płukanie preparatu wodą destylowaną, a następnie zanurzyć skrawki w kąpieli zawierającej amoniak o stęŝeniu 0,037 mol/l. W celu przygotowania wodnego roztworu amoniaku o stęŝeniu 0,037 mol/l naleŝy wymieszać 2,5 ml wodorotlenku amonu o stęŝeniu 15 mol/l (stęŝonego) z 1 litrem wody. Niewykorzystany wodny roztwór amoniaku o stęŝeniu 0,037 mol/l moŝna przechowywać w temperaturze pokojowej (20-25 C), w szczelnie za mkniętej butelce, przez okres do 12 miesięcy. Alternatywne procedury barwienia kontrastowego przedstawiono w wytycznych producenta. Środki do zatapiania preparatu Do zatapiania preparatu zaleca się stosowanie gotowego do uŝycia środka Faramount Aqueous Mounting Medium (nr kat. S3025) lub środka Glycergel Mounting Medium (nr kat. C0563). Przed uŝyciem naleŝy przeprowadzić preparat Glycergel w stan płynny, ogrzewając do temperatury ok. 40 (±5) C. Przygotowanie próbek Zobacz Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych i/lub Kartę Specyfikacji Przeciwciał. Przed wykonaniem odczynu IHC tkanki naleŝy utrwalić i poddać obróbce. Utrwalenie zabezpiecza przed autolizą i rozkładem wycinków, utrzymuje antygenowość, zwiększa współczynnik załamania światła przez struktury tkankowe i zwiększa odporność elementów komórkowych na obróbkę. Obróbka tkanki polega na odwodnieniu, usunięciu środków odwadniających, przepojeniu substancją zatapiającą, zatopieniu i wykonaniu wycinków. Utrwalacze najczęściej stosowane podczas przygotowania tkanek do diagnostyki IHC przedstawiono w dokumencie Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych. Podane informacje mają charakter wyłącznie orientacyjny. Optymalna procedura powinna zostać ustalona i zweryfikowana przez uŝytkownika. Wykonanie odczynu Uwagi dotyczące procedury Przed uŝyciem, uŝytkownik powinien uwaŝnie przeczytać podane instrukcje i zapoznać się z zawartością zestawu. Odczynniki i instrukcje dostarczane z systemem opracowano w celu uzyskania optymalnych wyników. Dodatkowe rozcieńczenie odczynników systemu bądź nieprzestrzeganie czasu lub temperatury inkubacji moŝe spowodować uzyskanie błędnych wyników. Przed przystąpieniem do wykonywania barwienia wszystkie odczynniki systemu, za wyjątkiem systemu substrat-chromogen AEC, naleŝy doprowadzić do temperatury pokojowej (20 25 C). Wszystkie proc edury inkubacji naleŝy równieŝ przeprowadzać w temperaturze pokojowej. System substrat-chromogen AEC moŝe być uŝywany natychmiast po wyjęciu z chłodziarki i nie trzeba go przed uŝyciem doprowadzać do temperatury pokojowej. Po uŝyciu ponownie umieścić w temperaturze 2 8 C. Przechowywanie w temperaturze wyŝszej niŝ 8 C ujemnie wpływa na stabilność systemu substrat-chromogen AEC. Podczas wykonywania barwienia nie moŝna dopuścić do wysychania skrawków tkankowych. Wysuszone skrawki tkankowe mogą powodować nasilenie odczynu nieswoistego. NaleŜy osłonić szkiełka nakrywkowe znajdujące się w miejscach naraŝonych na przeciągi. JeŜeli stosowane są długie czasy inkubacji, preparaty powinny znajdować się w środowisku o odpowiedniej wilgotności. Jeśli procedura wykonywania odczynu musi zostać przerwana, preparaty moŝna przechowywać w roztworze buforu, który tworzy się po inkubacji z przeciwciałami wiąŝącymi (etap 3), przez maksymalnie jedną godzinę w temperaturze pokojowej (20-25 C) bez wpływu na wynik barwienia. Czułość zestawu LSAB2 System, HRP moŝna dodatkowo zwiększyć, wydłuŝając czasy inkubacji w etapach 2, 3 i 4 o 30 ±5 minut kaŝdy. ( ) PL_001 p. 5/9

6 Wykonanie odczynu ETAP 1 ODCZYNNIK BLOKUJĄCY PEROKSYDAZĘ Strząsnąć nadmiar cieczy. Posługując się chusteczką niepozostawiającą nitek (np. Kimwipe lub gazikiem) ostroŝnie otrzeć szkiełko wokół preparatu tak, by usunąć pozostałości płynu i utrzymywać odczynniki w obszarze zgodnym z zaleceniami. Dodać tyle odczynnika blokującego peroksydazę, aby zakryć próbkę. Inkubować przez 5 (±1) minut. OstroŜnie przepłukać wodą destylowaną lub roztworem buforowym z butelki na płyn płuczący (nie naleŝy kierować strumienia płynu bezpośrednio na tkankę), a następnie umieścić preparat w świeŝej kąpieli z buforem. ETAP 2 ETAP 3 ETAP 4 ETAP 5 ETAP 6 ETAP 7 PRZECIWCIAŁA PIERWOTNE LUB ODCZYNNIK DO KONTROLI UJEMNEJ Strząsnąć nadmiar cieczy i przetrzeć preparaty jak poprzednio. Nanieść taką ilość przeciwciała pierwotnego lub odczynnika kontroli ujemnej, aby pokryć próbkę. Inkubować przez 10 (±1) minut, chyba Ŝe podano inaczej. OstroŜnie przepłukać roztworem buforowym z butelki na płyn płuczący (nie naleŝy kierować strumienia płynu bezpośrednio na tkankę), a następnie umieścić preparat w świeŝej kąpieli z buforem. BIOTYNYLOWANE PRZECIWCIAŁO WIĄśĄCE Strząsnąć nadmiar buforu i przetrzeć preparaty jak poprzednio. Nanieść tyle kropli śółtego preparatu przeciwciała wiąŝącego, aby zakryć próbkę. Inkubować przez 10 (±1) minut. Przemyć preparaty tak jak w etapie 2. Jeśli procedura wykonywania odczynu musi zostać przerwana, preparaty moŝna przechowywać w roztworze buforu, który tworzy się po inkubacji z przeciwciałami wiąŝącymi (etap 3), przez maksymalnie jedną godzinę, w temperaturze pokojowej (20 25 C), bez wpływu na wynik barwienia. STREPTAWIDYNA-HRP Wytrzeć preparaty jak poprzednio. Nanieść tyle kropli CZERWONEGO preparatu streptawidyny, aby zakryć próbkę. Inkubować przez 10 (±1) minut. Przemyć preparaty jak poprzednio ROZTWÓR CHROMOGEN-SUBSTRAT Wyjąć roztwory substrat-chromogen AEC lub DAB z chłodziarki 2 8 C. Sposób przygotowania DAB opisano w części Przygotowanie odczynników. Wytrzeć preparat jak poprzednio. Nanieść tyle roztworu chromogen-substrat AEC lub DAB, aby pokryć próbkę. Ponownie umieścić system substrat-chromogen AEC lub DAB w chłodziarce. AEC inkubować przez 10 (±1) minut a DAB przez 5 10 minut. OstroŜnie przepłukać wodą destylowaną z butelki. Nie naleŝy kierować strumienia wody bezpośrednio na tkankę. Umieścić odpady systemu substrat-chromogen AEC lub DAB w pojemniku na materiały niebezpieczne w celu właściwej likwidacji. BARWIENIE KONTRASTOWE HEMATOKSYLINĄ (OPCJONALNIE) Zanurzyć preparaty w kąpieli z roztworu hematoksyliny. Inkubować przez dwie do pięciu (2 5) minut, w zaleŝności od stęŝenia stosowanego roztworu hematoksyliny. OstroŜnie przepłukać w łaźni z wodą destylowaną. Dziesięciokrotnie zanurzyć preparaty w kąpieli wodnego roztworu amoniaku o stęŝeniu 0,037 mol/l (opcjonalnie). Przepłukiwać w kąpieli z wody destylowanej lub dejonizowanej przez dwie do pięciu (2 5) minut. ZATAPIANIE / NAKRYWANIE Do zatopienia i nakrycia preparatów moŝna uŝyć środka wodnego, takiego jak Faramount (nr kat. S3025) lub Glycergel (nr kat. C0563). Uwaga: Produkt reakcji z AEC jest rozpuszczalny w rozpuszczalnikach organicznych i dlatego niedopuszczalne jest stosowanie środków do trwałego zatapiania na bazie toluenu lub ksylenu. Uwaga: DAB moŝna zatapiać w dowolnym środku do trwałego zatapiania. Uwaga: Odczyt odczynu moŝna przeprowadzić w dogodnym momencie. Niemniej jednak, jeŝeli preparaty są naraŝone na silne światło przez okres jednego tygodnia, moŝe nastąpić ich zblaknięcie. Aby ograniczyć blaknięcie, naleŝy przechowywać preparaty w zaciemnionym miejscu, w temperaturze pokojowej (20 25 C). Kontrola jakości RóŜnice w metodach obróbki tkanek i procedurach technicznych stosowanych w laboratorium uŝytkownika mogą powodować istotne róŝnice wyników, wymagające regularnego wykonywania wewnętrznej kontroli jakości. NaleŜy postępować zgodnie z wytycznymi dotyczącymi kontroli jakości opisanymi w programie College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry oraz publikacjami 6 8, wyszczególnionymi w Piśmiennictwie. Informacje dotyczące czułości i immunoreaktywności przedstawiono w broszurach dołączonych do opakowań poszczególnych przeciwciał pierwotnych. Dalsze informacje na temat kontroli dodatnich i ujemnych przedstawiono w dokumencie Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych. Interpretacja odczynu Wskazówki dotyczące interpretacji przedstawiono w dokumencie Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych. ( ) PL_001 p. 6/9

7 Ograniczenia ogólne Informacje dotyczące ogólnych ograniczeń przedstawiono w dokumencie Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych. Ograniczenia swoiste dla opisywanego produktu Dostarczane przez firmę Dako odczynniki LSAB2 System są optymalnie rozcieńczone do stosowania zgodnie z podanymi instrukcjami dotyczącymi testów IHC na skrawkach tkankowych zatopionych w parafinie, preparatach mroŝakowych i rozmazach krwi. Jakakolwiek niezgodność z zalecanymi procedurami testu moŝe spowodować, Ŝe podane oczekiwane wartości wyników utracą waŝność. NaleŜy stosować właściwe próby kontrolne i notować ich wyniki w dokumentacji. UŜytkownicy stosujący procedury odbiegające od zalecanych są odpowiedzialni za interpretację wyników pacjenta w zmienionych warunkach badania. W zamroŝonych skrawkach tkanek wątroby (cały zrazik wątrobowy) oraz nerki (nabłonek cewek), jak równieŝ w zamroŝonych i utrwalanych formaliną tkankach limfoidalnych (histiocyty części przykorowej) zaobserwowano endogenną aktywność wiązania awidyny (endogenous avidin-binding activity EABA) Aktywność EABA moŝna zahamować przed wykonaniem odczynu poprzez przeprowadzenie sekwencji 20-minutowych inkubacji najpierw z awidyną o stęŝeniu 0,1%, a następnie z biotyną o stęŝeniu 0,01% w 0,05 M buforze Tris-HCl, o ph 7,2 7,6 lub zastosowanie systemu Biotin Blocking System (nr kat. X0590). Endogenna aktywność peroksydazy lub o podobnym charakterze moŝe występować w hemoproteinach, np. w hemoglobinie, mioglobinie, cytochromach i katalazie, jak równieŝ w eozynofilach. 13,14 W tkankach utrwalonych formaliną tego rodzaju aktywność moŝna wyeliminować, inkubując próbki z 3% nadtlenkiem wodoru przez pięć minut przed zastosowaniem przeciwciał pierwotnych. Rozmazy krwi i szpiku kostnego oraz zamroŝone wycinki tkanek moŝna poddać działaniu odczynnika Peroxidase Blocking Reagent (nr kat. S2001). Ta procedura nie usuwa jednak czerwonawo-brązowego zabarwienia wywołanego obecnością hemoprotein. MoŜna równieŝ stosować roztwór metanolu i nadtlenku wodoru. Ta procedura powoduje jednak denaturację niektórych antygenów. W tkankach które nie zostały uprzednio przetestowane, odczynniki mogą wykazywać nieoczekiwane reakcje. Nie moŝna wykluczyć wystąpienia nieoczekiwanych reakcji równieŝ w przetestowanych tkankach, z uwagi na zmienność biologiczną ekspresji antygenów w tkankach nowotworów i innych tkankach zmienionych chorobowo. 8 W przypadku uzyskania nieoczekiwanych reakcji naleŝy przesłać odpowiednią dokumentację do działu pomocy technicznej firmy Dako. Tkanki pochodzące od osób zakaŝonych wirusem zapalenia wątroby typu B i zawierające antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg) mogą wykazywać nieswoiste barwienie w reakcji z peroksydazą chrzanową. 15 Rozwiązywanie problemów Problem Prawdopodobna przyczyna Zalecane postępowanie 1. Brak barwienia we 1a. Odczynniki zostały 1a. Sprawdzić sposób uŝycia odczynników. wszystkich preparatach. uŝyte w niewłaściwej kolejności. 1b. Azydek sodu obecny 1b. UŜyć świeŝego buforu 2. Słabe barwienie we wszystkich preparatach. 3. Nadmierne barwienie tła na wszystkich preparatach, równieŝ na preparatach kontroli ujemnej. w kąpieli z buforem. 1c. Nieprawidłowe wymieszanie odczynnika chromogen-substrat. 2a. Skrawki zawierają zbyt duŝo roztworu po kąpieli płuczącej. 2b. Zbyt krótka inkubacja preparatów z odczynnikami. 2c. Nieodpowiednie barwienie kontrastowe lub środek do zatapiania, który rozpuszcza produkt reakcji. 3a. W próbkach występuje duŝa aktywność endogennej peroksydazy. 3b. Niecałkowicie usunięta parafina. 3c. Preparaty nie są odpowiednio przemywane. 3d. Szybsza niŝ zwykle reakcja substratu ze względu na nadmierną temperaturę w pomieszczeniu. niezawierającego azydku. 1c. Przygotować świeŝy roztwór substratchromogen zgodnie z protokołem zestawu. 2a. OstroŜnie strząsnąć nadmiar roztworu przed wytarciem preparatu wokół skrawka. 2b. Sprawdzić zalecane czasy inkubacji. 2c. Do preparatów barwionych za pomocą AEC stosować naleŝy wyłącznie wodne barwniki kontrastowe i środki do zatapiania. 3a. Inkubować preparaty ze świeŝym nadtlenkiem wodoru. 3b. Zastosować świeŝą kąpiel z ksylenu lub toluenu. 3c. Zastosować świeŝe roztwory w kąpielach z buforem i butelkach z roztworem płuczącym. 3d. Stosować krótszy czas inkubacji z roztworem barwiącym chromogensubstrat. ( ) PL_001 p. 7/9

8 4. Skrawki tkankowe oddzielają się od szkiełek. 5. Nadmiernie silny odczyn swoisty. 3e. Wyschnięte skrawki podczas wykonywania odczynu. 3f. Nieswoiste wiązanie odczynników do skrawka tkanki. 3g. Zbyt duŝe stęŝenie przeciwciał pierwotnych. 4a. Zastosowano niewłaściwe szkiełka mikroskopowe. 5a. Zbyt duŝe stęŝenie przeciwciał pierwotnych. 5b. Zbyt długa inkubacja z przeciwciałem pierwotnym, biotynylowanym przeciwciałem wiąŝącym lub streptawidyną-hrp. 3e. Stosować komorę nawilŝającą. Wycierać tylko trzy do czterech szkiełek na raz przed naniesieniem odczynnika. 3f. Zastosować rozcieńczalnik przeciwciał Dako lub dodać 1% BSA do rozcieńczalnika przeciwciał. Alternatywnie, jako bufor płuczący stosować moŝna 0,05 mol/l Tris zawierający 0,3 mol/l NaCl i 0,1% Tween 20, ph 7,2-7,6 (nr kat. S3306). Konieczna moŝe być równieŝ inkubacja z oddzielnym odczynnikiem blokującym białka (nr kat. X0909) przed naniesieniem przeciwciała pierwotnego. 3g. Zwiększyć rozcieńczenie przeciwciał pierwotnych. 4a. Do większości odczynów uŝywać szkiełek powlekanych poli-l-lizyną. W przypadku pierwotnych przeciwciał wymagających odmaskowania uŝywać szkiełek silanizowanych. 5a. Wykonać seryjne rozcieńczenie przeciwciał pierwotnych w celu ustalenia optymalnego rozcieńczenia. 5b. Określić odpowiedni protokół barwienia dla przeciwciała, np. długość inkubacji z przeciwciałem pierwotnym, biotynylowanym przeciwciałem wiąŝącym oraz streptawidyną-hrp. Uwaga: Jeśli problemu nie daje się przypisać Ŝadnej z powyŝszych przyczyn, bądź jeśli zalecane postępowanie jest nieskuteczne, naleŝy skontaktować się z działem pomocy technicznej firmy Dako w celu uzyskania dalszej pomocy. Dodatkowe informacje na temat technik wykonywania odczynów oraz przygotowywania próbek przedstawiono w publikacjach Immunochemical Staining Methods 10 (dostępna w firmie Dako), Atlas of Immunohistology 16 oraz Immunoperoxidase Techniques, A Practical Approach to Tumor Diagnosis. 17 Piśmiennictwo 1. Guesdon JL, Ternynck T, Avrameas S. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques. J Histochem Cytochem 1979;27(8): Giorno R. A comparison of two immunoperoxidase staining methods based on the avidin-biotin interaction. Diag Immunol 1984;2(3): Center for Disease Control Manual Guide Safety Management, No. CDC-22. Decontamination of laboratory sink drains to remove azide salts. Atlanta, Georgia. April 30, Department of Health, Education and Welfare, National Institute for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides. DHHS (NIOSH) Publ. No , Current 13. August 16, Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final rule, 57FR7163. February 18, Elias JM, Gown AM, Nakamura RM, Wilbur DC, Herman GE, Jaffe S, Battifora H, Brigati DJ. Quality control in immunohistochemistry. Report of a workshop sponsored by the Biological Stain Commission. Amer J Clin Pathol 1989;92(6): National Committee for Clinical Laboratory Standards. Internal quality control testing: Principles and definitions; approved guideline. Villanova, PA. 1991; 4: Order code C24-A 8. Herman GE, Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech & Histochem 1991;66(4): Kiernan JA. Histological and histochemical methods: Theory and practice. New York: Pergamon Press 1981: Key M (ed). Immunohistochemical Staining Methods. 4th Edition. Dako Wood GS, Warnke R. Suppression of endogenous avidin-binding activity in tissues and its relevance to biotin-avidin detection systems. J Histochem Cytochem 1981;29(10): Banerjee D, Pettit S. Endogenous avidin-binding activity in human lymphoid tissue. J Clin Pathol 1984;37(2): Escribano LM, Gabriel LC, Villa E, Navarro JL. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J Histochem Cytochem 1987;35(2): Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: American Society of Clinical Pathologists Press 1990; Omata M, Liew CT, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Am J Path 1980;73(5): Tubbs RR, et al. Atlas of immunohistology. Chicago: ASCP Press Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase techniques, A practical approach to tumor diagnosis. Chicago: ASCP Press 1986 ( ) PL_001 p. 8/9

9 Wydanie 05/07 ( ) PL_001 p. 9/9