Dystrofia mięśniowa Duchenne a - stan badań nad niektórymi możliwościami terapeutycznymi

Transkrypt

1 Dystrofia mięśniowa Duchenne a - stan badań nad niektórymi możliwościami terapeutycznymi Prof. dr hab. Józef Dulak Zakład Biotechnologii Medycznej Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytet Jagielloński & Kardio-Med Silesia, Zabrze 26 kwietnia 2019, Bielany Wrocławskie jozef.dulak@uj.edu.pl

2

3 Gen dystrofiny ważny i bardzo skomplikowany Największy ludzki gen Bardzo duża liczba zmian (mutacji) powodujących DMD Ponieważ jest tak duży - bardzo trudno nim manipulować i stosować w terapii genowej Odkrycie, na czym polega mutacja genu dystrofiny w dystrofii Beckera pozwoliło na opracowanie nowych strategii terapii genowej

4 Modyfikacje skracanie genu dystrofiny Krótsze wersje dystrofiny opracowane przez prof. Jeffreya Chamberlaina i wsp. z Uniwersytetu w Seattle mogą zastąpić pełną dystrofinę terapia zmieniałaby dystrofię Duchenne a w dystrofię Beckera

5 Terapia genowa białko Terapeutyczny gen Wektor Pacjent Ekspresja (produkcja) genu terapeutycznego

6 Genetyczne strzykawki - wektory Wektory retrowirusowe Wektory adenowirusowe Wektory AAV AAV vectors (adeno-associated) Różne wektory mają różną pojemność mogą przenosić cząsteczki kwasów nukleinowych o różnej długości Plazmidy Niektóre wektory, zwłaszcza AAV bardzo skutecznie dostarczają geny do mięśni szkieletowych i serca

7 Modele zwierzęce DMD 1. Myszy mdx - mutacja punktowa w Egonie 23 dystrofiny; częściowo odzwierciedla przebieg choroby u chłopców; 2. Psy Golden retriever (xmd) - różne mutacje punktowe prowadzące do całkowitego braku dystrofiny (wyłączenie egzonu 7); psy chodzą z trudem w wieku 8 miesięcy 7

8 Terapia genowa u myszy mdx przywraca ekspresję dystrofiny Mysz zdrowa Mysz mdx Mysz mdx po podaniu wektorów AAV z genem mikrodystrofiny Sham-injected dystrofina brak dystrofiny dystrofina Hum Mol Genet 2002 James G Tidball & Melissa J Spencer Nature Medicine 9, (2003) 8

9 Rodzaje terapii genowej w dystrofii mięśniowej Duchenne a 1 Wprowadzania prawidłowego genu dystrofiny - problem z wprowadzeniem całego genu - podawanie skróconej wersji genu tzw., mikrodystrofiny - za pomocą specjalnych strzykawek genetycznych - nieszkodliwych wirusów, najczęściej tzw. AAV - wirusy te (niektóre ich odmiany) wnikają przede wszystkim do mięśni oraz serca 2. Naprawa genu usunięcie zmienionego fragmentu Eteplirsen (Exondys 51) - przywrócenie ekspresji około 0.5% dystrofiny (potrzeba osiągnięcia 15-30% normalnego poziomu) 3. Naprawa genu edycja za pomocą systemu CRISPR/Cas9 Wydaje się bardziej efektywna niż inne formy edycji (naprawy) genów

10 Eteplirsen przeskakiwanie egzonów Zarejestrowany w roku 2016 w USA przez FDA, ale nie zarejestrowany przez EMA w Europie Zarejestrowany w 2016 przez FDA, ale nie w Europie przez EMEA Exondys 51, distributed by Sarepta Therapeutics Inc.), also called AVI- 4658, is a drug designed for treatment, but not a cure, of some mutations that cause DMD Koszt terapii: $

11 Podobna strategia skuteczna w leczeniu rdzeniowego zaniku mięśni (SMA)

12 Lek powodujący przeskakiwanie egzonów bardzo skuteczny w terapii SMA rdzeniowego zaniku mięśni 24 grudnia 2016 r. Nusinersen (Spinraza) został dopuszczony do leczenia SMA w Stanach Zjednoczonych, a 30 maja 2017 r. również na obszarze Unii Europejskiej, stając się pierwszym zarejestrowanym lekiem na rdzeniowy zanik mięśni Nusinersen należy do klasy oligonukleotydów antysensowych (ASO). Jego działanie polega na modyfikacji splicingu genu SMN2, tak aby przejął funkcję uszkodzonego genu SMN1. Dzięki temu w komórkach neuronalnych może powstawać zwiększona ilość proteiny SMN. Fundacja SMA -

13 Terapia genowa SMA podanie wektora AAV z prawidłowym genem SMA Lek zarejestrowany przez FDA 24 maja 2019 roku Zolgensma (onasemnogene abeparvovec-xioi, AveXis Inc.) is an adenoassociated virus vector-based gene therapy that targets the cause of spinal muscular atrophy (SMA). ba18f31989d2%7d/fda-approves-first-gene-therapy-for-spinal-muscular-atrophyin-children

14 Strategie terapeutyczne w dystrofii mięśniowej Duchenne a 1. Terapia genowa przywrócenie ekspresji dystrofiny plasmid b. ograniczona ekspresja AAV microdystrofina próby kliniczne (obserwowana odpowiedź immunologiczna) 2. Exon skipping - Eteplirsen zarejestrowany w USA 3. Zwiększenie ekspresji utrofiny 4. Inhibitory miostatyny (miosatatyna hamuje wzrost mięśni) 5. Omijanie stop-kodonu przywrócenie ekspresji dystrofiny (w mutacjach punktowych) : - ataluren zarejestrowany w UE 6. Terapie przeciwzapalne, przeciwzwłóknieniowe 6. Terapia komórkowa transplantacja - mioblasty badania od lat 90tych nie wykazały skuteczności 14

15 Nie wszystko złoto co się świeci: czym są, a czym nie komórki macierzyste i co potrafią leczyć

16 Turystyka komórkowa - Stem cells tourism Badacze komórek macierzystych (International Society of Stem Cell Research) ostrzegają przed korzystaniem z usług instytucji oferujących kosztowne terapie na rozmaite choroby za pomocą komórek macierzystych

17 Turystyka komórkowa 351 businesses and 570 clinics selling non-fda approved stem cell therapies in USA. Turner & Knoepfler. Cell Stem Cell 2016; Oferty komercyjne także w Polsce proponowanie nieuzasadnionych naukowo terapii tzw. komórkami macierzystymi na liczne choroby UWAGA: komórki pomocne w jednej chorobie mogą być nie tylko nieskuteczne ale i niebezpieczne w innych

18 Olbrzymie oczekiwania rozbudzone nadzieje NEJM, 15 March 2017

19 Aspiryna jest bardzo dobrym lekiem, ale czy to oznacza, że może leczyć wszystkie choroby?

20 Zastosowanie komórek macierzystych Potwierdzone klinicznie zastosowanie komórek macierzystych: 1. Komórki hematopoetyczne (znajdują się w szpiku kostnym, także w krwi pępowinowej) w leczeniu chorób krwi (białaczki, niedobory odporności, anemie) - w leczeniu chorób spichrzowych (z prawidłowych komórek krwi rozwijają się komórki produkujące enzymy) 2. Komórki macierzyste nabłonka rogówki oka 3. Komórki macierzyste skóry

21 STRIMVELIS - połączenie terapii genowej i komórkowej w leczeniu ADA-SCID

22 Komórki rąbkowe regenerują rogówkę Registered in 2015 in Europe - limbal stem cell therapy, Holoclar, - to treat ocular burns. P. Rama (G. Pellegrini) et al., NEJM

23 z badaczami włoskimi współpracuje zespół prof. Edwarda Wylęgały ze Śląskiego Uniwersytetu Medycznego

24 Komórki macierzyste skóry Gojenie oparzeń Dr hab. Justyna Drukała, WBBiB UJ

25 Terapia genowa i komórkowa u dziecka z epidermolysis bullosa Izolacja komórek macierzystych skóry od chorego chłopca Wprowadzenie prawidłowego genu Lamininy-322 Namnożenie komórek i zróżnicowanie do komórek naskórka Hodowla skóry Nałożenie na ciało chorego chłopca 9 letni Hassan Hirsch T et al, Nature ,

26 Komórki macierzyste mięśni szkieletowych

27 Komórki satelitarne mięśni myszy komórki macierzyste contracting cell M.E. Danoviz & Z. Yablonka-Reuveni, 2012 Kozakowska et al., ARS, 2012 contracting cell Dulak i wsp.

28 Problemy z terapią z mięśniowymi komórkami macierzystymi Używanie komórek macierzystych w terapii wiąże się z problemami: - bariera odpornościowa między dawcą komórek a biorcą (pacjentem) organizm pacjenta odrzuca przeszczepione komórki, jeśli nie zastosuje się immunosupresji czyli hamowania odporności (tak jak w przypadku przeszczepów narządów) - różne genetycznie są także komórki od ojca/zdrowego brata - komórki satelitarne po izolacji trudno się hoduje, ulegają one szybkiemu różnicowaniu tracą wtedy właściwości terapeutyczne - komórki satelitarne/mioblasty muszą być podawane do mięśni, nie mogą być podawane systemowo (nie przechodzą przez ścianę naczyń krwionośnych - komórki satelitarne od pacjenta nadal nie posiadają prawidłowego genu dystrofiny

29 Problemy w terapii dystrofii mięśniowej Duchenne a Konieczność korekcji bardzo dużej masy tkankowej 40% masy ciała Zahamowanie odrzucenia przeszczepionych/zmienionych komórek (odpowiedź immunologiczna może być także przeciw dystrofinie) Rozmiar genu i bardzo wiele mutacji Problemem są nie tylko mięśnie szkieletowe, ale zwłaszcza mięśnie oddechowe oraz serce (poprawa funkcji mięśni szkieletowych przy braku wpływu na mięśnie oddechowe i serce może nawet pogorszyć stan zdrowia) Ograniczona dostępność komórek macierzystych mięśni szkieletowych Brak komórek macierzystych w sercu 29

30 Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (ipscs) Fibroblasty (np. ze skóry) K. Takahashi & S. Yamanaka, Cell, Aug 2006 ipscs Nagroda Nobla 2012 Sir John Gurdon & Shinya Yamanaka Stepniewski et al.,2015 Wszystkie typy komórek

31 Metoda uzyskiwania ipsc pozwala na otrzymanie nieograniczonego źródła komórek macierzystych pacjenta zdolnych do różnicowania do wielu typów komórek, w tym komórek mięśni szkieletowych oraz kardiomiocytów (komórek serca) Szansa na wykorzystanie w przyszłości w terapii DMD

32 komórki satelitarne/kardiomiocyty od pacjenta nadal nie posiadają prawidłowego genu dystrofiny Jak naprawić wadliwy gen?

33 Naprawa mutacji za pomocą CRISPR/Cas9 edycja genów Bardzo wydajne molekularne nożyczki

34 Edycja genów w terapii dystrofii mięśniowej Duchenne a Edycja genów może być bardziej efektywna niż przeskakiwanie egzonów być może wystarczy jednorazowe podanie; oligonukleotydy w exon skipping trzeba podawać stale MIT Technology Rev Nov/Dec E5CE89012ED43C4DBE72E5CE89012ED&&FORM=VRDGAR

35 Badania nad zastosowaniem edycji genu dystrofiny w celu naprawy mutacji i przywrócenia ekspresji tego białka są bardzo obiecujące u myszy a także u psów golden retriever Nie zostały jeszcze zastosowane u pacjentów z dystrofią mięśniową Duchenne a Tempo badań nad zastosowaniem systemu edycji genów CRIPSR/Cas9 oraz ipsc pozwala żywić nadzieję na opracowanie nowych metod leczenia DMD

36 Nasze badania nad dystrofią mięśniową Duchenne a oraz indukowanymi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi

37 Nasze projekty badawcze Prof. Józef Dulak Molekularne mechanizmy niewydolności serca w dystrofii mięśniowej Duchenne a i Beckera. (NCN-MAESTRO) Prof. Józef Dulak Rola oksygenazy hemowej-1 w różnicowaniu kardiomiocytów z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (HMOX-CARD), (NCN - HARMONIA), dr hab. Agnieszka Łoboda Zaburzenia angiogenezy w dystrofii mięśniowej Duchenne'a rola oksygenazy hemowej-1 i statyn (NCN OPUS) dr Agnieszka Jaźwa Rola oksygenazy hemowej-1 w zależnej od monocytów i makrofagów progresji choroby niedokrwiennej serca (NCN-SONATA BIS), mgr Mateusz Tomczyk - Odpowiedź odpornościowa w procesach przebudowy i regeneracji mięśnia sercowego w następstwie zawału. Rola makrofagów tkankowych i oksygenazy hemowej-1.(ncn-etiuda) mgr Mateusz Jeż - Rola rodziny mir-15, metabolizmu komórkowego oraz hipoksji w proliferacji kardiomiocytów pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (NCN - PRELUDIUM),

38 Oksygenaza hemowa-1 Stress Heme Nrf2, others O 2 NADPH HO-1 biliverdin NADP+ CO Fe 2+ BvR cgmp p38 bilirubin Anti-oxidant Cytoprotective Anti-inflammatory Angiogenesis Stem cells differentiation micrornas regulation ferritin HO-1 is encoded by Hmox1/HMOX1 Reviewed in : Dulak et al. Circulation 2008:, 117: & recent studies

39 Słabsza aktywność HO-1 może nasilać stan zapalny w dystrofii Encoded by Hmox1 Anti-inflammatory Anti-fibrotic Pro-angiogenic C57BL/6xFVBHO1-KO C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J treadmill test double KO mice (HO-1 -/- mdx) Distance [m] T Wydolność fizyczna * ** x /- x WT mdx HO-1 -/- HO-1 -/- mdx Activity [U/l] * Kinaza kreatyninowa * WT mdx HO-1 -/- HO-1 -/- mdx - Zapalenie mięśni mdx HO-1 -/- mdx K. Pietraszek-Gremplewicz et al. Antioxid Redox Signal 2018 Kozakowska et al., Amer J Pathol 2018

40 Zwiększenie aktywności oksygenazy hemowej-1 może pomóc w ograniczaniu upośledzenia mięśni związanego z dystrofią mięśniową Duchenne a (wpływ na komórki satelitarne, mięśnie, unaczynienie?)

41 Planujemy badania nad wykorzystaniem kardiomiocytów uzyskanych z ipsc do terapii niewydolności serca w DMD Badania planowane na myszach