DIAGNOSTYKA W MIKROBIOLOGII ŻYWNOŚCI

Transkrypt

1 DIAGNOSTYKA W MIKROBIOLOGII ŻYWNOŚCI PRZEWODNIK DO ĆWICZEŃ DLA STUDENTÓW II ROKU KIERUNKU MIKROBIOLOGIA (opracowanie: dr inż. Wioleta Chajęcka-Wierzchowska) KATEDRA MIKROBIOLOGII PRZEMYSŁOWEJ I ŻYWNOŚCI WYDZIAŁ NAUKI O ŻYWNOŚCI OLSZTYN 2017

2 DIAGNOSTYKA W MIKROBIOLOGII ŻYWNOŚCI KIERUNEK: MIKROBIOLOGIA ROK AKADEMICKI 2017/2018 ĆWICZENIE r. wt. Zasady organizacji laboratorium mikrobiologicznego. 1. Zasady pracy w laboratorium mikrobiologicznym fartuchy, obuwie, układ sali 2. Sylabus 3. Harmonogram ćwiczeń 4. Zakres kolokwium I: Mikroflora mleka i przetworów mleczarskich (mleko surowe, mleko pasteryzowane, UHT, mleko w proszku, sery, masło, śmietana) Rutynowe kierunki badan mikrobiologicznych mleka i produktów mlecznych Mikroflora mięsa i przetworów mięsnych (mięso świeże, mięso mielone, przetwory: kiełbasy, w ty dojrzewające, wędliny, wyroby garmażeryjne) Kierunki badań mikrobiologicznych mięsa i przetworów mięsnych. Przetwory owocowe, warzywne i owocowo-warzywne (konserwy) mikroflora, kierunki badań mikrobiologicznych Piwo, słód, drożdże piekarskie zanieczyszczenia mikrobiologiczne, metody badań. 5. Normy ISO, Rozporządzenie 2073 ĆWICZENIE r. czw. godziny rektorskie Kryteria bezpieczeństwa żywności. 1. Pobieranie próbek do badań Pierwszym etapem analizy mikrobiologicznej żywności jest pobranie i przygotowanie próbki do badań. Niewłaściwe pobranie próbki może prowadzić do uzyskania wyników fałszywie ujemnych bądź fałszywie dodatnich. Gdy mówimy o pobieraniu próbek, często używa się terminu próbka reprezentatywna. Próbka powinna odzwierciedlać obraz produktu, z którego pochodzi w sposób tak precyzyjny jak tylko jest to możliwe. Z produktów płynnych np. mleka dość łatwo jest pobrać próbkę reprezentatywną, jeśli mleko zostało wystarczająco wymieszane przed pobraniem próbki. Natomiast gdy jest badany produkt o dużej lepkości, z powolnym przepływem lub o niejednorodnej strukturze wówczas niezmiernie trudno jest ocenić jakość mikrobiologiczną całej partii (np. beczki lub ładunku samochodu) przez zbadanie tylko jednej 25 gramowej próbki. Odpowiedź na pytanie dotyczące wymaganej ilości próbek jednostkowych jest niezmiernie trudna. Z uwagi na wysokie koszty badań mikrobiologicznych, liczba próbek z reguły jest ograniczona. Do pobierania próbek w laboratorium mikrobiologicznym używa się sterylnych narzędzi np. łyżeczek, skalpeli, noży, szpatułek, pipet. Produkty które są zamrożone najpierw należy

3 odmrozić w temperaturze poniżej 5 C ( nie dłużej niż 12 godzin). Jeśli próby są głęboko mrożone do poboru stosuje się jałowe świdry. Oznaczanie Salmonella sp. w produktach żywnościowych zawsze polega na wykryciu obecności tych pałeczek w określonej ilości produktu (z reguły jest to 25g/ ml, bardzo rzadko 10g/ml), nie oznacza się natomiast liczby tych drobnoustrojów w żywności. Zarówno w metodzie klasycznej jak i jej modyfikacjach pierwszym etapem oznaczenia jest etap nieselektywnego namnażania. Jest on niezmiernie ważny ponieważ produkcja żywności wiąże się z jej obróbką technologiczną np. ogrzewaniem co może spowodować śmierć większości komórek lub ich subletalne uszkodzenie. Pominięcie etapu przednamnażania próbki i posiew materiału bezpośrednio na podłoże stałe może dać wyniki fałszywie negatywne. Jeżeli w badanym materiale jest bardzo mała liczba żywych komórek, bądź komórki zostały subletalnie uszkodzone podczas procesów technologicznych, możemy nie otrzymać widocznych makroskopowo koloni na podłożu stałym. W takim wypadku istnieje niebezpieczeństwo dopuszczenia produktu do obrotu, mimo, że nie spełnia on kryteriów bezpieczeństwa. Podczas przechowywania takiego produktu może nastąpić odbudowa uszkodzonych komórek i namnożenie bakterii do poziomu niebezpiecznego dla konsumenta. 2. Klasyczna metoda oznaczania pałeczek Salmonella w żywności Wykrywanie obecności pałeczek Salmonella zgodnie z Rozporządzeniem Komisji Europejskiej 2073/2005 przeprowadza się zgodnie z normą ISO Rozporządzenie wskazuje, że wykrywanie obecności pałeczek Salmonella w żywności powinno być przeprowadzane dla takich produktów jak: surowe mięso, produkty mięsne przeznaczone do spożycia na surowo, żelatyna, sery, masło, śmietana, niepasteryzowane mleko, mleko w proszku, jaja i produkty zawierające surowe jaja, skorupiaki, mięczaki, owoce i warzywa, soki niepasteryzowane, preparaty w proszku dla niemowląt i żywność dietetyczna specjalnego przeznaczenia medycznego. Norma ISO , obejmuje cztery etapy oznaczeń i w zależności od konieczności potwierdzeń trwa od 5 do 7 dni: 1. Przednamnażania w nieselektywnej pożywce płynnej 2. Namnażanie selektywne w pożywkach płynnych 3. Różnicowanie na pożywkach stałych 4. Badania potwierdzające (biochemiczne i serologiczne)

4 Rys. 1 Schemat postępowania przy oznaczaniu pałeczek Salmonella w żywności wg ISO W pierwszym etapie, w celu namnożenia i regeneracji komórek uszkodzonych prowadzi się hodowlę na płynnej wodzie peptonowej w temperaturze 37 C przez 18±2godz. Zbuforowana woda peptonowa stosowana jest w celu nieselektywnego namnażania pałeczek Salmonella sp. Dla takich produktów jak kakao czy wyroby z czekolady stosuje się wodę peptonową z dodatkiem kazeiny lub odtłuszczonego mleka oraz zieleni brylantowej w celu zahamowania wzrostu bakterii Gram-dodatnich. Dla produktów żywnościowych kwaśnych i ukwaszonych powinno się stosować wodę peptonowa o podwójnym stężeniu składników, natomiast dla mięsa i żywności o wysokiej zawartości tłuszczów przednamnażanie należy prowadzić w bulionie laktozowym z dodatkiem Triton X-100. Z hodowli po etapie przednamnażania nieselektywnego pobiera się 0,1cm 3 i posiewa do 10cm 3 pożywki selektywnej Rapaport-Vassiliadis z soją oraz do pożywki MKTTn w ilości 1 cm 3. Pożywka Rappaport-Vassiliadis (RVS) jest płynna, silnie selektywna, zawiera w swoim składzie zieleń malachitową i chlorek sodu (hamujące wzrost mikroflory

5 towarzyszącej). Pepton sojowy, ph 5,2 i podwyższona temperatura inkubacji (41,5 C) sprzyjają wzrostowi szczepów Salmonella. sp Podłoże ma barwę ciemnoniebieską i jest klarowne. Szczepy Salmonella sp. rosną na tym podłożu w postaci mlecznego osadu, barwa samego podłoża nie ulega zmianie. Druga pożywka selektywna: Müllera-Kauffmana (KKTTn), zawiera w swoim składzie tiosiarczan sodu i jodek potasu, które reagując tworzą związek o nazwie tetrationian sodu hamujący wzrost pałeczek grupy coli. Pałeczki Salmonella sp. mają zdolność do redukcji tego związku. W podłożu znajduje się także zieleń brylantowa, która z kolei hamuje wzrost bakterii Gram-dodatnich. Po inkubacji w temperaturze 37 C przez 48±3godz. hodowle posiewa się izolacyjnie na dwie pożywki selektywne, w sposób umożliwiający otrzymanie pojedynczych kolonii. Pierwszą z nich jest pożywka XLD (xylose lysine deoxycholate agar). Druga pozostaje do wyboru przez laboratorium i może to być podłoże BGA (brillant green agar), Hektoen lub Wilson-Blaira. Pożywka XLD (wg EN-ISO 6579 agar z ksylozą, lizyną i dezoksycholanem) zawiera laktozę, ksylozę, sacharozę, L-lizynę, tiosiarczan sodu, deoksycholan sodu, cytrynian amonowo-żelazowy (III), czerwień fenolową. Czynnikami różnicującymi pożywki są: laktoza, sacharoza, ksyloza, lizyna oraz tiosiarczan sodu, z którego uwalniany jest siarkowodór, tworzący w reakcji z solami żelaza (III) czarny osad siarczku żelaza w środku kolonii. Wskaźnikiem ph jest czerwień fenolowa. Pożywka pozwala określić zdolność do fermentacji cukrów. Inkubacja w temp. 37ºC przez 24±3 godz. Typowe kolonie mogą być bezbarwne, bardzo jasne, lekko błyszczące i przezroczyste (kolor podłoża) z czarno zabarwionym środkiem, otoczone jasnoczerwoną strefą i z żółtym brzegiem lub mieć zabarwienie od różowego do czerwonego, z czarnym środkiem lub bez czarnego środka. Szczepy Salmonella H 2 S-ujemne (np. S. Paratyphi A) są bezbarwne lub jasnoróżowe z ciemniejszymi środkami. Szczepy Salmonella laktozo-dodatnie rosną na pożywce XLD w postaci kolonii żółtych z charakterystycznym zaczernieniem lub bez takiego zaczernienia. Podłoże BGA. Czynnikami różnicującymi podłoża są cukry: sacharoza i laktoza. Czynnikiem selektywnym jest zieleń brylantowa Typowe kolonie są przezroczyste, bezbarwne lub lekko różowe, a barwa wokół kolonii zmieniona z różowej na jasnoczerwoną. Podłoże Hektoena. Czynnikiem selektywnym są sole żółci, hamujące wzrost bakterii Gram (+). Czynnikami różnicującymi są trzy cukry: laktoza, sacharoza oraz salicyna. Podwyższona zawartość laktozy nie pozwala na pominięcie bakterii fermentujących ten cukier z opóźnieniem. Kolonie bakterii tworzących siarkowodór mają czarny środek wskutek reakcji siarkowodoru z żelazem (III). Typowe kolonie pałeczek Salmonella sp. są barwy zielonej z lub bez czarnego środka. Podłoże Wilson-Blaira. Jest to podłoże silnie wybiórcze i różnicujące dla pałeczek Salmonella, w tym S. Typhi izolowanych z żywności. Pałeczki Salmonella spp. w zależności od szczepu rosną w postaci czarnych kolonii otoczonych strefą czarnego podłoża lub ciemnobrązowych i brązowych bez strefy. Cechą charakterystyczną dla kolonii Salmonella spp. jest metaliczna, połyskująca powierzchnia jako wynik produkcji siarkowodoru, tworzącego metaliczno-czarny osad w reakcji z jonami żelaza. Wzrost bakterii Gramdodatnich i innych Enterobacteriaceae w tym Shigella spp. jest silnie hamowany przez obecną w podłożu zieleń brylantową i siarczyn bizmutu.

6 Podłoże chromogenne Rambach-agar z deoksycholanem sodu, glikolem propylenowym i mieszanina chromogenną. Kolonie Salmonella sp. są barwy czerwonej w wyniku fermentacji glikolu; bakterie laktozododatnie z grupy coli, dzięki działaniu galaktozydazy niszczą wiązanie między składnikami mieszaniny chromogennej, a uwalniający się chromofor daje niebiesko-fioletowe lub niebiesko-zielone zabarwienie ich kolonii. Salmonella Typhi i Salmonella Paratyphi tworzą na tym podłoży kolonie bezbarwne lub żółtawe. Po 48godz. inkubacji w 37 C dokonuje się wstępnej identyfikacji na podstawie wyglądu kolonii wyrosłych na podłożach selektywnych. Z każdej płytki wybiera się 5 charakterystycznych kolonii i posiewa izolacyjnie na podłoże agar odżywczy, a następnie wykonuje się badania biochemiczne. W celu wykonania powyższych badań stosuje się testy biochemiczne wykonywane na następujących podłożach: Agar trójcukrowy z żelazem - podłoże TSI (Triple-sugar iron agar) z laktozą, sacharozą, glukozą, siarczanem żelaza III i czerwienią fenolową (wskaźnik zmiany barwy), na podłożu ocenia się zdolność do fermentacji cukrów (glukoza, laktoza, sacharoza) i tworzenia H 2 S oraz gazu Agar z mocznikiem wg Christiensena (wytwarzanie ureazy) podłoże zawiera ekstrakt drożdżowy, KH 2 PO 4, Na 2 HPO 4, mocznik, czerwień fenolową. Jeżeli po 24godz. hodowli nastąpiła zmiana barwy na amarantowy świadczy to o rozkładzie mocznika (obecność NH 4 OH) podłoże z lizyną (dekarboksylacja lizyny) w pożywce znajduje się także ekstrakt drożdżowy, glukoza i purpura bromokrezolową. Po zaszczepieniu podłoża, posiew należy zalać parafiną, po czym wstawić do inkubacji. Zawsze wykonujemy próbę kontrolną. Drobnoustroje podczas wzrostu zużywają glukozę, zakwaszając podłoże (zmiana barwy na żółtą), następnie zachodzi rozkład aminokwasów powodujący wtórną alkalizację i powrót do barwy fioletowej, podczas gdy próba kontrolna jest barwy żółtej. podłoże Clarka (reakcja Vogues-Proskauera-VP ora MR) podłoże zawiera glukozę i pepton. Celem wykonania próby VP i MR posiew wykonuje się do dwóch probówek z podłożem Clarka. Probówki na próbę VP inkubuje się 48 h, a probówki na próbę MR 72 h w temperaturze 37 C. podłoże peptonowe z tryptofanem (wytwarzanie indolu) zdolność do rozkładu aminokwasu aromatycznego: tryptofanu- po zaszczepieniu i inkubacji należy zbadać obecność indolu za pomocą odczynnika Kovacsa. Powstanie czerwonej obrączki świadczy o obecności indolu. wykrywanie β-galaktozydazy - służy do tego test krążkowy nasączony ONPG, który w obecności ß-galaktozydazy ulega rozszczepieniu do związku o barwie żółtej. Test wykonuje się w probówce zawierającej 0,1 cm 3 sterylnej wody, którą zaszczepia się odrobiną hodowli, a następnie umieszcza się tam krążek testowy i poddaje inkubacji. ß- galaktozydaza jest enzymem odpowiedzialnym za rozkład laktozy do glukozy i galaktozy. Interpretacja wyników biochemicznych: TSI słupek

7 - barwa żółta fermentacja glukozy, - barwa czerwona lub niezmieniona brak fermentacji glukozy, - barwa czarna wytworzenie siarkowodoru (powstały w hodowli siarkowodór reaguje z jonami Fe 2+ dając siarczek żelaza, który zaczernia podłoże, - pęcherzyki gazu lub rozerwanie słupka wytworzenie gazu z glukozy. skos - barwa żółta fermentacja laktozy i/lub sacharozy, - barwa czerwona lub niezmieniona brak fermentacji laktozy i/lub sacharozy A B C D E Laktoza/sacharoza (-) Glukoza (-) H 2 S (-) Gaz (-) Kontrola Laktoza/sacharoza (-) Glukoza (+) H 2 S (-) Gaz (-) Laktoza/sacharoza (+) Glukoza (+) H 2 S (-) Gaz (+) Laktoza/sacharoza (-) Glukoza (+) H 2 S (+) Gaz (-) Posiewając na podłoże TSI nie należy wkłuwać igły do dna probówki, ponieważ w przypadku reakcji dodatniej na siarkowodór (zaczernienie) utrudniony będzie odczyt fermentacji laktozy i sacharozy. Tabela. 1. Wyniki posiewów wybranych pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae na podłoże TSI.

8 podłoże wg Christensena; zmiana barwy pożywki na różowoczerwony lub amarantowy kolor świadczy o rozkładzie mocznika z uwolnieniem amoniaku, podłoże z lizyną, zmętnienie i purpurowe zabarwienie pożywki świadczy o dekarboksylacji lizyny wynik dodatni, podłoże Clarka: próba VP, po inkubacji dodać do hodowli po 2 krople roztworu kreatyny i KOH oraz 3 krople etanolowego roztworu α-naftolu. Wytworzenie różowego lub jasnoczerwonego zabarwienia pożywki w ciągu 15 min. w temp. pokojowej wskazuje wynik dodatni obecność acetoiny, która w środowisku alkalicznym, w obecności keratyny, przy dostępie tlenu, utlenia się do diacetylu. Diacetyl w obecności α-naftolu reaguje z guanina zawarta w peptonie, dając czerwone zabarwienie świadczące o próbie dodatniej VP. próba MR, po inkubacji dodać kroplę czerwieni metylowej. Czerwone zabarwienie na powierzchni świadczy o wyniku dodatnim podłoże z tryptofanem, po inkubacji dodać 1 cm 3 czerwonej obrączki świadczy o obecności indolu, odczynnika Kovacsa; powstanie

9 3. Testy API 20E Do określenia cech biochemicznych pałeczek Salmonella można także zastosować gotowe testy biochemiczne API 20E (Biomerieux) służące do identyfikacji bakterii z rodziny Enterobacteriaceae. Rys. 1. Wynik testu API 20E pozytywnego dla pałeczek Salmonella. Paski API 20 E składają się z 20 mikroprobówek zawierających odwodnione substraty. Integralną częścią testu API 20 E jest też test na oksydazę. Substraty zostają uwodnione poprzez dodanie zawiesiny bakterii. Uwodnione substraty stanowią również podłoża do hodowli bakterii. Procesy metaboliczne zachodzące podczas inkubacji powodują zmiany koloru, które są albo spontaniczne, albo wywołane przez dodanie odczynników. Lista testów znajdujących się na paskach API 20 E: ONPG test na zdolność rozkładu laktozy. Proces rozkładu laktozy wymaga kilku enzymów, w tym β-galaktozydazy. W teście ONPG używa się molekularnego wskaźnika: orto-nitrofenylo-β-d-galaktopiranozydu, który w przypadku obecności β-galaktozydazy spowoduje pojawienie się żółtego zabarwienia. ADH, LCD, ODC - testy badające zdolność do dekarboksylacji aminokwasów (lizyny, ornityny, argininy) w warunkach beztlenowych z wytworzeniem amin biogennych. Bakterie hoduje się na pożywkach zawierających badany aminokwas jako substrat, oraz barwnik wskazujący zmiany ph pożywki. Podczas hodowli drobnoustroje wykorzystują najpierw glukozę bardziej przyswajalne źródło węgla, a po jej zużytkowaniu, jeżeli wytwarzają odpowiednią dekarboksylazę, rozkładają aminokwasy. Wykorzystanie glukozy powoduje zakwaszenie hodowli i podłoże przyjmuje zabarwienie żółte, zaś wtórna alkalizacja środowiska w wyniku dekarboksylacji aminokwasu powoduje zmianę barwy na pomarańczowo-czerwoną. Podobny mechanizm zachodzi w przypadku testu na dihydrolazę argininy (ADH).

10 CIT test na wykorzystanie cytrynianu. Na podłożu z cytrynianem trisodowym, wyrastają bakterie zdolne do wykorzystania tego związku jako jedynego źródła węgla oraz jako źródła azotu jonu amonowego. Źródłem tego jonu w podłożu jest fosforan amonowy. Drobnoustroje poprzez uwalnianie amoniaku z fosforanu amonowego alkalizują środowisko, co w obecności wskaźnika błękitu btomotymolowego prowadzi do zmiany barwy podłoża na niebieską. H 2 S wytwarzanie siarkowodoru. H 2 S powstaje w wyniku rozkładu aminokwasów siarkowych. Enzym, który warunkuje ten proces sulfhydraza, hydrolizuje wiązania chemiczne pomiędzy grupą sulfhydrolową (- SH) a resztą aminokwasu. Uwolniona grupa SH zostaje zredukowana do H 2 S środowisku wzrostu bakterii. Wydzielany H 2 S wykrywa się poprzez jego reakcję z octanem ołowiu, podczas której wydziela się siarczek ołowiu o czarnym zabarwieniu. URE hydroliza mocznika. Mocznik jest rozkładany przez bakterie syntetyzujące ureazę. Produktami końcowymi tego rozkładu są NH 3 i CO 2. Właściwości te u bakterii badamy na podłożu zawierającym mocznik jako jedyne źródło azotu oraz indykator czerwień krezolową. TDA wytwarzanie amoniaku. Amoniak powstaje podczas deaminacji aminokwasów. Amoniak wykrywa się poprzez reakcję barwną z indykatorem dodanym do pożywki np. z odczynnikiem Nesslera (odczynnik jodowo-rtęciowy) tworzy on brunatne zabarwienie. IND rozkład tryptofanu próba na indol. Bakterie syntetyzujące enzym tryptofanazę rozkładają tryptofan z wytworzeniem indolu. Obecność indolu sprawdzamy traktując kulturę specjalnym odczynnikiem wywołującym reakcję barwną. VP próba Voges-Proskauera, służy do identyfikacji bakterii z rodziny Enterobacteriaceae, które prowadzą rozkład glukozy z wytwarzaniem wielu produktów pośrednich i końcowych: kwasów organicznych, etanolu, gazów CO 2 i H 2, a także acetoiny (produkt kondensacji dwóch cząsteczek kwasu pirogronowego) oraz 2,3 butandiolu. Produkty te są wytwarzane w różnych zestawieniach jakościowych i ilościowych u różnych gatunków bakterii (np. u E. coli kwasy organiczne są głównymi produktami a 2,3 butandiol wytwarzany jest w niewielkiej ilości. Obecność acetoiny (prekursor 2,3 butandiolu) w próbce decyduje o pozytywnej reakcji VP. Acetoinę wykrywa się poprzez dodanie alkoholowego roztworu α-naftolu, stężonego KOH i kreatyny, co w efekcie daje czerwone zabarwienie. GEL upłynnianie żelatyny. Bakterie wytwarzające enzym żelatynazę hydrolizują żelatynę z wytworzeniem rozpuszczalnych w wodzie peptydów. Upłynniona żelatyna nie krzepnie w temperaturze pokojowej. GLU, MAN, INO, SOR, RHA, SAC, MEL, AMY, ARA testy do badania zdolności drobnoustrojów do rozkładania węglowodorów (glukozy, mannozy, inozytolu, sorbitolu, ramnozy, sacharozy, melibiozy, amigdaliny, arabinozy). W podłoży stosuje się dodatkowe wskaźniki powodujące zmianę zabarwienia pod wpływem produktów rozkładu węglowodorów. OX test na oksydazę. Oksydaza cytochromowa jest enzymem końcowym układu oddechowego bakterii tlenowych i przenosi elektrony na tlen atmosferyczny z wytwarzaniem H 2 O. Test ten pozwala na różnicowanie bakterii na tlenowe i beztlenowe. Obecność oksydazy w bakteriach wykrywamy za pomocą odczynnika NADI

11 (chlorowodorek dimetylo-p-fenylodoaminy i α-naftolu). Powstanie fioletowego zabarwienia świadczy o dodatniej próbie. Testy przeprowadza się na organizmach wyizolowanych bezpośrednio z badanych prób. Poszczególne etapy obejmują: 1. Przygotowanie komory inkubacyjnej (pokrywki i podstawki) - na podstawkę nanieść ok. 5 ml wody destylowanej, w celu zapewnienia odpowiedniej wilgotności podczas inkubacji 2. Wyjąć pasek z opakowania i umieścić w komorze inkubacyjnej 3. Przygotować jednorodną zawiesinę bakterii poprzez pobranie pipetą pojedynczej kolonii i dodanie jej do probówki zawierającej 5 ml soli fizjologicznej 4. Przy pomocy tej samej pipety napełnić zawiesiną bakteryjną probówki na pasku (unikając tworzenia się pęcherzyków przy podstawie probówki, przechylając nieco pasek i umieszczając końcówkę pipety naprzeciw zagłębienia)dla testów CIT, VP i GEL napełnić zarówno probówkę jak i wgłębienie mikroprobówkidla innych testów napełnić jedynie probówkę (bez wgłębień) 5. Dla testów ADH, LCD, ODC, H 2 S i URE wytworzyć warunki beztlenowe poprzez naniesienie oleju mineralnego 6. Zamknąć komorę i inkubować w 36 o C przez h Jeśli 3 lub więcej testów (test GLU + lub -) jest pozytywnych zanotować wyniki wszystkich reakcji spontanicznych na karcie wyników a następnie odczytać testy wymagające dodania odczynników. W przypadku niektórych testów wymagane jest dodanie przed odczytem odpowiednich odczynników: TDA: dodać 1 kroplę odczynnika TDA (chlorek żelaza). Czerwono-brązowy kolor wskazuje na reakcję pozytywną co należy wpisać do karty wyników VP: dodać po 1 kropli z każdego odczynnika VP1 (α-naftol) i VP2 (KOH). Odczekać przynajmniej 10 min; różowy lub czerwony kolor wskazuje na reakcję pozytywną; jeśli po 10 min pojawi się blado różowy kolor, reakcję należy uznać za negatywną IND: dodać 1 kroplę odczynnika JAMES; różowy kolor powstający w całej probówce wskazuje na reakcję pozytywną Test INDOL należy wykonać na końcu, ponieważ w trakcie jego wykonania dochodzi do wytwarzania produktów gazowych, które wpływają na interpretację innych wyników na pasku. Plastikowa pokrywka inkubacyjna nie powinna być podnoszona po dodaniu odczynnika. W celu wykonania testu na oxydazę (OX) kroplę odczynnika (oksydazy) zakroplić bezpośrednio na kolonię na płytce Petriego; w przypadku pozytywnej reakcji nastąpi zmiana koloru na różowy w ciągu 1 minuty, następnie na niebieski i czarny; w przypadku reakcji negatywnej nie nastąpi zmiana zabarwienia kolonii.

12 Identyfikację bakterii uzyskuje się używając bazy danych z Książki Kodowej, poprzez odszukanie właściwego profilu numerycznego, lub przy pomocy oprogramowania komputerowego apiweb TM. Rys. 2. Negatywne wyniki testów API 20E Rys. 3. Pozytywne wyniki testów API 20E

13 Tabela 2. Tabela odczytu testu API 20 E (w oparciu o ulotkę informacyjną API 20E) TEST Aktywne składniki Stężenie mg Reakcje/Enzymy Wynik negatywny Wynik pozytywny ONPG 2-nitrofenylo-βD- 0,223 β-galaktozydaza (orto nitrofenylo βd- bezbarwny żółty (1) galaktopiranozyd Galaktopiranozyd) ADH L-arginina 1,9 dihydrolaza argininy żółty czerwony / pomarańczowy (2) LDC L-lizyna 1,9 dekarboksylaza lizyny żółty czerwono /pomarańczowy (2) ODC L-ornityna 1,9 dekarboksylaza ornityny żółty czerwono-pomarańczowy (2) CIT cytrynian trisodowy 0,756 wykorzystanie cytrynianu jasno szary /żółty niebiesko-zielony/niebieski (3) H 2 S Tiosiarczan sodowy 0,075 wytwarzanie H 2 S bezbarwny / szarawy czarny osad/ rozpłynięta linia URE Mocznik 0,76 ureaza żółty czerwono-pomarańczowy (2) TDA L-tryptofan 0,38 dezaminaza tryptofanu TDA/żółty natychmiast,czerwono-brązowy IND L-tryptofan 0,19 wytwarzanie indolu JAMES/bezbarwny natychmiast, różowy jasno zielony/ żółty VP pirogronian sodu 1,9 wytwarzanie acetoniny (VP) VP1 + VP2/bezbarwny 10 minut różowy/czerwony (5) GEL Żelatyna (wołowa) 0,6 żelatynaza brak dyfuzji dyfuzja czarnego pigmentu GLU D-glukoza 1,9 fermentacja/utlenianie (glukoza) (4) niebieski/niebiesku-zielony żółty/szaro-żółty MAN D-mannitol 1,9 fermentacja/utlenianie (mannitol) (4) niebieski/niebiesku-zielony żółty INO Inozytol 1,9 fermentacja/utlenianie (inoytol) (4) niebieski/niebiesku-zielony żółty SOR D-sorbitol 1,9 fermentacja/utlenianie (sorbitol) (4) niebieski/niebiesku-zielony żółty RHA L-ramnoza 1,9 fermentacja/utlenianie (ramnoza) (4) niebieski/niebiesku-zielony żółty SAC D sacharoza 1,9 fermentacja/utlenianie (sacharoza) (4) niebieski/niebiesku-zielony żółty MEL D-melibioza 1,9 fermentacja/utlenianie (melibioza) (4) niebieski/niebiesku-zielony żółty AMY Amigdalina 0,57 fermentacja/utlenianie (amigdalina) (4) niebieski/niebiesku-zielony żółty ARA L-arabinoza 1,9 fermentacja/utlenianie (arabinoza) (4) niebieski/niebiesku-zielony żółty OX Oksydaza oksydaza bezbarwny/żółty fioletowy (1) Nawet bardzo blady żółty kolor należy uznać za reakcję pozytywną. (2) Pomarańczowy kolor po h inkubacji należy uznać za negatywny. (3) Odczytu dokonać we wgłębieniu (warunki tlenowe). (4) Fermentacja zachodzi w najniższej części probówki, utlenianie we wgłębnej. (5) Słabo różowy kolor po 10 minutach należy uznać za negatywny.

14 W przypadkach wątpliwych prowadzi się testy dodatkowe: Redukcja azotanów do azotynów (NO 2 ) i gazowego azotu (N 2 ): dodać po 1 kropli z każdego odczynnika NIT 1 i NIT 2 do probówki GLU. Odczekać 2-5 minut. Czerwony kolor wskazuje na reakcję pozytywną (NO 2 ); reakcja negatywna (żółty) może być spowodowana redukcją do azotu (co czasami jest uwidaczniane przez pęcherzyki gazu); w celu weryfikacji należy dodać 2-3 mg odczynnika Zn do probówki GLU; po 5 min jeśli probówka pozostaje żółta wskazuje to na reakcję pozytywną (N 2 ), co należy zanotować w karcie wyników; jeżeli pojawia się kolor pomarańczowo-czerwony jest to wynik negatywny: azotany nadal występujące w probówce zostały zredukowane przez cynk. Serotypowanie Salmonella Dla szczepów bakterii, które na podstawie cech biochemicznych zostały zakwalifikowane do rodzaju Salmonella przeprowadza się testy serologiczne w celu wykrycia obecności antygenów somatycznych O, otoczkowych Vi i rzęskowych H. Badania wykonuje się metoda aglutynacji szkiełkowej na podstawie schematu antygenowego Kauffmanna- White a. Do oznaczania antygenów somatycznych powinno się stosować surowice poliwalentne i monowalentne, natomiast do wykrywania obecności antygenu Vi i H surowice anty-vi i anty H. Oznaczenie antygenów rzęskowych umożliwia określenie typu serologicznego badanych bakterii. Alternatywne metody oznaczania obecności Salmonella w żywności PCR łańcuchowa reakcja polimerazy (polimerase chain reaction) to enzymatyczna reakcja powielania cząsteczki DNA. Warunkiem krytycznym przebiegu PCR jest obecność enzymu, termostabilnej polimerazy DNA. Substratami reakcji są deoksyrybonukleotydy (cegiełki budujące nowo syntetyzowane cząsteczki DNA) oraz oligonukleotydy (startery), które komplementarnie przyłączają się do powielanej nici DNA. Reakcja łańcuchowa polimerazy jest procesem termicznym, z cyklicznie zmieniającymi się temperaturami. Na jeden cykl prowadzący do syntezy jednej kopii DNA z jednej cząsteczki matrycowej składają się etapy: denaturacji DNA (90-95 C), przyłączenia starterów (tzw. annealingu, C) i wydłużania nici. Reakcja w warunkach laboratoryjnych przeprowadzana jest w urządzaniu zwanym termocyklerem. Zazwyczaj w jednej reakcji PCR przeprowadza się cykli, których rezultatem jest powstanie kilku miliardów kopii pojedynczej cząsteczki DNA (w każdym cyklu ilość produktu przyrasta logarytmicznie). REAL-TIME PCR Ulepszeniem klasycznej metody PCR jest real-time PCR, czyli reakcja PCR obserwowana w czasie rzeczywistym. Termocykler realtime PCR posiada system optyczny, który cykl po cyklu zbiera informacje o przebiegu reakcji. Dodatkowym składnikiem reakcji real-time PCR są sondy TaqMan wyznakowane barwnikami fluorescencyjnymi. Sonda to oligonukleotyd zaprojektowany tak, aby wiązał się wysoce specyficznie z powielanym fragmentem DNA, a więc w przypadku omawianego zastosowania w mikrobiologii żywności wykrywał charakterystyczną dla szukanego patogenu sekwencję. Sonda powinna wiązać się specyficznie i silnie, co mogą zapewnić jej specjalne cząsteczki białkowe (cząsteczka MGB w sondach TaqMan Applied Biosystems).

15 Polimeraza, syntetyzując nową nić, przesuwa się po matrycy, napotykając na swojej drodze sondę. Dzięki aktywności egzonukleolitycznej enzym zaczyna odlepiać sondę od matrycy, a następnie ją niszczyć, uwalniając barwnik fluorescencyjny. System optyczny termocyklera wzbudza, a następnie odbiera świecenie barwnika, które z każdym cyklem staje się coraz intensywniejsze (logarytmiczny przyrost ilości produktu oznacza logarytmiczny przyrost stężenia uwalnianego barwnika). W efekcie jesteśmy w stanie w czasie rzeczywistym monitorować, czy mamy produkt reakcji. Czterdziestocyklowa reakcja real-time PCR trwa około 1,5 godziny, po dodaniu do tego czasu potrzebnego na wyizolowanie DNA z analizowanej próbki (do 30 minut) całość oznaczenia obecności bądź braku patogenu trwa 2 godziny (przy użyciu systemu Applied Biosystems TaqMan Pathogen Detection System). Próby do oznaczenia pobiera się z hodowli przednamnażających na zbuforowanej wodzie peptonowej po 18 godzinach inkubacji w temp. 37 C, tak więc sumarycznie czas od pobrania próbki do gotowego wyniku zamyka się w 24 godzinach. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ FISH Technika FISH polega na hybrydyzacji sekwencji rrna unieruchomionych komórek sondą oligonukleotydową 16S rrna znakowaną fluorescencyjnie. Sondy oligonukleotydowe SA krotkimi fragmentami kwasu deoksyrybonukleinowego, które hybrydyzuja, czy paruja się z komplementarnymi sekwencjami DNA lub RNA ekstrahowanymi z badanych drobnoustrojow. Paruja się one w ten sam sposób, jak formy dwuniciowego DNA (adenina z tymina i guanina z cytozyna). Jeżeli sekwencja zasad w sondzie DNA jest komplementarna do sekwencji charakterystycznej dla oznaczanego mikroorganizmu, sonda wiąże się jedynie z DNA identyfikowanego mikroorganizmu. Sondy najczęściej znakowane są na jednym bądź na obu końcach znacznikiem fluorescencyjnym. Sondy molekularne specyficznie wiążą się z rrna w rybosomach komórek docelowych, identyfikując je na różnych poziomach taksonomicznych. Rozwiązanie takie znacznie zwiększa czułość oznaczenia, gdyż rrna jest integralną częścią bakteryjnego rybosomu, wiec występuje w komórce w dużej liczbie kopii (od 1000 do 10000). Inną zaleta tego rozwiązania jest dostępność obszernej informacji odnośnie sekwencji rrna pochodzących od różnych często bardzo blisko genetycznie spokrewnionych mikroorganizmów, dzięki czemu możliwe jest otrzymywanie sond o bardzo wysokiej specyficzności. Ze względu na zakres specyficzności sondy wyróżnia się: sondy uniwersalne np. EUB338 (GCTGCCTCCCGTAGGAGT), nonsensowne, np. NON388 (CGACGGAGGGCATCCTCA) do wykrywania niespecyficznego wiązania sondy oraz sondy specyficzne, np. Sal3 (5 -AATCACTTCACCTACGTG-3 )dla Salmonella sp.. Sondy oligonukleotydowe 16S (23S) specyficzne dla Salmonella sp. m.in. można wyszukać w bazie danych probebase ( i literaturze. Wysoko specyficzne sondy można zaprojektować samodzielnie wykorzystując oprogramowanie ARB ( oraz bazy danych: Ribosomal Database Project II ( oraz probebase ( ecology.de/probebase/index.html). Specyficzność wybranych sekwencji względem gatunków bakterii z rodzaju Salmonella można sprawdzić in silico przy użyciu PROBE MATCH ( lub probecheck (

16 Metodą FISH z zastosowaniem fluorescencyjnie znakowanych sond oligonukleotydowych 16S rrna oznacza się liczbę tylko fizjologicznie aktywnych komórek, ponieważ okres półtrwania rrna jest krótszy niż DNA, co czyni rrna potencjalnie lepszym wskaźnikiem ich aktywności. W rybosomach szybko rosnących komórek znajduje się liczba kopii rrna, zwykle ponad 1000 co wystarcza do indukcji sygnału świetlnego po związaniu wyznakowanej sondy. Po śmierci komórki następuje rozpad rrna, a jego szybkość zależy, między innymi, od koncentracji enzymów - RNAz, a także od ciągłości błony cytoplazmatycznej. Komórki wolno rosnące lub metabolicznie nieaktywne, zawierające niewielką liczbę kopii rybosomów, emitują światło o słabym natężeniu. Nowe czulsze modyfikacje techniki FISH powodują amplifikację sygnału (TSA-FISH znany również jako CARD-FISH) stając się użytecznym narzędziem w rękach współczesnej mikrobiologii. Sondy oligonukleotydowe 16S rrna znakowane fluoroforami o zróżnicowanej masie cząsteczkowej (np. peroksydazą chrzanową 44 kda, fluoresceiną 330 kda) pozwalają na wizualną ocenę stopnia permeabilizacji ściany komórkowej na zasadzie różnicy w przenikaniu barwników do wnętrza komórki. Niezmiernie dużą zaletą techniki FISH jest możliwość wykrycia komórek VBNC (viable but not culturable), które nie dają wzrostu na podłożach stałych co powoduje, że metoda ta jest czulsza od metod płytkowych. Standardowa metodyka FISH obejmuje przygotowanie i permeabilizację komórek, hybrydyzację, wymywanie nadmiaru niezwiązanej sondy oraz detekcję sygnału z zastosowaniem mikroskopii fluorescencyjnej. Doniesienia na temat zastosowania techniki fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w badaniach żywności informują o możliwości jej aplikacji w tej dziedzinie i wskazują na tę metodę jako bardzo czułą, szybką i tanią. Jednak wnioski płynące z badań wskazują na konieczność ciągłego doskonalenia metodyki i doboru i/lub projektowania bardziej specyficznych sond. Związane to jest z różnorodnym składem chemicznym i mikrobiologicznym żywności (tzw. matrycą), który może prowadzić do błędów w odczycie. Dlatego dla stosunkowo szybkiej oceny jakości i bezpieczeństwa żywności potrzebny jest dobór nie tylko sond dla poszczególnych gatunków drobnoustrojów ale przede wszystkim zoptymalizowanie przygotowania prób żywności do badań w zależności od matrycy. Poprzez przygotowanie prób rozumie się odpowiednią filtrację i wirowanie przy różnych parametrach celem wyeliminowania dużych cząstek, a także dobór optymalnych warunków trawienia lub permeabilizacji ściany komórkowej drobnoustrojów (np. lizozymem, proteinazą K, achromopeptydazą, paraformaldehydem, etanolem itp.) występujących w badanej żywności. Właściwe przygotowanie próby i komórek uniemożliwia niespecyficzną absorpcję sondy do elementów komórkowych, oraz łatwiejszą penetrację cytoplazmy komórek. ĆWICZENIE r. - wt. Projektowanie analizy produktu z uwzględnieniem obowiązujących wymagań. Studium przypadków. Cz. I. Studium przypadków: 1. Mięso mielone, w toku produkcji

17 Pałeczki Salmonella nieobecne w 25g (kryterium higieny) E. coli 3,2x10 2 jtk/g (wytyczne branżowe) Liczba bakterii tlenowych mezofilnych: 6,7x10 7 jtk/g (wymagane przekroczony parametr) Proteus sp. 1,7x10 4 jtk/g (wytyczne branżowe) Gronkowce koagulazo-dodatnie: 4,3x10 7 jtk/g (trzeba zrobić enterotoksynę) Liczba grzybów: 2,3x10 2 jtk/g (zbędne oznaczenie) 2. Mięso mielone, pakowane próżniowo: Pałeczki Salmonella nieobecne w 10g (błąd, powinno być w 25g) E. coli 5,4x10 2 jtk/g (zbędne oznaczenie) Liczba bakterii tlenowych mezofilnych: 5,7x10 6 jtk/g (zbędne) Proteus sp. 2,7x10 4 jtk/g (wytyczne branżowe) Gronkowce koagulazo-dodatnie: 4,9x10 3 jtk/g Liczba grzybów: 2,3x10 2 jtk/g (Brak Listeria monocytogenes) 3. Mleko w proszku dla niemowląt na końcu procesu produkcyjnego Pałeczki Salmonella nieobecne w 10g (błąd, powinno być w 25g) E. Coli 5,2x10 2 jtk/g (zbędne oznaczenie) Rodzina Enterobacteriaeae 5,2x10 2 jtk/g (wyróżnik higieny) Liczba bakterii tlenowych mezofilnych: 3,7x10 5 jtk/g (niewymagane) Gronkowce koagulazo-dodatnie: 1,3x10 3 jtk/g (niewymagane) Liczba grzybów: 1,3x10 3 jtk/g (brak Cronobacter sakazakii) 4. Ser z mleka niepasteryzowanego gotowy do spożycia Pałeczki Salmonella nieobecne w 25g (kryterium higieny) E. coli 1,2x10 2 jtk/g (zbędne oznaczenie, wyróżnik higieny) Rodzina Enterobacteriaceae 3,2x10 2 jtk/g (zbędne oznaczenie) Liczba bakterii tlenowych mezofilnych: 6,8x10 5 jtk/g (niewymagane) Gronkowce koagulazo-dodatnie: 6,3x10 6 jtk/g (powinna być oznaczona enterotoksyna) Liczba grzybów: 7,1x10 3 jtk/g (wymagania branżowe) Listeria monocytogenes nieobecna w 10g (błąd, powinno być w 25g) 5. Ser z mleka niepasteryzowanego Pałeczki Salmonella nieobecne w 25g (kryterium bezpieczeństwa) E. coli 1,2x10 2 jtk/g (wyróżnik higieny) Rodzina Enterobacteriaceae 3,2x10 2 jtk/g (zbędne oznaczenie) Liczba bakterii tlenowych mezofilnych: 4,7x10 6 jtk/g (niewymagane) Gronkowce koagulazo-dodatnie: 6,3x10 6 jtk/g (powinna być oznaczona enterotoksyna, nie spełnia kryterium higieny) Liczba grzybów: 7,1x10 3 jtk/g (wymagania branżowe) Listeria monocytogenes nieobecna w 25g (niewymagane)

18 6. Lody w toku produkcji Pałeczki Salmonella nieobecne w 10g (niewymagane) Rodzina Enterobacteriaceae 5,8x10 3 jtk/g (wyróżnik higieny nie spełnia wymogów) Liczba bakterii tlenowych mezofilnych: 6,2x10 5 jtk/g Gronkowce koagulazo-dodatnie: 2,1x10 3 jtk/g Listeria monocytogenes nieobecna w 25g (niewymagane) 7. Owoce morza, żywe Pałeczki Salmonella nieobecne w 10g (błąd, powinno być w 25g) E. coli 2,2x10 2 jtk/g (kryterium bezpieczeństwa) Rodzina Enterobacteriaceae 3,5x10 2 jtk/g (niewymagane) Liczba bakterii tlenowych mezofilnych: 3,2x10 5 jtk/g (niewymagane) Gronkowce koagulazo-dodatnie: 3,8x10 3 jtk/g Student ma za zadanie: Określić czy odpowiednio dobrane są analizy mikrobiologiczne Czy poprawnie uwzględniono kryteria higieny lub/i kryteria bezpieczeństwa Czy nie brakuje jakichś analiz lub któreś są zbędne Czy produkt spełnia wymagania ustalone w Rozporządzeniu 2073 Przypadki do podziału dla zespołów 2 osobowych na kolejnych zajęciach głoszą seminarium) 1. Ser dojrzewający - wzdęty z białym nalotem (możliwe kierunki badań: Clostridia sacharolityczne, grupa coli - wzdęcie, pleśnie, drożdże - nalot) 2. Sałatka warzywna z majonezem w opakowaniu plastikowym wypukłe wieczko (możliwe kierunki badań: heterofermentatywne mlekowe, grupa coli, Clostridia sacharolityczne) 3. Mleko skondensowane, niesłodzone, UHT słodki skrzep (możliwe kierunki badań: Bacillus) 4. Masło - zjełczałe z czarnymi plamami (możliwe kierunki badań: Clostridia sacharolityczne pleśnie) 5. Wędlina pakowana próżniowo - kwaśny posmak i lekko wzdęte opakowanie (możliwe kierunki badań: mlekowe heterofermentatywne) 6. Sok jabłkowy pasteryzowany - zmętnienie, medyczny dezynfekcyjny zapach (możliwe kierunki badań: Alicyclobacillus) 7. Pieczywo - ciągliwość miękiszu, nitki śluzu o nieprzyjemnym zapachu (możliwe kierunki badań: Bacillus ) Student ma za zadanie: - rozpatrzyć przyczyny powstałych wad z uwzględnieniem poszczególnych etapów produkcji na których mogło dojść do powstania wad - wymienić grupy drobnoustrojów, które zamierza oznaczyć celem stwierdzenia przyczyny wad

19 - podczas odczytu wyników muszą zwrócić uwagę na fakt, że może zachodzić potrzeba wykonania schematycznego drzewka decyzyjnego (np. barwienie metodą grama, test na katalazę, oksydazę itd.) - zaprojektować tok przebiegu analizy z uwzględnieniem poboru prób, użytych podłoży, warunków inkubacji, sposobu odczytu i ewentualnych posiewów potwierdzających ĆWICZENIE r. czw. Projektowanie analizy produktu z uwzględnieniem obowiązujących wymagań. Studium przypadków. Cz. II seminarium. ĆWICZENIE r. - wt. Analiza mikrobiologiczna przetworów owocowych, warzywnych i warzywno-mięsnych. Cz. I Kolokwium I. ĆWICZENIE r. czw. Analiza mikrobiologiczna przetworów owocowych, warzywnych i warzywno-mięsnych. Cz. II odczyt wyników i posiewy potwierdzające. Poprawa kolokwium I. ĆWICZENIE r. - wt. Analiza mikrobiologiczna mięsa i przetworów mięsnych. Cz. I. Kolokwium II. ĆWICZENIE r. czw. Analiza mikrobiologiczna mięsa i przetworów mięsnych. Cz. II odczyt wyników i posiewy potwierdzające. Poprawa kolokwium II. ĆWICZENIE r. - wt. Analiza mikrobiologiczna mleka i produktów mlecznych. Cz. I. ĆWICZENIE r. czw. Analiza mikrobiologiczna mleka i produktów mlecznych. Cz. II odczyt wyników i posiewy potwierdzające ĆWICZENIE r. - wt. Raport końcowy z wyników badań. Zaliczenie końcowe.