ĆWICZENIE 5. Zastosowanie chromatografii cienkowarstwowej TLC w badaniach kryminalistycznych

Transkrypt

1 ĆWICZENIE 5 Zastosowanie chromatografii cienkowarstwowej TLC w badaniach kryminalistycznych 1. Część teoretyczna 1.1. Zagrożenia współczesnego świata Pierwsze wzmianki na temat przestępczości zorganizowanej sięgają już XIII wieku. Jednakże rozkwit działalności organizacji przestępczych nastąpił w XIX wieku kiedy to w Stanach Zjednoczonych, w styczniu 1920 roku wprowadzono ustawę, znaną także jako The Noble Experiment ( Szlachetny Eksperyment ) zakazującą sprzedaży, produkcji i transportu alkoholu na terenie całego kraju (Rysunek 1). Powszechnie obowiązująca prohibicja doprowadziła do rozprzestrzenienia się organizacji przestępczych i rozkwitu podziemnego handlu. Rysunek 1. Prohibicja w USA. Plakat kampanijny [1]. Wet's -The wets believed that the prohibition led to an increase of illegal activity and did not stop was it was created to prevent. -They wanted the 18 th amendment to be repealed. - People who were on the wet side included many congressmen, men, and people living in the city. Dry s -They believed that the prohibition was good for America and benefited America greatly because men were bringing their paychecks home and there was less abuse. -People who were on the dry side included many women (because of the abuse caused by alcohol) and rural area populations Dzisiaj, obszary zdominowane przez przestępczość zorganizowaną to głównie: handel kradzionymi samochodami, przemyt papierosów i alkoholu, przestępcza działalność gospodarcza, kontrola lokali rozrywkowych, agencji towarzyskich, kasyn oraz produkcja i handel narkotykami. 1

2 W ostatnich latach, w odpowiedzi na systematycznie wzrastający popyt na substancje narkotyczne podaż preparatów psychoaktywnych uległa znacznemu zwiększeniu. Na rynku pojawiają się zarówno substancje uzależniające jak i narkotyki syntetyczne pochodzące z nielegalnych źródeł. ferowane używki oprócz często bardzo słabej jakości i niskiej czystości cechuje duża różnorodność, a ich właściwości psychoaktywne są słabo poznane. Konsekwencją użytkowania słabo poznanych substancji chemicznych są coraz częściej notowane przypadki śmiertelne wśród nabywców substancji niewiadomego pochodzenia, a także przypadki niekontrolowanych zachowań (nadmierne pobudzenie, zachowania agresywne, także akty samoagresji) Profilowanie narkotyków gólnym celem profilowania jest identyfikacja substancji jednocześnie wytworzonych (pochodzących z tej samej partii) lub pochodzących z tego samego źródła (miejsca nielegalnej produkcji). Profilowanie narkotyków oznacza zespół czynności analitycznych mających na celu określenie źródła pochodzenia próbki na podstawie min. cech fizykochemicznych próbki narkotyku oraz oznaczenia składu ilościowego i jakościowego zanieczyszczeń występujących w próbce. Skład jakościowy i ilościowy zanieczyszczeń może posłużyć do wskazania pochodzenia próbki bazując na niewielkich nawet różnicach w jakości i ilości użytych reagentów i rozpuszczalników, warunkach prowadzenia reakcji, obecności produktów pośrednich, rodzaju użytego sprzętu laboratoryjnego, rodzaju zastosowanych technik oczyszczania, warunków higienicznych panujących w wytwórni, nawyków osoby zajmującej się syntezą, czy wreszcie transportu, konfekcjonowania i dystrybucji narkotyków. Profilowanie narkotyków może zatem prowadzić do określenia czy badane próbki pochodzą z tego samego laboratorium, czy zostały wyprodukowane w tym samym procesie technologicznym (w jednej partii) lub też mogą wskazywać na ewentualny brak powiązań badanych próbek. Za podstawę porównywania próbek służy profil zanieczyszczeń w postaci np. chromatogramu lub widma mas dostarczający informacji o rodzaju i ilości zanieczyszczeń obecnych w próbce. Całkowite podobieństwo profilu zanieczyszczeń określane jako identyczne wskazuje na to samo źródło pochodzenia próbki. Informacje zawarte w profilu zanieczyszczeń mogą służyć organom śledczym do stworzenia siatki powiazań pomiędzy producentami, dystrybutorami i konsumentami produktów psychogennych. Uzyskane profile narkotyków podlegają archiwizacji stwarzając podstawy do działań długoterminowych oraz współpracy organów ścigania na całym świecie. Globalna współpraca laboratoriów kryminalistycznych pozwala na wskazanie pochodzenia danego narkotyku także w odniesieniu do regionu świata oraz określenie jego drogi przemytu. Może także posłużyć do przypisania procederu do konkretnej grupy przestępczej oraz do oszacowania skali działalności danej grupy (Rysunek 2). Rysunek 2. Przykładowy sprzęt laboratoryjny skonfiskowany w nielegalnym laboratorium. 2

3 Z punku widzenia profilowania, szczególnie jeśli chodzi o narkotyki syntetyczne, ważne jest określenie tzw. markerów (znaczników) wskazujących na metodę syntezy, ewentualne powiązanie próbek ze względu na metodę i warunki prowadzonej syntezy oraz na miejsce ich pochodzenia. Przy tego rodzaju porównaniach uwzględnia się zarówno skład organiczny, jak i nieorganiczny próbek. Wyróżnia się trzy grupy związków potencjalnie profilujących próbkę, z czego za najważniejsze (tzw. markery) uważa się grupę pierwszą oraz drugą. Grupa 1 Substancje naturalnie współobecne w narkotykach pochodzenia naturalnego takich jak opium czy heroina lub w narkotykach półsyntetycznych kodeina, noskapina, papaweryna. oraz zanieczyszczenia prekursorów (substratów) i rozpuszczalników np. acetofenon - zanieczyszczenie benzylometyloketonu prekursora amfetaminy Grupa 2 Produkty reakcji ubocznych t.j. acetylokodeina, 6-monoacetylomorfina, acetylowe pochodne alkaloidów opium w heroinie, N-formyloamfetamina czy fenylometylopirydyny - zanieczyszczenia charakterystyczne dla syntezy amfetaminy metodą Leuckarta. Grupa 3 Wypełniacze wprowadzane do produktów po syntezie, na etapie konfekcjonowania narkotyków. Substancje nie wykazujące działania biologicznego- rozcieńczalniki np. skrobia, cukier Substancje wykazujące działanie biologiczne np. kofeina, prokaina 1.3. Procedura profilowania narkotyków 1. Badanie fizyczne - ocena cech fizycznych próbki narkotyku: a. postać, b. kolor, c. zapach. 2. Badanie chemiczne: a. identyfikacja i oznaczenie ilościowe głównego składnika, b. analiza domieszek (rozcieńczalników i dodatków), c. profilowanie zanieczyszczeń. Badanie fizyczne jest bardzo ważnym, silnie różnicującym etapem wstępnym profilowania narkotyków, podczas którego grupuje się próbki według cech wspólnych (Rysunek 3). Dużą wagę przywiązuje się do: sposobu konfekcjonowania narkotyków, znakowania producenta (logo), oraz rodzaju opakowania. 3

4 Rysunek 3. Przykładowy sposób konfekcjonowania narkotyków syntetycznych (znakowanie, formowanie, zabarwianie itp.). Informacje uzyskiwane w trakcie oceny wizualnej stanowią znaczące źródło wiedzy na temat pochodzenia materiału przestępczego. Producenci kokainy, haszyszu, narkotyków konfekcjonowanych w postaci tabletek często bowiem znakują swój towar tzw. znakiem firmowym (np. napis Rolling Stones, znaki: ptak, kot, sierp i młot, ryba itd.). Procedura ta służy wyrobieniu marki i rozpoznawalności na rynku narkotykowym. Wśród badań fizycznych dokonuje się także oceny kształtu, koloru, masy i znaków szczególnych przechwyconych używek. Zgromadzone na podstawie badania fizycznego dane podlegają procedurze katalogowania (np. w Narodowym Laboratorium Kryminalistycznym W Szwecji) i udostępniane są właściwym służbom w celu ustalenia lub uprawdopodobnienia źródła pochodzenia narkotyku. Badanie chemiczne, z kolei, skupia się na profilowaniu zanieczyszczeń obecnych w próbkach narkotyków. bok zanieczyszczeń organicznych ocenia się także obecność związków nieorganicznych. Te ostatnie mogą być wykorzystywane do syntezy jako regulatory ph, związki suszące, katalizatory (np. H 2 S 4, HCl, NaH, KH, CaCl 2 ). Ich obecność jest swoistym odciskiem palca wskazującym na pochodzenie materiału przestępczego, wskazując laboratorium (stopień czystości narkotyku, użyte reagenty, rozpuszczalniki, stosowaną aparaturę, warunki higieniczne panujące w laboratorium, techniki osuszania próbki, jakość wody używanej w procesie technologicznym itp.) czy też partię narkotyku. Badanie chemiczne przeprowadza się w trzech etapach. W pierwszym dokonuje się identyfikacji składnika głównego i przeprowadza się jego analizę ilościową. W drugim etapie ocenia się zawartość domieszek obecnych w próbce zarówno pod katem ilościowym jak i jakościowym. Na koniec, na podstawie danych eksperymentalnych oraz informacji uzyskanych z baz danych dokonuje się profilowania narkotyku, oceniając stopień podobieństwa profili zanieczyszczeń (Tabela 1) wiążąc daną próbkę z grupą przestępczą i ewentualnym konsumentem lub grupą konsumentów. 4

5 Tabela 1. Stopnie podobieństwa profili zanieczyszczeń porównywanych próbek. Lp. Stopień podobieństwa Interpretacja Próbki pochodzą z tej samej partii narkotyku, 1 Bardzo duże podobieństwo otrzymanej w jednej serii produkcyjnej 2 Duże podobieństwo Próbki prawdopodobnie pochodzą z tej samej partii narkotyku, ale istnieją niewielkie różnice w profilach wskazujące na możliwość pochodzenia z różnych partii materiału 3 Podobny podstawowy skład z wyraźnymi różnicami w chromatogramach Próbki otrzymano w podobnych warunkach, prawdopodobnie w tym samym laboratorium, ale w różnych seriach 4 Różnice w podstawowym składzie 5 Brak podobieństwa Próbki otrzymano w różnych laboratoriach, ale tą samą metoda syntezy Próbki otrzymano różnymi metodami 1.4. Badanie chemiczne 1. Ekstrakcja W celu wyodrębnienia poszczególnych substancji z materiału profilowanego w pierwszym etapie badania przeprowadza się procedurę ekstrakcji stosując jedną z technik ekstrakcyjnych właściwą dla rodzaju i wielkości próbki: ekstrakcja ciecz-ciecz (LLE, Liquid-Liquid Chromatography), ekstrakcja do fazy stałej (SPE, Solid Phase Extraction) lub mikroekstrakcję do fazy stałej (SPME, Solid Phase Microextraction). 2. Analiza instrumentalna Analiza związków organicznych obecnych w badanej próbce odbywa się z zastosowaniem dedykowanych technik chromatograficznych. Na początku, standardowo, dokonuje się rozdział badanej próbki na poszczególne frakcje, a następnie odbywa się detekcja poszczególnych składników z jednoczesną oceną jakościową oraz ilościową. Badanie prowadzi się przy użyciu jednej z poniższych technik: chromatografia gazowa sprzężona ze spektrometrią mas (GC/MS), chromatografia gazowa z detektorem płomieniowo jonizacyjnym (GC/FID), chromatografia cieczowa sprzężona ze spektrometrią mas (LC/MS), wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC), chromatografia cienkowarstwowa (TLC). 3. Klasyfikacja i porównanie narkotyków z wykorzystaniem algorytmów statystycznych Jedną z metod porównawczych stosowanych rutynowo w laboratoriach kryminalistycznych jest porównanie chromatogramów próbek. W tym celu dokonuje się wyboru kilku obecnych zarówno na chromatogramie próbki jak i wzorca pików. Dokonuje się ich integracji, a następnie ocenia wzajemne relacje ilościowe powierzchni pików. Przyjmuje się, że dla próbki 5

6 pochodzącej z tej samej partii materiału, przy założeniu 5% tolerancji, wystarczająca jest zgodność powierzchni 8 pików. Metoda ta znajduje zastosowanie dla próbek o stosunkowo wysokim stopniu zanieczyszczenia. Dla próbek czystych lub bardzo czystych, stosuje się metodę współczynnika korelacji liniowej (Równanie 1) Współczynnik zawiera się w przedziale <-1;1>. Współczynnik większy od 0.8 wskazuje na wysokie podobieństwo porównywanych chromatogramów. Równanie 1. Współczynnik korelacji liniowej. r XY = n i=1 (x i x )(y i y ) ( n i=1 (x i x ) 2 n )( (y i y ) 2 ) i=1 gdzie: x i, y i pola powierzchni analogicznych sygnałów na chromatogramie próbki i wzorca Co może zawierać próbka czarnorynkowego narkotyku (Tabela 2.)? Często wynik składu zaskakuje specjalistów. Trzeba mieć świadomość, że na czarny rynek nigdy nie trafia proszek, który jest 100% narkotykiem. Najczęściej mamy do czynienia z substancją rozcieńczoną. Sprzedaż czystej substancji aktywnej byłaby po prostu nieopłacalna. Szacuje się, że średnia zawartość substancji narkotycznej w towarze dostępnym na czarnym rynku to około 10-15%. Jednakże, coraz częściej spotyka się i partie, które zawierają jedynie 5% narkotyku. Co zatem ukrywa się pod pozostałymi procentami próbki? Moda na dopełniacze zmienia się. Kilka lat temu podstawowymi wypełniaczami były glukoza, sacharoza bądź skrobia. Trochę później rynek zdominowała kreatyna - kwas β-metyloguanidynooctowy (suplement stosowany przez sportowców na przyrost masy i siły). Biały proszek, który bardzo uatrakcyjnia wygląd narkotyku, stwarzając pozory substancji o wysokiej czystości. Bywa, że narkotyk wzbogacany jest o kofeinę, ale także i gips. Dodatek kofeiny powoduje, że już i tak niebezpieczny dla zdrowia narkotyk wspomagany jest jeszcze substancją o działaniu silnie pobudzającym czego konsekwencje mogą być trudne do przewidzenia. Na długiej liście potencjalnie obecnych substancji w mieszance narkotykowej można wymienić leki przeciwzapalne np. paracetamol, ibuprofen; także kwaśny węglan sodu (znany jako proszek do pieczenia), pseudoefedrynę i laktozę. Pomysłowość grup przestępczych nie zna ograniczeń. Tabela 2. Potencjalne wypełniacze próbek narkotyków. Amfetamina 6

7 (C 9 H 13 N) 2 H 2 S 4 Siarczan(VI) amfetaminy (+)-Pseudoefedryna (konfiguracja 1S,2S) (R)-Ibuprofen Paracetamol Soda oczyszczona (proszek do pieczenia) 7

8 Kofeina Glukoza CaS 4 2H 2 Gips Laktoza Kreatyna 8

9 1.5. Chromatografia Chromatografia to technika rozdziału mieszanin na substancje składowe w celu analizy, identyfikacji, oczyszczenia lub oznaczenia ilościowego mieszaniny lub jej składników. Termin "Chromatografia" pochodzi od dwóch greckich słów chrōma (kolor) i gráphō (piszę) i oznacza pisanie kolorem. Twórcą tej techniki jest rosyjski botanik Michaił Cwiet (1906), który opracował ją do różnicowania substancji występujących w chlorofilu. Chromatografię można podzielić na dwa rodzaje planarną i kolumnową (Schemat 1). Schemat 1. Podział technik chromatograficznych w zależności od sposobu przeprowadzenia rozdziału. Bibułowa Planarna TLC Chromatografia Gazowa Kolumnowa Cieczowa Chromatografia cienkowarstwowa (TLC, Thin Layer Chromatography) Chromatografia cienkowarstwowa, lub TLC, jest metodą rozdziału mieszanin, która polega na partycji substancji składowych mieszaniny pomiędzy fazę ruchomą i stacjonarną. TLC może służyć do określania liczby składników mieszaniny, tożsamości związków, a także ich czystości. TLC znajduje także zastosowanie w syntezie organicznej, jako proste narzędzie do śledzenia postępu reakcji poprzez obserwację zaniku śladów substratów lub pojawienie się śladów powstającego produktu. Technika ta charakteryzuje się wysoką czułością w zakresie mikrogramów ( g) i zajmuje niewiele czasu (około 5-10 minut. TLC wykonywane jest przy użyciu cienkich arkuszy ze szkła, aluminium lub z tworzyw sztucznych, powlekanych warstwą fazy stacjonarnej, zwykle żelu krzemionkowego, ale także tlenku glinu, poliamidu, celulozy lub wymieniacza jonowego. becność grup polarnych krzemionki (Rysunek 4) zapewnia możliwość separacji polarnych i niepolarnych materiałów przy użyciu rozpuszczalników niepolarnych lub mieszanych. Gotowe arkusze TLC są dostępne komercyjnie. Rysunek 4. Struktura cząsteczki żelu krzemionkowego (Si 2 H 2 ) n. H H H Si Si Si Si Si Si 9

10 Przebieg analizy TLC TLC przebiega w następujących etapach: 1. Naniesienie próbki na fazę stacjonarną, 2. Rozwinięcie chromatogramu, 3. Wizualizacja chromatogramu, 4. znaczenie składników próbki. Etap 1. Naniesienie próbki Próbki należy rozpuścić w stosunkowo lotnych rozpuszczalnikach (0,5 do 5mL) tak, żeby plamy nie rozprzestrzeniały się nadmiernie (3-4 mm średnicy). Następnie za pomocą kapilary aplikuje się próbkę na powierzchnię płytki, około 1 centymetr powyżej dolnej krawędzi płytki. Roztwory muszą być nanoszone ostrożnie, tak aby zminimalizować rozmywanie się porcji (plamki) analitu. Lepiej aplikować kilkakrotnie małe porcje niż ryzykować powstanie dużej plamy. ptymalna Ilość analitu nanoszonego na płytkę wynosi od 0,1 mg do 50 mg. Mniejsze ilości są trudne do obserwacji, większe natomiast powodują nieczytelność wyniku. Etap 2. Rozwinięcie chromatogramu Płytka z naniesionymi analitami umieszczana jest w komorze chromatograficznej, w której znajduje się odpowiednia ilości rozpuszczalnika lub mieszaniny rozpuszczalników (fazy ruchomej). Komora powinna być zamknięta, aby zapewnić równomierne wypełnienie jej oparami rozpuszczalnika. Płytkę, sprawnym ruchem, zanurzamy w rozpuszczalniku. Poziom rozpuszczalnika musi znajdować się poniżej miejsca naniesienia próbki. W wyniku działania sił kapilarnych faza ruchoma wędruje w górę płytki. Jest to proces rozwijania chromatogramu, który trwa od 3 do 60 minut. Etap 3. Wizualizacja chromatogramu W wyniku oddziaływania substancji analitu z adsorbentem oraz z wstępującym rozpuszczalnikiem następuję rozdzielenie się składników próbki na płytce. Na skutek rozdziału, poszczególne składniki tworzą oddzielne plamki. Jeśli substancja posiada grupę chromoforową w zakresie widzialnym samoistnie uwidacznia się ona na płytce. Jeśli natomiast analit wymaga wywołania, korzysta się z odczynników chemicznych tworzących barwne substancje z analitem lub też ogląda się płytkę pod lampą UV, aby uwidocznić substancje wykazujące właściwości fluorescencyjne pod wpływem tegoż promieniowania. Etap 4. znaczanie składników próbki Podstawowym parametrem w TLC, który określa położenie substancji na chromatogramie, jest współczynnik opóźnienia R f. Jest to stosunek drogi migracji substancji (a) do drogi przebytej przez fazę ruchomą (b) (Równanie 2). Równanie 2. Współczynnik opóźnienia. R f = a b 10

11 Współczynnik ten przyjmuje wartości od 0 do 1 i służy do identyfikacji substancji, ponieważ jest charakterystyczny dla danej substancji w danych warunkach chromatograficznych (Rysunek 5). Rysunek 5. Sposób wyznaczania współczynnika opóźnienia R f. Jeżeli dana substancja ma tę samą wartość współczynnika retencji co substancja wzorcowa, w tych samych warunkach chromatograficznych, to można założyć, że substancje te są identyczne (Rysunek 6). Rysunek 6. Przykładowy chromatogram. Związek A Mniej polarny Związek B Bardziej polarny 2. Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z metodą profilowania narkotyków oraz techniką chromatografii cienkowarstwowej jako prostego narzędzia przesiewowego do zastosowania w laboratorium kryminalistycznym. W ćwiczeniu określony zostanie także wpływ ph na wydajność ekstrakcji ciecz-ciecz z próbki narkotyku Wykonanie ćwiczenia I. Ekstrakcja próbek 1. Z próbek I i II otrzymanych od laboranta odważyć do fiolek o obj. 5 ml po dwie naważki po 200 mg każda (w sumie 4 próbki). 11

12 A I B I A II B II 2. Próbki A I i A II rozpuścić w 2 ml roztworu buforowego o ph = 7, pozostałe dwie B I i B II w 2 ml roztworu buforowego o ph = Roztwory wytrząsać na wytrząsarce przez około 30 minut. 4. Następnie do każdej probówki dodać 200 µl n-heksanu. 5. Wytrząsać przez kolejne 30 minut. II. Analiza TLC 1. Przygotować 20 ml mieszaniny chloroform/metanol o następujących stosunkach objętościowych: 1/1, 2/1, 9/1. 2. Przygotować 3 płytki oraz 3 komory chromatograficzne (zlewka 150 ml ze szkiełkiem zegarkowym). 3. W odległości 1 cm od linii startu nanieść na płytki chromatograficzne plamki analitów. 4. Umieścić płytki w komorach chromatograficznych. 5. Rozwinąć chromatogram. Wyjąć płytkę i pozostawić na powietrzu do wyschnięcia. 6. Wywołać płytkę pod lampą UV zaznaczając plamki ołówkiem. 7. Wygrzać płytkę przez około 20 minut za pomocą suszarki i ponownie obejrzeć pod lampą UV pracowanie wyników 1. Wyznaczyć współczynnik R f dla poszczególnych plamek. 2. Dokonać wyboru najlepszej fazy rozwijającej. Wybór uzasadnić. 3. mówić i uzasadnić różnice w profilach otrzymanych po ekstrakcji z roztworów buforowych o różnym ph. 4. mówić różnice występujące w próbkach I i II. Literatura [1.] [2.] Tomasz Kunda Profilowanie fenyloacetonu (BMK), Problemy Kryminalistyki 260 (kwiecień czerwiec) 2008 [3.] Krawczyk W.: Nielegalne laboratoria narkotykowe, Wyd. CLK KGP, Warszawa 2005 [4.] [5.] Mikroślady i ich znaczenie w postępowaniu przygotowawczym i sądowym, Wyd. Instytutu Ekspertyz Sądowych, Kraków 2015, Pod redakcją J. Zięby-Palus [6.] I. Sołtyszewski (red.), Badania kryminalistyczne (wybrane aspekty), lsztyn 2007 [7.] M. Goc, J. Moszczyński (red.), Ślady kryminalistyczne. Ujawnianie, zabezpieczanie, wykorzystanie, Warszawa