(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 14/09 EP B1 (13) (1) T3 Int.Cl. C12N 1/ (06.01) A61K 3/74 (06.01) C12R 1/2 (06.01) (4) Tytuł wynalazku: LACTOBACILLUS FERMENTUM ESS-1, DSM1781 I JEGO ZASTOSOWANIE DO LECZENIA I/LUB ZAPOBIEGANIA KANDYDOZIE I ZAKAŻENIOM DRÓG MOCZOWYCH () Pierwszeństwo: (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 09/33 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 14/08 (73) Uprawniony z patentu: SCA Hygiene Products AB, Göteborg, SE (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 ULRIKA HUSMARK, Mölnlycke, SE ULLA FORSGREN BRUSK, Pixbo, SE EVA GRAHN HÅKANSSON, Umeå, SE DANIEL RÖNNQVIST, Umeå, SE (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Katarzyna Rudnicka SULIMA-GRABOWSKA-SIERZPUTOWSKA BIURO PATENTÓW I ZNAKÓW TOWAROWYCH SP.J. skr. poczt Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 SGS-028/VAL EP B1 Opis 3 4 Dziedzina wynalazku [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy dziedziny bakterii probiotycznych wywierających korzystny wpływ na zakażenia drożdżakiem Candida, tj. kandydozę i zakażenia bakteryjne. Wynalazek dotyczy także kompozycji farmaceutycznych i produktów do higieny osobistej zawierających takie bakterie oraz medycznego zastosowania takich bakterii. Tło wynalazku [0002] Zwykła flora w okolicy moczowo-płciowej stanowi złożony ekosystem obejmujący ponad 0 różnych gatunków bakterii (Hill i in., Scand. J. Urol. Nephrol. 1984(86 (suppl.)):23-29). W normalnej florze dominują bakterie należące do rodzaju Lactobacillus (LB), które są Gram dodatnimi pałeczkami przystosowanymi do środowiska pochwy płodnej kobiety. Te bakterie także przyczyniają się do utrzymania swoistego środowiska i równowagi ekologicznej w pochwie. W pochwie otaczające ph jest niższe od 4,. Drożdżaki i enterobakterie występują w niewielkiej liczbie lub nie występują w ogóle (Redondo-Lopez i in., Rev. Inf. Dis. 1987(12):86-872). [0003] Niektóre szczepy LB hamują wzrost potencjalnie patogennych bakterii w różnych mechanizmach. Przemiana materii LB prowadzi do powstawania kwasów organicznych, w szczególności kwasu mlekowego i kwasu octowego, które przyczyniają się do niskiego ph płynu pochwowego, które jest niekorzystne dla wielu innych gatunków drobnoustrojów. LB mogą także wytwarzać rozpuszczalne substancje, które bezpośrednio hamują wzrost potencjalnie patogennych bakterii i drożdżaków. Mogą także wytwarzać nadtlenek wodoru, który jest toksyczny dla bakterii i grzybów. Ta charakterystyka hamowania różnych szczepów LB może wykazywać istotne różnice (Hooton i in., JAMA 1990(26):64-69). [0004] Podobnie jak w obszarze moczowo-płciowym, skóra jest skolonizowana przez cały szereg organizmów, tworzących jej prawidłową florę. Skóra w różnych miejscach posiada różną liczbę i inne rodzaje organizmów, przy czym obszary wilgotne i zawierające dużo lipidów posiadają więcej drobnoustrojów w przeliczeniu na jednostkę powierzchni skóry. To wraz z strukturalną barierą, jaką stanowi skóra, zapewnia doskonałą obronę organizmu gospodarza przed inwazją drobnoustrojów. Liczba bakterii na skórze waha się od kilkuset na cm 2 na suchych obszarach przedramienia i pleców do dziesiątków tysięcy na cm 2 na wilgotnych obszarach, takich jak pacha i pachwina. Ta prawidłowa flora odgrywa ważną rolę w zapobieganiu kolonizacji skóry przez obce organizmy, ale musi znajdować się pod kontrolą, aby nie dopuścić do zakażeń skóry. [000] Przewód żołądkowo-jelitowy (ŻJ), od jamy ustnej do odbytu, posiada bogatą florę, w skład której wchodzi ponad 00 różnych gatunków bakterii, z których niektóre pełnią ważne role dla zdrowia. Flora ŻJ składa się z około 14 bakterii i niewielkiej liczby komensalnych drożdżaków. W wyniku zmiany ogólnego stanu zdrowia, może dochodzić do nadmiernego wzrostu gatunków Candida i zakażeń powierzchniowych. Dodatkowo, nadmierny wzrost gatunków Candida u pacjentów z obniżoną odpornością może prowadzić do zakażenia układowego, które jest bardzo ciężkim schorzeniem. [0006] Osłabienie lub zaburzenie równowagi naturalnego układu obronnego mogą pozwolić potencjalnie patogennym drobnoustrojom na wywołanie klinicznie zakażenia, na przykład w związku ze stosowaniem leku, niedostateczną higieną osobistą albo zmianami w mikroflorze lub błonach śluzowych. Zmiany w mikroflorze można stwierdzić także w związku z innymi stanami patogenetycznymi. [0007] Drożdżaki zawsze występują w organizmie człowieka, ale miejscowa flora drobnoustrojowa zazwyczaj nie pozwala na ich nadmierny wzrost. Kandydoza to zakażenie spowodowane przez drożdżaki Candida, które może występować w różnorodnych układach narządów. Najczęściej zakażenie jest spowodowane przez Candida albicans i C. gla-

3 brata. Rzadziej zakażenie jest spowodowane przez C. tropicalis, C. parapsilosis i C. kruseii i rzadko czynnikiem przyczynowym są inne gatunki Candida. Kandydoza jest często wyzwalana przez zmiany hormonalne, takie jak podczas ciąży, miesiączki i stosowania środków antykoncepcyjnych. Do innych częstych przyczyn należą zaburzenia ph pochwy, cukrzyca i antybiotykoterapia, zaburzające delikatną równowagę mikrobiologiczną organizmu. Naturalne mechanizmy obronne organizmu gospodarza przed zakażeniami Candida obejmują bariery mechaniczne, nieswoiste substancje przeciwdrobnoustrojowe (polipeptydy, proteazy zasadowe), fagocytozę i swoistą odpowiedź odpornościową (limfocyty T i B, nadwrażliwość typu opóźnionego). [0008] U osoby z prawidłową odpornością każda ciepła, wilgotna część organizmu narażona na kontakt ze środowiskiem jest podatna na zakażenie powodujące zapalenie pochwy; wysypkę sromu; pleśniawki jamy ustnej; zapalenie spojówek; zapalenie tkanek wewnętrznych gałki ocznej; pieluszkowe zapalenie skóry; oraz zakażenia paznokcia, odbytnicy i innych fałdów skórnych. U pacjentów z obniżoną odpornością mogą wystąpić choroby układowe, takie jak zapalenie mięśnia sercowego, ropień wątroby i śledziony, zakażenie płuc, zakażenie OUN i choroba przewlekła. Kandydoza może rozszerzać się z zakażenia miejscowego na zakażenie układowe przebiegające z poważnymi powikłaniami, takie jak zapalenie mięśnia sercowego, zapalenie tkanek wewnętrznych gałki ocznej oraz ropień wątroby i śledziony Stąd duże znaczenie ma znalezienie skutecznego leczenia i profilaktyki kandydozy, aby uniknąć tych poważnych stanów u osobników. [0009] Pleśniawki to popularna nazwa na zakażenie jamy ustnej spowodowane przez grzyb Candida albicans, które dotyczy wilgotnych powierzchni wokół warg, wewnętrznej powierzchni policzków i języka oraz podniebienia. Pleśniawki występują często u osób z cukrzycą lub podrażnieniem wywołanym protezami dentystycznymi. Kandydoza także występuje często u osób z chorobami, takimi jak nowotwór i AIDS, które to obie choroby prowadzą do stłumienia aktywności układu odpornościowego. [00] Zakażenie jamy ustnej spowodowane przez Candida może rozszerzać się na przełyk, powodując zapalenie przełyku. To zakażenie najczęściej występuje u chorych na AIDS oraz osób otrzymujących chemioterapię w leczeniu nowotworu. [0011] Zakażenie Candida także często występuje na wilgotnych częściach skóry, takich jak na obszarach skóry pokrytych przez pieluszki, na rękach osób, które rutynowo noszą gumowe rękawice, na brzegu skóry na podstawie paznokcia u rąk, szczególnie na rękach narażonych na wilgoć, na obszarach wokół pachwiny i w bruździe pośladkowej oraz na fałdach skórnych pod dużymi piersiami. [0012] Zapalenie pochwy to zapalenie błony śluzowej pochwy spowodowane przez bakterie lub grzyby. Samo zapalenie pochwy jest nieszkodliwe, ale może prowadzić do porodu przedwczesnego u kobiet w ciąży lub do niepłodności. [0013] Kandydoza pochwy powoduje świąd i podrażnienie pochwy, którym towarzyszy białawe, gęste upławy, które mogą przypominać twaróg. Dla kobiety te objawy często są przyczyną dużego dyskomfortu i dodatkowo ograniczają normalną aktywność, na przykład sport i aktywność seksualną. [0014] Zazwyczaj kandydozę pochwy leczy się miejscowo kremami, czopkami, kapsułkami żelatynowymi, tabletkami dopochwowymi i maściami zawierającymi środki przeciwgrzybicze. Dostępne są także leki podawane doustnie. Jednym z problemów związanych z lekami przeciwgrzybicznymi jest narastająca oporność grzyba, jeśli dany lek jest stosowany wielokrotnie. Dodatkowo takie leki są często nieskuteczne i są wydawane na receptę lekarską. [00] Środki domowe, takie jak stosowanie jogurtu, tabletek acidophilus lub irygacji z octu, są także stosowane w leczeniu kandydozy. Natomiast skuteczność tych terapii jest niska. Pomimo tego, że jogurt zawiera bakterie kwasu mlekowego, nie są one specjalnie przystosowane do zabijania lub zmniejszania wzrostu grzybów. Jak sobie zdaje sprawę z tego specjalista w dziedzinie wynalazku, takie leczenie może być jedynie skuteczne w ła-

4 godzeniu objawów mało nasilonych zakażeń. Sugerowano także, że bakterie wytwarzające kwas mlekowy mogą być dostarczane przez materiały chłonne, na przykład pieluchy, podpaski higieniczne, wkładki higieniczne i tampony, jak opisano np. w WO97/02846, WO , WO99/99 i WO00/2. [0016] WO 0/ jest ukierunkowany na ochronę przed zakażeniem HIV przez wzmocnienie odporności wrodzonej. W WO 0/ ujawniono szczep Lactobacillus fermentum oznaczony jako OLB19a, który, jak pokazano, hamuje wzrost drożdżaków związanych z zakażeniami pochwy. Ten szczep Lactobacillus fermentum może być dostarczany przez produkty higieny osobistej dla kobiet. [0017] Istnieje coraz większe zainteresowanie w znalezieniu drobnoustrojów probiotycznych, które byłyby w stanie przywrócić zdrową florę drobnoustrojową i/lub zapobiec niekontrolowanemu wzrostowi niepożądanych drobnoustrojów. Podawanie takich bakterii probiotycznych nie wiąże się z niekorzystnymi działaniami ubocznymi występującymi w przypadku środków przeciwgrzybiczych i korzystnie są one skuteczniejsze w leczeniu i/lub zapobieganiu zakażeniom grzybiczym. Wcześniejsze próby znalezienia takich drobnoustrojów skończyły się mieszanym powodzeniem w związku z problemami takimi, jak słabe wiązanie i przeżycie probiotyków w pochwie, ograniczona skuteczność w zapobieganiu wzrostowi grzybów, niskie przeżycie w trakcie przechowywania preparatów itp. Inną ważną cechą wybranego probiotyku jest zdolność do wzrostu w obecności tlenu i przeżycia suszenia sublimacyjnego. Jednakże co najważniejsze, wybrana bakteria probiotyczna musi skutecznie zabijać i/lub zapobiegać wzrostowi niepożądanych grzybów i/lub bakterii. Już wcześniej wykazano, że probiotyczne bakterie kwasu mlekowego są skuteczne w leczeniu i zapobieganiu bakteryjnemu zapaleniu pochwy. Natomiast skuteczność zapobiegania i/lub leczenia kandydozy pochwy była bardzo ograniczona. Dlatego w dalszym ciągu istnieje zapotrzebowanie na opracowanie skutecznych probiotyków do leczenia kandydozy, w tym kandydozy pochwy, które także mogłoby być skuteczne w zakażeniach bakteryjnych, takich jak zakażenia dróg moczowych. Streszczenie wynalazku [0018] Przedmiotem wynalazku jest dostarczenie bakterii probiotycznej do leczenia i/lub zapobiegania kandydozie i/lub zakażeniom bakteryjnym, takim jak zakażenia dróg moczowych. [0019] Wyżej zdefiniowany cel w pierwszym aspekcie wynalazku osiąga się przez dostarczenie nowego szczepu Lactobacillus fermentum, nazywanego Ess-1, który złożono w Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH i przydzielono mu numer dostępu DSM1781. [00] W innym aspekcie wynalazek dotyczy zastosowania Lactobacillus fermentum, szczepu Ess-1, do stosowania jako lek. [0021] W innym aspekcie wynalazek dotyczy zastosowania Lactobacillus fermentum, szczepu Ess-1, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zapobiegania i/lub leczenia kandydozy. [0022] W innym aspekcie wynalazek dotyczy zastosowania Lactobacillus fermentum, szczepu Ess-1, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zapobiegania i/lub leczenia zakażeń bakteryjnych, na przykład zakażenia dróg moczowych. [0023] W jeszcze innym aspekcie wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej zawierającej Lactobacillus fermentum, szczep Ess-1, ewentualnie z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, zaróbką i/lub rozcieńczalnikiem. [0024] W jeszcze innym aspekcie wynalazek dotyczy artykułu higieny osobistej zawierającego Lactobacillus fermentum, szczep Ess-1. [00] Wynalazek dotyczy także sposobu wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia i/lub zapobiegania kandydozie obejmującego dodanie Lactobacillus fermentum, szczepu Ess-1, do tej kompozycji farmaceutycznej. [0026] Dodatkowo, wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania artykułu higieny osobistej

5 do leczenia i/lub zapobiegania kandydozie obejmującego dodanie Lactobacillus fermentum, szczepu Ess-1, do artykułu higieny osobistej. [0027] Jako że pokazano, że nowy szczep Lactobacillus fermentum, szczep Ess-1, zapewnia doskonałe zahamowanie wzrostu grzyba Candida, ten nowy szczep bakterii posiada cenne właściwości do zastosowania w wytwarzaniu leku do leczenia i/lub zapobiegania kandydozie. Dodatkowo wynalazek rozwiązuje problem dostarczania produktów i artykułów do podawania tego nowego szczepu bakterii do obszarów organizmu przeznaczonych do takiego leczenia i/lub profilaktyki. Definicje [0028] W niniejszym kontekście środkiem przeciwgrzybiczym jest lek stosowany do leczenia zakażeń grzybiczych, który to lek nie jest probiotykiem według poniższej definicji. [0029] Określenie probiotyk/probiotyki w niniejszym kontekście dotyczy żywych drobnoustrojów, które podane w odpowiedniej ilości gospodarzowi zapewniają korzyść zdrowotną. [00] Kandydoza w niniejszym kontekście dotyczy zakażenia spowodowanego przez grzyb Candida występujący w obrębie lub na dowolnej części organizmu, takiej jak skóra, okolica moczowo-płciowa, jama ustna, przełyk lub jelita. [0031] Suplement doustny w niniejszym kontekście dotyczy kompozycji podawanej doustnie, takiej jak sprej, tabletka, guma do żucia itp. [0032] Czysta biologicznie w niniejszym kontekście dotyczy hodowli bakterii, która zawiera wyłącznie jeden konkretny szczep bakterii. [0033] Określenie artykuł higieny osobistej dotyczy produktów, które są umieszczane na skórze osoby je stosującej w celu pochłaniania i zatrzymywania wydzielin organizmu, takich jak mocz, kał i płyn miesiączkowy, oraz także produktów, które są stosowane do oczyszczania i pielęgnacji skóry i obszaru moczowo-płciowego, oraz które mogą być także stosowane do dostarczania bakterii probiotycznych do tych obszarów. Wynalazek dotyczy głównie jednorazowych artykułów higieny osobistej, co oznacza artykuły nieprzeznaczone do prania ani w żaden inny sposób przywracania lub ponownego stosowania jako artykuł higieny osobistej. Przykłady jednorazowych artykułów higieny osobistej obejmują mokre chusteczki, suche chusteczki, produkty higieny osobistej dla kobiet, takie jak podpaski higieniczne, wkładki higieniczne, majtki higieniczne i tampony; wkładki dla kobiet; pieluchy i pieluchomajtki dla niemowląt i osób dorosłych z nietrzymaniem moczu i/lub stolca; podkłady higieniczne; wkładki pieluchowe i tym podobne. [0034] Określenie artykuł chłonny dotyczy produktów, które są umieszczane na skórze osoby je stosującej w celu pochłaniania i zatrzymywania wydzielin organizmu, takich jak mocz, kał i płyn miesiączkowy. Przykłady jednorazowych artykułów higieny osobistej obejmują produkty higieny osobistej dla kobiet, takie jak podpaski higieniczne, wkładki higieniczne, majtki higieniczne i tampony; wkładki dla kobiet; pieluchy i pieluchomajtki dla niemowląt i osób dorosłych z nietrzymaniem moczu i/lub stolca; podkłady higieniczne; wkładki pieluchowe i tym podobne. [003] Określenie chusteczka higieniczna oznacza każde urządzenie do wycierania skóry, na przykład myjkę, ściereczkę, chusteczkę odświeżającą, serwetkę, mokrą chusteczkę, suchą chusteczkę i tym podobne. [0036] Lipid w niniejszym kontekście oznacza substancje, które są nierozpuszczalne w wodzie, ale rozpuszczalne w rozpuszczalniku organicznym. Krótki opis rysunków [0037] Figura 1 przedstawia średnie hamowanie wzrostu trzech szczepów C. albicans i C. glabrata. = C. albicans, = C. glabrata. *dmrs skorygowane o ph dla najniższego zarejestrowanego ph dla wszystkich przesączy (ph 3,7). 0 oznacza brak widocznego wzrostu, oznacza bardzo dobry wzrost. Figura 2 przedstawia hamowanie wzrostu C. albicans w 0 mm kwasie askorbinowym

6 3 4 0 (Fig. 2a) i 0 mm kwasie propionowym (Fig. 2b), w przesączu Ess-1 i w przesączu Ess-1 z dodatkiem 0 mm kwasu askorbinowego (Fig. 2a) i 0 mm kwasu propionowego (Fig. 2b). 0 oznacza brak widocznego wzrostu, oznacza bardzo dobry wzrost. Figura 3 przedstawia wytwarzanie kwasu bursztynowego, kwasu octowego i kwasu propionowego przez pięć różnych szczepów Lactobacillus, w tym Ess-1. Te szczepy były hodowane w bulionie MRS i rejestrowano wytwarzanie kwasu w bulionie po sterylizacji supernatantu przez przesączanie. Szczegółowy opis wynalazku [0038] Niniejszy wynalazek dotyczy nowego szczepu Lactobacillus fermentum, w dalszej części nazywanego Ess-1, złożonego zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Mascheroder Weg 1b, D Braunschweig), któremu przydzielono numer dostępu DSM1781 (deponent Essum AB, Box 3160, SE 904 Umeå, Szwecja, złożony 6 stycznia 06 r.). Wykazano, że ten szczep posiada unikatowe właściwości w leczeniu i/lub zapobieganiu zakażeniom Candida, tj. kandydozie, w związku z jego właściwościami hamującymi wzrost drożdżaka Candida. Pokazano także, że szczep Ess-1 posiada cenne właściwości w leczeniu i/lub zapobieganiu zakażeniom bakteryjnym, takim jak zakażenia dróg moczowych. Dodatkowo Ess- 1 jest w stanie przeżyć długi okres przechowywania, co jest istotne dla wygody posługiwania się produktami zawierającymi bakterię. Ponadto Ess-1 nie jest organizmem bezwzględnie beztlenowym, ale może rosnąć w obecności tlenu i przeżyć suszenie sublimacyjne. Szczep Ess-1 Lactobacillus fermentum według wynalazku jest biologicznie czysty. [0039] Jak pokazano w Przykładzie 1, Ess-1 wykazuje unikatowe hamowanie wzrostu różnych szczepów drożdżaków Candida. W tym doświadczeniu badano dużą liczbę szczepów Lactobacili w kierunku ich właściwości hamujących wzrost Candida. Do dalszych badań wybrano 23 najlepsze szczepy. Hamowanie wzrostu przez Ess-1 jest ponad dwukrotnie silniejsze, niż wykazano dla najlepszego z 23 różnych szczepów Lactobacillus stosowanych do porównania. Ponadto wykazano, że Ess-1 hamuje wzrost szeregu różnych szczepów bakterii, o których wiadomo, że powodują zakażenie dróg moczowych. Ponadto wykazano, że Ess-1, podany do pochwy, jest w stanie kolonizować pochwę i przeżyć w pochwie. Co istotne Ess-1 jest w stanie przeżyć w pochwie także w trakcie miesiączki. Kolonizacja i przeżycie in vivo po podaniu osobnikowi są ważnym czynnikiem dla zamierzonej skuteczności probiotyku. Natomiast brak lub ograniczona kolonizacja i przeżycie in vivo często ograniczają użyteczność praktyczną probiotycznych bakterii wytwarzających kwas mlekowy. Dodatkowo, ograniczone przeżycie w trakcie przechowywania i posługiwania się produktami zawierającymi bakterie wytwarzające kwas mlekowy często prowadzą do stosowania nieskutecznych produktów. [00] W pierwszym aspekcie niniejszy wynalazek dotyczy nowego szczepu Lactobacillus fermentum, oznaczonego jako szczep Ess-1, złożonego w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, i któremu przydzielono numer dostępu DSM1781. [0041] W związku z właściwościami Ess-1 hamującymi wzrost Candida i bakterii powodujących zakażenia dróg moczowych, niniejszy wynalazek dotyczy także zastosowania medycznego tego szczepu. W szczególności wynalazek dotyczy zastosowania szczepu Ess- 1 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zapobiegania i/lub leczenia kandydozy korzystnie u osobnika będącego ssakiem, korzystniej u osobnika będącego człowiekiem. W innej korzystnej postaci wynalazek dotyczy zastosowania szczepu Ess-1 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zapobiegania i/lub leczenia kandydozy w okolicy moczowo-płciowej, takiej jak kandydoza pochwy. W innej korzystnej postaci niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania szczepu Ess-1 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zapobiegania i/lub leczenia zapalenia przełyku. Inna korzystna postać niniejszego wynalazku dotyczy zastosowania szczepu Ess-1 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia pleśniawek.

7 [0042] Jako że pokazano doświadczalnie (patrz Część doświadczalna ), że nowy szczep Ess-1 według niniejszego wynalazku hamuje wzrost szeregu różnych bakterii powodujących zakażenie, takie jak zakażenie dróg moczowych, inny aspekt wynalazku dotyczy zastosowania szczepu Ess-1 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zapobiegania i/lub leczenia zakażeń bakteryjnych, takich jak zakażenie dróg moczowych. [0043] W jednym aspekcie niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania Lactobacillus fermentum, szczepu Ess-1, złożonego w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, i któremu przydzielono numer dostępu DSM1781, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do podawania doustnego. [0044] W jednej korzystnej postaci kompozycja farmaceutyczna zawierająca Lactobacillus fermentum, szczep Ess-1, zawiera także jeden lub większą liczbę farmaceutycznie dopuszczalnych nośników, zaróbek i/lub rozcieńczalników. Zasadniczo takie środki w stosowanych stężeniach i dawkach powinny być nietoksyczne dla osobnika je przyjmującego. Przykładami takich środków są bufory, środki zagęszczające z środków żelotwórczych, takie jak gliceryna, glikol polietylenowy, przeciwutleniacze (np. kwas askorbinowy), polipeptydy o niskiej masie cząsteczkowej (zawierające mniej niż około reszt), białka, węglowodany obejmujące glukozę, sacharozę i dekstryny. Przykłady nośników obejmują cukry, takie jak laktoza, glukoza i sacharoza; skrobie takie jak skrobia kukurydziana i skrobia ziemniaczana; celulozę i jej pochodne, takie jak karboksymetyloceluloza sodowa, etyloceluloza i octany celulozy; trehalozę; sproszkowany tragakant, słód; żelatynę; talk; kwasy stearynowe; stearynian magnezu; siarczan wapnia; alkohole wielowodorotlenowe, takie jak glikol propylenowy, gliceryna, sorbitol, mannitol i glikol polietylenowy; agar; kwasy alginowe; wodę wolną od pirogenów; izotoniczny roztwór soli; i roztwór buforowany fosforanami. W jednej korzystnej postaci wynalazku nośnik zapewniający środowisko bezwodne jest stosowany jako nośnik dla bakterii probiotycznych. Takie środowisko bezwodne wydłuża czas przeżycia bakterii w trakcie wytwarzania, transportu i przechowywania. Jednym przykładem takich nośników są nośniki lipidowe, obejmujące lipidy uzyskane z przerobu ropy naftowej, takie jak parafina ciekła (oleje mineralne, oleje parafinowe i inne oleje), wazelina (wazelina i parafina), wosk mikrokrystaliczny, ozokeryt, cerezyna i parafiny. Alternatywnie mogą być stosowane lipidy syntetyczne, takie jak dimetikon, cyklometikon i estry silikonowe, takie jak metikon cetearylu. Trzecia alternatywa polega na zastosowaniu lipidów pochodzenia zwierzęcego lub roślinnego, którymi zazwyczaj są triglicerydy. Lipidy pochodzenia zwierzęcego i roślinnego często stanowią mieszaniny mono-, di- i triglicerydów oraz wolnych kwasów tłuszczowych. Lipidy mogą być oczyszczane, uwodorniane, rafinowane, modyfikowane i stosowane oddzielnie lub w różnych mieszaninach. Przykłady odpowiednich, oryginalnych lipidów pochodzenia zwierzęcego obejmują wosk pszczeli, olej emu, lactis lapida, lanolinę, olej z wątroby rekina i łój. Przykłady odpowiednich oryginalnych lipidów pochodzenia roślinnego obejmują olej z pestek moreli, olej arachidowy, olej/wosk z awokado, wosk mirtowy, olej z nasion czarnej porzeczki, olej z nasion ogórecznika, olej z orzecha brazylijskiego, olej kameliowy, wosk kandelilla, olej canola, wosk karnauba, olej rycynowy, masło mamakowe, olej kokosowy, olej kukurydziany, olej z nasion bawełny, olej z nasion dzikiej róży, olej z nasion wiesiołka, olej z nasion winogron, masło illipe, wosk jaśminowy, wosk jojoba, wosk lawendowy, olej lniany, olej z nasion mango, olej z oliwek, wosk pomarańczowy, olej palmowy, olej z ziaren palmowych, olej arachidowy, wosk ryżowy, olej słonecznikowy, olej sezamowy, masło shea, olej sojowy, wosk z nasion słonecznika, olej ze słodkich migdałów, olej teobrominowy i olej z kiełków pszenicy. Zastosowanie nośników lipidowych ma dodatkową zaletę polegającą na przenoszeniu bakterii do użytkownika, na przykład gdy kompozycja farmaceutyczna jest podawana przy użyciu produktu higieny osobistej, takiego jak produkt chłonny lub chusteczka higieniczna (patrz np. WO 04/060416). Przykładami korzystnych lipidów są wazelina i wosk silikonowy. Mogą także występować środki zwilżające i smarujące, takie jak laurylosiarczan sodu i środki barwiące, smarujące, tabletkujące, stabilizatory i konserwanty. Ko-

8 rzystnymi farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami są trehaloza lub inulina i/lub oligofruktoza, polidekstroza, laktytol lub oporna skrobia, w postaci proszku lub innej postaci. Kompozycja farmaceutyczna według niniejszego wynalazku może w jednej korzystnej postaci także zawierać, poza komórkami Lactobacillus fermentum Ess-1, kwas organiczny i/lub jego sól, taki jak kwas octowy, kwas propionowy, kwas mlekowy, kwas askorbinowy, fenyloalaninę, kwas cytrynowy, kwas masłowy, kwas walerianowy, kwas kapronowy, kwas bursztynowy i/lub jego sól, korzystnie kwas octowy, kwas propionowy, kwas mlekowy, kwas askorbinowy, fenyloalaninę, kwas cytrynowy lub kwas bursztynowy i/lub jego sól, najkorzystniej kwas askorbinowy, kwas octowy, kwas propionowy, kwas bursztynowy i/lub jego sól. Efekt synergistyczny można uzyskać przez połączenie probiotycznych Ess-1 z kwasami organicznymi i/lub ich solami, przy czym kwas organiczny ma wartość pka nieprzekraczającą,. Kwasy organiczne lub ich odpowiednie sole powinny mieć taki charakter, żeby po ich zastosowaniu w artykule higieny osobistej nie powodowały podrażnienia skóry użytkownika artykułu higieny osobistej, dlatego pka kwasu organicznego, gdy pomiary są wykonywane w wodzie o temperaturze C, korzystnie nie powinno być niższe od 2. Natomiast jeśli wartości pka są za wysokie, kwasy organiczne lub ich sole będą głównie występowały w postaci kwasu. To oznacza, że dany dodatek nie będzie w dostatecznym stopniu zdysocjowany na jod wodoru i pozbawioną protonu postać anionową, co, jak się uważa, jest warunkiem koniecznym dla wystąpienia omawianego działania bakterii probiotycznych lub ich zewnątrzkomórkowego produktu. Stąd co najmniej jedna z wartości pka kwasu organicznego odpowiedniego do niniejszego wynalazku, powinna być niższa od,, korzystnie niższa od. Dodatkowo do kompozycji farmaceutycznej mogą być dodawane środki odżywcze do rozmnażania bakterii, takie jak aminokwasy, peptydy, pochodne kwasu nukleinowego, witaminy, sole, kwasy tłuszczowe, glukoza, fruktoza, ryboza, maltoza i laktoza, oddzielne lub w różnych połączeniach. [004] Kompozycja farmaceutyczna według niniejszego wynalazku jest korzystnie podawana w postaci spreju, kremu, proszku, czopka, płynu do podawania doustnego, kapsułki, tabletki, wkładki dopochwowej lub suplementu doustnego. Kompozycje do leczenia skóry mogą np. być wytwarzane według US 06/ [0046] Innymi przykładami produktów zawierających szczep Ess-1 są proszek w rękawicy, pastylka, guma do żucia, płyn do płukania jamy ustnej lub sprej do jamy ustnej. [0047] Dodatkowo, kompozycja farmaceutyczna według niniejszego wynalazku może także zawierać substancję, która zmniejsza nieprzyjemne zapachy, taką jak zeolity, krzemionka, cyklodekstryna i węgiel aktywowany. Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku może także zawierać substancje, które mają zdolność zwiększania wiązania pałeczek kwasu mlekowego i/lub substancje, które zmniejszają wiązanie drobnoustrojów patogennych. [0048] Kompozycja farmaceutyczna według niniejszego wynalazku może być podawana w pojedynczej dawce, ale korzystnie jest podawana w wielu dawkach. Kompozycja farmaceutyczna może również korzystnie być podawana w połączeniu z podawaniem środka(ów) przeciwgrzybiczego(ych). [0049] W jednej korzystnej postaci kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera suszone komórki bakteryjne, takie jak suszone sublimacyjnie komórki, suszone rozpryskowo komórki lub suszone powietrzem komórki. Takie komórki wykazują dobrą zdolność do przeżycia w trakcie przechowywania (patrz część doświadczalna badania przeżycie komórek suszonych sublimacyjnie). [000] Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera korzystnie 4 do 11 jednostek tworzących kolonie (cfu), korzystnie 6 do cfu, a jeszcze korzystniej 8 do CFU, szczepu Lactobacillus fermentum Ess-1 na dawkę. [001] Kompozycja farmaceutyczna lub produkt według wynalazku mogą poza Ess-1 zawierać inne bakterie o właściwościach probiotycznych w celu osiągnięcia szerszego działania klinicznego. Takie korzystne bakterie dla celu niniejszego wynalazku obejmują bak-

9 terie wytwarzające kwas mlekowy, np. z rodzaju Lactobacillus, Lactococcus, Pediococcus, niepatogenne bakterie z rodzaju Bacillus, wszystkie bakterie z rodzaju Bifidobacterium oraz Pseudomonas limbergii. Korzystne bakterie z rodzaju Lactobacillus obejmują Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei, Lactobacillus cereale, Lactobacillus delbrukeii, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gaserii, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus thermophilus, Lactobacillus papacasai sp. paracasai, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus lactis i tym podobne. Korzystniej wybrana stosowana bakteria jest z gatunku Lactococcus lactis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus curvatus lub Lactobacillus plantarum. Inne korzystne przykłady obejmują niepatogenne gatunki ziarniaków, takie jak S. nalivarius, S. oralis i S. mitis. Jednym jeszcze korzystniejszym przykładem takiej bakterii wytwarzającej kwas mlekowy jest, lecz nie wyłącznie, Lactobacillus plantarum, szczep LB931 (EP 602, numer dostępu DSM w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen). [002] Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku może być umieszczana w szeregu różnych produktów. Przykładowo proszek zawierający Ess-1 może być dostarczany w różnych typach rękawic ochronnych. Takie rękawice często zapewniają wilgotne środowisko dla rąk, które może ułatwiać wzrost grzyba, prowadząc do zakażeń grzybiczych skóry i paznokci u rąk. [003] W innym aspekcie niniejszy wynalazek dotyczy artykułu higieny osobistej zawierającego Lactobacillus fermentum szczep Ess-1, który został złożony w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, i któremu przydzielono numer dostępu DSM1781. Taki artykuł higieny osobistej może być materiałem chłonnym, na przykład produktem higieny osobistej dla kobiet, takim jak podpaska higieniczna, wkładka higieniczna, majtki higieniczne lub tampon; wkładką dla kobiet; pieluchą i pieluchomajtkami dla niemowląt lub osób dorosłych z nietrzymaniem moczu i/lub stolca; podkładem higienicznym; lub wkładką pieluchową. Artykuł higieny osobistej może być także chusteczką higieniczną, taką jak myjka, ściereczka, chusteczka odświeżająca, serwetka, mokra chusteczka lub sucha chusteczka. Chusteczka higieniczna odpowiednia do niniejszego wynalazku została opisana w WO 04/ W tej chusteczce higienicznej bakterie wytwarzające kwas mlekowy zostały skapsułkowane w lipid w środowisku bezwodnym w celu ochrony bakterii przed wilgocią w trakcie przechowywania i ułatwienia ich przeniesienia do użytkownika chusteczki higienicznej. Taka chusteczka higieniczna może także ewentualnie zawierać jeden lub większą liczbę dodatków czyszczących, na przykład środków zmiękczających, środków emulgujących, środków nawilżających, środków regulujących ph, środków chelatujących, modyfikatorów lepkości, środków przeciwdrobnoustrojowych, konserwantów i środków zapachowych, jak ujawniono w WO 04/ Dalsze szczegóły dotyczące odpowiednich środków często dodawanych do produktów oczyszczających skórę podano w Woodruff's Ingredients and Formulary Handbook, John Woodruff, wydanie pierwsze, 1997, Miller Freeman fjk Ltd. Produkt chłonny lub chusteczka higieniczna według wynalazku może także dodatkowo zawierać kwasy, sole, środki hamujące nieprzyjemny zapach, substancje, które wpływają na przyleganie probiotyków i niepożądanych drobnoustrojów, jak omówiono wyżej. Taki produkt chłonny może zawierać przepuszczalną zewnętrzną powłokę, która ma bezpośrednio stykać się ze skórą osoby stosującej produkt, korzystnie nieprzepuszczalną dla lipidów powłoką podstawną, która ma znajdować się z dala od użytkownika produktu, oraz położoną między powłoką zewnętrzną a powłoką podstawną strukturę chłonną. W niektórych przypadkach dodatkowa powłoka w postaci np. waty lub podobnego materiału może znajdować się między powłoką zewnętrzną a strukturą chłonną. Powłoka podstawna jest korzystnie oddychalna. Bakterie probiotyczne mogą być rozmieszczone w różnych częściach artykułu chłonnego, na przykład w powłoce zewnętrznej, w strukturze chłonnej, między dwiema warstwami artykułu chłonnego, w luźnym produkcie, wkładce, w produkcie chłonnym lub w inny sposób. Produkt chłonny

10 według niniejszego wynalazku może także korzystnie zawierać superchłonny polimer (SAP). [004] Artykuł higieny osobistej według wynalazku poza komórkami Lactobacillus fermentum Ess-1 może dodatkowo zawierać kwas organiczny i/lub jego sól, taki jak kwas octowy, kwas propionowy, kwas mlekowy, kwas askorbinowy, fenyloalaninę, kwas cytrynowy, kwas masłowy, kwas walerianowy, kwas kapronowy, kwas bursztynowy i/lub jego sól, korzystnie kwas octowy, kwas propionowy, kwas mlekowy, kwas askorbinowy, fenyloalaninę, kwas cytrynowy lub kwas bursztynowy i/lub jego sól, najkorzystniej kwas askorbinowy, kwas octowy, kwas propionowy, kwas bursztynowy i/lub jego sól, przy czym taki kwas ma wartość pka nieprzekraczającą, Efekt synergistyczny można uzyskać przez połączenie probiotycznych komórek Ess-1 z kwasami organicznymi i/lub ich solami. [00] Artykuł higieny osobistej według wynalazku zawiera korzystnie 4 do 11 jednostek tworzących kolonie (cfu), korzystnie 6 do cfu, a jeszcze korzystniej 8 do CFU, Lactobacillus fermentum szczepu Ess-1 w artykule higieny osobistej. [006] Bakterie probiotyczne według niniejszego wynalazku mogą być bezpośrednio umieszczane na artykule higieny osobistej według wynalazku lub dostarczane w kompozycji farmaceutycznej, jak ujawniono w opisie, umieszczanej na produkcie. W jednej korzystnej postaci bakterie są bakteriami suszonymi, jak ujawniono powyżej, i są umieszczane bezpośrednio na artykule higieny osobistej, oddzielnie lub w kompozycji farmaceutycznej, zgodnie z powyższym opisem. W innej korzystnej postaci bakterie mogą być najpierw umieszczane na artykule higieny osobistej, np. w zawiesinie zawierającej bakterie, a następnie produkt higieny osobistej może być suszony, w ten sposób dostarczając produkt zawierający suszone bakterie, ewentualnie w połączeniu z dodatkowymi środkami farmaceutycznymi, jak ujawniono powyżej. W innej korzystnej postaci suszony proszek bakterii jest dostarczany w lipidzie dodanym do artykułu higieny osobistej. W celu zmniejszenia narażenia bakterii na wilgoć w trakcie wytwarzania, transportu i przechowywania artykułów zawierających pro biotyczny Ess-1, w jednej korzystnej postaci artykuł higieny osobistej jest pakowany w opakowanie nieprzepuszczalne dla wody. [007] W innym aspekcie niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania Lactobacillus fermentum szczepu Ess-1, który został złożony w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, i któremu przydzielono numer dostępu DSM1781, do wytwarzania artykułu higieny osobistej, takiego jak mokra chusteczka, sucha chusteczka, produkt higieny osobistej dla kobiet, taki jak podpaska higieniczna, wkładka higieniczna, majtki higieniczne lub tampon; wkładka dla kobiet; pielucha lub pieluchomajtki dla niemowląt lub osób dorosłych z nietrzymaniem moczu i/lub stolca; podkład higieniczny; lub wkładka pieluchowa. Artykuł higieny osobistej jest korzystnie materiałem chłonnym, na przykład produktem higieny osobistej dla kobiet, takim jak podpaska higieniczna, wkładka higieniczna, majtki higieniczne lub tampon; wkładką dla kobiet; pieluchą lub pieluchomajtkami dla niemowląt lub osób dorosłych z nietrzymaniem moczu i/lub stolca; podkładem higienicznym; lub wkładką pieluchową. Artykuł higieny osobistej może także korzystnie być chusteczką higieniczną, na przykład myjką, ściereczką, chusteczką odświeżającą, serwetką, mokrą chusteczką lub suchą chusteczką. [008] Wynalazek także dotyczy zastosowania Lactobacillus fermentum szczepu Ess-1, który został złożony w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, i któremu przydzielono numer dostępu DSM1781, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej, takiej jak zawiesina, sprej, krem, proszek, czopek, kapsułka, tabletka, suplement doustny lub wkładka dopochwowa itp., zgodnie z powyższym opisem. [009] Kompozycje farmaceutyczne i produkty zawierające L. fermentum szczep Ess-1 zawierają terapeutycznie skuteczną ilość tego szczepu bakterii. [0060] Niniejszy wynalazek także dotyczy sposobu leczenia i/lub zapobiegania kandydozie, obejmującego podawanie terapeutycznie skutecznej ilości Lactobacillus fermentum

11 3 4 0 szczepu Ess-1, który został złożony w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, i któremu przydzielono numer dostępu DSM1781, potrzebującemu tego osobnikowi. Wynalazek także dotyczy sposobu leczenia i/lub zapobiegania zakażeniom bakteryjnym, takim jak zakażenie dróg moczowych, obejmującego podawanie terapeutycznie skutecznej ilości Lactobacillus fermentum szczepu Ess-1, który został złożony w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, i któremu przydzielono numer dostępu DSM1781, potrzebującemu tego osobnikowi. W takich sposobach szczep Ess-1 jest podawany osobnikowi w dowolnych kompozycjach farmaceutycznych lub produktach, które zostały ujawnione powyżej. Do podawania w artykule higieny osobistej, na przykład produkcie chłonnym, ważne jest, aby produkt chłonny został umieszczony w bezpośrednim kontakcie ze skórą tego osobnika. [0061] Ważnym przedmiotem niniejszego wynalazku jest podawanie doustne Ess-1. Stąd jeden aspekt wynalazku dotyczy kompozycji farmaceutycznej do podawania doustnego. To podawanie doustne w pierwszym aspekcie prowadzi do zahamowania wzrostu grzybów i/lub bakterii w przewodzie żołądkowo-jelitowym i polepszenia równowagi flory drobnoustrojowej. Jednakże grzyby i bakterie obecne w przewodzie żołądkowo-jelitowym mogą także być przenoszone do obszaru moczowo-płciowego przez odbyt. Stąd zahamowanie wzrostu grzybów i/lub bakterii w przewodzie żołądkowo-jelitowym może mieć korzystny wpływ na sam przewód żołądkowo-jelitowy, ale także na obszar moczowo-płciowy z powodu zmniejszonego szerzenia patogennych grzybów i/lub bakterii w tej okolicy. Można także uzyskać efekt układowy, na przykład wyzwolenie substancji pośredniczących w odpowiedzi odpornościowej. Podawanie doustne można np. zapewnić przez umieszczenie Ess-1 w kapsułkach, tabletkach, kołaczykach, pastylkach do ssania, pastylkach, zawiesinach ciekłych, suchych zawiesinach doustnych, ciekłych zawiesinach doustnych, gumach do żucia, płynach do płukania jamy ustnej, drażetkach, sprejach doustnych, fiolkach itp. Podawanie doustne można także uzyskać w produktach spożywczych, takich jak jogurt, mleko, świeży ser, lody, produkty wykonane ze sfermentowanego mleka, produkty wykonane ze sfermentowanych produktów zbożowych, mleka w proszku itp. oraz produktów dla dzieci, takich jak kleik. [0062] W innym aspekcie niniejszy wynalazek dotyczy produktów do podawania miejscowego i/lub doustnego szczepu Ess-1 zwierzęciu w celu polepszenia stanu zdrowia zwierzęcia, np. w kompozycji farmaceutycznej według powyższego opisu albo w karmie lub w suplemencie karmy dla zwierzęcia. Ess-1 może być także stosowany do polepszenia jakości karmy zwierzęcia, na przykład kiszonki, przez zahamowanie w niej wzrostu grzybów i bakterii. [0063] Niniejszy wynalazek dotyczy także sposobu wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia i/lub zapobiegania kandydozie, obejmującego dodawanie Lactobacillus fermentum szczepu Ess-1, który został złożony w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, i któremu przydzielono numer dostępu DSM1781, do tej kompozycji farmaceutycznej. Niniejszy wynalazek dotyczy także sposobu wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia i/lub zapobiegania zakażeniom bakteryjnym, na przykład zakażeniom dróg moczowych, obejmującego dodawanie Lactobacillus fermentum szczepu Ess-1, który został złożony w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, i któremu przydzielono numer dostępu DSM1781, do tej kompozycji farmaceutycznej. [0064] Niniejszy wynalazek dotyczy także sposobu wytwarzania artykułu higieny osobistej, takiego jak produkt chłonny lub chusteczka higieniczna, do leczenia i/lub zapobiegania kandydozie, obejmującego dodawanie Lactobacillus fermentum szczepu Ess-1, który został złożony w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, i któremu przydzielono numer dostępu DSM1781, do tego artykułu higieny osobistej. Niniejszy wynalazek dotyczy także sposobu wytwarzania artykułu higieny osobistej, takiego jak produkt chłonny lub chusteczka higieniczna, do leczenia i/lub zapobiegania zakaże-

12 niom bakteryjnym, takim jak zakażenia dróg moczowych, obejmującego dodawanie Lactobacillus fermentum szczepu Ess-1, który został złożony w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, i któremu przydzielono numer dostępu DSM1781, do tego artykułu higieny osobistej. [006] Wynalazek opisano bardziej szczegółowo w poniższej części doświadczalnej. Natomiast zamieszczone przykłady mają charakter wyłącznie ilustracyjny i nie mają ograniczać zakresu niniejszego wynalazku. Część doświadczalna Przykład 1: Izolacja i typowanie Ess-1 Cel [0066] Pierwszym celem niniejszego badania była izolacja i typowanie szczepu Lactobacillus, który w dużym stopniu hamuje wzrost Candida albicans i Candida glabrata w porównaniu z innymi szczepami Lactobacillus. Metoda Szczepy drożdżaków [0067] Jako badane szczepy stosowano izolaty kliniczne Candida albicans i Candida glabrata. Wyizolowano je z pochwy kobiet z kandydozą pochwy i od zdrowych kobiet. Badanie przesiewowe I. [0068] Około 1 szczepów Lactobacillus, pochodzących z ludzkiej skóry, gardła, zębów, kału małych dzieci, warzyw i nasion, hodowano w bulionie MRS i wysiewano na płytki agarowe MRS. Płytki agarowe inkubowano w warunkach beztlenowych w 37 C. Dodatkowo agar SAB (Sabouraud) (LAB M, Bury, Wielka Brytania) wylewano na agar MRS i pozostawiano do zestalenia. Hodowlę C. albicans wysiewano na agar i płytki inkubowano w warunkach tlenowych w 37 C. Przeprowadzano wzrokową ocenę zahamowania wzrostu. Do dalszych badań przesiewowych (badań przesiewowych II) wybierano szczepy hamujące wzrost C. albicans w stopniu równym lub większym niż szczep referencyjny Lactobacillus plantarum LB931. Badanie przesiewowe II. [0069] Zawiesiny pałeczek kwasu mlekowego hodowane w bulionie dmrss (bulionie MRS bez dodatku octanu sodu) odwirowywano i sterylizowano przez przesączanie. W dalszej części taki przesącz nazywano przesączem wolnym od komórek Lactobacillus, LCS. Określoną objętość przenoszono do studzienek płytki do mikromiareczkowania i pozostawiano do wyschnięcia w powietrzu, a następnie resuspendowano w jałowej wodzie destylowanej do stężenia trzykrotnie wyższego i przenoszono do 96-studzienkowych płytek do mikromiareczkowania. Do wszystkich fiolek dodawano Candida (stosowano trzy izolaty odpowiednio C. albicans i C. glabrata). Hamowanie wzrostu oceniano wzrokowo, obserwując zmętnienie; ocenę przeprowadzały dwie osoby przy użyciu wzorca na skali od pięciu do zera. Studzienki zawierające silny wzrost Candida sp. w czystym bulionie dmrss oceniano na pięć punktów, natomiast studzienki bez widocznego wzrostu oceniano na zero punktów. Typowanie API i typowanie genetyczne [0070] Identyfikację do poziomu gatunku przeprowadzano przy użyciu systemu API 0 CHL (biomérieux, Francja), zgodnie z instrukcją producenta. Dane z badań fermentacji analizowano przy użyciu oprogramowania API Lab Plus. Typowanie genetyczne przeprowadzano przy użyciu DSMZ (Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH), wykonując częściową analizę sekwencji 16S rrna. Wyniki [0071] Wszystkie szczepy były oceniane pod względem hamowania zdolności wzrostu C. albicans w badaniu przesiewowym I. Do badania przesiewowego II wybrano 23 szczepy Lactobacillus, dla których wyniki były porównywalne lub lepsze niż dla LB931. Z 23 szczepów Lactobacillus, trzy stanowiły szczepy referencyjne, a większość szczepów wyizolowano z jamy ustnej. Figura I przedstawia hamowanie wzrostu przez każdy szczep Lac-

13 12 3 tobacillus, przy czym każdy słupek odpowiada średniemu wzrostowi odpowiednio trzech szczepów C. albicans i trzech szczepów C. glabrata. [0072] Wykazano, że inny 1 posiada wszechstronną zdolność hamowania wzrostu Candida. Żaden z badanych szczepów Lactobacillus nie wykazywał podobnej aktywności do innego 1 pod względem hamowania wzrostu C. albicans i C. glabrata. Szczep inny 1 określono jako Ess-1, a jego wzór fermentacji węglowodanów oraz typowanie genetyczne wykazało, że należy do gatunku Lactobacillus fermentum. Scharakteryzowanie Ess-1 [0073] 16S rdna szczepu Ess-1 (DSM 1781) poddano analizie przy użyciu DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) za pomocą bezpośredniego sekwencjonowania około nukleotydów amplifikowanego przy użyciu PCR 16S rdna. Ekstrakcję genomowego DNA, amplifikację przy użyciu PCR oraz oczyszczenie produktu PCR przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem (Rainey, F.A. i in. Int. J. Sys. Bacteriol. 1996(46):88-92). Oczyszczone produkty sekwencjonowano przy użyciu zestawu CEQ DTCS-Quickstart (Beckamn Coulter) zgodnie z instrukcją wytwórcy. [0074] Produkty reakcji sekwencjonowania poddano elektroforezie przy użyciu systemu do analizy genetycznej CEQ [007] Otrzymane dane dotyczące sekwencji umieszczono w edytorze uliniowienia ae2 (Maidak, B.L. i in. Nucl. Acids Res. 1999(27): ), uliniowiono manualnie i porównano z reprezentatywną sekwencją genu 16S rrna organizmu należącego do Firmicutes (Maidak, B.L. i in.). Do celów porównania, sekwencje 16S rrna uzyskano z bazy danych EMBL lub RDP (Maidak, B.L. i in.). [0076] W wyniku przeprowadzenia tej analizy, w poniższej tabeli 1 wymieniono te organizmy, których sekwencja genu 16S rrna wykazuje największe podobieństwo z sekwencją 16S rdna Ess-1. Tabela 1 Szczep % podobieństwa sekwencji genu 16S rrna z Ess-1 Lactobacillus fermentum ATCC ,3 Lactobacillus fermentum KRM 99,0 Lactobacillus malefermentans DSM 70 8, Lactobacillus rossiae ATCC BAA ,9 Lacrobacillus suebicus DSM ,9 Lactobacillus vaccinostercus DSM ,2 [0077] Częściowa sekwencja genu 16S rdna szczepu Ess-1 wykazuje najwyższe podobieństwo do Lactobacillus fermentum. W efekcie szczep Ess-1 może być szczepem Lactobacillus fermentum, ale może równie dobrze być nowym gatunkiem z rodzaju Lactobacillus. Przykład 2: Działanie wysokiej temperatury Cel [0078] Celem tego doświadczenia było zbadanie odporności na wysoką temperaturę substancji hamujących wzrost Candida, wytwarzanych przez szczep Ess-1. Metoda [0079] LCF poddano działaniu wysokiej temperatury (90 C) przez minut. Dodano C. albicans i C. glabrata w końcowym stężeniu około x 4 CFU ml -1. Płytki były inkubowane przez godzin w 37 C i wzrokowo oceniano wzrost Candida w fiolkach oraz oceniano w skali od pięciu do zera punktów.

14 Wyniki [0080] Przesącz szczepu Ess-1 poddany działaniu wysokiej temperatury był równie skuteczny pod względem hamowania wzrostu drożdżaków, jak niepoddany działaniu wysokiej temperatury przesącz stosowany dla porównania. Stąd działanie wysokiej temperatury na przesącz nie niszczy substancji czynnej wydzielanej przez tę bakterię. Przykład 3: Hamowanie C. albicans przez LCF z dodatkiem soli i kwasów Cel [0081] Celem niniejszego badania było określenie, czy sole i kwasy wpływają na wzrost Candida i czy można uzyskać polepszone hamowanie wzrostu po ich dodaniu do LCF szczepu Ess-1. Metoda sole [0082] W porcjach LCF doprowadzano ph do wartości pka dla każdej soli i suszono na powietrzu do czasu całkowitego wysuszenia, a następnie resuspendowano w 0,3% octanie sodu i propionianie sodu. C. albicans dodawano do końcowego stężenia około x 4 CFU ml -1. Frakcje inkubowano przez godzin w 37 C. Hamowanie oceniano wzrokowo, obserwując zmętnienie; ocenę przeprowadzały dwie osoby przy użyciu wzorca na skali od pięciu do zera. Studzienki zawierające silny wzrost Candida sp. w czystym bulionie dmrss oceniano na pięć punktów, natomiast studzienki bez widocznego wzrostu oceniano na zero punktów. Metody kwasy [0083] Kwas bursztynowy, kwas octowy, kwas propionowy i kwas askorbinowy dodawano do końcowego stężenia 0 mm do probówek zawierających LCF. Doprowadzano ph przesączu do wartości pka dla danego kwasu. C. albicans i C. glabrata dodawano do końcowego stężenia około x 4 CFU ml -1. Płytki inkubowano przez godzin w temperaturze 37 C i oceniano wzrost Candida w studzienkach wzrokowo oraz oceniano w skali od pięciu do zera punktów. Wyniki [0084] Wykazano, że różne kwasy i sole kwasów wywierają wpływ na wzrost C. albicans. Początkowo wykazano, że stężenie 0 nm w przesączach było najniższym stężeniem niezbędnym dla uzyskania efektu niektórych kwasów, a stężenie 0,1-0,3% do uzyskania efektu dodania soli. Najsilniejszy wpływ na C. albicans miały propionian sodu i kwas propionowy. Jak przedstawiono na Figurze 2a i b, dodatkowe działanie hamujące wzrost uzyskano po dodaniu do LCF Ess-1 kwasu askorbinowego (0 mm, pka i ph: 4,2) lub kwasu propionowego (0 mm, pka i ph: 4,87). To pokazuje, że działanie synergistyczne można uzyskać łącząc LCF Ess-1 z kwasami organicznymi i/lub ich solami. Stąd przewidujemy, że połączenie komórek Ess-1 z kwasami organicznymi i/lub ich solami może doprowadzić do uzyskania podobnego działania synergistycznego. Przykład 4: Analiza kwasów Cel [008] Celem tego badania było zbadanie, czy szczep Ess-1 wytwarza kwasy, które nie są wytwarzane lub są wytwarzane w mniejszej ilości przez inne szczepy Lactobacillus, i które mogłyby wyjaśnić silną zdolność hamowania wzrostu drożdżaków przez ten szczep bakterii. Metoda [0086] Ess-1 i inne szczepy Lactobacillus były hodowane w 4 ml bulionu dmrss (bulionu MRS bez dodatku octanu sodu) przez 18 godzin, odwirowywane w temperaturze C, z szybkością 00 obr./min przez minut. Supernatant sterylizowano przez przesączanie (0,22 µm, Millex, Billerica, MA, US) i zamrażano w - C do czasu wysłania do Steins Laboratorium A7S (Löddeköping, Szwecja) do analizy przy użyciu chromatografii cieczowej. Wyniki [0087] Jak widać na Figurze 3, szczep ESS-1 wytwarza więcej kwasu bursztynowego i

15 więcej kwasu octowego niż inne badane szczepy bakterii, co może być jedną z przyczyn doskonałej zdolności hamowania wzrostu drożdżaków przez ten szczep. Przykład : Przeżycie Ess-1 suszenia sublimacyjnego i przechowywania Cel [0088] Celem tego doświadczenia było sprawdzenie, czy Ess-1 przeżywa suszenie sublimacyjne i utrzyma żywotność po następczym przechowywaniu. Metoda [0089] Ess-1 hodowano w MRS, zagęszczano dziesięciokrotnie w % zawiesinie trehalozy. Zawiesinę zamrażano w - C w pojemniku z tworzywa sztucznego. Po 24 godzinach pojemnik wkładano do aparatu suszenia sublimacyjnego (Hetosicc, Heto Birkerød, Dania) i poddano obróbce przez 48 godzin. Końcowy produkt proszkowano i umieszczano w szczelnym pojemniku w celu dalszego przechowywania. W celu zwiększenia obciążenia, pojemnik przechowywano w temperaturze 37 C. Pobierano z niego próbki w tygodniu 0, 2, i 11. Żywe bakterie zliczano przez suspendowanie w proszku w roztworze sodu chlorku i wysiewano na płytki agarowe. Wyniki [0090] Szczep Ess-1 dobrze przetrwał suszenie sublimacyjne i zachował trwałość przez 11 tygodni; w tym czasie doszło tylko do spadku liczby żywych bakterii o jeden rząd wielkości. Po 17 tygodniach przechowywania, liczba żywych bakterii spadała o 4, rzędy wielkości. To wskazuje na bardzo dobrą przeżywalność bakterii, gdyż zazwyczaj przechowywanie odbywa się w temperaturze pokojowej lub w lodówce, a w takich temperaturach spadek przeżywalności bakterii odbywa się jeszcze wolniej. Przykład 6: Przeżycie szczepu Ess-1 po jego podaniu do pochwy w postaci kapsułek zawierających suszoną sublimacyjnie bakterię Cel: [0091] Zbadanie przeżycia i kolonizacji Ess-1 po jego podaniu do pochwy. Metoda [0092] Ess-1 hodowano w MRS, zagęszczano dziesięciokrotnie w % zawiesinie trehalozy i suszono sublimacyjnie, jak opisano wyżej. Po sproszkowaniu napełniano kapsułki żelatynowe (rozmiar 2, Apoteket AB, Gothenburg, Szwecja) materiałem w postaci proszku do stężenia około 1x 9 CFU na kapsułkę. W badaniu wzięły udział cztery ochotniczki, stosujące jedną kapsułkę w tygodniu przez jeden cykl miesiączkowy, rozpoczynając podawanie przed miesiączką. Uczestniczki badania samodzielnie pobierały próbki z pochwy, raz w tygodniu, przed podaniem kapsułki, pięciokrotnie obracając jałowy bawełniany patyczek wprowadzony na 3 cm do pochwy. Próbki wysiewano na płytkach agarowych i zliczano pałeczki kwasu mlekowego oporne na wankomycynę, morfologicznie zbliżone do Ess-1 i w związku z tym uznawane za Ess-1. Wyniki [0093] Na początku badania u żadnej z kobiet nie występował silny wzrost pałeczek kwasu mlekowego opornych na wankomycynę. Druga próbka pobrana kilka dni po rozpoczęciu miesiączki wykazała, że wszystkie kobiety zostały skolonizowane przez Ess-1. U niektórych kobiet stwierdzono Ess-1 w trakcie całego badania, a u innych w niektórych próbkach. Stąd kapsułki dopochwowe można wykorzystywać do kolonizacji pochwy w cyklu miesiączkowym. Dane przedstawiono w Tabeli 2. Tabela 2. Ilość Ess-1 stwierdzona w próbkach pobranych z pochwy kobiet uczestniczących w badaniu. Do badania włączono cztery kobiety i na początku badania żadna z nich nie była skolonizowana przez szczepy Lactobacillus oporne na wankomycynę (Przed). Dane przedstawiono w postaci log CFU ml -1. Symbolem - oznaczono brakujące próbki. Przed rozpoczęciem badania Próbka 2 Próbka 3 Próbka 4 Próbka Próbka 6 Kobieta 1 0 6,22 6,2 4,9,43 2,00

16 Przed rozpoczęciem badania Próbka 2 Próbka 3 Próbka 4 Próbka Próbka 6 Kobieta 2 0 4,70 0,00-4,4 4,28 Kobieta 3 0 1, - 4,22 3,8 - Kobieta 4 0 2,41 0, Przykład 7: Hamowanie wzrostu bakterii powodujących zakażenia, takie jak zakażenie dróg moczowych Cel [0094] Celem badania było zbadanie, czy Ess-1 wytwarza substancje, które hamują wzrost bakterii powodujących zakażenia, takie jak zakażenia dróg moczowych. Metoda [009] Stosowano zmodyfikowaną metodę pokrywania agarem. Ess-1 hodowano w bulionie MRS przez h. 1 ml hodowli bakteryjnej mieszano z 2 ml 7, M roztworu octanu sodu i 22 ml agaru MRS w 0 C i nalewano do szalek Petriego i zostawiano do zestalenia. Płytkę inkubowano w warunkach beztlenowych, w 37 C przez h. Dodatkową warstwę 24 ml agaru M17 wymieszano z 0,7 ml 6, M roztworu diwodorofosforanu potasu wylano na warstwę MRS i pozostawiono do zestalenia. W studzienkach tacy Bertraniego zawierających hodowle patogenów prowadzone przez noc zanurzono replikator Steera ze stalowymi pinami i odciśnięto w górnej warstwie agaru. Płytki pozostawiono do wyschnięcia na minut i inkubowano w temperaturze 37 C przez 24 h przed ich odczytem. Jako kontrolę stosowano jałowy bulion MRS. Rejestrowano ph zmierzone na górnej warstwie agaru po inkubacji i wzrost klasyfikowano jako wzrost lub brak wzrostu. Szczepy patogenne (łącznie 23 szczepy) wyizolowano od kobiet z zakażeniami dróg moczowych; obejmowały E. coli (4), Klebsiella sp. (4), E. faecalis (3), Enterobacter (4), Streptococcus Grupy B (3), S. aureus (2), S. saprophyticus (1) i P. mirabills (2). Wyniki [0096] Ess-1 hamował wzrost wszystkich patogenów, natomiast wszystkie patogeny rosły dobrze na płytce kontrolnej. ph wynosiło 6,0 na górnej warstwie agaru i w związku z tym nie miało żadnego wpływu na wzrost. Zastrzeżenia patentowe 3 1. Biologicznie czysty szczep Lactobacillus fermentum, szczep Ess-1, który został złożony w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, i któremu przydzielono numer dostępu DSM Biologicznie czysty szczep Lactobacillus fermentum, szczep Ess-1, który został złożony w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, i któremu przydzielono numer dostępu DSM1781, do stosowania medycznego. 3. Zastosowanie biologicznie czystego szczepu Lactobacillus fermentum, szczepu Ess-1, który został złożony w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, i któremu przydzielono numer dostępu DSM1781, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zapobiegania i/lub leczenia kandydozy. 4. Zastosowanie biologicznie czystego szczepu Lactobacillus fermentum, szczepu Ess-1, który został złożony w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, i któremu przydzielono numer dostępu DSM1781, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zapobiegania i/lub leczenia kandydozy pochwy.. Zastosowanie biologicznie czystego szczepu Lactobacillus fermentum, szczepu Ess-1, który został złożony w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, i któremu przydzielono numer dostępu DSM1781, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zapobiegania i/lub leczenia zakażenia bakteryjnego, takiego jak zakażenie dróg moczowych.

17 Zastosowanie biologicznie czystego szczepu Lactobacillus fermentum, szczepu Ess-1, który został złożony w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, i któremu przydzielono numer dostępu DSM1781, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do podawania doustnego. 7. Biologicznie czysty szczep Lactobacillus fermentum, szczep Ess-1, który został złożony w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, i któremu przydzielono numer dostępu DSM1781, do zapobiegania i/lub leczenia kandydozy. 8. Biologicznie czysty szczep Lactobacillus fermentum, szczep Ess-1, który został złożony w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, i któremu przydzielono numer dostępu DSM1781, do zapobiegania i/lub leczenia kandydozy pochwy. 9. Biologicznie czysty szczep Lactobacillus fermentum, szczep Ess-1, który został złożony w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, i któremu przydzielono numer dostępu DSM1781, do zapobiegania i/lub leczenia zakażenia bakteryjnego, takiego jak zakażenie dróg moczowych.. Biologicznie czysty szczep Lactobacillus fermentum, szczep Ess-1, który został złożony w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, i któremu przydzielono numer dostępu DSM1781, do podawania doustnego. 11. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca biologicznie czysty szczep Lactobacillus fermentum, szczep Ess-1, który został złożony w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, i któremu przydzielono numer dostępu DSM1781, ewentualnie z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, przy czym tym farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem jest trehaloza w postaci proszku lub innej postaci. 12. Kompozycja farmaceutyczna według zastrzeżenia 11, w której komórki biologicznie czystego szczepu Lactobacillus fermentum szczepu Ess-1 są suszone, tak jak suszone sublimacyjnie, suszone rozpryskowo lub suszone na powietrzu. 13. Kompozycja farmaceutyczna według któregokolwiek z zastrzeżeń 11-12, która stanowi zawiesinę, sprej, krem, proszek, czopek, kapsułka, suplement doustny lub wkładka dopochwowa. 14. Artykuł higieny osobistej zawierający biologicznie czysty szczep Lactobacillus fermentum, szczep Ess-1, który został złożony w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, i któremu przydzielono numer dostępu DSM Artykuł higieny osobistej według zastrzeżenia 14, dodatkowo zawierający kwas organiczny i/lub jego sól, taki jak kwas octowy, kwas propionowy, kwas mlekowy, kwas askorbinowy, fenyloalaninę, kwas cytrynowy, kwas masłowy, kwas walerianowy, kwas kapronowy, kwas bursztynowy i/lub jego sól. 16. Artykuł higieny osobistej według któregokolwiek z zastrzeżeń 14-, dodatkowo zawierający inne bakterie wytwarzające kwas mlekowy. 17. Artykuł higieny osobistej według zastrzeżenia 14-16, zawierający 4 do 11 jednostek tworzących kolonie (cfu), korzystnie 6 do cfu, a jeszcze korzystniej 8 do CFU, biologicznie czystego szczepu Lactobacillus fermentum, szczepu Ess-1, na produkt. 18. Artykuł higieny osobistej według któregokolwiek z zastrzeżeń 14-17, przy czym ten artykuł higieny osobistej jest artykułem chłonnym, takim jak produkt higieny osobistej dla kobiet, takim jak podpaska higieniczna, wkładka higieniczna, majtki higieniczne lub tampon; wkładki dla kobiet; pielucha i pieluchomajtki dla niemowląt i osób dorosłych z nietrzymaniem moczu i/lub stolca; podkład higieniczny lub wkładka pieluchowa. 19. Artykuł higieny osobistej według któregokolwiek z zastrzeżeń 14-17, przy czym ten artykuł higieny osobistej jest chusteczką higieniczną, taką jak myjka, ściereczka, chusteczka odświeżająca, serwetka, mokra chusteczka lub sucha chusteczka.. Sposób wytwarzania artykułu higieny osobistej do leczenia i/lub zapobiegania kandy-

18 17 dozie i/lub zakażeniom bakteryjnym, obejmujący dodawanie biologicznie czystego szczepu Lactobacillus fermentum, szczepu Ess-1, który został złożony w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, i któremu przydzielono numer dostępu DSM1781, do tego artykułu higieny osobistej. Uprawniony: SCA Hygiene Products AB Pełnomocnik: mgr Katarzyna Rudnicka Rzecznik patentowy

19 18

20 19