GENETYKA BAKTERII Materiały do ćwiczeń

Transkrypt

1 GENETYKA BAKTERII Materiały do ćwiczeń Przygotowane przez zespół pracowników Zakładu Genetyki Bakterii Zakład Genetyki Bakterii Instytut Mikrobiologii Wydział Biologii Uniwersytet Warszawski

2 SPIS TREŚCI 1. Mutageneza transpozonowa str Przeprowadzenie koniugacji szczepu zawierającego plazmid z Tn1 ze szczepami biorców E. coli lub S. marcescens dającymi możliwość eliminacji z mieszaniny koniugacyjnej szczepu dawcy 1.2. Wyselekcjonowanie transkoniugantów, do których został przeniesiony plazmid zawierający transpozon Tn1 1.3 Odszukanie wśród transkoniugantów (drogą analizy fenotypu) frakcji klonów, w których insercja kasety transpozycyjnej spowodowała inaktywację genu poddawanego mutagenezie 1.4. Potwierdzenie obecności transpozonu w genomach mutantów transpozonowych z wykorzystaniem procedury odzyskania plazmidu 2. Mutageneza spontaniczna i indukowana str Zbadanie częstości rewersji spontanicznych w szczepie E. coli AB1157 oraz w szczepie z mutacją w genie mut 2.2. Zbadanie częstości mutacji indukowanych UV, MMS i EMS w szczepie AB1157 i w AB1157 z delecją umudc 3. Test Rec-assay z wykorzystaniem wybranych szczepów E. coli str Badanie zwiększonego działania letalnego związków mutagennych na komórki E. coli posiadające mutacje w genach rec 4. Biofilmy bakteryjne str Metoda barwienia fioletem krystalicznym 5. Transdukcja ogólna przy udziale faga P1 str Otrzymanie lizatu fagowego o odpowiednio dużym mianie faga i możliwie dużej zawartości cząstek transdukujących, mianowanie lizatu 5.2. Zainfekowanie lizatem fagowym odpowiedniego szczepu biorcy. Zbadanie wpływu fenotypu szczepu biorcy (Rec + lub Rec - ) na wynik przekazywania genów chromosomowych i plazmidowych. 5.3 Szczegółowa analiza transduktantów (weryfikacja fenotypu oczyszczonych transduktantów, stwierdzenie występowania kotrandukcji pewych cech). 6. Oczyszczanie białek bakteryjnych i badanie ich zdolności do interakcji z DNA str Nadprodukcja zrekombinowanego białka antytoksyny 6.2. Przygotowanie żelu poliakryloamidowego i elektroforeza białek 7. Badanie interakcji białek str Reakcja sieciowania białek za pomocą aldehydu glutarowego 7.2. Wizualizacja produktów reakcji sieciowania białek 8. Podłoża str Metody str Zalecana literatura str. 24 2

3 1. Mutageneza transpozonowa Wykorzystanie wektora niosącego kasetę transpozycyjną do mutagenizacji genu gfp zlokalizowanego na plazmidzie E.coli oraz genów chromosomowych Serratia marcescens Transpozony (Tn) należą do elementów transpozycyjnych, a więc ruchomych elementów genetycznych zdolnych do zmiany miejsca w genomie w wyniku procesu zwanego transpozycją. Transpozycja jest typem rekombinacji nieuprawnionej, która nie wymaga homologii sekwencji nukleotydowych cząsteczek DNA uczestniczących w tym procesie i zależy od enzymu transpozazy kodowanej przez Tn. Wyróżnia się dwa mechanizmy transpozycji: konserwatywny i replikacyjny. Tn zwykle niosą geny warunkujące różne cechy fenotypowe. Dzielimy je na transpozony złożone, charakteryzujące się obecnością na obu końcach sekwencji insercyjnych, które okalają część centralną, niosącą geny niezwiązane z transpozycją, i Tn niezłożone, przypominające budową sekwencje insercyjne, lecz niosące geny kodujące cechy fenotypowe. Plazmid samobójczy pdstn1 wykorzystywany na ćwiczeniach niesie kasetę transpozycyjną Tn1 zawierającą gen oporności na kanamycynę. Nośnik kasety transpozycyjnej jest plazmidem mobilizowalnym. Dodatkowo jest wyposażony w gen lewanosacharazy (sacb), co pozwala na eliminację z puli uzyskanych mutantów klonów, w których doszło do integracji całego plazmidu z genomem biorcy. Schemat plazmidu pdstn1 przedstawiono na rycinie 1. IR tnp Km R ori R6K IR sacb PDSTn1 9,3 kpz Cm R Mob ori R6K Ryc. 1. Schemat plazmidu samobójczego do mutagenezy transpozonowej Celem ćwiczenia jest: wykorzystanie mutagenezy transpozonowej do insercyjnej inaktywacji genu gfp występującego w obrębie plazmidu w szczepie E. coli TG1 oraz genów chromosomowych Serratia marcescens. 3

4 Eksperyment obejmuje następujące etapy: 1.1. Przeprowadzenie koniugacji szczepu zawierającego plazmid z Tn1 ze szczepami biorców E. coli lub S. marcescens, dającymi możliwość eliminacji z mieszaniny koniugacyjnej szczepu dawcy Wyselekcjonowanie transkoniugantów, do których został przeniesiony plazmid zawierający transpozon Tn Odszukanie wśród transkoniugantów (drogą analizy fenotypu) frakcji klonów, w których insercja kasety transpozycyjnej spowodowała inaktywację genu poddawanego mutagenezie Potwierdzenie obecności transpozonu w genomach mutantów transpozonowych z wykorzystaniem procedury odzyskania plazmidu. Szczepy: E. coli S17-1 (pdstn1; Kan R ) Serratia marcescens (Rif R ) E. coli TG1 (psb1a2gfp; Rif R, Amp R ) Podłoża, roztwory i inne: - podłoże LB i LA - roztwory chloramfenikolu, rifampicyny, ampicyliny, kanamycyny, sacharozy - roztwory do izolacji całkowitego DNA - roztwory do izolacji plazmidowego DNA - roztwory do transformacji metodą wapniowo-rubidową - ligaza, bufor do ligazy - endonukleaza restrykcyjna MluI Wykonanie ćwiczenia: Dzień 1 1) Przeprowadzić koniugację szczepu E. coli S17-1 (Kan R ), będącego dawcą, ze szczepami biorców: - E. coli TG1 (Rif R Amp R ) - S. marcescens (Rif R ) Koniugację wykonać poprzez zmieszanie logarytmicznych hodowli biorcy i dawcy (hodowle odpłukane od antybiotyków) w proporcji 1:1 (np. 0,5 ml biorcy i 0,5 ml dawcy). Mieszaniny koniugacyjne inkubować 60 minut w 37 C. 2) Odpowiednie rozcieńczenia mieszaniny koniugacyjnej (10 0, 10-1 ) wysiać na podłoże selekcyjne: - LA z kanamycyną (50 μg/ml), ampicyliną (100 μg/ml), rifampicyną (50 μg/ml) i sacharozą (20%). Płytki inkubować 24 godz. w 37 C. - LA z kanamycyną, rifampicyną (50 μg/ml) i sacharozą (20%). Płytki inkubować przez 24 godz. w 30 C. 3) Transkoniuganty selekcjonować na podstawie różnic w zabarwieniu kolonii w porówaniu z koloniami biorców. Wybrane transkoniuganty przesiać posiewem redukcyjnym na szalki z odpowiednim podłożem. Płytki inkubować w 30/37 C przez 24 godz. 4) Z wyselekcjonowanych uprzednio klonów mutantów S. marcescens wyizolować całkowity DNA. 4

5 Dzień 2 5) Wykonać trawienie całkowitego DNA S. marcescens endonukleazą restrykcyjną MluI, a następnie autoligację strawionego DNA. 6) Wyizolować plazmidowy DNA z komórek E. coli TG1 uzyskanych po mutagenezie. 7) DNA plazmidowy E. coli TG1 przeanalizować elektroforetycznie pod kątem wielkości plazmidu w porównaniu z wielkością plazmidu szczepu wyjściowego. 8) Przygotować komórki kompetentne E. coli DH5αλpir metodą wapniowo-rubidową. Komórki transformować mieszaniną ligacyjną. Szalki (LB z kanamycyną) inkubować 24 h w 37 C. Dzień 3 9) Sprawdzić wydajność transformacji, z uzyskanych kolonii wyizolować DNA plazmidowy. Zsekwencjonować DNA plazmidu i określić lokalizację kasety transpozycyjnej. 5

6 2. Mutageneza spontaniczna i indukowana Mutageneza spontaniczna ma u swojej podstawy pomyłki replikacyjne polimeraz DNA, głównie polimerazy III DNA, prowadzące do wstawienia niekomplementarnej zasady do nowo syntetyzowanej nici DNA. Mutageneza indukowana różnymi czynnikami fizycznymi lub chemicznymi wynika głównie z modyfikacji zasad azotowych, a co za tym idzie zmiany w tworzeniu wiązań wodorowych z zasadą komplementarną. Powstające w DNA zmiany pierwotne, spontaniczne lub indukowane, jeśli nie zostaną naprawione, stanowią przyczynę mutacji, które zostają utrwalone zazwyczaj po dwóch rundach replikacyjnych. Escherichia coli, podobnie jak inne bakterie, wykształciła wiele systemów naprawczych. Pomyłki replikacyjne polimeraz DNA naprawiane są przez ich aktywność egzonukleolityczną oraz przez system naprawy niedopasowanych nukleotydów, w którym biorą udział białka Mut. Zmiany indukowane naprawiane są przez wiele systemów naprawy, np. naprawę bezpośrednią, naprawę przez wycinanie, naprawę rekombinacyjną, które odtwarzają pierwotną strukturę DNA, oraz przez jeden system naprawy za wszelką cenę tzn. naprawę błędną, w której kluczową rolę pełnią białka Umu. Celem eksperymentu jest porównanie częstości: 1) mutacji (tu mutacji powrotnych czyli rewersji) spontanicznych w szczepie E. coli AB1157 oraz w tym szczepie z mutacją w genie mut (którego produkt MutT bierze udział w naprawie mutacji spontanicznych); 2) mutacji indukowanych UV, MMS i EMS w szczepie AB1157 i w AB1157 z delecją umudc (co prowadzi do inaktywacji naprawy błędnej ). Szczepy: E. coli AB1157 thr-1 leub6 hisg4 (oc) arg E3 (oc) AB1157 thr-1 leub6 hisg4 (oc) arg E3 (oc) mut T AB1157 thr-1 leub6 hisg4 (oc) arg E3 (oc) umudc Podłoża: 1) Minimalne Davisa stałe a) bez treoniny (selekcja Thr + ) b) bez argininy (selekcja Arg + ) c) bez histydyny (selekcja His + ) 2) LB Wykonanie: 1) Nocne hodowle badanych szczepów (w LB) rozcieńczyć 1:50 (OD 600 ~ 0,1) świeżym podłożem LB (objętość końcowa około15 ml) i hodować z wytrząsaniem w 37 o C przez 1,5 2,5 h do osiągnięcia fazy logarytmicznej (OD 600 ~ 0,6). 2) Przygotowane hodowle logarytmiczne podzielić w następujący sposób: a) hodowlę AB1157 podzielić na cztery części po 2 ml, a następnie: cz 1-2 ml, pozostawić w 37 o C, 30 min (kontrola - mutageneza spontaniczna); cz 2-2 ml, dodać 17 l MMS (stężenie końcowe MMS 100 mm), a następnie inkubować próbę 15 min w 37 o C; 6

7 cz 3-2 ml, dodać 106 l EMS (stężenie końcowe EMS 0,5 M), a następnie inkubować próbę 30 min w 37 o C; cz 4-2 ml hodowli odwirować w chłodzie, zlać supernatant, a osad zawiesić w 2 ml jałowego buforu Davisa; przenieść hodowlę na plastikową szalkę Petriego i naświetlać 30 s UV (szalkę, a w dalszej części doświadczenia probówki z próbami po UV chronić przed światłem); b) 2 ml hodowli AB1157 mutt pozostawić w 37 o C, 30 min c) hodowlę AB1157 umudc podzielić na cztery części po 2 ml, a następnie: cz 1-2 ml, pozostawić w 37 o C, 30 min (kontrola - mutageneza spontaniczna); cz 2-2 ml, dodać 17 l MMS (stężenie końcowe MMS 100 mm), a następnie inkubować próbę 15 min w 37 o C cz 3-2 ml, dodać 106 l EMS (stężenie końcowe EMS 0,5 M), a następnie inkubować próbę 30 min w 37 o C cz 4-2 ml hodowli odwirować w chłodzie, zlać supernatant, a osad zawiesić w 2 ml jałowego buforu Davisa; przenieść hodowlę na plastikową szalkę Petriego i naświetlać 30 s UV (szalkę, a w dalszej części doświadczenia probówki z próbami po UV chronić przed światłem); 3) Następnie wszystkie próby przenieść do 8 ml podłoża LB i inkubować w 37 o C z wytrząsaniem 1 h. 4) Komórki odwirować w 4 o C przez 10 min na wirówce Sorval przy 8000 rpm., osad przemyć 5 ml buforu Davisa, ponownie odwirować i zawiesić w 1 ml buforu Davisa. Odpowiednie rozcieńczenia wysiewać na podłoża: a) LB 10-5, 10-6 ; inkubować 24 h w 37 o C b) minimalne Davisa His o, 10-1 Arg o, 10-1 Thr o, 10-1 płytki inkubować 2-3 doby w 37 o C 5) Obliczyć liczbę kolonii rewertantów wyrosłych na poszczególnych podłożach selekcyjnych, oraz liczbę kolonii wyrosłych na podłożu LB. Policzyć częstość mutacji w przeliczeniu na 10 8 komórek ze wzoru: ilość poszczególnych mutantów /ml x 10 8 ilość komórek na LB /ml 7

8 3. Test Rec-assay z wykorzystaniem wybranych szczepów E. coli Test Rec-assay pozwala na badanie letalnego działania związków mutagennych na komórki E. coli posiadające mutacje w genach rec. Komórki tych mutantów nie mają zdolności do naprawy uszkodzeń w DNA za pomocą rekombinacji, w przeciwieństwie do szczepów dzikich. Mają też osłabione pozostałe mechanizmy naprawcze, dlatego nawet niewielkie uszkodzenia w DNA powodują zahamowanie ich wzrostu. Szczepy: E. coli CSH51 szczep dziki E. coli CSH52 (reca - ) E. coli SK7881 ( recb) E. coli JC5703 (recc - ) E. coli SK7885 (recbc - ) E. coli JC5519 (recbcd - ) E. coli SK7892 (recbc - sbcb - ) E.coli JC7623 (recbc - socb - ) Podłoże: LA Wykonanie: 1. W centralnej części powierzchni płytki Petriego z LA za pomocą sterylnej pęsety umieścić krążek bibuły filtracyjnej. 2. Pobrać ezą inoculum z całonocnej hodowli szczepu E. coli (mutanta) i rozprowadzić w postaci pasma od brzegu krążka bibuły (ryc.1). Podobnie posiać na tej samej płytce szczep dziki, pod kątem ok. 90 o względem poprzedniego posiewu. 3. Na krążek nanieść 10 μl roztworu MMS, EMS lub 5 μl rifampicyny (5 mg/ml). Uwaga! Praca ze związkami mutagennymi, NALEŻY PAMIĘTAĆ O RĘKAWICZKACH. 4. Szalki inkubować 24 godziny w temperaturze 37 o C. 5. Po zakończeniu inkubacji zmierzyć długość strefy zahamowania wzrostu obu szczepów (od brzegu krążka do początku wzrostu). Porównać badany wzrost obu szczepów. Ryc.1. Sposób nanoszenia hodowli na płytkę w teście Rec-assay 8

9 4. Biofilmy bakteryjne Większość bakterii w środowisku naturalnym występuje w postaci biofilmu. Dotyczy to również bakterii patogennych, ponad 80% infekcji w ludzkim organizmie wywoływanych jest przez drobnoustroje, głównie bakterie, rosnące w tej właśnie postaci. Powszechnie uważa się że biofilm to osiadła społeczność komórek nieodwracalnie związana z jakąś powierzchnią, otoczona matriks złożoną najczęściej z polisacharydów. W matriks mogą znajdować się substancje nie mające komórkowego pochodzenia, jak np.: kryształy minerałów, cząsteczki gliny czy komórki. Biofilmy tworzą się nie tylko na powierzchniach stałych (biotycznych lub abiotycznych) lecz również na granicy faz np. woda/powietrze. W definicji biofilmu zawarte jest również stwierdzenie, że komórki, które go tworzą, wykazują zmieniony fenotyp, szczególnie jeśli chodzi o szybkość wzrostu oraz transkrypcję genów chromosomowych w porównaniu z bakteriami swobodnie żyjącymi. Dla przykładu, proteom komórek Pseudomonas aeruginosa rosnących w biofilnie jest inny niż wolnożyjących komórek tego gatunku, w przypadku komórek osiadłych dodatkowo silnie zależy on od charakteru podłoża. Biofilmy bada się różnymi metodami, począwszy od metod mikroskopowych, przez barwienie fioletem krystalicznym, po metody luminometryczne umożliwiające ocenę liczby żywych komórek w wytworzonym już biofilnie przez pomiar wydzielanego ATP (np. poprzez utlenianie lucyferazy w obecności ATP i tlenu cząsteczkowego). W ramach ćwiczeń, stosując klasyczną metodę barwienia fioletem krystalicznym, zbadamy zdolność do tworzenia biofilmów przez wybrane szczepy bakteryjne oraz sprawdzimy wrażliwość powstałych biofilmów na klasyczne i alternatywne środki antybakteryjne jak: antybiotyki- np. ampicylinę (Ap), związek pochodzenia roślinnego (o udokumentowanym działaniu antybakteryjnym) kwas oleanolowy (OA) oraz nanocząstki srebra (AgNPs). Celem ćwiczenia jest zbadanie: 1) zdolności do tworzenia biofilmów przez wybrane szczepy bakteryjne Szczepy: Escherichia coli MG1693 Escherichia coli MG1693 ΔhtpG Escherichia coli ATCC ΔdnaKdnaJ Wykonanie: Podłoża LB LB + Glc Uzupełnienia Km (50mg/ml) Metoda barwienia fioletem krystalicznym cz. I 1) Nocna hodowla bakterii w LB lub LB +Km (dla szczepów mutantów), 37 o C, 2) Rozcieńczyć hodowle 1:100 w LB lub LB +Glc nanieść po 200 l na płytki titracyjne, przykryć wieczkiem i inkubować 48 h w 37 o C 3) niezwiązane komórki usunąć delikatnie wytrząsając 4) przemyć dołki, w tym celu płytki zanurzyć w wodzie i lekko mieszać, po usunięciu wody odpłukane dołki barwi się fioletem krystalicznym (125 l r-r 0,1% na dołek) przez 10 min w temperaturze pokojowej 5) po 10 min barwnik zlać, a płytki przemyć 2x wodą przez zanurzenie 6) wodę usunąć, a szalki pozostawić do wyschnięcia 7) po wysuszeniu płytek barwnik rozpuścić, dodając do każdego dołka 200 l 95 % etanolu i inkubować pod przykryciem w temperaturze pokojowej przez 15 min 8) wykonać pomiar przy długości fali 570 nm (A 570 ). 9

10 5. Transdukacja ogólna przy użyciu faga P1 Horyzontalny transfer genów u prokariotów może odbywać się w wyniku bezpośredniego pobierania DNA ze środowiska (transformacja) lub za pośrednictwem ruchomych elementów genetycznych, takich jak plazmidy i transpozony koniugacyjne (koniugacja) lub bakteriofagi (transdukcja). W transdukcji materiał genetyczny dawcy przenoszony jest do biorcy w kapsydzie fagowym. Cząstki fagowe niosące w kapsydzie obcy materiał genetyczny nazywamy cząstkami transdukującymi. Mogą one zawierać DNA fagowy połączony kowalencyjnie z DNA gospodarza (dzieje się tak w wypadku transdukcji specyficznej) lub wyłącznie materiał genetyczny gospodarza (transdukcja ogólna). Do transdukcji specyficznej dochodzi w przypadku fagów, które w czasie szlaku lizogennego wbudowują swój genom w ściśle określone miejsce chromosomu gospodarza (np. fag E. coli. Z chwilą wejścia faga w szlak lityczny, z niewielką częstością, może zajść nieprawidlowe wycięcie profaga, w związku z czym powstaje hybrydowy DNA zawierający sekwencje profagowe z odcinkiem chromosomu znajdującym się po jednej bądź drugiej stronie genomu profaga. Tak więc w tym przypadku tylko ściśle określone geny gospodarza mogą by przenoszone przez cząstki transdukujące (dla λ są to geny gal lub bio). W transdukcji ogólnej uczestniczą cząstki transdukujące zawierające wyłącznie materiał genetyczny gospodarza. Powstają one w wyniku błędnego pakowania materiału genetycznego bakterii do główek fagowych w trakcie litycznego rozwoju faga. W przypadku takich fagów jak P1 (infekujący E. coli) teoretycznie każdy kawałek DNA, o odpowiedniej wielkości, może być przeniesiony w kapsydzie wirusa. Ze względu na mechanizm tworzenia cząstek transdukujących, praktycznie z równym prawdopodobieństwem, przeniesieniu może ulec każdy gen (dlatego proces ten nosi nazwę transdukcji ogólnej). Odcinek DNA gospodarza przenoszony w cząstkach transdukujących jest wielkością zbliżony do genomu fagowego. Na przykład genom P1 zawarty w główce fagowej liczy 100 kpz (co stanowi ponad 2% genomu E. coli) i tej wielkości fragmenty DNA są przenoszone w procesie transdukcji z jednego szczepu E. coli do innego. Przenoszony może być zarówno DNA chromosomowy jak i plazmidowy, jednak aby powstały stabilne transduktanty, w pierwszym przypadku musi dojść do wbudowania, w wyniku rekombinacji homologicznej, materiału do genomu biorcy, natomiast w drugim przypadku musi zostać odtworzony funkcjonalny replikon (oczywiście powinien on być zdolny do autonomicznej replikacji w nowym gospodarzu). Transdukcja ogólna była kiedyś wykorzystywana do mapowania blisko położonych genów (prawdopodobieństwo jednoczesnego przeniesienia dwu lub większej liczby genów zależy od ich odległości od siebie) oraz do konstrukcji szczepów bakterii o określonych cechach. Koniugacja, transdukcja i transformacja to procesy odgrywające ważną rolę w ewolucji prokariotów, bowiem w czasie pojedynczego wydarzenia organizmy te mogą uzyskać nowe cechy, przystosowujące je do zmieniającego się środowiska. Celem ćwiczenia jest: 1) wykazanie, że w procesie transdukcji mogą być przenoszone: a) geny chromosomowe, b) genom plazmidowy. 2) zbadanie wpływu fenotypu szczepu biorcy (Rec + lub Rec - ) na wynik przekazywania genów chromosomowych i plazmidowych. 10

11 Cały eksperyment transdukcji składa się z kilku etapów: 1) Otrzymanie lizatu fagowego o odpowiednio dużym mianie faga i możliwie dużej zawartości cząstek transdukujących poprzez przeprowadzanie co najmniej 2 cykli namnażania faga P1 na odpowiednim szczepie dawcy DNA (wrażliwym na P1 i niosącym cechę, którą chcemy przenieść). 2) Zainfekowanie lizatem fagowym odpowiedniego szczepu biorcy. Zawartość cząstek transdukujących w tzw. lizacie transdukującym wynosi nie więcej niż 0,3%, pozostałe cząstki fagowe to funkcjonalne wirulentne fagi. Fakt ten ma swoje implikacje w przebiegu całego procesu i wymaga spełnienia odpowiednich warunków technicznych, aby uzyskać pozytywny wynik transdukcji, np. stosowanie niskiej wielokrotności zakażenia (moi = 0,05, ang. multiplicity of infection), obecności jonów wapnia tylko w etapie adsorpcji. Dobór szczepu biorcy musi być przeprowadzony z uwzględnieniem kilku ważnych czynników, w tym: a) możliwości przeprowadzenia bezpośredniej selekcji odpowiednich transduktantów, b) lub możliwości uzyskania odpowiedniej klasy transduktantów poprzez wykorzystanie zjawiska kotransdukcji, c) zastosowania biorcy o aktywnym systemie rekombinacji ogólnej (RecA + RecBCD + ) w przypadku transdukcji genów chromosomowych, ponieważ włączenie wprowadzonego za pośrednictwem faga fragmentu DNA do chromosomu biorcy następuje w wyniku procesu rekombinacji homologicznej. 3) Selekcja transduktantów na odpowiednich podłożach selekcyjnych; 4) Szczegółowa analiza transduktantów (weryfikacja fenotypu oczyszczonych transduktantów, stwierdzenie występowania kotrandukcji pewych cech). Zadanie I. Transdukcja genów chromosomowych Celem eksperymentu jest przeniesienie mutacji recb ze szczepu dawcy Escherichia coli SK7881 ( recb/km r ) do dwóch szczepów biorcy: (i) E. coli MG1693 (RecB +, Km s, thya), (ii) E. coli JC5703 ( recc82 Km s ). Szczepy: Podłoża i roztwory: SK7881( recb/km r ) LA MG1693 (RecB + Km s thya); podłoże Davisa stałe JC5703 (recc82 Km s ) hydrolizat kazeiny (20 %) roztwór tyminy (1 mg/ml) roztwór kanamycyny (10 mg/ml) roztwór chloramfenikolu (50 mg/ml) roztwory do minilizy alkalicznej Wykonanie: Wariant 1 wykorzystanie szczepu MG1693 (Rec + ) jako biorcy 1) Namnożenie faga P1 na szczepie SK7881 (2 pasaże metodą płytek dwuwarstwowych). 2) Oznaczenie miana faga z użyciem E. coli AB1157 jako szczepu wskaźnikowego. 3) Infekcja szczepu MG1693 lizatem fagowym otrzymanym w punkcie 1 i selekcja transduktantów: 11

12 a) Km r na podłożu LA + Km (50 g/ml); b) ThyA + - na podłożu minimalnym Davisa uzupełnionym hydrolizatem kazeiny (stężenie końcowe 0,2%). 4) Analiza otrzymanych transduktantów metodą replik: a) transduktanty Km r (z punktu "3a") replikujemy na podłoża: - LA zawierające MMS (0,04 %); - LA zawierające MMS (0,055 %); - podłoże Davisa + hydrolizat kazeiny (0,2 %). b) transduktanty Thy + (z punktu "3b") replikujemy na podłoża: - LA z kanamycyna; - LA zawierajace MMS (0,04 %); - LA zawierające MMS (0,055 %). 5) Zestawienie i omówienie otrzymanych wyników. Wariant 2. - wykorzystanie szczepu JC5703 (Rec - ) jako biorcy 1) Przeprowadzenie infekcji szczepu E. coli JC5703 lizatem transdukującym otrzymanym w Zadaniu 1. Selekcja transduktantów na podłożu LA z kanamycyną. 2) Porównanie liczby transduktantów Km r uzyskanych w obu zadaniach. Zadanie II. Transdukcyjne przenoszenie genomów plazmidowych Plazmid pwmk3 zawarty w szczepie SK7297 ma wielkość 25 kb. Został skonstruowany przez sklonowanie fragmentu (o wielkości 19 kb) chromosomu E. coli, niosącego dzikie allele genów recbcd, w wektorze pochodnym pbr325 (6 kb) w miejsce BamHI. Markerem selekcyjnym plazmidu pwmk3 jest oporność na chloramfenikol (Cm r ). Szczepy: Podłoża i roztwory: E. coli SK7297 (pwmk3) Cm r LA E coli SK7881 ( recb/km r ) Cm s roztwór chloramfenikolu (50 mg/ml) E. coli MG1693 (Rec + Km s thya) Cm s roztwory do minilizy alkalicznej E. coli AB szczep wskaźnikowy Wykonanie: Wariant 1. Przeniesienie plazmidu pwmk3 ze szczepu SK7297 do szczepu MG1693 (Rec + ) Wariant 2. Przeniesienie plazmidu pwmk3 ze szczepu SK7297 do szczepu SK7881 (Rec - ). 1) Przygotowanie lizatu transdukującego poprzez namnożenie faga P1 na szczepie SK ) Oznaczenie miana faga z użyciem szczepu AB1157 jako szczepu wskaźnikowego. 3) Infekcja szczepów MG1693 oraz SK7881 lizatem transdukującym, selekcja transduktantów Cm r na podłożu LA+ Cm (20 g/ml). 4) Porównanie liczby transduktantów Cm r uzyskanych dla obu biorców. 5) Potwierdzanie obecności plazmidu pwmk3 w transduktantach Cm r poprzez wykonanie minilizy z 10 transduktantów i analizę elektroforetyczną preparatów DNA. Jako kontrolę należy zastosować preparaty DNA uzyskane z minilizy szczepu dawcy (SK7297). 6) Sprawdzenie wrażliwości na MMS transduktantów SK7881 Cm r metodą replik. Ponieważ plazmid pwmk3 niesie dziki allel genu recb winna nastąpić komplementacja chromosomowej mutacji recb obecnej w biorcy SK7881, a więc transduktanty powinny wykazywać fenotyp MMS r. 12

13 6. Oczyszczanie białek bakteryjnych i badanie ich zdolności do interakcji z DNA Ryc. 1. Model organizacji genetycznej i autoregulacji modułu addykcyjnego tad-ata. pet28b(+) (5368 pz) Ryc. 2. Wektor ekspresyjny pet28b(+) wykorzystany do nadprodukcji białka antytoksyny systemu addykcyjnego s045-s044. Dane na temat wektorów typu pet na stronie: 13

14 Celem ćwiczenia jest: 1) otrzymanie wydajnej nadekspresji białka 2) zapoznanie się z różnymi układami ekspresyjnymi 3) badanie interakcji białka z DNA Wykonanie: 6.1. Nadprodukcja zrekombinowanego białka antytoksyny 1. Odmłodzić hodowlę w stosunku 1: Po godzinie dodać IPTG do stężenia końcowego 0,2 mm. 3. Co 40 min zwirować 1 ml hodowli i zamrażać w -20 C Przygotowanie żelu poliakryloamidowego i elektroforeza białek 1. Przygotować żel rozdzielający, a po 30 min. zagęszczający. 2. Próbki zawiesić w 100 μl wody dejonizowanej i dodać 100 μl buforu lizującego do białek [2 x stężony; 0,125 M Tris HCl (ph 6,8), 10 % β-merkaptoetanol, 0,05 % błękit bromofenolowy, 20 % glicerol, 4 % SDS]. 3. Próbki inkubować 10 min w 100 C. 4. Nanieść 10 μl próbki na żel i przeprowadzić elektroforezę SDS-PAGE w 15 % żelu poliakryloamidowym w buforze glicynowym 1 x stężonym (0,025 M Tris base, 0,192 M glicyna, 0,1 % SDS). Elektroforezę prowadzić przy napięciu 70 V aż do wejścia prób w żel rozdzielający, wtedy należy zmienić napięcie na 150 V Badanie zdolności do interakcji zrekombinowanego białka antytoksyny z DNA 1. Wymieszać: Odczynnik kompetycyjny DNA (mieszanina zlinearyzownych plazmidów pabw3 i pcf430, w stosunku 1:1) bufor do EMSA [40 mm Tris-HCl (ph 8,0), 10 mm MgCl 2, 100 mm KCl, 1 mm ditiotreitol (DTT), 10% surowicza albumina wołowa (BSA)] Ilość -- 4 μl -- 4 μl rekombinowane białko Ata -- próbka nr 1 --> 0 μl próbka nr 2 --> 0,5 μl z roztworu rozcieńczonego 1:10 próbka nr 3 --> 0,5 μl z roztworu nierozcieńczonego woda dejonizowana -- próbka nr 1 --> 11 μl próbka nr 2 --> 10,5 μl próbka nr 3 --> 10,5 μl 2. Próby inkubować 10 min. w temp. pokojowej 3. Dodać 1 μl DNA grupa nr 1 --> fragment DNA oznaczony A grupa nr 2 --> fragment DNA oznaczony B grupa nr 3 --> fragment DNA oznaczony C grupa nr 4 --> fragment DNA oznaczony D 14

15 4. Próby inkubować 5 min. w temp. 37 C 5. Po obciążeniu 50 % glicerolem próbki nanieść na 2,4 % żel agarozowy. Elektroforezę prowadzić w 0,5 x stężonym buforze TBE (89 mm Tris base, 2,5 mm EDTA, 89 mm kwas borowy), w lodzie. Przez pierwsze 30 min przy napięciu 50 V, następnie przy napięciu 80 V. 6. Po rozdziale elektroforetycznym żel umieścić w wodnym roztworze bromku etydyny o końcowym stężeniu 0,5 mg/ml (5 min), a następnie płukać w wodzie (5 min). Wyniki rozdziału DNA analizować z wykorzystaniem transiluminatora UV. 15

16 7. Badanie interakcji białek Czynnikami sieciującymi są zarówno homo- jak i heterobifunkcyjne substancje, które mają odpowiednio identyczne lub różne grupy reaktywne. Najczęściej używane są odczynniki sieciujące, które: (i) mają identyczne grupy reaktywne (homobifunkcyjne), oddziałujące z pierwszorzędowymi grupami aminowymi (najczęściej lizyny), (ii) dobrze rozpuszczają się w środowisku wodnym, (iii) tworzą stabilne wiązania kowalencyjne z białkami. Odczynniki sieciujące mające identyczne grupy reaktywne dzielą się na dwie klasy: (i) odczynniki tworzące trwałe wiązania pomiędzy białkami (np. aldehyd glutarowy i estry imidowe) oraz (ii) odczynniki [np. ester N-hydroksyimidu kwasu bursztynowego (NHS)] tworzące nietrwałe wiązania, które mogą zostać przecięte w wyniku działania odpowiedniego czynnika redukującego [np. β-merkaptoetanol i ditiotreitol (DTT)]. aldehyd glutarowy Celem ćwiczenia jest: 1) zbadanie zdolności do oddziaływań pomiędzy białkami 2) zapoznanie się z różnymi metodami badań interakcji białek Wykonanie: 7.1. Reakcja sieciowania białek za pomocą aldehydu glutarowego 1. Wymieszać: Odczynnik Ilość 0,5 M bufor bicyna-naoh (ph 8,5) - 2 μl 4 M NaCl - 2 μl 1 mm ditiotreitol (DTT) - 2 μl aldehyd glutarowy - próbka nr 1 0 μl; próbka nr 2 0,5 μl z roztworu o stężeniu 0,1%; próbka nr 3 2 μl z roztworu o stężeniu 0,1%; próbka nr 4 1 μl z roztworu o stężeniu 1%; zrekombinowane białko Ata - grupa nr 1 2 μl (białko z domeną histydynową na końcu C ); grupa nr 2 3 μl (białko z domeną histydynową na końcu C ); grupa nr 3 2 μl (białko z domeną histydynową na końcu N ); grupa nr 4 3 μl (białko z domeną histydynową na końcu N ) woda dejonizowana - dopełnić do 20 μl RAZEM - 20 μl 2. Inkubować 20 min. w temp. pokojowej. 3. Dodać 2,5 μl 1,4 M roztworu etanoloamina-hcl (ph 8,0). 4. Inkubować 20 min. w temp. pokojowej. 5. Dodać 20 μl buforu lizującego do białek (2 x stężony). 6. Próbki inkubować 10 min w 100 C. 16

17 7. Nanieść próbki na żel i przeprowadzić elektroforezę SDS-PAGE w 15 % żelu poliakryloamidowym w buforze glicynowym 1 x stężonym (0,025 M Tris base, 0,192 M glicyna, 0,1 % SDS). Elektroforezę prowadzić przy napięciu 70 V aż do wejścia prób w żel rozdzielający, wtedy należy zmienić napięcie na 150 V Wizualizacja produktów reakcji sieciowania białek 1. Po przeprowadzonej elektroforezie umieścić żel na 10 min. w barwniku Coomasie Briliant Blue. 2. Przenieść do roztworu tzw. odbarwiacza mocnego i przeprowadzić 2 płukania po 10 min. 3. Przenieść do roztworu tzw. odbarwiacza słabego. 17

18 PODŁOŻA Podłoże LB (Luria broth) Bacto tryptone 10 g Bacto yeast Extract 5 g NaCl 5 g H 2 O dest. do 1000 ml ph 7,2; sterylizować 15 min w 121 o C. Podłoże LA (Luria agar) Do 200 ml podłoża LB dodać 3 g Bacto - agaru. Jałowić jak wyżej. Podłoże minimalne Davisa sole: K 2 HPO 4 bezw. KH 2 PO 4 bezw. (NH 4 ) 2 SO 4 bezw. MgSO 4 x 7H 2 O 14 g 6 g 2 g 0,2 g 1,0 g 400 ml Rozlać po 40 ml; jałowić 30 min. w 121 o C. cytrynian sodu H 2 O agaroid: agar-agar 3,0 g H 2 O dest. 150 ml glukoza 20% Podłoże płynne przygotowuje się przez zmieszanie: 150 ml H 2 O dest. 40 ml soli 4 ml glukozy Podłoże stałe otrzymuje się przez zmieszanie: 150 ml agaroidu (upłynnionego) 40 ml soli 4 ml 20% glukozy Bulion odżywczy (BO) Bulion suchy (Biomed) 15 g H 2 O dest. do 1000 ml Agar odżywczy (AO) Do 200 ml bulionu odżywczego dodać 3 g agaru-agaru. Jałowić jak wyżej. 18

19 METODY Miniliza alkaliczna (modyfikacja metody Birnboim i Doly, 1979) W metodzie tej wykorzystuje się fakt, że w wąskim zakresie ph (12,0-12,5) zachodzi wybiórcza denaturacja liniowej formy DNA, ale nie formy CCC. Komórki lizuje się całkowicie traktując je SDS i NaOH. DNA chromosomowy zostaje wybiórczo zdenaturowany, a kiedy lizat zostaje zobojętniony przez dodatek kwaśnego roztworu octanu sodu, DNA chromosomowy renaturuje i tworzy nierozpuszczalne agregaty. Jednocześnie pod wpływem wysokiego stężenia octanu sodu zachodzi wytrącenie kompleksów białek z SDS, a także wielkokocząsteczkowego RNA. W ten sposób ko-precypitacji ulegają trzy rodzaje największych makrocząsteczek mogących stanowić zanieczyszczenie preparatów DNA plazmidowego. Można je następnie usunąć poprzez jedno wirowanie. Supernatant zawiera przede wszystkim DNA plazmidowy (oraz resztki drobnocząsteczkowego RNA), który można odzyskać z supernatantu w wyniku wytrącenia etanolem. Materiały 1) Roztwór I: 50 mm glukoza 10 mm EDTA 25 mm Tris HCl (ph 8,0) 2) Roztwór II: 0,2 N NaOH 1% SDS 3) Roztwór III: octan potasu (ph~4,8) Roztwór III przygotowuje się, mieszając 60 ml 5 M octanu potasu z 11,5 ml lodowatwgo kwasu octowego i 28,5 ml H 2 O dest. Otrzymany roztwór jest 3 M względem potasu i 5 M względem octanu. Wykonanie: 1) Odwirować w probówce Eppendorfa 1,5 ml nocnej hodowli bakterii w LB (3 min, mikrowirówka) 2) Dokładnie zlać supernatant, osad zawiesić w 100 l zimnego roztworu I i inkubować 5 min w temp. pokojowej. 3) Dodać 200 l roztworu II, zawartość eppendorfówki wymieszać przez kilkukrotne odwracanie i inkubować w lodzie przez 5 min. 4) Dodać 150 l zimnego roztworu III, wymieszać i inkubować w lodzie przez 5 min. 5) Dodać 30 l mieszaniny fenolu z chloroformem i wymieszać łagodnie. 6) Odwirować 10 min. w mikrowirówce w temp. pokojowej. 7) Do zebranej fazy wodnej dodać 2 objętości (1ml) 96% etanolu i trzymać 15 min w zamrażarce. 8) Odwirować wytrącony DNA (10 min. w wirówce z chłodzeniem), zlać supernatant. 10) Przemyć osad 100 l 70% etanolu i odwirować 10 min w wirówce z chłodzeniem. 11) Dokładnie usunąć supernatant, wysuszyć osad (np. przez wstawienie otwartej eppendorfówki na 15 min do termostatu na 65 o C). 12) Osad zawiesić w 40 l buforu TE (ph 8,0). 19

20 Elektroforeza DNA w żelu agarozowym Elektroforeza DNA w żelu agarozowym jest standardową metodą pozwalającą wykryć obecność plazmidów w lizatach komórkowych, określić ich liczbę i wielkość, a także rozdzielić fragmenty DNA otrzymane po trawieniu plazmidów enzymami restrykcyjnymi. Tempo migracji cząsteczek DNA zależy od ich wielkości a także od użytych parametrów elektroforezy (stężenia agarozy, przyłożonego napięcia, użytego buforu i temperatury). Wykonanie: 1) Przygotować bufor elektrodowy Tris-octan (TAE ) o składzie: 0,04 M Tris-octan i 0,001M EDTA, ph 8,0. 2) Przygotować 0,8% agarozę w buforze elektrodowym, ogrzać do całkowitego rozpuszczenia, a następnie schłodzić do 60 o C. 3) Wlać agarozę do przygotowanego odpowiednio aparatu do elektroforezy z włożonym grzebieniem (grubość żelu powinna wynosić około 5 mm). 4) Po zestaleniu żelu wyjąć grzebień i wlać bufor elektrodowy w takiej ilości, aby przykrył żel cienką warstwą. 5) Wymieszać próbki DNA z buforem obciążającym (o składzie 0,25% błękit bromofenolowy, 30% glicerol) w proporcji 6:1 i nałożyć do studzienek w żelu przy pomocy pipety automatycznej. 6) Prowadzić elektroforezę, ustawiając zasilacz na wartość napięcia 100 V do momentu dojścia barwnika do 2/3 żelu. 7) Barwić żel przez 10 min. w roztworze bromku etydyny o stężeniu końcowym 0,5 g/ml. 8) Odpłukać bromek etydyny w wodzie destylowanej. 9) Obejrzeć żel pod lampą UV. Transformacja metodą rubidowo-wapniową (Kushner, 1978) Metoda ta pozwala uzyskać dla wielu szczepów E. coli wyższą wydajność transformacji niż standardowa metoda wapniowa. Podloża i roztwory: Podłoże LB i LA Roztwór I do transformacji 10 mm MOPS ph 7,0 10 mm RbCl Roztwór II do transformacji 100 mm MOPS ph 6,5 50 mm CaCl 2 10 mm RbCl 20

21 Wykonanie: 1) Nocną hodowlę E. coli rozcieńczyć 1 : 50 w świeżym podłożu LB (np. do 10 ml podłoża w kolbie a 100 ml dodać 0,2 ml hodowli). 2) Inkubować z wytrząsaniem w 37 o C do osiągnięcia gęstości około 1 x 10 8 /ml (co trwa około 2 godz.). 3) Odwirować 1,5 ml hodowli w probówkach Eppendorfa (3 min, mikrowirówka, 4 o C). 4) Zlać dokładnie supernatant, osad zawiesić w 1 ml jałowego roztworu I i odwirować jak wyżej. 5) Zlać dokładnie supernatant, a osad zawiesić w 0,2 ml jałowego roztworu II. 6) Zawieszone bakterie inkubować 15 min w lodzie. 7) Dodać DNA i trzymać przez dalsze 15 min w lodzie. 8) Przenieść na 50 sek. do łaźni wodnej o temp o C. 9) Natychmiast dodać 5 ml LB i inkubować w 37 o C bez wytrząsania przez 60 min. 10) Wysiać na odpowiednie płytki selekcyjne. Jeśli trzeba, komórki przed wysiewem można rozcieńczyć bądź zagęścić przez wirowanie. Izolacja całkowitego DNA (wg Chen i Kuo, 1993) 1) nocną hodowlę bakteryjną (1,5 ml) wirować przez 3 minuty przy obr./min. 2) osad zawiesić w 200 ul roztworu TESO, dodać 66 µl 5M NaCl, mieszać intensywnie przy użyciu worteksu przez 1 minutę i odwirować 4 minuty / 12 tys. obr./min. w temp. pokojowej 3) zebrać supernatant, dodać równą objętość mieszaniny fenol:chloroform (nasyconej 1M Tris HCl o ph 8,0) 4) mieszać intensywnie przy użyciu worteksu przez minutę i odwirować 5 minut (12 tys obr./min) 5) zebrać fazę wodną i dodać równą objętość chloroformu, zworteksować przez minutę i zwirować 5 minut jw. 6) do zebranej fazy wodnej dodać 2 objętości etanolu (96%) oraz 1/10 objętości roztworu III do lizy alkalicznej 7) DNA wytrącać przez 30 minut w -20 C 8) preparat odwirować 20 minut w 4 C, 12 tys obr./min. 9) osad przemyć 2 razy 70% etanolem, wysuszyć i zawiesić w 100 µl buforu TE TESO: 40 mm Tris-HCl (ph 8,0) 1mM EDTA (ph 8,0) 1% SDS 20 mm NaAc 21

22 Przygotowanie faga P1 do transdukcji (metoda płytek dwuwarstwowych) Materiały: podłoże płynne LB podłoże półpłynne LB (tzw."top agar"), zawierające 0,8% agaru. chloroform Wykonanie: 1) Zaszczepić 10 ml podłoża LB szczepem dawcy i inkubować przez noc w 37 o C bez wytrząsania. 2) Do hodowli dodać 0,1 ml 0,5 M jałowego roztworu CaCl 2 (stęż. końc. 5 mm). 3) Rozlać po 0,5 ml hodowli do 4 probówek i dodać faga P1: nr 1 - bez faga nr 2-0,1 ml faga nierozcieńczonego nr 3-0,1 ml faga rozcieńczonego w LB do 10-1 nr 4-0,1 ml faga rozcieńczonego w LB do ) Inkubować 10 min. w termostacie (37 o C) - adsorpcja. 5) Dodać 3 ml "top agaru" o temp o C. 6) Delikatnie wymieszać i wylać na powierzchnię płytki LB. 7) Po zakrzepnięciu agaru, płytkę odwrócić i inkubować w 37 o C przez noc. 8) Po inkubacji wybrać płytkę o odpowiednim stopniu lizy (tzw. "confluent lysis", tzn nie widać pojedynczych łysinek, ale liza nie powinna być kompletna). Zeskrobać jałową bagietką szklaną górną warstwę agaru półpłynnego, przenieść do jałowej probówki wirowniczej, powierzchnię agaru przepłukać 2 ml LB, przenieść do tej samej probówki; dodać 0,5 ml chloroformu i mocno wytrząsać. 9) Odwirować 4000 obrotów na min przez min. 10) Przenieść supernatant do fiolki zawierającej nieco chloroformu. 11) Powtórzyć cykl namnażania, używając w punkcie 3 lizatu otrzymanego w punkcie 10. Mianowanie lizatu fagowego 1) Do "nocnej" hodowli szczepu wskaźnikowego E. coli AB1157 lub do hodowli logarytmicznej dwukrotnie zagęszczonej dodać CaCl 2 do końcowego stężenia 5 mm. 2) Przygotować rozcieńczenia lizatu fagowego w LB (zwykle 10 o C -5, 10-6 oraz 10-7 ). 3) Zmieszać w probówce 0,1 ml bakterii wskaźnikowych i 0,1 ml rozcieńczonego lizatu. 4) Inkubować 20 min. w 37 o C (etap adsorpcji). 5) Dodać 1,5-1,8 ml półpłynnego podłoża LB o temp o C (mała objętość pozwala zwiększyć rozmiar łysinek P1, które są małe). Delikatnie wymieszać, i wylać na płytkę LB. 6) Po zakrzepnięciu płytki inkubować w 37 o przez noc. 7) Policzyć łysinki i obliczyć miano faga. Transdukcja 1) Nocną hodowlę szczepu biorcy rozcieńczyć 1 : 50 świeżym podłożem LB i inkubować z wytrząsaniem do gęstości około 1 x 10 8 /ml. 2) Hodowlę (5 ml) odwirować i zawiesić w 1/10 objętości podłoża LB (gęstość 1 x 10 9 /ml). 3) Zmieszać: - 0,5 ml zagęszczonej hodowli biorcy; 22

23 - 0,5 ml lizatu transdukującego rozcieńczonego w LB do gęstości 5 x 10 7 pfu/ml (co daje moi około 0,05); - 0,5 ml mieszaniny 0,005 M CaCl 2 i 0,03 M MgSO 4 (przygotowanej przez zmieszanie 3,0ml wody, 0,1 ml 0,5 M CaCl 2 i 0,1 ml 1 M MgSO 4 ). 4) Inkubować 20 min. w 37 o C. 5) Odwirować, przemyć 5 ml buforu Davisa, zawiesić w 1 ml tego buforu. 6) Wysiać 0,1 ml na płytkę selekcyjna, resztę zawiesiny odwirować, osad zawiesić w 0,1 ml buforu Davisa i wysiać na płytkę selekcyjną. 7) Inkubować co najmniej 2 dni Uwaga: Wykonać następujące kontrole: a) bez dodatku faga (na rewersję); b) bez bakterii - sprawdzenie, czy lizat fagowy jest pozbawiony bakterii. 23

24 Zalecana literatura 1) Kunicki-Goldfinger W.J.H. Życie bakterii. PWN, ) Salyers A.A, Whitt D.D. Mikrobiologia. PWN, ) Biologia molekularna bakterii PWN, 2006 pod redakcją J. Baj i Z. Markiewicza. 4) Brown T. A. Genomy. PWN, ) Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L. Biochemia. PWN,