GENETYKA BAKTERII Materiały do ćwiczeń

Transkrypt

1 GENETYKA BAKTERII Materiały do ćwiczeń Przygotowane przez zespół pracowników Zakładu Genetyki Bakterii Zakład Genetyki Bakterii Instytut Mikrobiologii Wydział Biologii Uniwersytet Warszawski 2008

2 1 SPIS TREŚCI Ćwiczenie 1 Badanie własności fenotypowych różnych rodzajów mutantów bakteryjnych 1 Ćwiczenie 2 Koniugacja 4 Ćwiczenie 3 Rola białek RecA i RecBC w rekombinacji i reperacji DNA 9 Ćwiczenie 4 Transdukacja ogólna przy użyciu faga P1 12 Ćwiczenie 5 Mutageneza transpozonowa 15 Ilustracje 18 Podłoża 22 Metody 23 Mini liza alkaliczna 23 Elektroforeza DNA w żelu agarozowym 24 Transformacja metodą rubidowo-wapniową 24 Przygotowanie zawiesiny faga P1 do transdukcji 25 Mianowanie lizatu fagowego 26 Transdukcja 26

3 2 Ćwiczenie 1. Badanie własności fenotypowych różnych rodzajów mutantów bakteryjnych Powodzenie każdego eksperymentu genetycznego uwarunkowane jest użyciem szczepów bakteryjnych charakteryzujących się właściwym i dokładnie określonym fenotypem. W przypadku fenotypu mutantów polimerazowych (np. w genach pola i dnae ) ze względu na różne zapotrzebowanie białek polimeryzacyjnych, których te mutacje dotyczą (funkcjonalna polimeraza III wymagana jest bezwzględnie w każdych warunkach, natomiast funkcja polimerazy I może być przejęta przez inne białko/a), można określić, czy są to mutanty obligatoryjne czy fakultatywne (temperaturowrażliwe), poprzez badanie ich zdolności do wzrostu w warunkach restrykcyjnych (42 o C). Polimeraza I, inaczej niż polimeraza III, obok udziału w procesie replikacji chromosomu bakteryjnego pełni kluczową rolę w innych procesach komórkowych, jak rekombinacja i reperacja DNA. Zdolność szczepów bakteryjnych do naprawy uszkodzeń DNA można określić poprzez badanie wzrostu w obecności czynnika uszkadzającego DNA (np. MMS) i to pozwala na określenie i zróżnicowanie fenotypu mutantów polimerazowych defetywnych w genach pola i polc. Fenotyp mutantów defektywnych w inicjacji replikacji (dnaa) i elongacji łańcucha DNA (dnab) określa się poprzez badanie zdolności do replikacji chromosomu, a pośrednio zdolności do wzrostu w warunkach restrykcyjnych (42 o C). Inaktywacja białek inicjacyjnych (np. DnaA) koniecznych do wytworzenia nowych widełek replikacyjnych w miejscu origin, hamuje replikację z opóźnieniem, natomiast inaktywacja białek elongacyjnych prowadzi do natychmiastowego zahamowania procesu replikacji. Do drugiej grupy białek należy helikaza DnaB, chociaż należy pamiętać, że jest ona istotna również na etapie inicjacji. Zaobserwowanie zróżnicowania tempa zahamowania replikacji DNA w warunkach restrykcyjnych (42 o C) w obu typach mutanatów możliwe jest po wykonaniu eksperymentu określającego włączanie radioaktywnej zasady azotowej, np. tyminy. Śledzenie wzrostu poprzez wyznaczenie krzywej wzrostu w temperaturze permisyjnej (36 o C) i restrykcyjnej (42 o C) i ich porównanie daje zróżnicowanie fenotypów mutantów w genach dnaa i dnab, w wyniku pochodnego efektu wpływu temperatury na replikację DNA. Określenie zdolności do wzrostu mutantów defektywnych w genach dnaa i dnab w temperaturze 36 o C i 42 o C pozwala jedynie stwierdzić, że oba te mutanty są mutantami fakultatywnymi, gdyż funkcjonowanie białek DnaA i DnaB jest bezwzględnie wymagane w procesie replikacji. Istnieją pewne rodzaje mutantów szczególnie często stosowanych w badaniach genetycznych ze względu na możliwość selekcji biorcy po zajściu transferu materiału genetycznego. Należą do nich: mutanty żywieniowe (auksotroficzne), mutanty opornościowe (np. na antybiotyki lub fagi) oraz mutanty kataboliczne, które utraciły zdolność do rozkładu określonych związków organicznych. Fenotyp tych grup mutantów sprawdza się, stosując różne typy podłoży minimalnych, różnicujących, wybiórczych. Celem ćwiczenia jest: badanie fenotypu wymienionych wyżej rodzajów mutantów. Zadanie I. Mutanty polimerazowe w genach pola i dnae Szczepy: Podłoża E. coli W3110 pola Podłoże LB i LA E. coli dziki typ E. coli dnae48 mutant polc

4 3 1) Nocne hodowle szczepów w LB rozcieńczyć 1:20 świeżym podłożem i inkubować około 2 godz. w wytrząsarce w 37 o C. 2) Do rozpuszczonego i schłodzonego podłoża LA dodać sulfonian metanometylowy (MMS) w ilości 40 μl na 200 ml podłoża. Wymieszać, rozlać na płytki. 3) Przygotować płytki z podłożem LA bez MMS. 4) Płytki podzielić na 3 sektory - na każdy sektor wysiać jeden szczep. Należy wysiać szczepy na 2 płytki LA z MMS i 2 płytki LA. Po jednej płytce z każdego rodzaju wstawić do inkubacji w o C i w 42 o C przez 24 godz. 5) Sprawdzić, gdzie wystąpił wzrost bakterii. Zinterpretować wyniki. Zadanie II. Mutanty defektywne w inicjacji i elongacji łańcucha DNA (w genach dnaa i dnab) Szczepy: Podłoża i roztwory E. coli CRT83 dnaa LB (uzupełnione tyminą) E. coli CRT266 dnab płyn fizjologiczny (RF) 1) Z pojedynczej kolonii badanego szczepu na agarze odżywczym sporządzić zawiesinę bakterii w około 2 ml płynu fizjologicznego. 2) Kroplę każdej zawiesiny dodać do 2 probówek z 5 ml podłoża LB. 3) Po posianiu zawiesiny, jedną probówkę inkubować w temp o C, a drugą w 42 o C. 4) Po 24 godz inkubacji obserwować wzrost w postaci zmętnienia. Zadanie III. Mutanty auksotroficzne, defektywne w wykorzystywaniu różnych źródeł węgla i opornościowe Szczepy: E. coli HfrC - prototrof E. coli AB1157 thr leu ara pro lac T6 r gal λ s his xyl mtl arg thi Str r Podłoża i roztwory podłoże minimalne płynne Davisa agar odżywczy EMB r-ry aminokwasów: treoniny, leucyny, proliny, histydyny, argininy (1mg/ml) r-r tiaminy (0,1 mg/ml) r-r streptomycyny (5 mg/ml) r-r chlorku tetrazoliowego (5 mg/ml) r-r laktozy 20%) Przygotowane roztwory dodaje się w ilości 1 ml na 100 ml podłoża. Przygotowanie podłoży: 1) Minimalne płynne Davisa: do 150 ml jałowej wody destylowanej dodać 40 ml soli Davisa i 4 ml 20% glukozy. Wymieszać. Rozlać do probówek po 5 ml.

5 4 2) Agar odżywczy ze streptomycyną: do kolby zawierającej 200 ml agaru odżywczego dodać roztwór streptomycyny do końcowego stężenia 50 μg/ml. Rozlać na płytki. 3) Agar odżywczy z tetrazolem: do 200 ml upłynnionego agaru odżywczego dodać roztwór chlorku tetrazoliowego do końcowego stężenia 50 μg/ml oraz 10 ml 20% laktozy. Wymieszać, rozlać na płytki. 4) Podłoże EMB z laktozą: do 200 ml rozpuszczonego podłoża dodać po 2 ml roztworu barwników (eozyna i błękit metylenowy) oraz 10 ml 20% laktozy. Wymieszać, rozlać na płytki. Z pojedynczej kolonii danego szczepu na agarze odżywczym sporządzić zawiesinę bakterii w płynie fizjologicznym (około 2 ml). 1) Sprawdzenie wymagań pokarmowych szczepów: Do probówek zawierających po 5 ml podłoża Davisa dodać po 0,1 ml potrzebnych do wzrostu czynników (wg schematu podanego przez prowadzącego ćwiczenia). Do każdej probówki dodać następnie po kropli zawiesiny badanego szczepu. Inkubować przez 24 godz. w 37 o C. 2) Sprawdzenie wrażliwości na streptomycynę: Na płytkę zawierającą agar odżywczy ze streptomycyną wysiać rysą badany szczep. Inkubować w 37 o C przez 24 godz. 3) Badanie zdolności szczepu do fermentowania laktozy: a) na płytkę agaru odżywczego z laktozą i tetrazolem wysiać badany szczep metodą posiewu redukcyjnego. Inkubować 24 godz. w 37 o C. Kolonie zdolne do fermentowania laktozy są białe; zabarwienie czerwone świadczy o braku zdolności do fermentacji tego cukru. b) na płytkę podłoża EMB z laktozą wysiać badany szczep metodą posiewu redukcyjnego. Inkubować 24 godz. w 37 o C. Kolor bladoróżowy kolonii świadczy o braku zdolności do fermentowania cukru, kolor bordowo-granatowy o zdolności do fermentacji. 4) Sprawdzenie wrażliwości na fagi: Na powierzchnię agaru odżywczego nanieść grubą rysą (przy pomocy pipety) zawiesinę faga. Po wsiąknięciu zawiesiny faga wysiać badany szczep rysami prostopadłymi prowadzonymi w jednym kierunku. Po 24 godz. inkubacji w 37 o C obserwować, czy wystąpiła liza bakterii. Po odczytaniu wyników na wszystkich podłożach porównać własności fenotypowe badanych szczepów z ich genotypem podanym w opisie szczepu.

6 5 Ćwiczenie 2 Koniugacja Koniugacja to bardzo wyspecjalizowany proces, podczas którego przekazywanie DNA z komórki dawcy do biorcy wymaga bezpośredniego kontaktu komórek - partnerów koniugacyjnych. Bakteryjne systemy koniugacyjne uwarunkowane są obecnością w komórkach dawców plazmidów koniugacyjnych. Prototypem takiego plazmidu, rezydującego w komórkach E. coli, jest plazmid F (rys. 1), który może występować w formie autonomicznej (komórki typu F + ) lub w formie zintegrowanej z chromosomem (komórki typu Hfr). Te ostatnie charakteryzują się dużą częstością przekazywania markerów chromosomowych i z tego właśnie powodu były wykorzystywane do sporządzania map genetycznych chromosomów. Znanych jest bardzo wiele szczepów Hfr, w których określone są miejsca integracji plazmidu F z chromosomem oraz punkt początkowy i kierunek przekazywania materiału genetycznego do komórki biorcy (rys. 3). Celem ćwiczenia jest: 1) otrzymywanie dawcy o wysokiej częstości przekazywania chromosomu (Hfr); 2) określenie czasu wejścia markerów dawcy do komórki biorcy podczas koniugacji przerywanej, co daje informację o wzajemnym położeniu i odległości między genami (wyrażonej w minutach); 3) mapowanie chromosomu bakteryjnego metodą analizy sprzężeń; 4) zapoznanie się z różnymi typami i metodami koniugacji. Zadanie I. Otrzymywanie dawcy o wysokiej częstości przekazywania chromosomu (Hfr) metodą koniugacji kroplowej na podłożu stałym Przed eksperymentem koniugacyjnym celowe jest wyprowadzenie czystej hodowli szczepu Hfr, który ma w pełni funkcjonalny system transferu materiału genetycznego, a więc daje wysoką częstość uzyskiwania rekombinatów. Wykonuje się to przy pomocy prostego testu z zastosowaniem koniugacji kroplowej na podłożu stałym. Szczepy Dawca - Escherichia coli HfrC Biorca E.coli AB1157 Podłoża podłoże selekcyjne Davisa płynne i stałe, (z odpowiednimi uzupełnieniami) agar odżywczy płyn fizjologiczny (RF) a) Szczep Escherichia coli HfrC rozsiać na pojedyncze kolonie na agarze odżywczym. b) Z czterech kolonii HfrC oraz hodowli szczepu AB1157 założyć nocne hodowle w odpowiednio wzbogaconym podłożu Davisa. c) Przygotować płytki z podłożem selekcyjnym dla rekombinantów Pro + Str r (na bazie podłoża Davisa). d) Odwirować 2ml nocnej hodowli biorcy AB1157 i zawiesić w takiej samej objętości RF. e) Na płytkę z podłożem selekcyjnym wysiać 0,1 ml nierozcieńczonej zawiesiny biorcy AB1157 i rozprowadzić głaszczką po powierzchni podłoża. f) Na powierzchnię płytki z wysianym biorcą nanieść krople (po 50 μl) nierozcieńczonych hodowli dawcy (uzyskane z pojedynczych kolonii) poczekać, aż płyn wsiąknie a następnie wstawić do inkubacji w 37 o C na 48 godz.

7 6 g) Ocenić liczbę powstałych rekombinantów w poszczególnych próbach. Wybrać klon dawcy dający najwyższą liczbę rekombinantów. h) Wybrany klon dawcy zastosować do dalszych eksperymentów. Zadanie II. Określenie czasu wejścia markerów dawcy do komórki biorcy metodą koniugacji przerywanej Szczepy: E. coli HfrC - prototrof Str s E. coli AB1157 F - thr leu ara proa lac T6 r gal λ s his xyl mtl arge thi Str r Podłoża i roztwory: minimalne Davisa - płynne i stałe agar odżywczy roztwory: aminokwasów, hydrolizatu kazeiny, tiaminy, streptomycyny płyn fizjologiczny 1) Nocne hodowle szczepów w odpowiednio uzupełnionym podłożu Davisa (wymagane czynniki wzrostowe i hydrolizat kazeiny) rozcieńczyć 1:20 świeżym podłożem i inkubować z wytrząsaniem w 37 o C do uzyskania hodowli w fazie wzrostu logarytmicznego (około 2 godz). 2) Przygotować: - odpowiednią liczbę probówek zawierających po 4,5 ml podłoża Davisa (bez glukozy) ze streptomycyną w stężeniu 1 mg/ml, - płytki z agarem odżywczym, - płytki z podłożem selekcyjnym dla rekombinantów Pro + Str r, Thr + Leu + Str r i Arg + Str r, - odpowiednią ilość probówek zawierających po 4,5 ml płynu fizjologicznego do rozcieńczania. 3) W celu określenia ilości komórek dawcy w hodowli logarytmicznej wysiać rozcieńczenia 10-5 i 10-6 hodowli na agar odżywczy. Wstawić płytki do inkubacji na 24 godz. w 37 o C. 4) Koniugacja - zmieszać 1 ml logarytmicznej hodowli dawcy z 9 ml logarytmicznej hodowli biorcy. Inkubować w 37 o C przez 60 min. 5) Bezpośrednio po zmieszaniu (czas 0), a następnie w czasach wskazanych w tabeli, pobierać 0,5 ml próbki mieszaniny koniugacyjnej i przenosić je do probówek zawierających podłoże Davisa ze streptomycyną (będzie to rozcieńczenie 10-1 mieszaniny koniugacyjnej). Wytrząsnąć na worteksie i wysiać na podłoża selekcyjne (każde rozcieńczenie w 2 powtórzeniach). Inkubować w 37 o C przez 48 godz. 6) Policzyć kolonie poszczególnych typów rekombinantów i szczepu dawcy. Podać liczbę kolonii na płytkach, liczbę bakterii w 1 ml i częstość rekombinacji dla każdego markera. Sporządzić wykres liczby selekcjonowanych typów rekombinantów w zależności od czasu trwania koniugacji. Określić czas wejścia markerów do komórki biorcy. 7) Sprawdzić rewersję poszczególnych markerów biorcy przez wysiew nierozcieńczonych hodowli logarytmicznych na wszystkie rodzaje płytek selekcyjnych.

8 7 Selekcja rekombinantów Czas pobierania próbek mieszaniny koniugacyjnej [min] i rozcieńczenia wysiewane na podłoża selekcyjne: Pro + Str r Tre + Leu + Str r Arg + Str r Zadanie III. Mapowanie chromosomu bakteryjnego metodą analizy sprzężeń Należy sprawdzić zdolność rekombinantów Pro + Str r (pro - marker proksymalny), uzyskanych po 60-minutowej koniugacji HfrC i F - AB1157, do syntezy innych aminokwasów, kodowanych przez geny dystalne w stosunku do genu pro. Liczbę rekombinantów Pro + Str r, które są równocześnie Thr + Leu + lub Arg + lub His + można określić, stosując metodę replik, co pozwoli na przeprowadzenie tzw. analizy sprzężeń. Podłoża Minimalne Davisa Uzupełnienia podłoży jak w Zadaniu II. 1) Przygotować płytki z podłożami selekcyjnymi dla rekombinantów: a) Thr + Leu + c) His + b) Arg + d) Pro + 2) Materiał z kolonii rekombinantów Pro + Str r przenieść metodą replik (przy pomocy jałowych wykałaczek) na płytki z przygotowanymi podłożami selekcyjnymi. 3) Po inkubacji (48 godz. w 37 o C) określić procent rekombinantów Pro + Str r, które są równocześnie: (i) Thr + Leu + (ii) Arg + (iii) His +. 4) Na podstawie procentu sprzężenia z markerem proksymalnym określić ułożenie pozostałych markerów w stosunku do orit. Zadanie IV. Metody koniugacji na podłożu stałym Koniugacja na podłożu stałym (kroplowa) stosowana jest do szybkiej, szacunkowej oceny wydajności tworzonych rekombinantów, w przypadku przekazywania cech chromosomowych jak też częstości powstawania transkoniugantów w przypadku przekazywania plazmidów. Metody koniugacji na podłożu stałym pozwalają ponadto na zwiększenie częstości uzyskiwanych rekombinantów w wyniku bardziej stabilnego kontaktu komórek koniugujących i z tego względu stosuje się je w przypadkach spodziewanej niskiej wydajności koniugacji oraz w przypadkach użycia dawcy niosącego plazmid niekoniugacyjny.

9 8 A. Koniugacja międzygatunkowa Szczepy: Podłoża i roztwory: dawca: E. coli ECF270(pFL129) Cm r Tc r podłoże LB płynne biorcy: a) E. coli MC1061 Rif r agar odżywczy b) Klebsiella pneumoniae Rif r płyn fizjologiczny r-ry: tetracykliny, ryfampicyny Wykonanie a) Przygotować nocną hodowlę szczepu dawcy w podłożu LB z chloramfenikolem (20 μg/ml) lub tetracykliną (20 μg/ml) oraz hodowle biorców w podłożu LB bez antybiotyków. Inkubować w 37 o C z wytrząsaniem. b) Doprowadzić gęstości wszystkich hodowli do tej samej wartości. c) Hodowlę dawcy odwirować i osad zawiesić w podłożu LB bez antybiotyku. d) Zmieszać hodowlę dawcy z każdym z biorców w stosunku 1:1 (100 μl μl) w probówkach Eppendorfa i odwirować (3-5 min). e) Po dokładnym wylaniu supernatantu, osad w każdej probówce zawiesić w 25 μl LB. f) Nanieść 20 μl mieszaniny koniugacyjnej na jałowy filtr nitrocelulozowy umieszczony na powierzchni agaru odżywczego. Inkubować 2 godz w 37 o C. g) Każdy filtr umieścić w probówce Eppendorfa (używając opalonej pensety), zalać 200 μl LB i wytrząsnąć tak, aby zmyć bakterie z filtra (to już jest rozcieńczenie 10-1 ). h) Mieszaniny koniugacyjne rozcieńczyć do 10-2 (50 μl mieszaniny do 450 μl RF), wysiać rozc i 10-2 (po 2 płytki z każdego) na podłoża selekcyjne: - agar odżywczy z tetracykliną (20 μg/ml) i ryfampicyną (50 μg/ml) dla biorcy E. coli - agar odżywczy z tetracykliną (5 μg/ml) i ryfampicyną (50 μg/ml) dla biorcy Klebsiella pneumoniae. i) Inkubować w 37 o C przez 24 godz lub dłużej. Porównać liczbę transkoniugantów uzyskanych w obu krzyżówkach. B. Koniugacja trójrodzicielska Szczepy: dawca D1: E. coli DH5α (prk2013) Km r dawca D2: E. coli TG1 (prk404) Tc r biorca: E. coli MC1061 Rif r Podłoża i roztwory: podłoże LB płynne i stałe r-ry: kanamycyny, tetracykliny, ryfampicyny a) Przygotować nocne hodowle szczepów: (i) MC1061 w podłożu LB, (ii) DH5α w LB z kanamycyną (50 μg/ml), (iii) TG1 w LB z tetracykliną (20 μg/ml). b) Nocne hodowle dawców odwirować (po 1,5 ml), przemyć podłożem LB bez antybiotyków, ponownie odwirować i zawiesić w tej samej objętości podłoża. c) Zmieszać w probówce Eppendorfa hodowle rodzicielskie w proporcjach: DH5α (100μl) + TG1 (100 μl) +MC1061 (200 μl) d) Wysiać na płytkę z podłożem LB 100 μl tak przygotowanej mieszaniny lekko rozprowadzając ją na środku płytki. e) Przygotować równocześnie kontrolę przez zmieszanie szczepów: TG1 (100 μl) + MC1061 (200 μl) + LB (100 μl)

10 9 i wysiać 100 μl tej mieszaniny na płytkę z podłożem LB (jak wyżej). f) Płytki inkubować w 37 o C przez 2 godziny. g) Każdą płytkę z mieszaniną koniugacyjną spłukać 1 ml RF, zebrać pipetą do probówki Eppendorfa (to już jest rozcieńczenie 10-1 ) i rozcieńczyć do h) Wysiać mieszaninę koniugacyjną na: - podłoże selekcyjne: agar odżywczy z tetracykliną (20 μg/ml) i ryfampicyną (50 μg/ml), rozcieńczenia 10-1, 10-2 i 10-3 (po 2 powtórzenia); - agar odżywczy z ryfampicyną (50 μg/ml) rozcieńczenia 10-5, 10-6 (w celu określenia ilości biorcy w tej mieszaninie). i) Wysiać mieszaninę kontrolną (rozcieńczenie 10-1 ) na podłoże selekcyjne - agar odżywczy z tetracykliną (20 μg/ml) i ryfampicyną (50 μg/ml). j) Po 24-godz. inkubacji w 37 o C określić liczbę kolonii na wszystkich płytkach. Obliczyć, jaki procent komórek biorcy uzyskało plazmid.

11 10 Ćwiczenie 3 Rola białek RecA i RecBC w rekombinacji i reperacji DNA Rekombinacja homologiczna to proces, w którym następuje przerwanie ciągłości jednej lub obu nici cząsteczki DNA i połączenie z jedno- lub dwuniciowym fragmentem innej cząsteczki, co uwarunkowane jest homologią sekwencji między rekombinującymi partnerami. Rekombinacja homologiczna, mimo że jest procesem wieloetapowym i mającym kilka różnych dróg, zawsze, bezwzględnie wymaga aktywności białka RecA wykazującego liczne aktywności enzymatyczne. Oprócz kluczowej roli w rekombinacji, białko to istotne jest dla reperacji DNA, a konkretnie w tzw. naprawie rekombinacyjnej szczególnie ważnej w usuwaniu uszkodzeń powodowanych światłem UV i promieniami X. RecA jest również pozytywnym regulatorem (ze względu na swą aktywność koproteazy) globalnego systemu napraw SOS. Białko RecBC bierze udział w jednym ze szlaków rekombinacji E. coli, tzw. szlaku RecBCD, który uczestniczy w rekombinacji pokoniugacyjnej. Mutanty recbc mają obniżoną częstość rekombinacji, jakkolwiek efekt nie jest tak dramatyczny, jak w przypadku mutantów reca, a poza tym może być supresowany przez mutacje w genie sbcb, kodującym egzonukleazę I. Supresja jest pośrednia i polega na odblokowaniu innego szlaku rekombinacyjnego - RecF. Podobnie jak RecA, RecBC bierze udział w reperacji uszkodzeń w DNA. Celem ćwiczenia jest zbadanie: 1) wpływu białek RecA i RecBC na rekombinację - przez określenie częstości rekombinacji pokoniugacyjnej w krzyżówkach z różnymi mutantami, 2) zaangażowania tych białek w procesie reperacji - przez określenie przeżywalności mutantów poddanych działaniu czynników uszkadzających DNA. Zadanie I. Rola białka RecA w rekombinacji Szczepy: Podłoża i roztwory: E. coli HfrC - prototrof Str s minimalne Davisa - płynne i stałe E. coli F - CSH51 - pro Str r bulion odżywczy i agar odżywczy E. coli F - CSH52 - pro reca Str r roztwór streptomycyny (5 mg/ml) płyn fizjologiczny 1) Nocne hodowle badanych szczepów rozcieńczyć 1:20 świeżym podłożem Davisa z hydrolizatem kazeiny i hodować z wytrząsaniem w 37 o C przez 2-3 godz. (do osiągnięcia fazy logarytmicznej). 2) Przygotować dwie mieszaniny koniugacyjne: a) HfrC x F - CSH51 b) HfrC x F - CSH52 przez zmieszanie hodowli rodzicielskich w stosunku 1:10. Koniugację prowadzić przez 50 minut w 37 o C. 3) Mieszaniny koniugacyjne odpowiednio rozcieńczyć i wysiać na płytki z podłożem selekcyjnym dla rekombinantów Pro + Str r : a) rozcieńczenie 10-2, 10-3 b) rozcieńczenie 10-1, 10-2

12 11 Zadanie II. Rola białka RecA w reperacji DNA 1) Nocne hodowle bulionowe szczepów CSH51 i CSH52 wysiać bez rozcieńczania po 0,1ml na płytki z agarem odżywczym. Każdy szczep wysiać na 5 płytek. 2) Naświetlać lampą UV po jednej płytce każdego szczepu przez 5, 10, 15 i 20 sekund; jedną płytkę każdego szczepu pozostawić bez naświetlania. 3) Naświetlone płytki owinąć folią aluminiową (zabezpieczenie przed fotoreaktywacją) i inkubować przez 24 godz. w 37 o C. 4) Porównać liczby kolonii obu szczepów otrzymane na płytkach po różnym czasie naświetlania. Zadanie III. Rola białka RecBC w rekombinacji; różne szlaki rekombinacyjne u E. coli Szczepy: dawca - E.coli SK6033 (HfrH Tc r ) biorcy - E.coli MC1061 (recbc + Str r) E.coli SK7883 (recbc - Str r) E.coli SK7892 (recbc - sbcb - Str r) Podłoża i roztwory: LB agar odżywczy roztwór tetracykliny (1,5 mg/ml) roztwór streptomycyny (5 mg/ml) płyn fizjologiczny (RF) 1) Założyć hodowle szczepów: - dawcy w podłożu LB z tetracykliną (15 μg/ml ) - biorców w podłożu LB ze streptomycyną (50 μg/ml ) Inkubować przez noc w 37 o C. 2) Przygotowanie hodowli logarytmicznych: nocne hodowle rozcieńczyć świeżym podłożem LB w proporcji 1:50 (np. 0,2 ml do 10 ml podłoża) i inkubować w 37 o C z wytrząsaniem przez 2-3 godz. (gęstość hodowli 1-5 x10 8 /ml ). 3) Koniugacja: każdy ze szczepów biorcy zmieszać z dawcą w proporcji 10 : 1 (np. 0,9 ml logarytmicznej hodowli biorcy + 0,1 ml logarytmicznej hodowli dawcy ). Inkubować bez wytrząsania w 37 o C przez 30 min. 4) Selekcja rekombinantów: mieszaninę koniugacyjną silnie wytrząsnąć (worteks), rozcieńczyć do 10-3 po koniugacji z biorcą recbc + i recbc - sbcb -, oraz do 10-1 po koniugacji z biorcą recbc -. Wysiać odpowiednio rozcieńczenia 10-2 i 10-3 lub 10-1 na podłoże selekcyjne (agar odżywczy ze streptomycyną i tetracykliną). Inkubować przez 24 godz. w 37 o C. 5) Oznaczenie liczby komórek dawcy: hodowlę dawcy użytą do koniugacji rozcieńczyć; rozcieńczenia 10-5 i 10-6 wysiać na agar odżywczy z tetracykliną. Inkubować 24 godz. w 37 o C. 6) Obliczyć i porównać częstości rekombinacji w analizowanych układach koniugacyjnych. Zadanie IV. Rola białka RecBC w reperacji DNA Szczepy: E.coli recbc + Cm r E.coli recbc - Cm r E.coli recbc - sbcb - Cm r Podłoża: LA LA z MMS

13 12 1) Szczepy biorców używane w koniugacji wysiać rysą na podłoże: a) LA; b) LA + MMS (40 μl/200 ml podłoża). 2) Płytki inkubować w 37 o C przez 24 godz. 3) Określić wrażliwość badanych szczepów na czynnik uszkadzający DNA.

14 13 Ćwiczenie 4 Transdukacja ogólna przy użyciu faga P1 Horyzontalny transfer genów u prokariotów może odbywać się w wyniku bezpośredniego pobierania DNA ze środowiska (transformacja) lub za pośrednictwem ruchomych elementów genetycznych, takich jak plazmidy i transpozony koniugacyjne (koniugacja) lub bakteriofagi (transdukcja). W transdukcji materiał genetyczny dawcy przenoszony jest do biorcy w kapsydzie fagowym. Cząstki fagowe niosące w kapsydzie obcy materiał genetyczny nazywamy cząstkami transdukującymi. Mogą one zawierać DNA fagowy połączony kowalencyjnie z DNA gospodarza (dzieje się tak w wypadku transdukcji specyficznej) lub wyłącznie materiał genetyczny gospodarza (transdukcja ogólna). Do transdukcji specyficznej dochodzi w przypadku fagów, które w czasie szlaku lizogennego wbudowują swój genom w ściśle określone miejsce chromosomu gospodarza (np. fag λ E. coli). Z chwilą wejścia faga w szlak lityczny, z niewielką częstością, może zajść nieprawidlowe wycięcie profaga, w związku z czym powstaje hybrydowy DNA zawierający sekwencje profagowe z odcinkiem chromosomu znajdującym się po jednej bądź drugiej stronie genomu profaga. Tak więc w tym przypadku tylko ściśle określone geny gospodarza mogą by przenoszone przez cząstki transdukujące (dla λ są to geny gal lub bio). W transdukcji ogólnej uczestniczą cząstki transdukujące zawierające wyłącznie materiał genetyczny gospodarza. Powstają one w wyniku błędnego pakowania materiału genetycznego bakterii do główek fagowych w trakcie litycznego rozwoju faga. W przypadku takich fagów jak P1 (infekujący E. coli) teoretycznie każdy kawałek DNA, o odpowiedniej wielkości, może być przeniesiony w kapsydzie wirusa. Ze względu na mechanizm tworzenia cząstek transdukujących, praktycznie z równym prawdopodobieństwem, przeniesieniu może ulec każdy gen (dlatego proces ten nosi nazwę transdukcji ogólnej). Odcinek DNA gospodarza przenoszony w cząstkach transdukujących jest wielkością zbliżony do genomu fagowego. Na przykład genom P1 zawarty w główce fagowej liczy 100 kpz (co stanowi ponad 2% genomu E. coli) i tej wielkości fragmenty DNA są przenoszone w procesie transdukcji z jednego szczepu E. coli do innego. Przenoszony może być zarówno DNA chromosomowy jak i plazmidowy, jednak aby powstały stabilne transduktanty, w pierwszym przypadku musi dojść do wbudowania, w wyniku rekombinacji homologicznej, materiału do genomu biorcy, natomiast w drugim przypadku musi zostać odtworzony funkcjonalny replikon (oczywiście powinien on być zdolny do autonomicznej replikacji w nowym gospodarzu). Transdukcja ogólna była kiedyś wykorzystywana do mapowania blisko położonych genów (prawdopodobieństwo jednoczesnego przeniesienia dwu lub większej liczby genów zależy od ich odległości od siebie) oraz do konstrukcji szczepów bakterii o określonych cechach. Koniugacja, transdukcja i transformacja to procesy odgrywające ważną rolę w ewolucji prokariotów, bowiem w czasie pojedynczego wydarzenia organizmy te mogą uzyskać nowe cechy, przystosowujące je do zmieniającego się środowiska. Celem ćwiczenia jest: 1) wykazanie, że w procesie transdukcji mogą być przenoszone: a) geny chromosomowe, b) genom plazmidowy. 2) zbadanie wpływu fenotypu szczepu biorcy (Rec + lub Rec - ) na wynik przekazywania genów chromosomowych i plazmidowych.

15 14 Cały eksperyment transdukcji składa się z kilku etapów: 1) Otrzymanie lizatu fagowego o odpowiednio dużym mianie faga i możliwie dużej zawartości cząstek transdukujących poprzez przeprowadzanie co najmniej 2 cykli namnażania faga P1 na odpowiednim szczepie dawcy DNA (wrażliwym na P1 i niosącym cechę, którą chcemy przenieść). 2) Zainfekowanie lizatem fagowym odpowiedniego szczepu biorcy. Zawartość cząstek transdukujących w tzw. lizacie transdukującym wynosi nie więcej niż 0,3%, pozostałe cząstki fagowe to funkcjonalne wirulentne fagi. Fakt ten ma swoje implikacje w przebiegu całego procesu i wymaga spełnienia odpowiednich warunków technicznych, aby uzyskać pozytywny wynik transdukcji, np. stosowanie niskiej wielokrotności zakażenia (moi = 0,05, ang. multiplicity of infection), obecności jonów wapnia tylko w etapie adsorpcji. Dobór szczepu biorcy musi być przeprowadzony z uwzględnieniem kilku ważnych czynników, w tym: a) możliwości przeprowadzenia bezpośredniej selekcji odpowiednich transduktantów, b) lub możliwości uzyskania odpowiedniej klasy transduktantów poprzez wykorzystanie zjawiska kotransdukcji, c) zastosowania biorcy o aktywnym systemie rekombinacji ogólnej (RecA + RecBCD + ) w przypadku transdukcji genów chromosomowych, ponieważ włączenie wprowadzonego za pośrednictwem faga fragmentu DNA do chromosomu biorcy następuje w wyniku procesu rekombinacji homologicznej. 3) Selekcja transduktantów na odpowiednich podłożach selekcyjnych; 4) Szczegółowa analiza transduktantów (weryfikacja fenotypu oczyszczonych transduktantów, stwierdzenie występowania kotrandukcji pewych cech). Zadanie I. Transdukcja genów chromosomowych Celem eksperymentu jest przeniesienie mutacji recb ze szczepu dawcy Escherichia coli SK7881 (ΔrecB/Km r ) do dwóch szczepów biorcy: (i) E. coli MG1693 (RecB +, Km s, thya), (ii) E. coli JC5703 ( recc82 Km s ). Szczepy: Podłoża i roztwory: SK7881(ΔrecB/Km r ) LA MG1693 (RecB + Km s thya); podłoże Davisa stałe JC5703 (recc82 Km s ) hydrolizat kazeiny (20 %) roztwór tyminy (1 mg/ml) roztwór kanamycyny (10 mg/ml) roztwór chloramfenikolu (50 mg/ml) roztwory do minilizy alkalicznej Wariant 1 wykorzystanie szczepu MG1693 (Rec + ) jako biorcy 1) Namnożenie faga P1 na szczepie SK7881 (2 pasaże metodą płytek dwuwarstwowych). 2) Oznaczenie miana faga z użyciem E. coli AB1157 jako szczepu wskaźnikowego. 3) Infekcja szczepu MG1693 lizatem fagowym otrzymanym w punkcie 1 i selekcja transduktantów: a) Km r na podłożu LA + Km (50 μg/ml);

16 15 b) ThyA + - na podłożu minimalnym Davisa uzupełnionym hydrolizatem kazeiny (stężenie końcowe 0,2%). 4) Analiza otrzymanych transduktantów metodą replik: a) transduktanty Km r (z punktu "3a") replikujemy na podłoża: - LA zawierające MMS (0,04 %); - LA zawierające MMS (0,055 %); - podłoże Davisa + hydrolizat kazeiny (0,2 %). b) transduktanty Thy + (z punktu "3b") replikujemy na podłoża: - LA z kanamycyna; - LA zawierajace MMS (0,04 %); - LA zawierające MMS (0,055 %). 5) Zestawienie i omówienie otrzymanych wyników. Wariant 2. - wykorzystanie szczepu JC5703 (Rec - ) jako biorcy 1) Przeprowadzenie infekcji szczepu E. coli JC5703 lizatem transdukującym otrzymanym w Zadaniu 1. Selekcja transduktantów na podłożu LA z kanamycyną. 2) Porównanie liczby transduktantów Km r uzyskanych w obu zadaniach. Zadanie II. Transdukcyjne przenoszenie genomów plazmidowych Plazmid pwmk3 zawarty w szczepie SK7297 ma wielkość 25 kb. Został skonstruowany przez sklonowanie fragmentu (o wielkości 19 kb) chromosomu E. coli, niosącego dzikie allele genów recbcd, w wektorze pochodnym pbr325 (6 kb) w miejsce BamHI. Markerem selekcyjnym plazmidu pwmk3 jest oporność na chloramfenikol (Cm r ). Szczepy: Podłoża i roztwory: E. coli SK7297 (pwmk3) Cm r LA E coli SK7881 (ΔrecB/Km r ) Cm s roztwór chloramfenikolu (50 mg/ml) E. coli MG1693 (Rec + Km s thya) Cm s roztwory do minilizy alkalicznej E. coli AB szczep wskaźnikowy Wariant 1. Przeniesienie plazmidu pwmk3 ze szczepu SK7297 do szczepu MG1693 (Rec + ) Wariant 2. Przeniesienie plazmidu pwmk3 ze szczepu SK7297 do szczepu SK7881 (Rec - ). 1) Przygotowanie lizatu transdukującego poprzez namnożenie faga P1 na szczepie SK ) Oznaczenie miana faga z użyciem szczepu AB1157 jako szczepu wskaźnikowego. 3) Infekcja szczepów MG1693 oraz SK7881 lizatem transdukującym, selekcja transduktantów Cm r na podłożu LA+ Cm (20 μg/ml). 4) Porównanie liczby transduktantów Cm r uzyskanych dla obu biorców. 5) Potwierdzanie obecności plazmidu pwmk3 w transduktantach Cm r poprzez wykonanie minilizy z 10 transduktantów i analizę elektroforetyczną preparatów DNA. Jako kontrolę należy zastosować preparaty DNA uzyskane z minilizy szczepu dawcy (SK7297). 6) Sprawdzenie wrażliwości na MMS transduktantów SK7881 Cm r metodą replik. Ponieważ plazmid pwmk3 niesie dziki allel genu recb winna nastąpić komplementacja chromosomowej mutacji recb obecnej w biorcy SK7881, a więc transduktanty powinny wykazywać fenotyp MMS r.

17 16 Ćwiczenie 5 Mutageneza transpozonowa Wykorzystanie transpozonu Tn1000 (transpozonu γδ) do mutagenizacji genu recb sklonowanego w plazmidzie pbr325 Elementy transpozycyjne (TE, ang. transposable elements) należą do grupy ruchomych elementów genetycznych, bowiem są one zdolne do zmiany miejsca w genomie, w wyniku procesu zwanego transpozycją. Transpozycja jest typem rekombinacji nieuprawnionej, która nie wymaga homologii sekwencji nukleotydowych cząsteczek DNA uczestniczących w tym procesie i zależy od transpozazy kodowanej przez TE. Wśród elementów transpozycyjnych wyróżniamy sekwencje insercyjne (IS) i transpozony (Tn) (rys. 4). Najprostsze IS zawierają jedną otwartą ramkę odczytu, kodującą transpozazę, otoczoną z obu stron odwróconymi sekwencjami powtórzonymi (IR, ang. inverted repeats), będącymi miejscami działania tego enzymu. Transpozycja IS może przebiegać według mechanizmu konserwatywnego bądź replikacyjnego (rys. 6). W pierwszym przypadku element zmienia jedynie swoje miejsce w genomie - zostaje wycięty z jednego miejsca i wstawiony w inne. W trakcie transpozycji replikacyjnej IS ulega powieleniu i powstaje forma pośrednia zwana kointegratem, w której replikony uczestniczące w transpozycji połączone są kowalencyjnie dwiema kopiami IS, ułożonymi w tej samej orietacji. Po rozdziale kointegratu, każdy z replikonów zawiera pojedynczą kopię IS. Transpozony (rys. 4) mają znacznie bardziej skomplikowaną strukturę, bowiem zwykle niosą geny warunkujące różne cechy fenotypowe. Dzielimy je na transpozony złożone, charakteryzujące się obecnością na obu końcach sekwencji insercyjnych, które okalają część centralną, niosącą geny niezwiązane z transpozycją, i transpozony niezłożone, przypominające budową sekwencje insercyjne, lecz kodujące cechy fenotypowe. Te ostatnie są zwykle opisywane wraz z sekwencjami insercyjnymi i należą do rodziny Tn3. Jednym z transpozonów niezłożonych jest transpozon Tn1000 (transpozon γδ), będący naturalnym składnikiem genomu plazmidu F (rys. 1). Odmiennie od innych członków rodziny Tn3, nie koduje on żadnych cech fenotypowych. Tn1000 ma wielkość około 6 kb, a jego sekwencje IR są złożone z 35 par zasad. Charakteryzuje się on wysoką częstością transpozycji do plazmidów. Miejsce insercji jest przypadkowe, chociaż występują pewne preferencje do miejsc bogatych w pary AT. Tworzone w trakcie transpozycji kointegraty odpowiedzialne są za mobilizację chromosomu lub plazmidów niekoniugacyjnych do transferu koniugacyjnego. Celem ćwiczenia jest: wykorzystanie transpozonu Tn1000 do inaktywacji genu recb sklonowanego w plazmidzie pwmk3. Plazmid pwmk3 składa się z wektora typu pbr325, w którym sklonowany został fragment chromosomu E. coli o wielkości 19 kb, zawierający geny recbcd (rys. 2) Eksperyment obejmuje kilka etapów: 1) Wprowadzenie metodą transformacji chemicznej plazmidu (zawierającego gen, który chcemy zmutować) do szczepu zawierającego plazmid F. 2) Przeprowadzenie koniugacji szczepu zawierającego obydwa plazmidy (F i plazmid mutagenizowany) ze szczepem biorcy, niosącym w chromosomie defektywną formę interesującego nas genu oraz dającym możliwość eliminacji z mieszaniny koniugacyjnej szczepu dawcy.

18 17 3) Wyselekcjonowanie transkoniugantów, do których został przeniesiony kointegrat obu plazmidów powstający w czasie transpozycji replikacyjnej Tn ) Odszukanie wśród transkoniugantów (drogą analizy fenotypu) frakcji klonów, w których insercja transpozonu Tn1000 spowodowała inaktywację genu poddawanego mutagenezie. 5) Potwierdzenie obecności transpozonu Tn1000 w mutowanym genie poprzez analizę restrykcyjną badanego plazmidu. Szczepy: Podłoża, roztwory i inne E. coli W1845 (F + ) podłoże LB i LA E. coli SK7881 (ΔrecB/Km r ) roztwór chloramfenikolu (50 mg/ml) E. coli 7297(pWMK3) roztwory do minilizy 0,8% agaroza bufor do elektroforezy roztwory do transformacji (metodą rubidowo-wapniową) jałowe wykałaczki endonukleaza restrykcyjna PstI I etap 1) Przygotować metodą mini-lizy alkalicznej DNA plazmidu pwmk3 ze szczepu SK ) Otrzymany preparat zanalizować metodą elektroforezy w żelu agarozowym. 3) Przygotować komórki szczepu E. coli W1845 (F + ) kompetentne do transformacji metodą Kushnera (rubidowo-wapniową). Preparatem plazmidu pwmk3 transformować przygotowane komórki. Selekcjonować transformanty Cm r na podłożu LA z chloramfenikolem (stęż. końc. 20 μg /ml). II etap 1) Przeprowadzić koniugację transformanta W1845 Cm r, będącego dawcą, ze szczepem SK7881 (ΔrecB, Km r ) - biorcą. Koniugację wykonać poprzez zmieszanie logarytmicznych hodowli biorcy i dawcy w proporcji 10:1 (np. 4,5 ml biorcy i 0,5 ml dawcy). 2) Mieszaniny koniugacyjne inkubować 60 min. w 37 o C. 3) Odpowiednie rozcieńczenia mieszaniny koniugacyjnej (10 0, 10-1, 10-2 ) wysiać na podłoże selekcyjne: LA z kanamycyną (25 μg/ml) i chloramfenikolem (20 μg/ml). Płytki inkubować 24 godz. w 37 o C. III etap 1) Wśród wyselekcjonowanych po koniugacji kolonii o fenotypie Km r Cm r drogą replik odszukać klony wrażliwe na MMS. Każda para studentów replikuje przy pomocy wykałaczek 50 kolonii transkoniugantów na 3 płytki z następujacymi podłożami: a) LA + MMS (0,05%); b) LA + MMS (0,04%); c) LA. Jako kontrole użyć SK7881 (MMS s ) i SK7297 (MMS r ). 2) Wszystkie płytki inkubować w 30 o C przez 48 h. IV etap 1) Odczytać wyniki replik i określić procent otrzymanych klonów (MMS s ). 2) Klony MMS s przesiać posiewem redukcyjnym. Płytki inkubować w 37 o C.

19 18 V etap 1) Z klonów MMS s izolować plazmid metodą lizy alkalicznej i wykonać analizę elektroforetyczną preparatów DNA na żelu agarozowym. 2) Sprawdzić ponownie ich fenotyp, wysiewając je ilościowo (wg wskazówek prowadzącego ćwiczenia) na podłoża: 1) LA + MMS; 2) LA. VI etap 1) Wykonać trawienie otrzymanego preparatu plazmidowego DNA enzymem PstI. Równolegle przeprowadzić trawienie preparatu wyjściowego plazmidu pwmk3. 3) Przeprowadzić elektroforezę strawionych preparatów w 0,8% żelu agarozowym. 4) Poprzez porównanie wzoru restrykcyjnego obu plazmidów wnioskować o obecności i lokalizacji transpozonu w analizowanym genie recb (mapa restrykcyjna Tn1000 jest przedstawiona na rys. 5).

20 19 ILUSTRACJE Rys. 1. Uproszczona mapa genetyczna plazmidu F. Na mapie zaznaczono lokalizację systemów replikacyjnych (rep), regionu odpowiedzialnego za transfer koniugacyjny (tra), punktu początkowego transferu (orit) oraz elementów transpozycyjnych (IS2, IS3 i Tn1000). Region tra obejmuje geny: 1) warunkujące syntezę pilusów płciowych, 2) koniugacyjnego metabolizmu DNA, 3) odpowiedzialne za stabilizacje par, 4) odpowiedzialne za wykluczanie powierzchniowe, 5) regulacyjne. Rys. 2.Schemat plazmidu pwmk3.

21 20 Rys. 3. Mapa chromosomu Escherichia coli. Na mapie wyróżniono loci i szczepy Hfr istotne w przebiegu ćwiczenia. Na wewnętrznym kole liczbami zaznaczono w minutach pozycje mapy w stosunku do locus thr oraz zaznaczono wybrane 43 loci z pełnej mapy. Na zewnętrznym kole zaznaczono strzałkami początek i kierunek przekazywania chromosomu przez różne szczepy Hfr.

22 21 Rys 4. Schemat organizacji genetycznej elementów transpozycyjnych. (strzałkami zaznaczono kierunek transkrypcji genów) Rys. 5. Mapa restrykcyjna transpozonu Tn1000.

23 22 Rys. 6. Etapy transpozycji konserwatywnej i replikacyjnej. (Biologia molekularna bakterii, PWN, 2006, str. 410)

24 23 PODŁOŻA Podłoże LB (Luria broth) Bacto tryptone 10 g Bacto yeast Extract 5 g NaCl 5 g H 2 O dst. do 1000 ml ph 7,2; sterylizować 15 min w 121 o C. Podłoże LA (Luria agar) Do 200 ml podłoża LB dodać 3 g Bacto - agaru. Jałowić jak wyżej. Podłoże Davisa sole: K 2 HPO 4 bezw. KH 2 PO 4 bezw. (NH 4 ) 2 SO 4 bezw. MgSO 4 x 7H 2 O 14 g 6 g 2 g 0,2 g 1,0 g 400 ml Rozlać po 40 ml; jałowić 30 min. w 121 o C. cytrynian sodu H 2 O agaroid: agar-agar 3,0 g H 2 O dest. 150 ml glukoza 20% Podłoże płynne przygotowuje się przez zmieszanie: 150 ml H 2 O dest. 40 ml soli 4 ml glukozy Podłoże stałe otrzymuje się przez zmieszanie: 150 ml agaroidu 40 ml soli 4 ml 20% glukozy Bulion odżywczy Bulion suchy (Biomed) 15 g H 2 O dest. do 1000 ml Agar odżywczy Do 200 ml bulionu odżywczego dodać 3 g agaru-agaru. Jałowić jak wyżej. Podłoże EMB Bacto tryptone 10 g Bacto yeast extract 1 g NaCl 5 g K 2 HPO 4 bezw. 2 g Bacto - agar 15 g H 2 O dest. do 1000 ml Wyjałowić, a następnie dodać po 2 ml jałowych roztworów 4% eozyny i 0,65% błękitu metylenowego oraz jałowy roztwór danego cukru do stężenia końcowego 1%.

25 24 METODY 1 Miniliza alkaliczna (modyfikacja metody Birnboim i Doly, 1979) W metodzie tej wykorzystuje się fakt, że w wąskim zakresie ph (12,0-12,5) zachodzi wybiórcza denaturacja liniowej formy DNA, ale nie formy CCC. Komórki lizuje się całkowicie traktując je SDS i NaOH. DNA chromosomowy zostaje wybiórczo zdenaturowany, a kiedy lizat zostaje zobojętniony przez dodatek kwaśnego roztworu octanu sodu, DNA chromosomowy renaturuje i tworzy nierozpuszczalne agregaty. Jednocześnie pod wpływem wysokiego stężenia octanu sodu zachodzi wytrącenie kompleksów białek z SDS, a także wielkokocząsteczkowego RNA. W ten sposób ko-precypitacji ulegają trzy rodzaje największych makrocząsteczek mogących stanowić zanieczyszczenie preparatów DNA plazmidowego. Można je następnie usunąć poprzez jedno wirowanie. Supernatant zawiera przede wszystkim DNA plazmidowy (oraz resztki drobnocząsteczkowego RNA), który można odzyskać z supernatantu w wyniku wytrącenia etanolem. Materiały 1) Roztwór I: 50 mm glukoza 10 mm EDTA 25 mm Tris. Cl (ph 8,0) 2) Roztwór II: 0,2 N NaOH 1% SDS 3) Roztwór III: octan potasu (ph~4,8) Roztwór III przygotowuje się mieszając 60 ml 5 M octanu potasu z 11,5 ml lodowatwgo kwasu octowego i 28,5 ml H 2 0 dest. Otrzymany roztwór jest 3 M względem potasu i 5 M względem octanu. 1) Odwirować w eppendorfówce 1,5 ml nocnej hodowli bakterii w LB (3 min, mikrowirówka) 2) Dokładnie zlać supernatant, osad zawiesić w 100 μl zimnego roztworu I i inkubować 5 min w temp. pokojowej. 3) Dodać 200 μl roztworu II, zawartość eppendorfówki wymieszać przez kilkukrotne odwracanie i inkubować w lodzie przez 5 min. 4) Dodać 150 μl zimnego roztworu III, wymieszać i inkubować w lodzie przez 5 min. 5) Dodać 30 μl mieszaniny fenolu z chloroformem i wymieszać łagodnie. 6) Odwirować 10 min. w mikrowirówce w temp. pokojowej. 7) Do zebranej fazy wodnej dodać 2 objętości (1ml) 96% etanolu i trzymać 15 min w zamrażarce. 8) Odwirować wytrącony DNA (10 min. w wirówce z chłodzeniem), zlać supernatant. 10) Przemyć osad 100 μl 70% etanolu i odwirować 10 min w wirówce z chłodzeniem. 11) Dokładnie usunąć supernatant, wysuszyć osad (np. przez wstawienie otwartej eppendorfówki na 15 min do termostatu na 65 o C).

26 25 12) Osad zawiesić w 40 μl buforu TE (ph 8,0). 2. Elektroforeza DNA w żelu agarozowym Elektroforeza DNA w żelu agarozowym jest standardową metodą pozwalającą wykryć obecność plazmidów w lizatach komórkowych, określić ich liczbę i wielkość, a także rozdzielić fragmenty DNA otrzymane po trawieniu plazmidów enzymami restrykcyjnymi. Tempo migracji cząsteczek DNA zależy od ich wielkości a także od użytych parametrów elektroforezy (stężenia agarozy, przyłożonego napięcia, użytego buforu i temperatury). 1) Przygotować bufor elektrodowy Tris-octan (TAE ) o składzie: 0,04 M Tris-octan i 0,001M EDTA, ph 8,0. 2) Przygotować 0,8% agarozę w buforze elektrodowym, ogrzać do całkowitego rozpuszczenia, a następnie schłodzić do 60 o C. 3) Wlać agarozę do przygotowanego odpowiednio aparatu do elektroforezy z włożonym grzebieniem (grubość żelu powinna wynosić około 5 mm). 4) Po stężeniu żelu wyjąć grzebień i wlać bufor elektrodowy w takiej ilości, aby przykrył żel cienką warstwą. 5) Wymieszać próbki DNA z buforem obciążającym (o składzie 0,25% błękit bromofenolowy, 30% glicerol) w proporcji 6 : 1 i nałożyć do studzienek w żelu przy pomocy pipety automatycznej. 6) Prowadzić elektroforezę, ustawiając zasilacz na wartość napięcia 100 V do momentu dojścia barwnika do 2/3 żelu. 7) Barwić żel przez 10 min. w roztworze bromku etydyny o stężeniu końcowym 0,5 μg/ml. 8) Odpłukać bromek etydyny w wodzie destylowanej. 9) Obejrzeć żel pod lampą UV. 3. Transformacja metodą rubidowo-wapniową (Kushner, 1978) Metoda ta pozwala uzyskać dla wielu szczepów E. coli wyższą wydajność transformacji niż standardowa metoda wapniowa. Podloża i roztwory: Podłoże LB i LA Roztwór I do transformacji 10 mm MOPS ph 7,0 10 mm RbCl Roztwór II do transformacji 100 mm MOPS ph 6,5 50 mm CaCl 2 10 mm RbCl

27 26 1) Nocną hodowlę E. coli rozcieńczyć 1 : 50 w świeżym podłożu LB (np. do 10 ml podłoża w kolbie a 100 ml dodać 0,2 ml hodowli). 2) Inkubować z wytrząsaniem w 37 o C do osiągnięcia gęstości około 1 x 10 8 /ml (co trwa około 2 godz.). 3) Odwirować 1,5 ml hodowli w probówkach Eppendorfa (3 min, mikrowirówka, 4 o C). 4) Zlać dokładnie supernatant, osad zawiesić w 1 ml jałowego roztworu I i odwirować jak wyżej. 5) Zlać dokładnie supernatant, a osad zawiesić w 0,2 ml jałowego roztworu II. 6) Zawieszone bakterie inkubować 15 min w lodzie. 7) Dodać DNA i trzymać przez dalsze 15 min w lodzie. 8) Przenieść na 50 sek do łaźni wodnej nastawionej na temp o C. 9) Natychmiast dodać 5 ml LB i inkubować w 37 o C bez wytrząsania przez 60 min. 10) Wysiać na odpowiednie płytki selekcyjne. Jeśli to potrzebne komórki przed wysiewem można rozcieńczyć bądź zagęścić przez wirowanie. 4. Przygotowanie faga P1 do transdukcji (metoda płytek dwuwarstwowych) Materiały: podłoże płynne LB podłoże półpłynne LB (tzw."top agar"), zawierające 0,8% agaru. chloroform 1) Zaszczepić 10 ml podłoża LB szczepem dawcy i inkubować przez noc w 37 o C bez wytrząsania. 2) Do hodowli dodać 0,1 ml 0,5 M jałowego roztworu CaCl 2 (stęż. końc. 5 mm). 3) Rozlać po 0,5 ml hodowli do 4 probówek i dodać faga P1: nr 1 - bez faga nr 2-0,1 ml faga nierozcieńczonego nr 3-0,1 ml faga rozcieńczonego w LB do 10-1 nr 4-0,1 ml faga rozcieńczonego w LB do ) Inkubować 10 min. w termostacie (37 o C) - adsorpcja. 5) Dodać 3 ml "top agaru" o temp o C. 6) Delikatnie wymieszać i wylać na powierzchnię płytki LB. 7) Po zakrzepnięciu agaru, płytkę odwrócić i inkubować w 37 o C przez noc. 8) Po inkubacji wybrać płytkę o odpowiednim stopniu lizy (tzw. "confluent lysis", tzn nie widać pojedynczych łysinek, ale liza nie powinna być kompletna). Zeskrobać jałową bagietką szklaną górną warstwę agaru półpłynnego, przenieść do jałowej probówki wirowniczej, powierzchnię agaru przepłukać 2 ml LB, przenieść do tej samej probówki; dodać 0,5 ml chloroformu i mocno wytrząsać. 9) Odwirować 4000 obrotów na min przez min. 10) Przenieść supernatant do fiolki zawierającej nieco chloroformu. 11) Powtórzyć cykl namnażania, używając w punkcie 3 lizatu otrzymanego w punkcie 10.

28 27 5. Mianowanie lizatu fagowego 1) Do "nocnej" hodowli szczepu wskaźnikowego E. coli AB1157 lub do hodowli logarytmicznej dwukrotnie zagęszczonej dodać CaCl 2 do końcowego stężenia 5 mm. 2) Przygotować rozcieńczenia lizatu fagowego w LB (zwykle 10 o C -5, 10-6 oraz 10-7 ). 3) Zmieszać w probówce 0,1 ml bakterii wskaźnikowych i 0,1 ml rozcieńczonego lizatu. 4) Inkubować 20 min. w 37 o C (etap adsorpcji). 5) Dodać 1,5-1,8 ml półpłynnego podłoża LB o temp o C (mała objętość pozwala zwiększyć rozmiar łysinek P1, które są małe). Delikatnie wymieszać, i wylać na płytkę LB. 6) Po zakrzepnięciu płytki inkubować w 37 o przez noc. 7) Policzyć łysinki i obliczyć miano faga. 6. Transdukcja 1) Nocną hodowlę szczepu biorcy rozcieńczyć 1 : 50 świeżym podłożem LB i inkubować z wytrząsaniem do gęstości około 1 x 10 8 /ml. 2) Hodowlę (5 ml) odwirować i zawiesić w 1/10 objętości podłoża LB (gęstość 1 x 10 9 /ml). 3) Zmieszać: - 0,5 ml zagęszczonej hodowli biorcy; - 0,5 ml lizatu transdukującego rozcieńczonego w LB do gęstości 5 x 10 7 pfu/ml (co daje moi około 0,05); - -0,5 ml mieszaniny 0,005 M CaCl 2 i 0,03 M MgSO 4 (przygotowanej przez zmieszanie 3,0ml wody, 0,1 ml 0,5 M CaCl 2 i 0,1 ml 1 M MgSO 4 ). 4) Inkubować 20 min. w 37 o C. 5) Odwirować, przemyć 5 ml buforu Davisa, zawiesić w 1 ml tego buforu. 6) Wysiać 0,1 ml na płytkę selekcyjna, resztę zawiesiny odwirować, osad zawiesić w 0,1 ml buforu Davisa i wysiać na płytkę selekcyjną. 7) Inkubować co najmniej 2 dni Uwaga: Wykonać następujące kontrole: a) bez dodatku faga (na rewersję); b) bez bakterii - sprawdzenie, czy lizat fagowy jest pozbawiony bakterii.