CZĘŚĆ IV METODY BIOTECHNOLOGICZNE W OCHRONIE ŚRODOWISKA ZASTOSOWANIE WIRUSÓW BAKTERYJNYCH DO OCENY JAKOŚCI I CZYSTOŚCI WODY

Transkrypt

1 CZĘŚĆ IV METODY BIOTECHNOLOGICZNE W OCHRONIE ŚRODOWISKA ĆWICZENIE: ZASTOSOWANIE WIRUSÓW BAKTERYJNYCH DO OCENY JAKOŚCI I CZYSTOŚCI WODY PROWADZĄCY: dr Agnieszka Kwiatek CEL Celem ćwiczeń jest zapoznanie studentów z metodyką wykorzystania bakteriofagów w ocenie jakości wody. Efekty Student pozna bakteriofagi używane w testach do oceny jakości wody, ich cechy charakterystyczne oraz sposoby wykrywania i oznaczania ilościowego. Podstawy teoretyczne Bakteriofagi (fagi) to wirusy infekujące bakterie. Materiałem genetycznym fagów może być: jednoniciowy RNA [(+) ssrna] np. MS2 infekujący Escherichia.coli, dwuniciowy RNA [dsrna] np. 6 infekujący Pseudomonas syringae, jednoniciowy DNA [ssdna] np. M13, X174 infekujące E. coli, dwuniciowy DNA [dsdna] (kolisty lub liniowy) np. infekujące E. coli, T7 i T4, oraz HP1 infekujący Haemophilus influenzae. Cząstki wirusowe mogą mieć budowę prostą lub złożoną. Cząstki o budowie prostej mogą mieć strukturę helikalną (M13) lub izomeryczną (X174). W cząstkach bakteriofagowych o budowie złożonej wyróżniamy ikosaedralną główkę i helikalny ogonek (, T7, HP1). Wirion rzadko otoczony jest osłonką (np. 6). Bakteriofagi dzielą się na łagodne i wirulentne. Fagi wirulentne mogą przeprowadzać jedynie cykl lityczny, w którym od razu po wprowadzeniu wirusowego genomu do komórki dochodzi do jego replikacji. W cyklu lizogennym, po iniekcji, genom faga łagodnego staje się częścią materiału genetycznego gospodarza (jako autonomiczny liniowy bądź kolisty plazmid albo po wbudowaniu do chromosomu bakteryjnego) i pozostaje tam w formie pasywnej (utajonej, latentnej), jako profag. Podobnie jak inne patogeny wirusowe, fagi są obligatoryjnymi pasożytami wewnątrzkomórkowymi i ich namnażanie (replikacja) jest bezwzględnie zależna od komórek gospodarza. Uwolnione z komórek gospodarza do środowiska, cząstki fagowe mogą pozostać zakaźne przez stosunkowo długi czas. Niektóre fagi infekują bakterie wchodzące w skład mikrobiomu jelitowego ssaków, i w związku z tym, zawsze znajdują się w jelitach ludzi i różnych innych zwierząt, i są wydalane wraz z kałem do środowiska. Zatem obecność fagów infekujących bakterie kałowe (tzw. kolifagów) wskazuje na zanieczyszczenia odchodami. Kolifagi znajdują się w kale w wysokich stężeniach, a w związku z tym i w ściekach. Stężenia kolifagów w ściekach surowych są w przedziale PFU (ang. plaque forming units) na litr. 1

2 Wysoka ilość kolifagów, powszechna w kale i w ściekach surowych, pozwala na wykorzystanie bakteriofagów jako wskaźników przy wykrywaniu zanieczyszczeń kałowych np. w wodzie rekreacyjnej. Ich przewaga nad innymi biologicznymi wskaźnikami zanieczyszczeń tj. bakteriami wynika z ich dość wysokiej odporności na niekorzystne warunki i dłuższego utrzymywania się w środowisku. Ze względu na to, że kolifagi nie są chorobotwórcze dla człowieka, ich propagacja jest prosta i tania, a także, ze względu na to, że liczebność specyficznych bakteriofagów w wodzie koreluje z liczbą ich bakteryjnych gospodarzy są one wykorzystywane do oceny stanu skażenia wody bakteriami jelitowymi. Aktualnie dwie grupy kolifagów infekujących bakterie naturalnie występujące w jelitach ludzi i / lub zwierząt, używa się jako wskaźniki zanieczyszczenia odchodami: (i) F- specyficzne RNA-bakteriofagi oraz (ii) fagi somatyczne. Somatyczne kolifagi wykorzystują jako receptory elementy znajdujące się na powierzchni ściany komórkowej i błony komórkowej. Infekują głównie E. coli (np. X174), ale niektóre także inne enterobakterie. Są wykorzystywane jako wskaźniki jakości wody w estuariach, wody morskiej, słodkiej i pitnej oraz ścieków. F-specyficzne RNA-bakteriofagi są to wirusy bakteryjne zdolne do infekowania specyficznego gospodarza posiadającego pile koniugacyjne tzw. pile płciowe (np. pilus F Escherichia coli) i wytworzenia widocznych łysinek na murawie rosnących w odpowiednich warunkach specyficznych gospodarzy. Proces infekcji jest hamowany w obecności RNazy w podłożu hodowlanym, z powodu degradacji fagowego RNA przez enzym RNAza. W ten sposób można odróżnić infekcję komórki bakteryjnej, posiadającej pilę płciową, F-specyficznym RNA-bakteriofagiem od infekcji fagiem z DNA jako materiałem genetycznym, który również wykorzystuje pilę płciową jako receptor. Fagi, których materiałem genetycznym jest DNA nie będą wrażliwe na RNAzę. W testach wykorzystujących bakteriofagi do badania jakości wody ilość F-specyficznych RNA-bakteriofagów jest wyliczana z różnicy pomiędzy liczbą bakteriofagów uzyskanych w obecności i przy braku RNazy. Obecność F-specyficznych RNA-bakteriofagów w próbkach wody wskazuje na wprowadzenie do niej ścieków zanieczyszczonych odchodami ludzkimi lub zwierzęcymi. Przetrwanie kolifagów i możliwość ich usuwania przez filtry w procesie oczyszczania jest analogiczna jak w przypadku ludzkich wirusów jelitowych np. enterowirusów, wirusa zapalenia wątroby typu A czy rotawirusów. W ten sposób ilość wykrytych kolifagów wskazuje na czystość mikrobiologiczną wody. Polski Komitet Normalizacyjny (PKN) opracował 2 normy służące do oceny jakości wody, które wykorzystują bakteriofagi: 1. PN-EN ISO (Jakość wody Wykrywanie i oznaczanie ilościowe bakteriofagów, Część 1: Oznaczanie ilościowe F-specyficznych RNA-bakteriofagów). 2. PN-EN ISO (Jakość wody Wykrywanie i oznaczanie ilościowe bakteriofagów, Część 2: Oznaczanie ilościowe colifagów somatycznych). Bakteryjnymi szczepami wykorzystywanymi do wykrywania F-specyficznych RNA-bakteriofagów są m.in. E. coli HS (F amp R, ATCC ) i Salmonella enterica serowar Typhimurium (=Salmonella typhimurium WG49 (NCTC 12484). Dzięki kodowanym markerom selekcyjnym (oporności na antybiotyk i zdolności do wykorzystywania laktozy) oraz stabilności Salmonella typhimurium WG49 jest łatwiejszy do weryfikacji w testach badania jakości wody niż E. coli, która nie posiada takich markerów. Jednakże E. coli wydaje się bardziej stabilna niż Salmonella typhimurium WG49. Tym niemniej ilości fagów uzyskiwanych na obu gatunkach bakterii jest porównywana i dlatego w praktyce stosowane są zarówno E. coli jak i S. enterica. W części eksperymentalnej ćwiczeń wykrywane będą bakteriofagi zdolne do infekcji bakterii kałowych obecne w ściekach o pochodzeniu bytowo-gospodarczym (odpady kuchenne, wydaliny, detergenty związki organiczne i nieorganiczne tj. azot amonowy, chlorki, fosforany, potas) oraz 2

3 określona zostanie ich liczebność. Jako gospodarz zostanie użyty szczep E. coli XL-1 Blue, który zawiera plazmid F (a zatem ma pili płciowe), a do kontroli jakościowej tego szczepu fag MS2. Zastosowane podejście badawcze opiera się na regułach postępowania wymaganych przez PKN przy zastosowaniu normy PN-EN ISO do oceny jakości wody. Przebieg ćwiczeń Schemat przeprowadzenia postępowania standardowego do wykrywania F- specyficznych bakteriofagów w badanych próbkach wody. Materiały: E. coli XL-1 Blue F (reca1 enda1 gyra96 thi-1 hsdr17 supe44 rela1 lac, (F proab laciqz M15 Tn10 Tet r ) bufor SM: 50 mm TrisCl (ph 7,5), 100 mm NaCl, 8 mm MgSO 4, 2% żelatyna (w/v) podłoże McConkeya stałe: trzustkowy hydrolizat żelatyny 1,7%, trzustkowy hydrolizat kazeiny 0,15%, hydrolizat pepsynowy tkanki zwierzęcej 0,15%, laktoza 1%, sole żółciowe 0,15%, chlorek sodu 0,5%, czerwień obojetna 0,003%, fiolet metylowy 0,0001%, agar-agar 1,5% bulion odżywczy: trzustkowy hydrolizat żelatyny 0,5%, wyciąg z mięsa wołowego 0,3% 3

4 agar odżywczy: skład jak bulion odżywczy z dodatkiem 1,5% agar-agar; pożywka półpłynna: skład jak bulion odżywczy z dodatkiem 0,7% agar-agar roztwór tetracykliny: 5 mg/ml (w/v) w 70% etanolu ścieki komunalne pobrane z oczyszczalni ścieków Czajka: o ścieki surowe (po osadnikach); o ścieki oczyszczone; Dzień 1 I. Kalibracja pomiaru gęstości optycznej szczepu bakteryjnego 1. Zaszczepić 50 ml bulionu odżywczego 0,5 ml nocnej hodowli szczepu E. coli XL-1 Blue F. 2. Inkubować hodowlę bakteryjną przez 3 h w 37C z wytrząsaniem. 3. Co 30 min. określać spektrofotometrycznie gęstość optyczną hodowli. Jednocześnie pobierać 1 ml próbki hodowli bakteryjnej. 4. Rozcieńczyć próbki 10-6 i wysiać powierzchniowo po 0,1 ml z rozcieńczenia 10-4, 10-5 i 10-6 na szalki z agarem odżywczym. 5. Wysiane na agar odżywczy hodowle bakteryjne inkubować 16 h w temp. 37C. II. Kontrola jakościowa szczepu bakteryjnego A. 1. Przygotować 1 szalkę z podłożem McConkeya. 2. Przygotować rozcieńczenia szczepu bakteryjnego w bulionie odżywczym (rozcieńczenie 10-2 ) 3. Na przygotowaną szalkę ze stałym podłożem McConkeya wysiać po 0,1 ml rozcieńczenia 10-2 i pozostawić do inkubacji. 4. Dodatkowo na wysianej powierzchniowo hodowli bakteryjnej umieścić krążek nasycony tetracykliną (stężenie końcowe Hodowle bakteryjne inkubować 16 h w temp. 37C. B. Testowanie wrażliwości szczepu gospodarza na F-specyficzne RNA-bakteriofagi 1. Przygotować 2 szalki z agarem odżywczym uzupełnionym tetracykliną (stężenie końcowe Przygotować rozcieńczenia bakteriofaga MS2 w buforze SM (rozcieńczenia 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 ). 3. Do szklanej probówki pobrać 1 ml szczepu bakteryjnego (E. coli XL-1 F ). 4. Dodać 1 ml odpowiedniego rozcieńczenia faga MS2 (rozcieńczenie 10-4, 10-6 ) i pozostawić na 10 min. w temperaturze pokojowej. 5. Dodać 2,5 ml półpłynnego agaru odżywczego i od razu wylać na podłoże stałe. 6. Hodowle bakteryjne inkubować 16 h w temp. 37C. III. Postępowanie standardowe 4

5 1. Przygotować 4 szalki z agarem odżywczym uzupełnionym tetracykliną (stężenie końcowe Do szklanej probówki pobrać 1 ml odpowiedniego szczepu bakteryjnego (E. coli XL-1 F ). 3. Dodać 1 ml ścieku: a. Każdy zespół bada: i. próbki pobrane ze ścieków surowych (nieoczyszczonych), przygotować rozcieńczenia próbek w roztworze SM (10-1 i 10-2 ). ii. próbki pobrane ze ścieków oczyszczonych, iii. próbki dodatkowe (np. pobrane z Wisły, woda z kranu). 4. Pozostawić 10 min. w temperaturze pokojowej. 5. Dodać 2,5 ml półpłynnego agaru odżywczego i od razu wylać na szalki z agarem odżywczym. 6. Hodowle inkubować 16 h w temp. 37C. IV. Test potwierdzający 1. Przygotować 4 szalki z agarem odżywczym uzupełnionym tetracykliną (stężenie końcowe Do szklanej probówki pobrać 1 ml odpowiedniego szczepu bakteryjnego (E. coli XL-1 F ). 3. Dodać 1 ml ścieku i pozostawić na 10 min. Badane są te same próbki wody jak w punkcie III (patrz Postępowanie standardowe). 4. Dodać 2,5 ml półpłynnego agaru odżywczego uzupełnionego roztworem RNazy (stężenie końcowe 40 µg/ml) i od razu wylać na szalki z agarem odżywczym. 5. Hodowle inkubować 16 h w temp. 37C. V. Zapewnienie jakości 1. Przygotować 1 szalkę z agarem odżywczym uzupełnionym tetracykliną (stężenie końcowe Do szklanej probówki pobrać 1 ml buforu SM. 3. Dodać 1 ml odpowiednio rozcieńczonego bakteriofaga MS2 i pozostawić na 10 min. 4. Dodać 2,5 ml półpłynnej pożywki i od razu wylać na podłoże stałe. 5. Inkubować 16 h w temp. 37C. Dzień 2 I. Analiza otrzymanych wyników I 1. Wybrać szalki z policzalną liczbą kolonii (od 30 do 300 łysinek) i policzyć kolonie. 2. Ustalić CFU (ang. colony forming units) w 1 ml zgodnie z równaniem: gdzie: n liczba kolonii R odwrotność rozcieńczenia CFU = n x R x 10 II. Analiza otrzymanych wyników II 5

6 3. Wybrać szalki z policzalną liczbą łysinek (od 30 do 300 łysinek) i policzyć łysinki. 4. Uwzględniając wyniki testu potwierdzającego obliczyć PFU F-specyficznych RNAbakteriofagów w 1 ml zgodnie z równaniem: PFU = N NRNaza n x F gdzie: PFU potwierdzona liczba F-specyficznych RNA-bakteriofagów w 1 ml, N - ogólna liczba policzonych łysinek na szalkach bez RNazy N RNaza - ogólna liczba policzonych łysinek na szalkach z RNazą n liczba powtórzeń F wartość rozcieńczenia lub zagęszczenia 6