RUCHOME ELEMENTY GENETYCZNE BAKTERII

Transkrypt

1 RUCHOME ELEMENTY GENETYCZNE BAKTERII Skrypt do ćwiczeń 2013 dr hab. Dariusz Bartosik (koordynator zajęć) dr Łukasz Dziewit dr Magdalena Szuplewska Zakład Genetyki Bakterii Instytut Mikrobiologii Wydział Biologii Uniwersytet Warszawski

2 I. Regulamin pracowni 1. W pracowni obowiązuje noszenie fartucha ochronnego (najlepiej białego). 2. Na stołach laboratoryjnych mogą znajdować się wyłącznie materiały potrzebne do wykonywania ćwiczenia. 3. W pracowni zabronione jest spożywanie posiłków oraz palenie tytoniu. 4. Należy zachować daleko idącą ostrożność przy pracy z materiałem mikrobiologicznym: a) stosować się do zasad pracy jałowej (zachować szczególną ostrożność przy pracy w bezpośrednim sąsiedztwie płomienia palnika); b) hodowle bakteryjne w probówkach wstawiać do statywów (nie wolno ich kłaść na stole); c) każdą posianą próbę dokładnie opisywać (rodzaj posiewu, inicjały osoby wykonującej posiew, data itp.); d) po skończeniu posiewów wyżarzać ezy, opalać głaszczki, a pipety wkładać do specjalnych pojemników. 5. Po zakończeniu pracy należy posprzątać stół laboratoryjny, niepotrzebny już sprzęt odłożyć na miejsce, pozostawić w porządku mikroskop. 6. Niepotrzebne hodowle drobnoustrojów oraz szkło używane w trakcie pracy należy odłożyć do specjalnie przygotowanych pojemników, po uprzednim usunięciu wszelkich napisów, i zanieść do zmywalni. 7. Nie wolno wynosić z pracowni żadnych hodowli bakteryjnych i preparatów bez pozwolenia. 8. Po zakończeniu pracy należy sprawdzić, czy został wyłączony gaz oraz używana aparatura nie przeznaczona do pracy ciągłej. 9. Przed wyjściem z sali należy umyć ręce. 10. W razie jakichkolwiek problemów należy niezwłocznie zgłosić się do osoby prowadzącej zajęcia. 2

3 SPIS TREŚCI I. IZOLACJA PLAZMIDÓW, ICH ANALIZA I WYKORZYSTANIE W INŻYNIERII GENETYCZNEJ Ćw. 1 METODY OCZYSZCZANIA PLAZMIDOWEGO DNA 5 I. Oczyszczanie DNA plazmidowego na dużą skalę - ultrawirowanie w gradiencie chlorku cezu (CsCl) z bromkiem etydyny (EtBr) Ćw. 2 METODY OCZYSZCZANIA PLAZMIDOWEGO DNA cd. 8 KLONOWANIE. ENZYMY RESTRYKCYJNE I WEKTORY I. Wykorzystanie wektorów do klonowania DNA Ćw. 3 METODY WPROWADZANIA DNA DO KOMÓRKI BAKTERYJNEJ 10 I. Transformacja metodą rubidowo-wapniową II. Elektroporacja III. Koniugacja trójrodzicielska Ćw. 4 METODY ADNOTACJI GENOMÓW BAKTERYJNYCH ZAJĘCIA SEMINARYJNE 13 II. MOLEKULARNA CHARAKTERYSTYKA SYSTEMÓW KODUJĄCYCH TOKSYNĘ I ANTYTOKSYNĘ Ćw. 5 ANALIZA ORGANIZACJI GENETYCZNEJ SYSTEMU ADDYCYJNEGO 15 I. Izolacja RNA do RT-PCR Ćw. 6 ANALIZA ORGANIZACJI GENETYCZNEJ SYSTEMU ADDYKCYJNEGO cd. 17 II. RT-PCR Ćw. 7 Oznaczanie aktywności promotorów systemów addykcyjnych oraz badanie interakcji 19 białek systemów TA z wykorzystaniem bakteryjnego układu dwuhybrydowego Ćw. 8 Badanie efektu toksycznego wywołanego przez trucizny różnych systemów addykcyjnych oraz zdolności antidotum do jego odwracania 23 III. IDENTYFIKACJA I ANALIZA FUNKCJONALNYCH ELEMENTÓW TRANSPOZYCYJNYCH Ćw. 9 Ćw. 10 Ćw. 11 IDENTYFIKACJA ELEMENTÓW TRANSPOZYCYJNYCH Z WYKORZYSTANIEM WEKTORA PUŁAPKOWEGO pmat1 I. Identyfikacja elementów transpozycyjnych w szczepie Pseudomonas sp. LM7R IDENTYFIKACJA ELEMENTÓW TRANSPOZYCYJNYCH Z WYKORZYSTANIEM WEKTORA PUŁAPKOWEGO pmat1 cd. II. Określenie liczby kopii zidentyfikowanego TE i jego lokalizacja w genomie Pseudomonas sp. LM7R III. Rozpowszechnienie zidentyfikowanego TE w wybranych szczepach bakterii

4 CZĘŚĆ I IZOLACJA PLAZMIDÓW, ICH ANALIZA I WYKORZYSTANIE W INŻYNIERII GENETYCZNEJ 4

5 Ćwiczenie nr 1 Metody oczyszczania plazmidowego DNA I. Oczyszczanie DNA plazmidowego na dużą skalę Izolacja plazmidowego DNA metodą ultrawirowania w gradiencie chlorku cezu (CsCl) z bromkiem etydyny (EtBr). Metoda ta została po raz pierwszy zastosowana przez Radloff a, Bauer a i Vinograd a w 1967 roku do oczyszczenia mitochondrialnego DNA z linii komórkowej HeLa. Później znalazła zastosowanie w oczyszczaniu i izolacji na dużą skalę (pozwala na uzyskanie mg DNA) plazmidowego DNA. Zasada działania: Bromek etydyny interkaluje w strukturę dwuniciowych kwasów nukleinowych, co prowadzi do nieznacznego rozplecenia helisy. Forma kowalentnie zamkniętego DNA (cccdna) włącza znacznie mniej bromku etydyny niż formy OC i liniowego DNA, więc jej gęstość pławna zmienia się w mniejszym stopniu niż ma to miejsce w przypadku pozostałych form. Stosowany w tej metodzie chlorek cezu (CsCl) jest wysokocząsteczkową solą, której stężony (8 M) roztwór ma gęstość podobną do gęstości DNA (1,7 g/cm 3 ). W wyniku wirowania w wysokich obrotach (45 tys. rpm, 48 godz) wytwarza się gradient CsCl (Rys. 1a), zaś DNA, w zależności od formy, przesuwa się w miejsce, w którym jego gęstość pławna jest równa gęstości rozpuszczalnika (Rys. 1b). Różnice w gęstości pławnej form superhelikalnej (np. plazmidowy DNA) i liniowej (np. pofragmentowany DNA chromosomalny) powodują, że powstają dwa prążki DNA: cccdna lokuje się bliżej dna probówki, a liniowy DNA nad nim. Znajdujące się w surowym lizacie komórkowym RNA osiada na dnie komórki, a białka unoszą się w stronę korka. Należy pamiętać, że ultrawirowanie w gradiencie chlorku cezu (CsCl) z bromkiem etydyny pozwala na różnicowanie DNA ze względu na jego strukturę i gęstość pławną, a nie wielkość cząsteczki kwasu nukleinowego. Jeśli w tej metodzie zastosowany zostanie szczep posiadający kilka plazmidów, niezależnie od wielkości ich cząsteczek, wszystkie znajdą się w jednym paśmie DNA, a do ich rozdzielenia konieczne będzie zastosowanie innych metod, np. wirowania w gradiencie alkalicznej lub neutralnej sacharozy, czy też elektroforezy w żelu agarozowym. Rys. 1. (A) Gradient CsCl. (B) Obraz w UV po ultrawirowaniu wstępnie przygotowanej hodowli bakteryjnej w gradiencie CsCl i EtBr. 5

6 Celem ćwiczenia jest izolacja plazmidów poprzez ultrawirowanie w gradiencie CsCl+EtBr. Część praktyczna: Oczyszczanie formy cccdna plazmidowego metodą ultrawirowania w gradiencie chlorku cezu z bromkiem etydyny (procedura) 1. Załóż nocną hodowlę wybranego szczepu bakteryjnego w 10 ml podłoża LB z dodatkiem odpowiedniego antybiotyku i inkubuj w optymalnej dla szczepu temperaturze, z wytrząsaniem przez noc. 2. Dodaj 10 ml hodowli do 1 litra podłoża z antybiotykiem i inkubuj przez kilkanaście godzin z wytrząsaniem. 3. Odwiruj hodowlę w wirówce Sorval (6000 obr/min, 20 min, 4ºC). 4. Po zwirowaniu komórek dokładnie usuń supernatant. 5. Zawieś komórki w 40 ml roztworu I (50 mm glukoza, 25 mm Tris-HCl, 10 mm EDTA, ph 8,0). Wymieszaj bardzo dokładnie. 6. Dodaj 80 ml roztworu II (0,2 M NaOH, 1% SDS w/v, ph 12,5). 7. Wymieszaj dokładnie, lecz łagodnie i pozostaw probówki w lodzie na 10 min. 8. Dodaj 60 ml zimnego roztworu III (5 M octan potasu, ph 4,8). Wymieszaj dokładnie przez łagodne odwracanie probówki i pozostaw w lodzie na 15 min. 9. Odwiruj przez 15 min w wirówce Sorval (7 000 obr/min, 4ºC). 10. Zlej ostrożnie supernatant przez kilka warstw gazy do cylindra. Jeżeli w zlanym supernatancie pozostanie biały precypitat, powtórz wirowanie. 11. Zmierz objętość supernatantu. Dodaj 0,6 objętości izopropanolu. Wymieszaj i pozostaw w temperaturze pokojowej przez 15 min. 12. Odwiruj w wirówce Sorval (7 000 obr/min, 15 min, temperatura pokojowa). 13. Zlej ostrożnie supernatant, tak aby zachować nienaruszony osad. Osad należy wysuszyć pod próżnią lub w termostacie na 37ºC. 14. Wysuszony osad rozpuść w 8 ml buforu TE. Zneutralizuj ph (do ph 7-8) dodając kroplami 2 M Tris-base (ph=9,5) i kontrolując ph papierkiem wskaźnikowym. UWAGA: PRACA W RĘKAWICZKACH Bromek etydyny jest rakotwórczy, należy zachować ostrożność pracując z tym związkiem. 6

7 15. Przenieś całą objętość z probówki wirowniczej do probówki typu Falcon zawierającej 8,6 g CsCl (uprzednio wysuszonego). Wymieszaj dokładnie przez obracanie probówki. Dodaj 1 ml bromku etydyny (roztwór EtBr 10 mg/ml). Pozostaw w temperaturze pokojowej na 5 min. 16. Odwiruj przez 5-10 min w wirówce Eppendorf Centrifuge 5810R ( obr/min, temperatura pokojowa). 17. Usuń warstwę białek i właściwy roztwór przenieś do probówki do ultrawirowania. Zmierz gęstość roztworu przez zważenie 1 ml. Gęstość powinna być w zakresie 1,55 1,59 g/ml. Jeżeli wykracza poza te granice doprowadź do właściwego poziomu przez dodanie buforu TE lub roztworu CsCl (10 g CsCl/ 10 ml TE). 18. Probówki zrównoważ bardzo dokładnie. 19. Wiruj w ultrawirówce Beckman, rotor kątowy Ti50 przez 48 godz. ( obr/min, 15ºC). 20. Po zakończeniu wirowania obejrzyj probówki w świetle UV (320 nm). Powinny być widoczne dwa wyraźnie oddzielone pasma DNA (Rys. 1B). Używając pipety pasterowskiej zbierz DNA z dolnego pasma, starając się nie pobrać materiału z pasma górnego (DNA chromosomalny). 21. Z zebranego materiału należy usunąć EtBr przez kilkukrotną ekstrakcję alkoholem izopropanowym nasyconym CsCl, aż do zaniku różowej barwy roztworu DNA. 22. Następnie preparat należy oczyścić z CsCl. W tym celu przenieś preparat pipetą pasterowską do worka dializacyjnego. Dializa w chłodni w 1 litrze buforu TE przez noc, zmiana buforu 1-2 razy. 23. Oczyszczony preparat nałóż na żel i sprawdź elektroforetycznie jego jakość. 7

8 Ćwiczenie nr 2 Metody oczyszczania plazmidowego DNA cd. Klonowanie. Enzymy restrykcyjne i wektory. I. Wykorzystanie wektorów do klonowania DNA. Klonowanie to proces polegający na uzyskaniu wielu identycznych kopii interesującego nas genu (lub fragmentu DNA), poprzez jego wstawienie do tzw. wektora do klonowania, a następnie namnożenie zrekombinowanego wektora w odpowiednim gospodarzu. Wektory do klonowania: muszą by zdolne do autonomicznej replikacji w komórkach określonego gospodarza; muszą mieć miejsce do klonowania, w które można wbudować obcy fragment DNA; powinny mieć odpowiedni marker selekcyjny, kodujący łatwo wyróżnialne cechy fenotypowe, dzięki którym będzie można wyselekcjonować komórki niosące plazmidy; powinny mieć odpowiednią kasetę selekcyjną, kodującą łatwo wyróżnialne cechy fenotypowe, dzięki którym będzie można wyselekcjonować komórki niosące zrekombinowany plazmid; powinny by małe, aby łatwo dały się wprowadzać do komórek gospodarza. Celem tego cyklu zajęć jest zapoznanie uczestników z różnymi typami wektorów do klonowania oraz różnymi typami selekcji zrekombinowanych klonów. II. Konstrukcja minireplikonów Replikon fragment DNA występujący autonomicznie w cytoplazmie zdolny do samodzielnej replikacji. Minimalny replikon minireplikon zawierający najmniejszy fragment macierzystego plazmidu zdolny do autonomicznej replikacji. Nie charakteryzuje się on cechami plazmidu wyjściowego. Zwykle jest niestabilny. Podstawowy replikon jest to minimalna część plazmidu naturalnego zdolna do replikacji, ale jednocześnie zachowująca większość cech plazmidu macierzystego (liczba kopii, stabilność, zakres gospodarzy). Replikon złożony w cząsteczce takiego replikon (np. plazmid F) występuje kilka systemów replikacyjnych. 8

9 Część praktyczna: 1. Plazmid pbluescript SKII należy strawić enzymami restrykcyjnymi: EcoRI lub SmaI. Trawienie 20 min w temp. 37 C. Mieszanina reakcyjna: plazmid enzym bufor (10 x) H 2 O dejonizowana RAZEM - 4 μl - 1 μl - 2 μl - 13 μl - 20 μl 2. Plazmid pkrp11 oczyszczony przez ultrawirowanie w gradiencie CsCl+EtBr (źródło kasety kanamycynowej) należy strawić analogicznym enzymem. Trawienie 20 min w temp. 37 C. Mieszanina reakcyjna: pkrp11 enzym bufor (10 x) H 2 O dejonizowana RAZEM - 6 μl - 1 μl - 2 μl - 11 μl - 20 μl 3. Po zakończeniu trawienia plazmidu pkrp11 należy całą próbę nanieść na 0,8% żel agarozowy i przeprowadzić elektroforezę DNA. 4. Po zakończeniu elektroforezy należy wyizolować fragment DNA (zawierający kasetę kanamycynową) z żelu agarozowego za pomocą zestawu Gel Out (fragment wielkości około 1,4 kpz). 5. Strawiony odpowiednimi enzymami DNA plazmidu pbluescript, należy oczyścić po trawieniu za pomocą zestawu Clean Up. 6. Następnie należy nastawić reakcję ligacji preparatów uzyskanych po oczyszczeniu trawienia wektora z wyizolowaną kasetą kanamycynową. Ligacja przez noc, w temp. 16 C. Na następnych zajęciach (ćwiczenie nr 3): Transformacja mieszaniny ligacyjnej do szczepu E. coli TG1 i wysiew na podłoże odpowiednie podłoża selekcyjne. Mieszanina reakcyjna: fragment restrykcyjny pbluescript wyizolowana kaseta kanamycynowa ligaza DNA bakteriofaga T4 bufor do ligazy (10 x) RAZEM - 7 μl - 10 μl - 1 μl - 2 μl - 20 μl 9

10 Ćwiczenie nr 3 Metody wprowadzania DNA do komórki bakteryjnej Transformacja Transformacją nazywamy proces pobierania egzogennego DNA przez komórkę biorcy. Zjawisko naturalnej transformacji jest częste w przypadku bakterii rosnących w formie biofilmu, a w regulacji tego procesu znaczącą rolę odgrywa zjawisko wyczuwania liczebności (ang. quorum sensing). Transformacja większości bakterii wymaga zastosowania specyficznych metod laboratoryjnych. Jedynie komórki znajdujące się w stanie tzw. kompetencji są zdolne do pobrania DNA ze środowiska. Niektóre rodzaje bakterii osiągają stan kompetencji spontanicznie, np. Bacillus, Streptococcus, Azotobacter czy Helicobacter, bądź też są w stanie konstytutywnej kompetencji jak Neisseria gonorrhoeae. Bakterie są zdolne do pobrania każdego DNA, jedynie w przypadku N. gonorrhoeae i Helicobacter pylori wymagana jest homologia sekwencji z chromosomowym DNA. W warunkach laboratoryjnych transformację chemiczną przeprowadza się dodając mieszaninę DNA do zawiesiny komórek uprzednio traktowanych określonymi czynnikami chemicznymi w niskiej temperaturze. Całość poddaje się szokowi termicznemu, a po odpowiednim czasie inkubacji wysiewa na podłoża selekcyjne. Odmianą transformacji jest elektrotransformacja (elektroporacja) wykorzystywana w przypadku bakterii, które nie uzyskują stanu kompetencji pod wpływem czynników chemicznych lub gdy wydajność procesu transformacji jest niska. W tej metodzie mieszaninę DNA i bakterii poddaje się krótkiemu (5-10 msec) pulsowi prądu elektrycznego o napięciu rzędu 2,5 kv. Wydajność transformacji plazmidowym DNA w przypadku E. coli zależy od formy DNA: najwyższa dla formy CCC, niższa dla OC, a najniższa dla formy liniowej. Do komórki bakterii wnika najczęściej tylko jedna cząsteczka DNA, o czym warto pamiętać w przypadku przeprowadzania transformacji mieszaniną różnych cząsteczek DNA. Koniugacja Koniugacja jest definiowana jako proces przekazywania materiału genetycznego z jednej komórki bakteryjnej do drugiej, wymagający bezpośredniego kontaktu obu komórek. Transfer koniugacyjny plazmidów jest zaliczany do najistotniejszych procesów horyzontalnego transferu genów (HGT, ang. horizontal gene transfer). Proces koniugacji można podzielić na dwa etapy: przygotowanie DNA plazmidu do transferu koniugacyjnego, tzw. funkcje Dtr (ang. DNA transfer and replication); powstanie tzw. mostu koniugacyjnego czyli fuzji błon miedzy dawcą a biorcą u bakterii gramujemnych a w przypadku bakterii gramdodatnich tworzenie agregatów koniugacyjnych, tzw. funkcje Mpf (ang. mating pair formation). DNA jest przekazywany jednokierunkowo w postaci jednoniciowego odcinka DNA dawcy o polarności 5 3. Powstały na skutek przecięcia nici wolny koniec 5 pozostaje przytwierdzony do błony komórkowej w pobliżu miejsca połączenia partnerów. Do biorcy wprowadzana jest tylko jedna nić DNA (ta, która ulega przecięciu), stanowi ona matrycę do syntezy nici komplementarnej, czego efektem jest odtworzenie plazmidu w komórce biorcy. Wolny koniec 3 -OH stanowi starter do syntezy komplementarnej nici w komórce dawcy wg modelu RC. 10

11 Plazmid koniugacyjny (Tra + ) plazmid zawierający zespół genów warunkujących kompletny proces koniugacji. Duże rozmiary (kilkadziesiąt kb) plazmidów koniugacyjnych utrudniają ich stosowanie jako wektorów. Plazmid mobilizowalny (Tra - Mob + ) plazmid, który posiada w swojej cząsteczce geny warunkujące jedynie przygotowanie plazmidu do transferu koniugacyjnego DNA. Aby możliwe było przekazanie DNA wymagana jest obecność innego plazmidu koniugacyjnego, tzw. plazmidu mobilizującego (syn. plazmid pomocniczy; ang. helper). Celem ćwiczenia jest wprowadzenie plazmidowego DNA do komórek dwóch gatunków bakterii: E. coli (Gammaproteobacteria) i P. versutus (Alphaproteobacteria) na drodze transformacji chemicznej i elektroporacji oraz koniugacji. Na podstawie wyników ćwiczenia studenci określą zakres gospodarzy wprowadzanych plazmidów. Część praktyczna: Szczepy i plazmidy wykorzystywane na zajęciach: E. coli TG1 - F [trad36 proab + laci q lacz M15] supe44 hsd 5 (lac - proab P. versutus UW225 - Rif R I. Transformacja metodą rubidowo-wapniową (Kushner, 1978) 1. Nocną hodowlę E. coli odmłodzić a następnie inkubować z wytrząsaniem w temp. 37 o C do osiągnięcia wykładniczej fazy wzrostu (ok. 1,5 godz.). 2. 1,5 ml hodowli odwirować w probówce Eppendorfa w 4 o C, 12 tys. obr./min, 10 min. 3. Usunąć podłoże i ponownie dodać 1,5 ml hodowli do probówki i odwirować j.w. 4. Usunąć dokładnie supernatant, osad bakterii zawiesić w 1 ml Roztworu I, a następnie odwirować j.w. 5. Usunąć dokładnie supernatant, a uzyskany osad zawiesić w 0,2 ml Roztworu II. 6. Zawieszone bakterie inkubować min w lodzie. 7. Dodać 3 l DNA plazmidowego (pabw3ec, pabw3pv lub pbgs18) 8. Inkubować mieszaninę bakterii przez 50 sekund w temp. 43 o C (szok termiczny). 9. Szybko dodać 1 ml podłoża LB i inkubować przez ok. 30 min w temperaturze 37 o C bez wytrząsania. 10. Mieszaninę komórek zagęścić przez wirowanie - uzyskany osad zawiesić w 100 l LB i wysiać całość na szalki z podłożem selekcyjnym LA+Km. 11. Inkubować 24 godz. w 37 o C (E. coli) bądź 48 godz. w temp 30 o C (P. versutus). Roztwór I 10 mm MOPS ph 7,0 10 mm RbCl Roztwór II 100 mm MOPS ph 6,5 50 mmcacl 2 10 mm RbCl 11

12 II. Elektroporacja 1. Odpowiednio przygotowaną do elektroporacji porcję komórek wyjąć z zamrożenia (- 70 o C) i umieścić na 30 min w lodzie. 2. Do porcji komórek (40 l) dodać 2 l DNA (pabw3ec, pabw3pv lub pbgs18) i kontynuować inkubację przez kolejne 10 min. 3. Mieszaninę przenieść do schłodzonej kuwety do elektroporacji (szczelina 2 mm), umieścić kuwetę w saneczkach Bio-Rad Gene Pulser, i przepuścić impuls elektryczny 2,5 kv, 25 F (E. coli - 200, P. versutus ). 4. Po elektroporacji mieszaninę komórek zawiesić w 1 ml świeżego LB i przenieść do nowej probówki Eppendorfa. 5. Zawiesinę bakterii inkubować w 30 o C w przypadku, P. versutus, lub 37 o C, w przypadku E. coli, przez 1 godz. bez wytrząsania. 6. Hodowlę zagęścić przez wirowanie, zawiesić w 100 l LB i wysiać na szalki z podłożem selekcyjnym LA+Km. 7. Inkubować w 30 o C lub 37 o C przez godz. III. Koniugacja trójrodzicielska Biorca: P. versutus UW225; Dawca: E. coli z plazmidem pabw3 (Km r ) lub pbgs18 (Km r ) Szczep z plazmidem pomocniczym: E. coli z plazmidem prk2013 (Km r ) 1. Odwirować 1,5 ml nocnej hodowli P. versutus UW225, E. coli TG1 (pabw3 lub pbgs18) oraz E. coli TG1 (prk2013). 2. Zebrać supernatant, a uzyskany osad zawiesić w 1,5 ml RF i odwirować 5 min 12 tys. obr./min. 3. Zebrać supernatant, a osad zawiesić w 1,5 ml roztworu fizjologicznego (RF). 4. Zmieszać zawiesiny bakteryjne trzech szczepów w stosunku 1:1:2 (dawca:szczep pomocniczy:biorca), po czym wysiać 100 l mieszaniny na szalkę z podłożem LA. 5. Inkubować w 30 o C przez 24 godz. UWAGA: Studenci otrzymują szalkę LB z murawką zmieszanych szczepów dawcy, biorcy i szczepu pomocniczego i wykonują eksperyment od punktu Na płytkę z murawką bakteryjna nanieść 2 ml RF i zmyć warstwę bakterii za pomocą głaszczki. 7. Zawiesinę komórek przenieść do probówki Eppendorfa. 8. Kolejne rozcieńczenia (10 0, 10-1, 10-2 i 10-3 ) wysiać na szalkę z LB+Rif+Km 9. Inkubować 48 godz. w 30 o C. Na zajęciach nr 5 - Podsumowanie wyników transformacji, elektroporacji i koniugacji. 12

13 Ćwiczenie nr 4 Metody adnotacji genomów bakteryjnych zajęcia seminaryjne UWAGA: Studenci zaliczają te zajęcia w formie praktycznej wykonanie adnotacji. Dzięki temu uzyskują punkty, które są doliczane podczas kolokwium zaliczeniowego z przedmiotu. 13

14 CZĘŚĆ II MOLEKULARNA CHARAKTERYSTYKA SYSTEMÓW KODUJĄCYCH TOKSYNĘ I ANTYTOKSYNĘ 14

15 Ćwiczenie nr 5 Analiza organizacji genetycznej systemu addykcyjnego izolacja RNA do RT-PCR Systemy addykcyjne, nazywane również systemami trucizna-antidotum (TA), kodowane są zwykle na plazmidach niskokopiowych. Niekiedy plazmid koduje jednocześnie kilka systemów tego typu, np. plazmidy F i R1. Najczęściej są to układy dwugenowe, w których gen kodujący antidotum jest zlokalizowany przed genem trucizny. Wszystkie dotychczas poznane systemy trucizna-antidotum mają podobny mechanizm działania. Na plazmidzie kodowana jest zarówno trucizna jak i antidotum, które łączą się dając nieaktywny kompleks. Jeżeli po podziale powstanie komórka bezplazmidowa to jest ona eliminowana z populacji na drodze posegregacyjnego zabijania (ang. postsegregational cell killing). Jest to możliwe ponieważ wraz z odziedziczoną cytoplazmą trafiają do komórek potomnych oba produkty systemu, a białko trucizny jest o wiele bardziej stabilne niż antidotum. Brak konstytutywnej produkcji antidotum w komórce bezplazmidowej powoduje, że trucizna może oddziaływać na specyficzny cel komórkowy, co ostateczne prowadzi do efektu bakteriostatycznego lub bakteriobójczego. Celem niniejszych zajęć jest izolacja RNA do RT-PCR, który wykaże, czy geny tworzące badany system addykcyjny są zorganizowane w operon. Część praktyczna: I. Izolacja i elektroforeza RNA A. Izolacja RNA 1. Osad z 4,5 ml hodowli nocnej E. coli DH5 (pbgs-sxt) zawiesić w 1 ml TRIzolu i inkubować przez 5 min w temp. pokojowej. 2. Dodać 0,2 ml chloroformu i dokładnie wymieszać. 3. Po 15-minutowej inkubacji w temp. pokojowej, próbki zwirować w mikrowirówce przez 15 min w temp. 4 C przy obr./min. 4. Do zebranego supernatantu dodać 0,5 ml izopropanolu i wymieszać. 5. Po 10-minutowej inkubacji w temp. pokojowej próbę ponownie zwirować (8 min, obr./min, 4 C). 6. Osad RNA przemyć 75 % etanolem, zwirować (5 min, obr./min, 4 C), wysuszyć i zawiesić w 50 l H 2 O zawierającej pirowęglan dietylu (DEPC) 7. Próby inkubować przez 10 min w temp C. B. Przygotowanie żelu agarozowego z 2,2 M formaldehydem 1. 1,5 g agarozy rozpuścić w 75 ml wody zawierającej DEPC, w temp. 100 C. 2. Po jej schłodzeniu do temp. ok. 55 C dodać 10 ml stężonego buforu do elektroforezy RNA (10 x MOPS) oraz 9 ml formaldehydu. 15

16 3. Po wylaniu, żel pozostawić na 1 godz. w temp. pokojowej, a następnie przeprowadzić 5-minutową elektroforezę wstępną w buforze do elektroforezy RNA (1 x MOPS), przy napięciu 5 V/cm. C. Przygotowanie próbek RNA do elektroforezy Próbki przygotować przez zmieszanie: (a) 2 µl RNA, (b) 2 µl stężonego buforu do elektroforezy RNA (10 x MOPS), (c) 4 µl formaldehydu, (d) 10 µl formamidu, (e) 1 µl bromku etydyny. Próbki inkubować 60 min w temp. 55 C. Po schłodzeniu próbki zwirować (3 min, obr./min, 4 C), a następnie dodać 2 µl buforu obciążającego. Na żel nanieść po 10 l preparatu. D. Elektroforeza RNA Elektroforezę RNA prowadzić w 1,5 % żelu agarozowym z 2,2 M formaldehydem, w buforze z 1 x MOPS, przy napięciu 5 V/cm, przez 2 godz. w temp. pokojowej. Po rozdziale elektroforetycznym RNA analizować w świetle UV o długości fali 300 nm. Szczep i plazmid wykorzystywane na zajęciach: RNA będzie izolowany ze szczepu E. coli TG1 niosącego plazmid pbgs-sxt (plazmid pbgs18 z wklonowanym w miejsce SmaI modułem addykcyjnym pochodzącym z transpozonu koniugacyjnego SXT). Rys. 2. Mapa genetyczna plazmidu pbgs18-sxt. 16

17 Ćwiczenie nr 6 Analiza organizacji genetycznej systemu addykcyjnego RT-PCR Wszystkie scharakteryzowane dotychczas moduły addykcyjne tworzą dwu- lub trzygenowe operony. Wykazano, że system addykcyjny z transpozonu koniugacyjnego SXT koduje dwa geny i niesie dwa promotory (P1 i P2) (Ryc. 2). Nie można jednak wykluczyć, iż geny te tworzą operon, natomiast obecność dodatkowego wewnętrznego promotora P2, położonego przed genem antidotum, jest konieczna, aby zapewnić zbalansowane ilości białek badanego systemu. W celu zbadania czy oba geny są kodowane na policistronowym mrna, należy przeprowadzić syntezę cdna na matrycy mrna, aby następnie wykonać PCR z wykorzystaniem odpowiednio zaprojektowanych par starterów. Rys. 3. Schemat RT-PCR. Celem niniejszych zajęć jest sprawdzenie, czy geny tworzące badany system addykcyjny są zorganizowane w operon. Część praktyczna: A. Usuwanie DNA z próbek RNA poprzez trawienie DNazą pozbawioną RNaz Próbki przygotowywano przez zmieszanie: (a) 5 µl RNA,, (b) 2 µl 10 x buforu do DNazy, (c) 1 µl DNazy (1u/µl), (d) 12 µl H 2 O zawierającej DEPC. Mieszaninę inkubowano przez 45 min w temp. 37 C. Następnie reakcję zatrzymywano przez dodanie 1 µl 25 mm EDTA i 15-minutową inkubację w 65 C. Próby schładzano w lodzie i zamrażano w -70 C. B. Synteza cdna na matrycy RNA i usuwanie RNA (RT-PCR) 1. Próbki przygotowywać przez zmieszanie: (a) 10 µl preparatu całkowitego RNA traktowanego DNazą, (b) 4 µl startera GP1SXT2 (o stężeniu 1 pmol/µl), (c) 1,5 l H 2 O zawierającej DEPC. 2. Mieszaninę inkubować przez 10 min w temp. 70 C, a następnie przez 1 min w temp. 4 C. 17

18 3. Po krótkim zwirowaniu dodać: (d) 2,5 µl 10 x buforu PCR, (e) 2,5 µl 25 mm MgCl 2, (f) 1 µl 10 mm mieszaniny dntp, (g) 2,5 µl 0,1 M DTT. 4. Po wymieszaniu i zwirowaniu próby inkubować (w termocyklerze) kolejno w: 70 C przez 2 min, 65 C przez 1 min, 60 C przez 1 min, 55 C przez 1 min, 50 C przez 1 min i 45 C przez 1 min. 5. Próby zworteksować, zwirować i dodać: (h) 1 µl odwrotnej transkryptazy Super Script II RT. 6. Próby inkubować w następujących warunkach: 42 C przez 50 min, 5 x cykl 50 C 1 min, 53 C 1 min, 56 C 1 min, 70 C przez 15 min. 37 C HOLD 7. Po schłodzeniu mieszaniny reakcyjnej do 37 C, do prób dodać: (i) 1µl RNase Mix, po czym inkubować w 37 C przez 30 min w celu strawienia RNazą utworzonych dupleksów RNA:DNA i pozostałości całkowitego RNA. Następnie próby zwirowywać i inkubować w lodzie. C. Synteza drugiej nici DNA (PCR) 1. Próbki do syntezy drugiej nici DNA przygotować przez zmieszanie: (a) 31,5 µl dejonizowanej H 2 O, (b) 5 µl 10x buforu PCR, (c) 3 µl 25 mm MgCl 2, (d) 1 µl 10 mm mieszaniny dntp, (e) 2 µl 10 µm startera LTSXT, (f) 2 µl 10 µm startera RP2SXT lub 2RASXTER, (g) 5 µl matrycy (RNA, cdna lub DNA), (h) 0,5 µl [5 u/µl] polimerazy Taq. 2. Następnie przeprowadzić reakcję PCR w następujących warunkach: 95 C przez 5 min, 95 C przez 30 sec, 58 C przez 30 sec (gradient +/- 1 C, para LTSXT/RP2SXT w temp.57 C, para LTSXT/2RASXTER w temp. 58 C), 72 C przez 45 sec, (etapy b-d powtórzyć w 20 cyklach) 72 C przez 10 min 4 C HOLD. 3. Przeprowadzić analizę elektroforetyczną produktów PCR w 2% żelu agarozowym. 18

19 Ćwiczenie nr 7 Oznaczanie aktywności promotorów systemów addykcyjnych (TA) oraz badanie interakcji białek sytemów TA z wykorzystaniem bakteryjnego układu dwuhybrydowego Rys. 4. Schemat operonu laktozowego: A) podczas indukcji, B) podczas inhibicji. 19

20 Rys. 5. Bakteryjny układ dwuhybrydowy (Di Lallo i wsp., 2002). Celem ćwiczenia jest określenie aktywności promotorów wyodrębnionych z różnych systemów addykcyjnych typu tad-ata poprzez utworzenie fuzji z genami struktury operonu laktozowego w odpowiednim do tego celu wektorze oraz zbadanie interakcji białka toksyny i antytoksyny z wykorzystaniem bakteryjnego układu dwuhybrydowego. 20

21 Część praktyczna: Pkt. 1 2 Badanie aktywności promotorów systemów addykcyjnych Założyć hodowlę nocną szczepu E. coli DH5 lac niosącego plazmid prs551 lub zrekombinowany plazmid prs551/ promotor. 10 ml podłoża LB+odpowiedni antybiotyk zaszczepić odpowiednią objętością hodowli nocnej, tak aby przy długości fali = 600 nm absorbancja wynosiło około 0,05. Badanie interakcji białka toksyny i antidotum systemu addykcyjnego Założyć hodowlę nocną szczepu E. coli R721 niosącego odpowiednie układy dwuplazmidowe do badania interakcji białek. 10 ml podłoża LB + Ap(50 μg/ml) + Km (30 μg/ml) + IPTG (0,1 mm) zaszczepić odpowiednią objętością hodowli nocnej, tak aby przy długości fali = 600 nm absorbancja wynosiło około 0, Odmłodzone hodowle należy inkubować z wytrząsaniem w temp. 37 C przez około 2 godz., aż do osiągnięcia absorbancji = 0,28-0,7 przy długości fali = 600 nm. Następnie hodowle należy wstawić do lodu na 10 min i powtórnie zmierzyć absorbancję przy długości fali = 600 nm. Do probówki o pojemności 2 ml należy dodać kolejno: hodowlę μl 5 chloroform μl bufor Z μl SDS 0,1 % - 50 μl RAZEM μl 6 Mieszaninę należy zworteksować przez około 10 sec. 7 Następnie mieszaninę należy inkubować przez 5 min w temp. 28 C, po czym należy dodać 200 μl ONPG (4 mg/ml). Po dodaniu ONPG należy rozpocząć pomiar czasu. 8 Mieszaninę należy dalej inkubować w temp. 28 C aż do pojawienia się żółtego koloru. 9 Po zażółceniu mieszaniny reakcyjnej należy zatrzymać reakcję poprzez dodanie 0,5 ml 1 M Na 2 CO 3. Po zatrzymaniu reakcji należy zakończyć pomiar czasu. 10 Próby zwirować przez około 15 sec. 11 Przeprowadzić pomiar absorbancji przy długości fali = 550 nm i 420 nm. 12 Obliczyć siłę promotora korzystając ze wzoru: 1000 x (A420-1,75 x A 550) T x V x A600 gdzie: T czas w minutach; V objętość hodowli użyta do oznaczenia (0,1 ml). 21

22 Szczep i plazmid wykorzystywane na zajęciach: E. coli DH5 lac - deor thi1 rela1 supe44 enda1 gyra96 reca1 hsdr17 (argf,lac)u169 Nal R Rys. 6. Mapa genetyczna plazmidu prs

23 Ćwiczenie nr 8 Badanie efektu toksycznego wywołanego przez trucizny różnych systemów addykcyjnych oraz zdolności antidotum do jego odwracania Rys. 7. Schemat organizacji genetycznej i regulacji ekspresji operonu arabad E. coli. (A) Trzy geny strukturalne araa, arab i arad są transkrybowane z promotora P BAD i kodują odpowiednio: kinazę L-rybulozy, izomerazę L-arabinozy i epimerazę L-rybulozo-5-fosforanu. Powyżej promotora znajduję się region I, z którym wiąże się AraC aktywując transkrypcję w obecności arabinozy oraz miejsce wiązania białka receptorowego CRP. Ponadto wyróżniono dwa operatory O 1 i O 2, z którymi wiąże się białko AraC hamując transkrypcję. Gen arac kodujący białko aktywatora jest transkrybowany z promotora P c, który jest ułożony rozbieżnie w stosunku do P BAD. (B) Mechanizm działania AraC przy braku i (C) w obecności arabinozy (wg Schleif, 2000, zmodyfikowane). Celem ćwiczenia jest zbadanie: (i) efektu toksycznego wywołanego przez indukowaną obecnością arabinozy nadprodukcję białka toksyny kodowanego przez system addykcyjny oraz (ii) zdolności antidotum do odwrócenia ewentualnego efektu toksycznego. Część praktyczna: 1. Założyć hodowlę nocną szczepu E. coli MC1000 niosącego zrekombinowany plazmid pcf430/toksyna lub układ dwuplazmidowy pcf430/toksyna +pndm220/antidotum ml świeżego podłoża LB+Tc(+Ap) zaszczepić odpowiednią objętością hodowli nocnej, tak aby przy długości fali = 600 nm OD wynosiło 0,07. 23

24 3. Odmłodzoną hodowlę należy inkubować z wytrząsaniem w temp. 37 C przez 40 min, a następnie zmierzyć gęstość optyczną przy długości fali = 600 nm. 4. Do całości hodowli dodać 400 μl arabinozy. 5. Po 40 min zmierzyć absorbancję przy długości fali = 600 nm Następnie należy rozdzielić hodowlę na połowy (po 20 ml), dodać do jednej hodowli 100 μl IPTG i kontynuować inkubację z wytrząsaniem w temp. 37 C. 6. Przez następne 2 godz., co 40 min, należy pobierać próby i mierzyć gęstość optyczną przy długości fali = 600 nm. Po zakończeniu eksperymentu należy wyznaczyć krzywą zmian OD w czasie. Szczep i plazmidy wykorzystywane na zajęciach: E. coli MC F - arad139 delta(ara, leu)7697 delta(lac)chi74 galu- galk- rpsl Rys. 8. Plazmidy wykorzystane do badania wpływu toksyny na komórki bakteryjne oraz odwrócenia efektu toksycznego w obecności antidotum. 24

25 CZĘŚĆ III IDENTYFIKACJA I ANALIZA FUNKCJONALNYCH ELEMENTÓW TRANSPOZYCYJNYCH 25

26 Ćwiczenie nr 9 Identyfikacja elementów transpozycyjnych z wykorzystaniem wektora pułapkowego pmat1 Elementy transpozycyjne (TE; ang. transposable elements) to segmenty DNA zdolne do przemieszczania się z jednego miejsca genomu w inne (w obrębie jednego lub między różnymi replikonami) w wyniku transpozycji (typ rekombinacji nieuprawnionej). Ze względu na stopień złożoności struktury genetycznej, TE dzielimy na: (i) transpozony I grupy [sekwencje insercyjne (IS ang. insertion sequence), transpozony złożone, moduły transpozycyjne (TMo)] oraz (ii) transpozony II grupy (transpozony niezłożone, MITE). Do identyfikacji funkcjonalnych TE skonstruowano specjalne narzędzia, wektory pułapkowe, umożliwiające identyfikację funkcjonalnych elementów transpozycyjnych in vivo. To plazmidy wahadłowe, zawierające kasety selekcyjne umożliwiające obserwację zajścia zdarzenia transpozycyjnego w ich obrębie. Rys. 9. Wektor pułapkowy pmat1. (A) Organizacja genetyczna. Zaznaczono poszczególne elementy strukturalne plazmidu: rep system replikacyjny pbbr1; mob system mobilizacyjny; Km r kaseta oporności na kanamycynę; kasetę selekcyjną sacb; (B) Zasada działania kasety sacb. pmat1 Km r ; 7,0 kpz; ori pbbr1mcs-2; orit RK2; kaseta selekcyjna w postaci genu sacb. Produkt genu sacb (ektoenzym lewanosacharaza), z obecnej w podłożu sacharozy, syntetyzuje lewany związki, które są toksyczne dla komórek bakterii gramujemnych i prowadzą do ich lizy. Wzrost komórek na podłożu z sacharozą możliwy jest tylko w przypadku inaktywacji genu sacb, która może być spowodowana zdarzeniem transpozycyjnym (insercją elementu transpozycyjnego), ale również mutacjami punktowymi lub delecjami w jego obrębie. Celem ćwiczenia jest: (i) identyfikacja funkcjonalnych TE w genomie Pseudomonas sp. LM7R, (ii) określenie miejsca lokalizacji TE w kasecie selekcyjnej wektora pmat1, (iii) wybranie starterów do wstępnego sekwencjonowania TE. u toksycznego. 26

27 Część praktyczna: I. Identyfikacja elementów transpozycyjnych w szczepie Pseudomonas sp. LM7R A. Identyfikacja elementów transpozycyjnych: (część przygotowana przez prowadzącego zajęcia) 1. Wektor pmat1 wprowadzono drogą koniugacji trójrodzicielskiej do szczepu Pseudomonas sp. LM7R (Rif r ). Mieszaninę konigacyjną wysiano na podłoże selekcyjne [LA (podłoże LB zestalone agarem) + kanamycyna 50 μg/ml]. Obecność plazmidów w transkoniugantach potwierdzono za pomocą analizy elektroforetycznej. (część wykonywana na ćwiczeniach) 2. Wysiej odpowiednie rozcieńczenia nocnych hodowli Pseudomonas sp. LM7R (Rif r ) z wprowadzonym wektorem pułapkowym pmat1 na wcześniej przygotowane szalki z podłożem: (i) kontrolnym: LA + kanamycyna 50 μg/ml (rozcieńczenia 10-5, 10-6, 10-7 ) (ii) selekcyjnym: LA + kanamycyna 50 μg/ml + sacharoza 10% (rozcieńczenia 10 0, 10-1, 10-2, 10-3 ) Rozcieńczenia (w LB) przygotowuje 1 grupa. Inkubacja szalek w 30 o C, 48 godzin. Tabela 1. Liczba kolonii uzyskanych na (i) podłożu kontrolnym i (ii) na podłożu selekcyjnym (liczba potencjalnych mutantów w genie sacb) Podłoże Wysiewane rozcieńczenia hodowli nocnej Pseudomonas sp. LM7R (Rif r ) z wprowadzonym pmat KONTROLA LA + Km (50 μg/ml) XXXX XXXX XXXX XXXX XXXX SELEKCJA LA + Km (50 μg/ml) + sacharoza 10% XXXX XXXX XXXX XXXX 3. Policz/oszacuj kolonie wyrosłe na szalkach, uzupełnij powyższą tabelę, a następnie, na podstawie uzyskanych danych, oblicz częstość transpozycji (wg wskazówek prowadzącego). (część przygotowana przez prowadzącego zajęcia) 4. Do dalszej analizy, z klonów wyrosłych na podłożu selekcyjnym (LA + Km 50 μg/ml + sacharoza 10%) wybrano losowo 50, które przesiano na szalki z odpowiednim podłożem. 5. Założono nocne hodowle wybranych klonów (LA + Km 50 μg/ml). 27

28 (część wykonywana na ćwiczeniach) 6. Wyizoluj plazmidowy DNA z dwóch wybranych klonów za pomocą minilizy alkalicznej. Otrzymasz zwirowane osady bakterii z 1,5 ml hodowli nocnej. Jedna grupa izoluje DNA z kontroli Pseudomonas sp. LM7R z wprowadzonym pmat1 z podłoża kontrolnego LA + Km 50 μg/ml. Miniliza alkaliczna (modyfikacja metody Birnboim i Doly, 1979) Oczyszczanie DNA plazmidowego na małą skalę. Roztwór I: 50 mm glukoza; 10 mm EDTA; 25 mm Tris-HCl (ph 8,0) Roztwór II: 0,2 M NaOH; 1% SDS Roztwór III: octan potasu (ph 4,8) 1. Odwiruj w eppendorfówce 1,5 ml nocnej hodowli bakterii (3 min w mikrowirówce). 2. Bardzo dokładnie zlej supernatant. 3. Osad zawieś w 100 μl roztworu I. 4. Dodaj 200 μl roztworu II. Zawartość eppendorfówki wymieszaj przez kilkukrotne odwracanie probówki i inkubuj w lodzie przez 5 min. 5. Dodaj 150 μl zimnego roztworu III, delikatnie wymieszaj i inkubuj w lodzie przez 5 min. 6. Dodaj kilka kropli mieszaniny fenolu z chloroformem (1:1) w celu odbiałczenia preparatu. 7. Wymieszaj łagodnie i zwiruj 10 min w temp. pokojowej. 8. Zbierz fazę wodną (górna warstwa) do nowej probówki. Dodaj 2 objętości 96% etanolu (1 ml), wymieszaj i trzymaj 15 min w temp. -20ºC (precypitacja DNA). 9. Odwiruj wytrącony DNA w mikrowirówce (10 min, 4ºC). 10. Zlej dokładnie supernatant i przemyj osad 70% etanolem (70 μl). Krótko odwiruj (5 min). 11. Dokładnie usuń supernatant (tak aby alkohol nie pozostawał na ściankach). Wysusz osad przez wstawienie otwartej probówki do termostatu na 37ºC. 12. Osad zawieś w 40 μl buforu TE (ph 8,0). 7. Analiza elektroforetyczna wyizolowanego DNA w 0,8% żelu agarozowym z zastosowaniem kontroli w postaci wektora pułapkowego pmat1. B. Lokalizacja miejsca insercji elementów transpozycyjnych w kasecie selekcyjnej sacb. 28

29 Rys. 10. Kaseta selekcyjna sacb z zaznaczonymi miejscami przyłączenia starterów wykorzystanych w reakcjach PCR do badania miejsca insercji elementu transpozycyjnego. Nazwy starterów umieszczono nad grotami strzałek. 1. Amplifikacja DNA w reakcji PCR (wg Sambrook i Russel, 2001) Do amplifikacji DNA wykorzystaj: (i) plazmidowy DNA (jako matrycę), uzyskany w punkcie A6 miniliza z 1 klonu oraz (ii) cztery pary starterów specyficznych dla genu sacb: (i) A489 i A869, (ii) B824 i B1253, (iii) C1225 i C1639 oraz (iv) D1619 i D1928. Łącznie należy nastawić 4 reakcje PCR, dodatkowo jedna grupa jako matrycę DNA wykorzystuje pusty wektor pmat1. Tabela 2. Przygotowanie reakcji PCR 1 reakcja H 2 O Bufor x10 MgSO 4 Bufor Q (glicerol) dntp 10mM Matryca (miniliza) Startery Polimeraza DNA 25 μl 12,9 μl 2,5 μl 2,5 μl 5 μl 0,5 μl 0,5 μl 0,5 μl 0,1 μl 2. Określenie wielkości otrzymanych produktów PCR w 0,8% żelu agarozowym. C. Sekwencjonowanie DNA wybranych elementów transpozycyjnych. 29

30 Ćwiczenia nr 10 i 11 Identyfikacja elementów transpozycyjnych z wykorzystaniem wektora pułapkowego pmat1 cd. II. Określenie liczby kopii zidentyfikowanego TE i jego lokalizacja w genomie Pseudomonas sp. LM7R W celu określenia liczby kopii zidentyfikowanego elementu transpozycyjnego, całkowity DNA Pseudomonas sp. LM7R strawiono wybranym enzymem restrykcyjnym (wg wskazówek prowadzącego), który trawi w obrębie analizowanego TE. Produkty trawienia należy rozdzielić w 0,8% żelu, a następnie przetransferować na membranę nylonową i dokonać analizy hybrydyzacyjnej z wykorzystaniem sondy zamplifikowanej w reakcji PCR, która stanowi wyznakowany digoksygeniną (DIG) fragment DNA zawierający analizowany TE (wg skryptu). III. Rozpowszechnienie zidentyfikowanego TE w wybranych szczepach bakterii Rozpowszechnienie analizowanego TE zostanie zbadane w genomach wybranych szczepów bakterii (podane przez prowadzącego), poprzez analizę hybrydyzacyjną DNA-DNA z wykorzystaniem metody dot-blot. W analizie należy wykorzystać sondę, w postaci zamplifikowanego w reakcji PCR fragmentu DNA TE (fragment genu transpozazy) lub plazmidu pmat1 z wintegrowanym TE, wyznakowanego DIG. Należy dokonać transferu odpowiednio przygotowanego całkowitego DNA wybranych szczepów na membranę nylonową metodą dot-blot (wg skryptu). Izolacja całkowitego DNA (Chen i Kuo, 1993) Bufor lizujący TESO: 40 mm Tris, ph 8,0 20 mm octan sodu 1 mm EDTA 1% SDS Roztwór NaCl 5M NaCl 1. Odwiruj cztery porcje po 1,5 ml hodowli nocnej wybranego szczepu bakterii (3 min, 12 tys. rpm); 2. Otrzymany osad zawieś w 200 μl buforu lizującego TESO przez silne pipetowanie. 3. Dodaj 66 μl 5 M NaCl; 4. Dokładnie zworteksuj (~ 1 min); 5. Zwiruj (4ºC, 10 min, 12 tys. rpm); 6. Zbierz supernatant (z dwóch porcji do jednego eppendorfa, powinno być w każdej probówce ~ 450 μl lizatu); 7. Dodaj równą objętość mieszaniny fenol:chloroform (1:1); 30

31 8. Zworteksuj (~ 1 min); 9. Zwiruj (5 min, 12 tys. rpm); 10. Zbierz fazę wodną (górną) do nowego eppendorfa i dodaj równą objętość chloroformu; 11. Zworteksuj (~1 min); 12. Zwiruj (5 min, 12 tys. rpm); 13. Do zebranego supernatantu (faza górna) dodaj 0,1 objętości roztworu III do minilizy i 2 objętości EtOH 96%; 14. Wytrącaj DNA (30 min, -20ºC); 15. Odwiruj wytrącony DNA (4ºC, 20 min, 14 tys. rpm); 16. Zlej supernatant i dwukrotnie przemyj osad EtOH 70% (70 μl); 17. Dokładnie usuń supernatant (tak, aby alkohol nie pozostawał na ściankach). Wysusz osad przez wstawienie otwartych probówek do termostatu na 37ºC; 18. Po wysuszeniu osad zawieś w 75 μl buforu TE (ph 8,0). Jakość otrzymanego preparatu określ spektrofotometrycznie (NanoDrop2000). Hybrydyzacja DNA-DNA techniką dot-blot Przygotowanie membrany 1. Do 100 μl preparatu całkowitego DNA (o stężeniu 200 µg/ml) badanego szczepu bakterii dodaj 1/10 objętości 3 M NaOH; 2. Próby inkubuj w 65 o C przez 30 minut w termobloku; 3. Następnie szybko schłodź je w lodzie i dodaj 1 objętość 2 M octanu amonu; 4. Przygotowane próby nanieś na wcześniej wyciętą membranę nylonową (9 x 12 cm) nasączoną 6 x SSC, przy użyciu aparatu dot-blot; 5. Pomiędzy górną, a dolną część komory aparatu dot-blot ułóż 3 warstwy bibuły (Whatmann, 3MM Chr) oraz membranę nylonową (9 x 12 cm) zwilżone 6 x SSC; 6. Następnie 100 l przygotowanego preparatu DNA oraz po 100 l kolejnych rozcieńczeń (x10, x100) przesącz przez warstwy bibuł i membrany, stosując podciśnienie; 7. Po transferze membranę wysusz i naświetl 3 min w świetle UV (po stronie wiązania z DNA), o długości fali 300 nm, w celu przytwierdzenia do niej DNA. Membrana gotowa do hybrydyzacji DNA-DNA i immunodetekcji wyznakowanego DNA (patrz dalej). 31

32 A B Rys. 11. Aparat do transferu dot-blot firmy Bio-Rad. (A) Widok z góry. (B). Kolejność składania poszczególnych części aparatu (wg. Bio-Dot microfiltration apparatus; Instruction Maual; Bio-Rad). Hybrydyzacja DNA-DNA i immunodetekcja wyznakowanego DNA (wg Sambrook i Russel, 2001, zmodyfikowana). I. TRANSFER CIŚNIENIOWY DNA NA MEMBRANĘ NYLONOWĄ 1. Żel do transferu należy dokładnie odpłukać w wodzie destylowanej; 2. Wytnij: (i) membranę nylonową, o powierzchni nieco większej niż żel, (ii) 2 bibuły (Whatmann, 3MM Chr) tej samej wielkości co membrana. Pracuj w rękawiczkach. Membrany nie należy wyjmować z papieru ochronnego; 3. Na powierzchni porowatej płyty nośnej komory do transferu ułóż: (i) 2 warstwy bibuły zwilżone wodą destylowaną, (ii) membranę nylonową (usunąć papierki osłonowe) zwilżone wodą destylowaną, (iii) foliową maskownicą, (iv) żel z rozdzielonym DNA; UWAGA staraj sie nałożyć żel agarozowy jednym ruchem, tak aby wszystkie ścieżki zmieściły się w otworze maskownicy i mogły ulec transferowi na membranę; 4. Nałóż górną pokrywę aparatu do transferu i podłącz pompę próżniową; 5. Powierzchnię żelu zalej buforem do depurynacji; 6. Prowadź transfer przez 20 min (ciśnienie 0,2 MPa); 7. Następnie usuń pipetą bufor do depurynacji, a powierzchnię żelu zalej buforem elucyjnym; 8. Prowadź transfer 30 min (ciśnienie 0,04-0,05 MPa); 9. Po zakończonym transferze usuń roztwór elucyjny, wyłącz pompę; 32

33 10. Membranę wysusz i naświetl 3 min w świetle UV (po stronie wiązania z DNA), o długości fali 300 nm, w celu przytwierdzenia do niej DNA. Membrana gotowa do hybrydyzacji DNA-DNA i immunodetekcji wyznakowanego DNA (patrz dalej). BUFORY DO TRANSFERU CIŚNIENIOWEGO Roztwór do depurynacji Stężenie końcowe Przygotowanie 50 ml 0,25 N HCl 12 N HCl 1,04 ml Dopełnij wodą do 50 ml. Roztwór elucyjny (do transferu) Stężenie końcowe Przygotowanie 500 ml 0,4 M NaOH 2 M NaOH 100 ml 0,6 M NaCl 5 M NaCl 60 ml Dopełnij wodą do 500 ml. II. HYBRYDYZACJA Przygotowanie sondy DNA 1. 1 g DNA zawieś w 16 l ddh 2 O - na ćwiczeniach wykorzystujemy DNA plazmidowy (pmat1 z wintegrowanym TE), wyizolowany z wykorzystaniem zestawu Plasmid Mini, zawieszony w H 2 O; 2. DNA należy denaturować 10 min w 96 o C, a następnie próbkę przenieś do lodu; 4. Dodaj 4 l mieszaniny DIG High Prime (zawierającej 1 U/μl fragmentu Klenowa polimerazy I DNA, 1 mm datp, 1 mm dctp, 1 mm dgtp, 0,65 mm dttp, 0,3 mm DIG- 11-dUTP oraz 5-krotnie stężony bufor; firmy Roche); 5. Inkubuj próbę 12 h w 37 o C. Tak przygotowaną sondę można przechowywać w -20 o C. Prehybrydyzacja i hybrydyzacja 1. Membranę nylonową włóż do butelki do hybrydyzacji (stroną z DNA skierowaną do wnętrza butelki); 2. Dodaj bufor prehybrydyzacyjny (usuń pęcherzyki powietrza pojawiające się między powierzchnią szkła i membrany); 3. Tak przygotowaną butelkę z membraną umieść w piecu hybrydyzacyjnym na 2-24 godz w 68 o C; 4. Po zakończeniu etapu prehybrydyzacji, usuń bufor prehybrydyzacyjny i dodaj bufor hybrydyzacyjny (z dodaną sondą DNA; UWAGA: wcześniej sondę należy ponownie zdenaturować; patrz: przygotowanie sondy DNA, punkt 2); 33

34 5. Butelkę z membraną umieść w piecu hybrydyzacyjnym na 2-24 godz w 68 o C. Wizualizacja i immunodetekcja wyznakowanego DNA 1. Usuń roztwór hybrydyzacyjny z butelki. Membranę ostrożnie przełóż do czystego pojemnika i umieść na kołysce laboratoryjnej; 2. Membranę przepłucz 2 razy (przez 5 min) w 250 ml roztworu A (2 x SSC, 0,1% SDS); 3. Następnie usuń roztwór A i membranę przepłucz 2 razy (przez 15 min, w temperaturze 68 o C) w 250 ml roztworu B (0,1 x SSC, 0,1% SDS) ogrzanego do temperatury 68 o C; 4. Membranę przepłucz (płukanie ok. 1 min) w roztworze do płukania membrany; 5. Następnie membranę zablokuj poprzez płukanie przez 30 min w 100 ml roztworu B2; 6. Przeciwciała rozcieńcz w roztworze B2 w stosunku 1:5000 (20 ml B2 + 4 l przeciwciał); 7. Zlej roztwór B2, a następnie membranę inkubuj przez 30 min w roztworze przeciwciał; 8. Membranę przemyj 2 razy w roztworze B1 (przez 10 min). Na tym etapie są usuwane niezwiązane przeciwciała; 9. Przygotuj roztwór wywołujący: 10 ml B l NBT/BCIP; 10. Usuń roztwór B1 i membranę przemyj (1 min) w roztworze B3; 10. Zlej roztwór B3, przenieś membranę do czystego pojemnika. Inkubuj membranę w roztworze wywołującym, w ciemności, nie mieszając. Czas inkubacji może wynosić od 1 min do 16 godz; 11. Reakcje zatrzymaj przez przełożenie membrany do buforu TE. BUFORY DO HYBRYDYZACJI Bufor prehybrydyzacyjny Stężenie końcowe Przygotowanie 5 x SSC 20 x SSC 5,5 ml 1% BSS 10% BSS 2,2 ml 0,1% sarkozyl 10% sarkozyl 215 l 0,02% SDS 10% SDS 44 l dh 2 O 13,8 ml Bufor hybrydyzacyjny Stężenie końcowe Przygotowanie 5 x SSC 20 x SSC 1 ml 1% BSS 10% BSS 400 l 0,1% sarkozyl 10% sarkozyl 40 l 34

35 0,02% SDS 10% SDS 8 l dh 2 O 2,6 ml Roztwór A Stężenie końcowe Przygotowanie 500 ml 2 x SSC 20 x SSC 50 ml 0,1% SDS 10% SDS 5 ml Dopełnij wodą do 500 ml. Roztwór B Stężenie końcowe Przygotowanie 500 ml 0,1 x SSC 20 x SSC 2,5 ml 0,1% SDS 10% SDS 5 ml Dopełnij wodą do 500 ml. Roztwór do płukania membrany 0,3 g Tween 20 rozpuścić w 100 ml roztworu B1 Roztwór B1 Stężenie końcowe Przygotowanie 5000 ml 0,1 M kwas maleinowy kwas maleinowy 58 g 0,15 M NaCl NaCl 43,58 g Dopełnij wodą do 4500 ml, ustaw ph 7,5 za pomocą NaOH. Uzupełnij wodą do 5000 ml. Roztwór B2 Stężenie końcowe Przygotowanie 300 ml 1% BSS 10% BSS 30 ml B1 B1 270 ml - BSS (Blocking Stock Solution) 10% 10g BSS rozpuść w 100 ml roztworu B1 Roztwór B3 Stężenie końcowe Przygotowanie 500 ml 100 mm Tris HCl 1 M Tris HCl ph 9,5 20 ml 100 mm NaCl 2,5 M NaCl 8 ml 50 mm MgCl2 1 M MgCl2 10 ml Dopełnij wodą do 500 ml. Bufor TE Stężenie końcowe Przygotowanie 100 ml 10 mm Tris HCl 1 M Tris HCl ph 8 1 ml 1 mm EDTA 0,5 M EDTA ph 8 0,2 ml Dopełnij wodą do 100 ml. 35

36 Bibliografia: Birnboim HC, Doly J A rapid alkaline extraction procedure for screening recombination plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7: Chen W, Kuo Y A simple and rapid method for the preparation of gram-negative bacterial genomic DNA. Nucleic Acids Res. 21:2260. Di Lallo G, Ghelardini P, Paolozzi L Two hybrid assay in Escherichia coli K12. W: M. Blot (wyd), Procaryotic Genomics. Birkhauser Verlag, Berlin. Kushner SR An improved method for transformation of E. coli with ColE1 derived plasmids. W: H. B. Boyer, i S. Nicosia (wyd.), Genetic engineering. Elsevier/North-Holland, Amsterdam. Sambrook J, Russell DW Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 36