GENETYKA BAKTERII Materiały do ćwiczeń

Transkrypt

1 GENETYKA BAKTERII Materiały do ćwiczeń Przygotowane przez zespół pracowników Zakładu Genetyki Bakterii Zakład Genetyki Bakterii Instytut Mikrobiologii Wydział Biologii Uniwersytet Warszawski

2 SPIS TREŚCI 1. Mutageneza transpozonowa Przeprowadzenie koniugacji szczepu zawierającego plazmid z Tn1 ze szczepami biorców E. coli lub S. marcescens dającymi możliwość eliminacji z mieszaniny 4 koniugacyjnej szczepu dawcy 1.2. Wyselekcjonowanie transkoniugantów, do których został przeniesiony plazmid 4 zawierający transpozon Tn1 1.3 Odszukanie wśród transkoniugantów (drogą analizy fenotypu) frakcji klonów, w których insercja kasety transpozycyjnej spowodowała inaktywację genu 5 poddawanego mutagenezie 1.4. Potwierdzenie obecności transpozonu w genomach mutantów transpozonowych z wykorzystaniem procedury odzyskania plazmidu 5 2. Własności fenotypowe różnych rodzajów mutantów bakteryjnych Mutanty polimerazowe w genach pola i dnae Mutanty defektywne w inicjacji i elongacji DNA (w genach dnaa i dnab) Określenie częstości rewersji mutacji auksotroficznych Odzyskiwanie szczepu mutanta auksotroficznego w wyniku rewersji mutacji 8 3. Rola białek RecA i RecBC w rekombinacji i reperacji DNA Rola białka RecA w rekombinacji Rola białka RecBC w rekombinacji; różne szlaki rekombinacyjne u E.coli Rola białka RecA i RecBC w reperacji DNA - działanie MMS - działanie UV 10 - test Rec-assay z wykorzystaniem wybranych szczepów E. coli 4. Identyfikacja bakteryjnych czynników wirulencji Badanie aktywności żelatynaz metodą zymografii Oznaczanie aktywności β-laktamazy w szczepie E. coli MC Biofilmy bakteryjne Metoda barwienia fioletem krystalicznym Wrażliwość biofilmów na wybrane czynniki przeciwbakteryjne Oczyszczanie białek bakteryjnych i badanie ich zdolności do interakcji z DNA Nadprodukcja zrekombinowanego białka antytoksyny Przygotowanie żelu poliakryloamidowego i elektroforeza białek Badanie interakcji białek Reakcja sieciowania białek za pomocą aldehydu glutarowego Wizualizacja produktów reakcji sieciowania białek 22 2

3 1. Mutageneza transpozonowa Wykorzystanie wektora niosącego kasetę transpozycyjną do mutagenizacji genu gfp zlokalizowanego na plazmidzie E.coli oraz genów chromosomowych Serratia marcescens Transpozony (Tn) należą do elementów transpozycyjnych, a więc ruchomych elementów genetycznych zdolnych do zmiany miejsca w genomie w wyniku procesu zwanego transpozycją. Transpozycja jest typem rekombinacji nieuprawnionej, która nie wymaga homologii sekwencji nukleotydowych cząsteczek DNA uczestniczących w tym procesie i zależy od enzymu transpozazy kodowanej przez Tn. Wyróżnia się dwa mechanizmy transpozycji: konserwatywny i replikacyjny. Tn zwykle niosą geny warunkujące różne cechy fenotypowe. Dzielimy je na transpozony złożone, charakteryzujące się obecnością na obu końcach sekwencji insercyjnych, które okalają część centralną, niosącą geny niezwiązane z transpozycją, i Tn niezłożone, przypominające budową sekwencje insercyjne, lecz niosące geny kodujące cechy fenotypowe. Plazmid samobójczy pdstn1 wykorzystywany na ćwiczeniach niesie kasetę transpozycyjną Tn1 zawierającą gen oporności na kanamycynę. Nośnik kasety transpozycyjnej jest plazmidem mobilizowalnym. Dodatkowo jest wyposażony w gen lewanosacharazy (sacb), co pozwala na eliminację z puli uzyskanych mutantów klonów, w których doszło do integracji całego plazmidu z genomem biorcy. Schemat plazmidu pdstn1 przedstawiono na rycinie 1. IR tnp Km R ori R6K IR sacb PDSTn1 9,3 kpz Cm R Mob ori R6K Ryc. 1. Schemat plazmidu samobójczego do mutagenezy transpozonowej Celem ćwiczenia jest: wykorzystanie mutagenezy transpozonowej do insercyjnej inaktywacji genu gfp występującego w obrębie plazmidu w szczepie E. coli TG1 oraz genów chromosomowych Serratia marcescens. 3

4 Eksperyment obejmuje następujące etapy: 1.1. Przeprowadzenie koniugacji szczepu zawierającego plazmid z Tn1 ze szczepami biorców E. coli lub S. marcescens, dającymi możliwość eliminacji z mieszaniny koniugacyjnej szczepu dawcy Wyselekcjonowanie transkoniugantów, do których został przeniesiony plazmid zawierający transpozon Tn Odszukanie wśród transkoniugantów (drogą analizy fenotypu) frakcji klonów, w których insercja kasety transpozycyjnej spowodowała inaktywację genu poddawanego mutagenezie Potwierdzenie obecności transpozonu w genomach mutantów transpozonowych z wykorzystaniem procedury odzyskania plazmidu. Szczepy: E. coli S17-1 (pdstn1; Kan R ) Serratia marcescens (Rif R ) E. coli TG1 (psb1a2gfp; Rif R, Amp R ) Podłoża, roztwory i inne: - podłoże LB i LA - roztwory chloramfenikolu, rifampicyny, ampicyliny, kanamycyny, sacharozy - roztwory do izolacji całkowitego DNA - roztwory do izolacji plazmidowego DNA - roztwory do transformacji metodą wapniowo-rubidową - ligaza, bufor do ligazy - endonukleaza restrykcyjna MluI Wykonanie ćwiczenia: Dzień 1 1) Przeprowadzić koniugację szczepu E. coli S17-1 (Kan R ), będącego dawcą, ze szczepami biorców: - E. coli TG1 (Rif R Amp R ) - S. marcescens (Rif R ) Koniugację wykonać poprzez zmieszanie logarytmicznych hodowli biorcy i dawcy (hodowle odpłukane od antybiotyków) w proporcji 1:1 (np. 0,5 ml biorcy i 0,5 ml dawcy). Mieszaniny koniugacyjne inkubować 60 minut w 37 C. 2) Odpowiednie rozcieńczenia mieszaniny koniugacyjnej (10 0, 10-1 ) wysiać na podłoże selekcyjne: - LA z kanamycyną (50 μg/ml), ampicyliną (100 μg/ml), rifampicyną (50 μg/ml) i sacharozą (20%). Płytki inkubować 24 godz. w 37 C. - LA z kanamycyną, rifampicyną (50 μg/ml) i sacharozą (20%). Płytki inkubować przez 24 godz. w 30 C. 3) Transkoniuganty selekcjonować na podstawie różnic w zabarwieniu kolonii w porówaniu z koloniami biorców. Wybrane transkoniuganty przesiać posiewem redukcyjnym na szalki z odpowiednim podłożem. Płytki inkubować w 30/37 C przez 24 godz. 4) Z wyselekcjonowanych uprzednio klonów mutantów S. marcescens wyizolować całkowity DNA. 4

5 Dzień 2 5) Wykonać trawienie całkowitego DNA S. marcescens endonukleazą restrykcyjną MluI, a następnie autoligację strawionego DNA. 6) Wyizolować plazmidowy DNA z komórek E. coli TG1 uzyskanych po mutagenezie. 7) DNA plazmidowy E. coli TG1 przeanalizować elektroforetycznie pod kątem wielkości plazmidu w porównaniu z wielkością plazmidu szczepu wyjściowego. 8) Przygotować komórki kompetentne E. coli DH5αλpir metodą wapniowo-rubidową. Komórki transformować mieszaniną ligacyjną. Szalki (LB z kanamycyną) inkubować 24 h w 37 C. Dzień 3 9) Sprawdzić wydajność transformacji, z uzyskanych kolonii wyizolować DNA plazmidowy. Zsekwencjonować DNA plazmidu i określić lokalizację kasety transpozycyjnej. 5

6 2. Własności fenotypowe różnych rodzajów mutantów bakteryjnych Powodzenie każdego eksperymentu genetycznego uwarunkowane jest użyciem szczepów bakteryjnych charakteryzujących się właściwym, dokładnie określonym fenotypem. Badanie fenotypów powinno być stosunkowo proste dla eksperymentatora i dające jednoznaczne odróżnienie od fenotypu dzikiego. Sposób badania jest różny w zależności od rodzaju funkcji, która zostaje uszkodzona w mutancie. W przypadku fenotypu mutantów polimerazowych (np. w genach pola i dnae ) ze względu na różne zapotrzebowanie białek polimeryzacyjnych, których te mutacje dotyczą (funkcjonalna polimeraza III wymagana jest bezwzględnie w każdych warunkach, natomiast funkcja polimerazy I może być przejęta przez inne białko/a), można określić, czy są to mutanty obligatoryjne czy fakultatywne (temperaturowrażliwe), poprzez badanie ich zdolności do wzrostu w warunkach restrykcyjnych (42 o C). Polimeraza I, inaczej niż polimeraza III, obok udziału w procesie replikacji chromosomu bakteryjnego pełni kluczową rolę w innych procesach komórkowych, jak rekombinacja i reperacja DNA. Zdolność szczepów bakteryjnych do naprawy uszkodzeń DNA można określić poprzez badanie wzrostu w obecności czynnika uszkadzającego DNA (np. MMS, UV) co pozwala na określenie i zróżnicowanie fenotypu mutantów polimerazowych defetywnych w genach pola i polc. Fenotyp mutantów defektywnych w inicjacji replikacji (dnaa) i elongacji łańcucha DNA (dnab) określa się poprzez badanie zdolności do replikacji chromosomu, a pośrednio zdolności do wzrostu w warunkach restrykcyjnych (42 o C). Inaktywacja białek inicjacyjnych (np. DnaA) koniecznych do wytworzenia nowych widełek replikacyjnych w miejscu origin, hamuje replikację z opóźnieniem, natomiast inaktywacja białek elongacyjnych prowadzi do natychmiastowego zahamowania procesu replikacji. Do drugiej grupy białek należy helikaza DnaB, chociaż trzeba pamiętać, że jest ona istotna również na etapie inicjacji. Zaobserwowanie zróżnicowania tempa zahamowania replikacji DNA w warunkach restrykcyjnych (42 o C) w obu typach mutanatów możliwe jest po wykonaniu eksperymentu określającego włączanie radioaktywnej zasady azotowej, np. tyminy. Śledzenie wzrostu poprzez wyznaczenie krzywej wzrostu w temperaturze permisyjnej (36 o C) i restrykcyjnej (42 o C) i ich porównanie daje zróżnicowanie fenotypów mutantów w genach dnaa i dnab, w wyniku pochodnego efektu wpływu temperatury na replikację DNA. Określenie zdolności do wzrostu mutantów defektywnych w genach dnaa i dnab w temperaturze 36 o C i 42 o C pozwala jedynie stwierdzić, że oba te mutanty są mutantami fakultatywnymi, gdyż funkcjonowanie białek DnaA i DnaB jest bezwzględnie wymagane w procesie replikacji. Istnieją pewne rodzaje mutantów szczególnie często stosowanych w badaniach genetycznych ze względu na możliwość selekcji biorcy po zajściu transferu materiału genetycznego. Należą do nich: mutanty żywieniowe (auksotroficzne), mutanty opornościowe (np. na antybiotyki lub fagi) oraz mutanty kataboliczne, które utraciły zdolność do rozkładu określonych związków organicznych. Fenotyp tych grup mutantów sprawdza się, stosując różne typy podłoży minimalnych, różnicujących, wybiórczych. Mutanty reca i recbc mają uszkodzony szlak rekombinacji homologicznej i jednocześnie są defektywne w różnym stopniu w reperacji DNA. Sposób ich badania będzie tematem kolejnego ćwiczenia. Celem ćwiczenia jest: badanie fenotypu wymienionych wyżej rodzajów mutantów. 6

7 2.1. Mutanty polimerazowe w genach pola i dnae Szczepy: E. coli W3110 pola E. coli dziki typ E. coli dnae48 mutant polc Podłoże: Podłoże LB i LA Wykonanie: 1) Nocne hodowle szczepów w LB rozcieńczyć 1:20 świeżym podłożem i inkubować około 2 godz. w wytrząsarce w 37 º C. 2) Do rozpuszczonego i schłodzonego podłoża LA dodać sulfonian metanometylowy (MMS) w ilości 40 l na 200 ml podłoża. Wymieszać, rozlać na płytki. 3) Przygotować płytki z podłożem LA bez MMS. 4) Płytki podzielić na 3 sektory - na każdy sektor wysiać jeden szczep. Należy wysiać szczepy na 2 płytki LA z MMS i 2 płytki LA. Po jednej płytce z każdego rodzaju wstawić do inkubacji w º C i w 42 º C przez 24 godz. 5) Sprawdzić, gdzie wystąpił wzrost bakterii. Zinterpretować wyniki Mutanty defektywne w inicjacji i elongacji DNA (w genach dnaa i dnab) Szczepy: E. coli CRT83 dnaa E. coli CRT266 dnab Podłoża i roztwory: LB (uzupełnione tyminą) płyn fizjologiczny (RF) Wykonanie: 1) Z pojedynczej kolonii badanego szczepu na agarze odżywczym sporządzić zawiesinę bakterii w około 2 ml płynu fizjologicznego. 2) Kroplę każdej zawiesiny dodać do 2 probówek z 5 ml podłoża LB. 3) Po posianiu zawiesiny, jedną probówkę inkubować w temp º C, a drugą w 42 º C. 4) Po 24 godz inkubacji obserwować wzrost w postaci zmętnienia. Zinterpretować wyniki Określenie częstości rewersji mutacji auksotroficznych Szczepy: E. coli AB1157 thr leu ara pro lac T6 r gal s his xyl mtl arg thi Str r lub E.coli 108 pro met thy Str r Podłoża i roztwory podłoże minimalne Davisa (płynne i stałe) agar odżywczy r-ry aminokwasów (1mg/ml) r-r tyminy (3mg/ml) Roztwory w w/w stężeniach dodaje się w ilości 1 ml na 100 ml podłoża. 7

8 Wykonanie: 1) Założyć nocną hodowlę szczepu auksotroficznego w podłożu Davisa płynnym uzupełnionym odpowiednimi czynnikami wzrostowymi. Inkubować w 37 º C. 2) Rozcieńczyć hodowlę Wysiać rozcieńczenia 10-5 i 10-6 na agar odżywczy w celu określenia ogólnej liczby komórek. Inkubować płytki 24 godz. w 37 º C. 3) Nierozcieńczoną hodowlę szczepu auksotroficznego, po uprzednim odwirowaniu i zawieszeniu w RF (w celu usunięcia uzupełnień dodanych do podłoża), wysiać na płytki z podłożem Davisa bez poszczególnych uzupełnień wymaganych przez ten szczep. Inkubować w 37 º C przez 48 godz. 4) Policzyć kolonie rewertantów i określić liczbę komórek w 1ml. Policzyć kolonie po wysiewie 10-5 i 10-6 na agar odżywczy i określić liczbę komórek w 1ml. Oznaczyć częstość rewersji przyjmując ogólną liczbę komórek oznaczoną na agarze odżywczym za 100% Odzyskiwanie szczepu mutanta auksotroficznego w wyniku rewersji mutacji Wzrost szczepu auksotroficznego wielokrotnie pasażowanego na podłożu minimalnym bez uzupełnienia w czynnik wzrostowy świadczy o zajściu rewersji mutacji auksotroficznej. W celu odzyskania szczepu zmutowanego należy sięgnąć do wyjściowego szczepu i uwzględniając, że rewersja zachodzi z niską częstością w stosunkowo prosty sposób odzyskać właściwy szczep z tą auksotroficzną mutacją. Szczep E. coli mutant auksotroficzny wykazujący rewersję pojedynczej mutacji. Podłoża Jak w zadaniu 3 Wykonanie: 1) Rozsiać szczep wyjściowy na podłożu z wymaganymi czynnikami wzrostowymi w celu uzyskania pojedynczych kolonii. 2) Materiał z kolonii przenosić metodą replik (przy pomocy jałowych wykałaczek) na płytki z podłożem z uzupełnionym czynnikiem wzrostowym i na płytki z podłożem bez tego uzupełnienia. Inkubować 24 godz. w 37 O C. 3) Zaznaczyć na podłożu z uzupełnieniem pozycje repliki, które na podłożu bez uzupełnienia nie dały wzrostu. Materiał z zaznaczonej pozycji należy przesiać i następnie sprawdzić wychodząc z pojedynczej kolonii jego pozostałe cechy fenotypowe. 8

9 3. Rola białek RecA i RecBC w rekombinacji i reperacji DNA Rekombinacja homologiczna to proces, w którym następuje przerwanie ciągłości jednej lub obu nici cząsteczki DNA i połączenie z jedno- lub dwuniciowym fragmentem innej cząsteczki, co uwarunkowane jest homologią sekwencji między rekombinującymi partnerami. Rekombinacja homologiczna, mimo że jest procesem wieloetapowym i mającym kilka różnych szlaków, zawsze, bezwzględnie wymaga aktywności białka RecA wykazującego liczne aktywności enzymatyczne. Oprócz kluczowej roli w rekombinacji, białko to istotne jest w reperacji DNA, a konkretnie w tzw. naprawie rekombinacyjnej szczególnie ważnej w usuwaniu uszkodzeń powodowanych światłem UV i promieniami X. RecA jest również pozytywnym regulatorem (ze względu na swą aktywność koproteazy) globalnego systemu napraw SOS. Białka RecBC bierą udział w jednym ze szlaków rekombinacji E. coli, tzw. szlaku RecBCD, który uczestniczy w rekombinacji pokoniugacyjnej. Mutanty recbc mają obniżoną częstość rekombinacji, jakkolwiek efekt nie jest tak dramatyczny, jak w przypadku mutantów reca, a poza tym może być supresowany przez mutacje w genie sbcb, kodującym egzonukleazę I. Supresja jest pośrednia i polega na odblokowaniu innego szlaku rekombinacyjnego - RecF. Podobnie jak RecA, RecBC bierze udział w reperacji uszkodzeń w DNA. Celem ćwiczenia jest zbadanie: 1) wpływu białek RecA i RecBC na rekombinację przez określenie częstości rekombinacji pokoniugacyjnej w krzyżówkach z różnymi mutantami, 2) zaangażowania tych białek w proces reperacji przez określenie przeżywalności mutantów poddanych działaniu czynników uszkadzających DNA (EMS, MMS, UV, rifampicyna) Rola białka RecA w rekombinacji Szczepy: E. coli HfrC prototrof Str s E. coli F - CSH51 pro Str r E. coli F - CSH52 pro reca Str r Podłoża i roztwory: minimalne Davisa - płynne i stałe bulion odżywczy i agar odżywczy roztwór streptomycyny (5 mg/ml) płyn fizjologiczny (RF) Wykonanie: 1) Nocne hodowle badanych szczepów rozcieńczyć 1:20 świeżym podłożem Davisa z hydrolizatem kazeiny i hodować z wytrząsaniem w 37 º C przez 2-3 godz. (do osiągnięcia fazy logarytmicznej). 2) Przygotować dwie mieszaniny koniugacyjne: a) HfrC x F - CSH51 b) HfrC x F - CSH52 przez zmieszanie hodowli rodzicielskich w stosunku 1:10. Koniugację prowadzić przez 60 minut w 37 º C. 3) Mieszaniny koniugacyjne odpowiednio rozcieńczyć i wysiać na płytki z podłożem selekcyjnym dla rekombinantów Pro + Str r : a) rozcieńczenie 10-2, 10-3 b) rozcieńczenie 10-1,

10 3.2. Rola białka RecBC w rekombinacji; różne szlaki rekombinacyjne u E.coli Szczepy: dawca E.coli SK6033 HfrH Tc r biorcy E.coli MC1061 recbc + Str r E.coli SK7883 recbc - Str r E.coli SK7892 recbc - sbcb - Str r Podłoża: LB agar odżywczy roztwór tetracykliny (1,5 mg/ml) roztwór streptomycyny (5 mg/ml) płyn fizjologiczny (RF) Wykonanie: 1) Założyć hodowle szczepów: - dawcy w podłożu LB z tetracykliną (15 g/ml) - biorców w podłożu LB ze streptomycyną (50 g/ml) Inkubować przez noc w 37 º C. 2) Przygotowanie hodowli logarytmicznych: nocne hodowle rozcieńczyć świeżym podłożem LB w proporcji 1:50 (np. 0,2 ml do 10 ml podłoża) i inkubować w 37 º C z wytrząsaniem przez 2-3 godz. (gęstość hodowli 1-5 x10 8 /ml ). 3) Koniugacja: każdy ze szczepów biorcy zmieszać z dawcą w proporcji 10:1 (np. 0,9 ml logarytmicznej hodowli biorcy + 0,1 ml logarytmicznej hodowli dawcy ). Inkubować bez wytrząsania w 37 º C przez 30 min. 4) Selekcja rekombinantów: mieszaninę koniugacyjną silnie wytrząsnąć (worteks), rozcieńczyć do 10-3 po koniugacji z biorcą recbc + i recbc - sbcb -, oraz do 10-1 po koniugacji z biorcą recbc -. Wysiać odpowiednie rozcieńczenia 10-2 i 10-3 lub 10-1 na podłoże selekcyjne (agar odżywczy ze streptomycyną i tetracykliną). Inkubować przez 24 godz. w 37 º C. 5) Oznaczenie liczby komórek dawcy: hodowlę dawcy użytą do koniugacji rozcieńczyć; rozcieńczenia 10-5 i 10-6 wysiać na agar odżywczy. Inkubować 24 godz. w 37 º C. 6) Obliczyć i porównać częstości rekombinacji w analizowanych układach koniugacyjnych Rola białka RecA i RecBC w reperacji DNA Szczepy pkt 1,2: E.coli recbc + MC1061 E.coli recbc - SK7883 E.coli recbc - sbcb - SK7892 E.coli reca + CSH 51 E.coli reca CSH52 Podłoża: LA LA z MMS bulion odżywczy agar odżywczy 10

11 Wykonanie: 1) Działanie MMS a) Badane szczepy wysiać rysą na podłoże: a) LA, b) LA + MMS (40 l/200 ml podłoża). b) Płytki inkubować w 37 º C przez 24 godz. c) Określić wrażliwość badanych szczepów na czynnik uszkadzający DNA. 2) Działanie UV a) Nocne hodowle bulionowe badanych szczepów wysiać bez rozcieńczania po 0,1ml na płytki z agarem odżywczym. Każdy szczep wysiać na 5 płytek. b) Naświetlać lampą UV po jednej płytce każdego szczepu przez 5, 10, 15 i 20 sekund; jedną płytkę każdego szczepu pozostawić bez naświetlania. c) Naświetlone płytki owinąć folią aluminiową (zabezpieczenie przed fotoreaktywacją) i inkubować przez 24 godz. w 37 º C. d) Porównać liczby kolonii obu szczepów otrzymane na płytkach po różnym czasie naświetlania. 3) Test Rec-assay z wykorzystaniem wybranych szczepów E. coli Test pozwala na badanie zwiększonego działania letalnego związków mutagennych na komórki E. coli posiadające mutacje w genach rec. Komórki tych mutantów nie mają zdolności do naprawy uszkodzeń w DNA za pomocą rekombinacji, w przeciwieństwie do szczepów dzikich. Mają też osłabione pozostałe mechanizmy naprawcze, dlatego nawet niewielkie uszkodzenia w DNA powodują zahamowanie ich wzrostu. Szczepy: E. coli CSH51 szczep dziki E. coli CSH52 (reca - ) E. coli SK7881 ( recb) E. coli JC5703 (recc - ) E. coli SK7885 (recbc - ) E. coli JC5519 (recbcd - ) E. coli SK7892 (recbc - sbcb - ) E.coli JC7623 (recbc - socb - ) Podłoże: LA Wykonanie: 1. W centralnej części powierzchni płytki Petriego z LA za pomocą sterylnej pęsety umieścić krążek bibuły filtracyjnej. 2. Pobrać ezą inoculum z całonocnej hodowli szczepu E. coli (mutanta) i rozprowadzić w postaci pasma od brzegu krążka bibuły (ryc.1). Podobnie posiać na tej samej płytce szczep dziki, pod kątem ok. 90 o względem poprzedniego posiewu. 3. Na krążek nanieść 10 μl roztworu MMS, EMS lub 5 μl rifampicyny (5 mg/ml). Uwaga! Praca ze związkami mutagennymi, NALEŻY PAMIĘTAĆ O RĘKAWICZKACH. 4. Szalki inkubować 24 godziny w temperaturze 37 o C. 5. Po zakończeniu inkubacji zmierzyć długość strefy zahamowania wzrostu obu szczepów (od brzegu krążka do początku wzrostu). Porównać badany wzrost obu szczepów. Ryc.1. Sposób nanoszenia hodowli na płytkę w teście Rec-assay 11

12 4. Identyfikacja bakteryjnych czynników wirulencji Metody biochemiczne zmierzające do identyfikacji bakteryjnych enzymów, w tym również czynników, wirulencji wykorzystują najczęściej właściwości enzymatyczne białek lub mechanizm oddziaływań pomiędzy białkami wirulencji np. patogena a białkami gospodarza. Podstawowym warunkiem do zastosowania najprostszych metod biochemicznych jest wykazanie aktywności enzymatycznej lub toksycznej badanego białka, którą można odpowiednio oznaczyć in vivo lub in vitro. W ramach ćwiczeń oznaczymy aktywność enzymu β-laktamazy, w oparciu o analizę spektrofotometryczną. Molekularnych mechanizmów oporności bakterii na antybiotyki jest wiele jednym z nich jest inaktywacja antybiotyku w wyniku enzymatycznej hydrolizy jego cząsteczki. W przypadku antybiotyków β-laktamowych są to enzymy katalizujące rozszczepienie pierścienia β- laktamowego w cząsteczce antybiotyku. Zymografia to natomiast typowa technika służąca do identyfikacji białek o aktywnościach enzymatycznych, polega ona na rozdziale elektroforetycznym interesującej nas grupy bakteryjnych białek, a następnie wizualnej identyfikacji ich enzymatycznej aktywności. Wiele proteaz pochodzenia bakteryjnego zaangażowanych jest w proces degradacji błonowych białek komórek gospodarza. W celu wykonania oznaczenia przygotowuje się denaturujący żel poliakrylamidowy zawierający równomiernie rozmieszczony substrat dla enzymu, następnie rozdziela się w nim badaną grupę białek. Kolejnym krokiem jest zrenaturowanie rozdzielonych polipeptydów poprzez usuniecie czynnika denaturującego, a następnie inkubacja żelu w odpowiednich warunkach w celu wznowienia aktywności enzymatycznej. Ostatnim etapem jest barwienie żelu np. błękitem Coomasie. Obecność przejaśnień będzie wskazywała na brak substratu w danym miejscu żelu, co może być jedynie skutkiem obecności aktywnych enzymów proteolitycznych, które usunęły substrat z tego fragmentu żelu. Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z różnymi metodami służącymi do wykrywania aktywności enzymatycznej białek Badanie aktywności żelatynaz metodą zymografii Szczepy: Escherichia coli ATCC Enterococcus faecalis wt Bacillus subtilis ATCC 6633 Pseudomonas aeruginosa ATCC Podłoża LB Wykonanie: cz I przygotowanie ekstraktów białkowych 1) Nocną hodowlę badanych szczepów prowadzono w 37 º C z wytrząsaniem na podłożu LB (10 ml). 2) Przed przystąpieniem do dalszych etapów hodowlę należy schłodzić w lodzie. 3) Następnie zwirować po 6 ml każdej z hodowli (4 º C, obr./min, 10 min). 4) Osad przemyć 1 ml buforu Davisa i ponownie zwirować (warunki j.w.). 5) Otrzymany osad zawiesić w 0,5 ml buforu Daviesa, sonikować 4 6x pulsami po 15 sek. 6) Próbki zwirować (warunki j.w.), osad zawiesić w 200 µl 0,2% SDS a następnie zagotować 5 min w 100 º C. 7) Próby (20 µl) należy zmieszać w stosunku 1:1 z buforem Laemli ego a następnie nakładać na żel. 12

13 cz II elektroforeza SDS-PAGE w żelu z żelatyną Elektroforeza prowadzona będzie w 10% żelu poliakrylamidowym, zawierającym żelatynę w stężeniu 2 mg/ml żelu. Żel należy wylać z przekładkami 1mm o długości minimum 4,5 cm. Elektroforezę prowadzi się w chłodni, przy natężeniu prądu 25 ma i napięciu 100V przez około 150 min. Czas polimeryzacji żelu 1h. (Odczynniki i bufory do żelu umieszczono na końcu skryptu) cz III wywołanie zymogramu 1) Żele po wyjęciu z aparatu płukano 3-krotnie po 30 min w 2,5 % wodnym roztworze Triton X100 2) Po zakończeniu płukania żele umieszczano w buforze do inkubacji o ph 7,5 zawierającym: - 50 mm Tris/HCl - 10 mm CaCl mm NaCl - 0,05% NaN 3 i inkubowano 17 godz. w temperaturze 37 o C. 3) Żele barwiono 0,5 % roztworem Coomassi Brillant Blue R-250 w mieszaninie metanolu : kwasu octowego i wody destylowanej w stosunku objętościowym 3:1:6 przez około 30 min. 4) Żele odbarwiano w mieszaninie metanolu, lodowego kwasu octowego i wody destylowanej (3:1:6) do czasu pojawienia się maksymalnego kontrastu między białymi prążkami a niebieskim tłem. 5) Żele suszono w temperaturze pokojowej z użyciem zestawu Dryout firmy Kucharczyk. lub poddawano analizie wizualizacyjnej i cyfrowej Oznaczanie aktywności β-laktamazy w szczepie E. coli MC1061 Szczepy: Escherichia coli MC1061 Podłoże LB Wykonanie: 1) Nocną hodowlę szczepu E. coli MC1061 prowadzić w 10 ml podłoża LB w 37ºC 2) Hodowlę odmłodzić do A 600 = 0,1 (15 ml LB) i prowadzić do osiągnięcia A 600 = 0,6, hodowle schłodzić 5 min w lodzie! 3) Następnie oznaczyć aktywność enzymu β-laktamazy w hodowlach nocnych oraz logarytmicznych oraz ilość białka w następujących frakcjach: i. Lizat (sonikat komórkowy) ii. Frakcja białek peryplazmatycznych 13

14 cz I - otrzymanie lizatu komórkowego (sonikat komórkowy) 1) 5 ml odmłodzonej, schłodzonej hodowli o gęstości A 600 = 0,6 zwirować (10 min, 10 tys. rpm/min, 4 C, Sorvall) 2) zlać supernatant, osad zawiesić w 1 ml buforu fosforanowego (50 mm, ph 7,0) w 2 ml empi 3) trzymać na lodzie do czasu wyizolowania frakcji białek pery plazmatycznych, 4) sonikować do otrzymania klarownej zawiesiny w obecności kulek szklanych (mała głowica, ok. 5x 30 sek, 1 min przerwy) 5) zwirować 10 min, 10 tys. rpm/min, 4 C (wirówka Ependorff z chłodzeniem) supernatant przenieść do nowego eppi, trzymać na lodzie do czasu oznaczeń cz II frakcja białek peryplazmatycznych (metoda sferoplastyzacji) 1) 5 ml odmłodzonej, schłodzonej hodowli o gęstości A 600 = 0,6 zwirować (10 min, 10 tys. rpm/min, 4ºC, Sorvall, lub wirówka Eppendorf) 2) zlać supernatant, osad zawiesić w 100 μl buforu Tris/HCl (200 mm, ph 8,0), przenieść do schłodzonego empi 3) dodać 200 μl Tris/HCl (200 mm, ph 8,0) zawierajacego 1M sacharozę!!!, dodać 20 μl EDTA (10 mm, ph 8,0) 4) dodać 20 μl lizozymu (2 mg/ml) dokładnie ale delikatnie wymieszać!!! 5) dodać 660 μl wody destylowanej o temperaturze pokojowej!!! inkubacja na stole 10 min 6) dodać 20 μl MgSO 4 (1M) 7) próby odwirować 5 min, 5 tys. rpm, supernatant jest źródłem β-laktamazy cz III - oznaczać ilość białka w każdej frakcji metodą BCA, aby przeliczyć ilość rozłożonego nitrocefinu na mg wyizolowanego białka 1) Ilość białka w próbie oznaczano biorąc do pomiaru: - 70 l (supernatantu po sonikacji) lub l (r-ru zawierającego białka peryplazmatyczne) 2) Następnie do prób dodawano po 2 ml odpowiednio przygotowanego odczynnika BCA (Sigma). W tym celu należy zmieszać odczynnik A z B w stosunku 50:1, próby należy inkubować w 37ºC przez 30 min, następnie zmierzyć A 562, a ilość białka odczytać z wcześniej przygotowanej krzywej wzorcowej. Cz IV- oznaczenie aktywności enzymu 1) Do 0,5 ml odpowiednich lizatów komórkowych dodawano + 1 ml r-ru nitrocefinu następnie mieszaniny inkubowano 20 min w temp. pokojowej, do próby ślepej zamiast odpowiednich lizatów dodawano 0,5 ml 50 mm buforu fosforanowego. 2) Absorbancję mierzono przy długaści fali 486 nm (A 486 ) 3) Aktywność -laktamazy podaje się w jednostkach enzymu /mg białka. Za jednostkę enzymu przyjęto tę jego ilość, która rozkłada 1 g nitrocefinu w ciągu 1 min 14

15 5. Biofilmy bakteryjne Większość bakterii w środowisku naturalnym występuje w postaci biofilmu. Dotyczy to również bakterii patogennych, ponad 80% infekcji w ludzkim organizmie wywoływanych jest przez drobnoustroje, głównie bakterie, rosnące w tej właśnie postaci. Powszechnie uważa się że biofilm to osiadła społeczność komórek nieodwracalnie związana z jakąś powierzchnią, otoczona matriks złożoną najczęściej z polisacharydów. W matriks mogą znajdować się substancje nie mające komórkowego pochodzenia, jak np.: kryształy minerałów, cząsteczki gliny czy komórki. Biofilmy tworzą się nie tylko na powierzchniach stałych (biotycznych lub abiotycznych) lecz również na granicy faz np. woda/powietrze. W definicji biofilmu zawarte jest również stwierdzenie, że komórki, które go tworzą, wykazują zmieniony fenotyp, szczególnie jeśli chodzi o szybkość wzrostu oraz transkrypcję genów chromosomowych w porównaniu z bakteriami swobodnie żyjącymi. Dla przykładu, proteom komórek Pseudomonas aeruginosa rosnących w biofilnie jest inny niż wolnożyjących komórek tego gatunku, w przypadku komórek osiadłych dodatkowo silnie zależy on od charakteru podłoża. Biofilmy bada się różnymi metodami, począwszy od metod mikroskopowych, przez barwienie fioletem krystalicznym, po metody luminometryczne umożliwiające ocenę liczby żywych komórek w wytworzonym już biofilnie przez pomiar wydzielanego ATP (np. poprzez utlenianie lucyferazy w obecności ATP i tlenu cząsteczkowego). W ramach ćwiczeń, stosując klasyczną metodę barwienia fioletem krystalicznym, zbadamy zdolność do tworzenia biofilmów przez wybrane szczepy bakteryjne oraz sprawdzimy wrażliwość powstałych biofilmów na klasyczne i alternatywne środki antybakteryjne jak: antybiotyki- np. ampicylinę (Ap), związek pochodzenia roślinnego (o udokumentowanym działaniu antybakteryjnym) kwas oleanolowy (OA) oraz nanocząstki srebra (AgNPs). Celem ćwiczenia jest zbadanie: 1) zdolności do tworzenia biofilmów przez wybrane szczepy bakteryjne 2) wrażliwości wytworzonych biofilmów na klasyczne i alternatywne środki antybakteryjne. Szczepy: Escherichia coli ATCC Enterococcus faecalis wt Bacillus subtilis ATCC 6633 Pseudomonas aeruginosa ATCC Podłoża LB LB + Glc Wykonanie: 5.1. Metoda barwienia fioletem krystalicznym cz. I 1) Nocna hodowla bakterii w LB, 37 o C, 2) Rozcieńczyć hodowle 1:100 w LB lub LB +Glc nanieść po 200 l na płytki titracyjne, przykryć wieczkiem i inkubować 48 h w 37 o C 3) niezwiązane komórki usunąć delikatnie wytrząsając 4) przemyć dołki, w tym celu płytki zanurzyć w wodzie i lekko mieszać, po usunięciu wody odpłukane dołki barwi się fioletem krystalicznym (125 l r-r 0,1% na dołek) przez 10 min w temperaturze pokojowej 5) po 10 min barwnik zlać, a płytki przemyć 2x wodą przez zanurzenie 6) wodę usunąć, a szalki pozostawić do wyschnięcia 7) po wysuszeniu płytek barwnik rozpuścić, dodając do każdego dołka 200 l 95 % etanolu i inkubować pod przykryciem w temperaturze pokojowej przez 15 min 8) wykonać pomiar przy długości fali 570 nm (A 570 ). 15

16 5.2. Wrażliwość biofilmów na wybrane czynniki przeciwbakteryjne cz. II 1) analogicznie jak w cz. I, w pkt. 2 do odpowiednich dołków nanieść: - Ap do stężenia końcowego 40µg/ml (Roztwór wyjściowy 50mg/ml) - OA do stężenia końcowego 48µg/ml (Roztwór wyjściowy 1mg/ml) - AgNPs do stężenia końcowego 18µg/ml (Roztwór wyjściowy 50mg/ml) Ap-ampicylina, OA- kwas oleanolowy, AgNPs- nanocząstki srebra 16

17 6. Oczyszczanie białek bakteryjnych i badanie ich zdolności do interakcji z DNA Ryc. 1. Model organizacji genetycznej i autoregulacji modułu addykcyjnego tad-ata. pet28b(+) (5368 pz) Ryc. 2. Wektor ekspresyjny pet28b(+) wykorzystany do nadprodukcji białka antytoksyny systemu addykcyjnego s045-s044. Dane na temat wektorów typu pet na stronie: 17

18 Celem ćwiczenia jest: 1) otrzymanie wydajnej nadekspresji białka 2) zapoznanie się z różnymi układami ekspresyjnymi 3) badanie interakcji białka z DNA Wykonanie: 6.1. Nadprodukcja zrekombinowanego białka antytoksyny 1. Odmłodzić hodowlę w stosunku 1: Po godzinie dodać IPTG do stężenia końcowego 0,2 mm. 3. Co 40 min zwirować 1 ml hodowli i zamrażać w -20 C Przygotowanie żelu poliakryloamidowego i elektroforeza białek 1. Przygotować żel rozdzielający, a po 30 min. zagęszczający. 2. Próbki zawiesić w 100 μl wody dejonizowanej i dodać 100 μl buforu lizującego do białek [2 x stężony; 0,125 M Tris HCl (ph 6,8), 10 % β-merkaptoetanol, 0,05 % błękit bromofenolowy, 20 % glicerol, 4 % SDS]. 3. Próbki inkubować 10 min w 100 C. 4. Nanieść 10 μl próbki na żel i przeprowadzić elektroforezę SDS-PAGE w 15 % żelu poliakryloamidowym w buforze glicynowym 1 x stężonym (0,025 M Tris base, 0,192 M glicyna, 0,1 % SDS). Elektroforezę prowadzić przy napięciu 70 V aż do wejścia prób w żel rozdzielający, wtedy należy zmienić napięcie na 150 V Badanie zdolności do interakcji zrekombinowanego białka antytoksyny z DNA 1. Wymieszać: Odczynnik kompetycyjny DNA (mieszanina zlinearyzownych plazmidów pabw3 i pcf430, w stosunku 1:1) bufor do EMSA [40 mm Tris-HCl (ph 8,0), 10 mm MgCl 2, 100 mm KCl, 1 mm ditiotreitol (DTT), 10% surowicza albumina wołowa (BSA)] Ilość -- 4 μl -- 4 μl rekombinowane białko Ata -- próbka nr 1 --> 0 μl próbka nr 2 --> 0,5 μl z roztworu rozcieńczonego 1:10 próbka nr 3 --> 0,5 μl z roztworu nierozcieńczonego woda dejonizowana -- próbka nr 1 --> 11 μl próbka nr 2 --> 10,5 μl próbka nr 3 --> 10,5 μl 2. Próby inkubować 10 min. w temp. pokojowej 3. Dodać 1 μl DNA grupa nr 1 --> fragment DNA oznaczony A grupa nr 2 --> fragment DNA oznaczony B grupa nr 3 --> fragment DNA oznaczony C grupa nr 4 --> fragment DNA oznaczony D 18

19 4. Próby inkubować 5 min. w temp. 37 C 5. Po obciążeniu 50 % glicerolem próbki nanieść na 2,4 % żel agarozowy. Elektroforezę prowadzić w 0,5 x stężonym buforze TBE (89 mm Tris base, 2,5 mm EDTA, 89 mm kwas borowy), w lodzie. Przez pierwsze 30 min przy napięciu 50 V, następnie przy napięciu 80 V. 6. Po rozdziale elektroforetycznym żel umieścić w wodnym roztworze bromku etydyny o końcowym stężeniu 0,5 mg/ml (5 min), a następnie płukać w wodzie (5 min). Wyniki rozdziału DNA analizować z wykorzystaniem transiluminatora UV. 19

20 7. Badanie interakcji białek Czynnikami sieciującymi są zarówno homo- jak i heterobifunkcyjne substancje, które mają odpowiednio identyczne lub różne grupy reaktywne. Najczęściej używane są odczynniki sieciujące, które: (i) mają identyczne grupy reaktywne (homobifunkcyjne), oddziałujące z pierwszorzędowymi grupami aminowymi (najczęściej lizyny), (ii) dobrze rozpuszczają się w środowisku wodnym, (iii) tworzą stabilne wiązania kowalencyjne z białkami. Odczynniki sieciujące mające identyczne grupy reaktywne dzielą się na dwie klasy: (i) odczynniki tworzące trwałe wiązania pomiędzy białkami (np. aldehyd glutarowy i estry imidowe) oraz (ii) odczynniki [np. ester N-hydroksyimidu kwasu bursztynowego (NHS)] tworzące nietrwałe wiązania, które mogą zostać przecięte w wyniku działania odpowiedniego czynnika redukującego [np. β-merkaptoetanol i ditiotreitol (DTT)]. aldehyd glutarowy Celem ćwiczenia jest: 1) zbadanie zdolności do oddziaływań pomiędzy białkami 2) zapoznanie się z różnymi metodami badań interakcji białek Wykonanie: 7.1. Reakcja sieciowania białek za pomocą aldehydu glutarowego 1. Wymieszać: Odczynnik Ilość 0,5 M bufor bicyna-naoh (ph 8,5) - 2 μl 4 M NaCl - 2 μl 1 mm ditiotreitol (DTT) - 2 μl aldehyd glutarowy - próbka nr 1 0 μl; próbka nr 2 0,5 μl z roztworu o stężeniu 0,1%; próbka nr 3 2 μl z roztworu o stężeniu 0,1%; próbka nr 4 1 μl z roztworu o stężeniu 1%; zrekombinowane białko Ata - grupa nr 1 2 μl (białko z domeną histydynową na końcu C ); grupa nr 2 3 μl (białko z domeną histydynową na końcu C ); grupa nr 3 2 μl (białko z domeną histydynową na końcu N ); grupa nr 4 3 μl (białko z domeną histydynową na końcu N ) woda dejonizowana - dopełnić do 20 μl RAZEM - 20 μl 2. Inkubować 20 min. w temp. pokojowej. 3. Dodać 2,5 μl 1,4 M roztworu etanoloamina-hcl (ph 8,0). 4. Inkubować 20 min. w temp. pokojowej. 5. Dodać 20 μl buforu lizującego do białek (2 x stężony). 6. Próbki inkubować 10 min w 100 C. 20

21 7. Nanieść próbki na żel i przeprowadzić elektroforezę SDS-PAGE w 15 % żelu poliakryloamidowym w buforze glicynowym 1 x stężonym (0,025 M Tris base, 0,192 M glicyna, 0,1 % SDS). Elektroforezę prowadzić przy napięciu 70 V aż do wejścia prób w żel rozdzielający, wtedy należy zmienić napięcie na 150 V Wizualizacja produktów reakcji sieciowania białek 1. Po przeprowadzonej elektroforezie umieścić żel na 10 min. w barwniku Coomasie Briliant Blue. 2. Przenieść do roztworu tzw. odbarwiacza mocnego i przeprowadzić 2 płukania po 10 min. 3. Przenieść do roztworu tzw. odbarwiacza słabego. 21

22 PODŁOŻA Podłoże LB (Luria broth) Bacto tryptone 10 g Bacto yeast Extract 5 g NaCl 5 g H 2 O dest. do 1000 ml ph 7,2; sterylizować 15 min w 121 o C. Podłoże LA (Luria agar) Do 200 ml podłoża LB dodać 3 g Bacto - agaru. Jałowić jak wyżej. Podłoże minimalne Davisa sole: K 2 HPO 4 bezw. KH 2 PO 4 bezw. (NH 4 ) 2 SO 4 bezw. MgSO 4 x 7H 2 O 14 g 6 g 2 g 0,2 g 1,0 g 400 ml Rozlać po 40 ml; jałowić 30 min. w 121 o C. cytrynian sodu H 2 O agaroid: agar-agar 3,0 g H 2 O dest. 150 ml glukoza 20% Podłoże płynne przygotowuje się przez zmieszanie: 150 ml H 2 O dest. 40 ml soli 4 ml glukozy Podłoże stałe otrzymuje się przez zmieszanie: 150 ml agaroidu (upłynnionego) 40 ml soli 4 ml 20% glukozy Bulion odżywczy (BO) Bulion suchy (Biomed) 15 g H 2 O dest. do 1000 ml Agar odżywczy (AO) Do 200 ml bulionu odżywczego dodać 3 g agaru-agaru. Jałowić jak wyżej. 22

23 METODY 1 Miniliza alkaliczna (modyfikacja metody Birnboim i Doly, 1979) W metodzie tej wykorzystuje się fakt, że w wąskim zakresie ph (12,0-12,5) zachodzi wybiórcza denaturacja liniowej formy DNA, ale nie formy CCC. Komórki lizuje się całkowicie traktując je SDS i NaOH. DNA chromosomowy zostaje wybiórczo zdenaturowany, a kiedy lizat zostaje zobojętniony przez dodatek kwaśnego roztworu octanu sodu, DNA chromosomowy renaturuje i tworzy nierozpuszczalne agregaty. Jednocześnie pod wpływem wysokiego stężenia octanu sodu zachodzi wytrącenie kompleksów białek z SDS, a także wielkokocząsteczkowego RNA. W ten sposób ko-precypitacji ulegają trzy rodzaje największych makrocząsteczek mogących stanowić zanieczyszczenie preparatów DNA plazmidowego. Można je następnie usunąć poprzez jedno wirowanie. Supernatant zawiera przede wszystkim DNA plazmidowy (oraz resztki drobnocząsteczkowego RNA), który można odzyskać z supernatantu w wyniku wytrącenia etanolem. Materiały 1) Roztwór I: 50 mm glukoza 10 mm EDTA 25 mm Tris HCl (ph 8,0) 2) Roztwór II: 0,2 N NaOH 1% SDS 3) Roztwór III: octan potasu (ph~4,8) Roztwór III przygotowuje się, mieszając 60 ml 5 M octanu potasu z 11,5 ml lodowatwgo kwasu octowego i 28,5 ml H 2 O dest. Otrzymany roztwór jest 3 M względem potasu i 5 M względem octanu. Wykonanie: 1) Odwirować w probówce Eppendorfa 1,5 ml nocnej hodowli bakterii w LB (3 min, mikrowirówka) 2) Dokładnie zlać supernatant, osad zawiesić w 100 l zimnego roztworu I i inkubować 5 min w temp. pokojowej. 3) Dodać 200 l roztworu II, zawartość eppendorfówki wymieszać przez kilkukrotne odwracanie i inkubować w lodzie przez 5 min. 4) Dodać 150 l zimnego roztworu III, wymieszać i inkubować w lodzie przez 5 min. 5) Dodać 30 l mieszaniny fenolu z chloroformem i wymieszać łagodnie. 6) Odwirować 10 min. w mikrowirówce w temp. pokojowej. 7) Do zebranej fazy wodnej dodać 2 objętości (1ml) 96% etanolu i trzymać 15 min w zamrażarce. 8) Odwirować wytrącony DNA (10 min. w wirówce z chłodzeniem), zlać supernatant. 10) Przemyć osad 100 l 70% etanolu i odwirować 10 min w wirówce z chłodzeniem. 11) Dokładnie usunąć supernatant, wysuszyć osad (np. przez wstawienie otwartej eppendorfówki na 15 min do termostatu na 65 o C). 12) Osad zawiesić w 40 l buforu TE (ph 8,0). 23

24 2. Elektroforeza DNA w żelu agarozowym Elektroforeza DNA w żelu agarozowym jest standardową metodą pozwalającą wykryć obecność plazmidów w lizatach komórkowych, określić ich liczbę i wielkość, a także rozdzielić fragmenty DNA otrzymane po trawieniu plazmidów enzymami restrykcyjnymi. Tempo migracji cząsteczek DNA zależy od ich wielkości a także od użytych parametrów elektroforezy (stężenia agarozy, przyłożonego napięcia, użytego buforu i temperatury). Wykonanie: 1) Przygotować bufor elektrodowy Tris-octan (TAE ) o składzie: 0,04 M Tris-octan i 0,001M EDTA, ph 8,0. 2) Przygotować 0,8% agarozę w buforze elektrodowym, ogrzać do całkowitego rozpuszczenia, a następnie schłodzić do 60 o C. 3) Wlać agarozę do przygotowanego odpowiednio aparatu do elektroforezy z włożonym grzebieniem (grubość żelu powinna wynosić około 5 mm). 4) Po zestaleniu żelu wyjąć grzebień i wlać bufor elektrodowy w takiej ilości, aby przykrył żel cienką warstwą. 5) Wymieszać próbki DNA z buforem obciążającym (o składzie 0,25% błękit bromofenolowy, 30% glicerol) w proporcji 6:1 i nałożyć do studzienek w żelu przy pomocy pipety automatycznej. 6) Prowadzić elektroforezę, ustawiając zasilacz na wartość napięcia 100 V do momentu dojścia barwnika do 2/3 żelu. 7) Barwić żel przez 10 min. w roztworze bromku etydyny o stężeniu końcowym 0,5 g/ml. 8) Odpłukać bromek etydyny w wodzie destylowanej. 9) Obejrzeć żel pod lampą UV. 3. Transformacja metodą rubidowo-wapniową (Kushner, 1978) Metoda ta pozwala uzyskać dla wielu szczepów E. coli wyższą wydajność transformacji niż standardowa metoda wapniowa. Podloża i roztwory: Podłoże LB i LA Roztwór I do transformacji 10 mm MOPS ph 7,0 10 mm RbCl Roztwór II do transformacji 100 mm MOPS ph 6,5 50 mm CaCl 2 10 mm RbCl 24

25 Wykonanie: 1) Nocną hodowlę E. coli rozcieńczyć 1 : 50 w świeżym podłożu LB (np. do 10 ml podłoża w kolbie a 100 ml dodać 0,2 ml hodowli). 2) Inkubować z wytrząsaniem w 37 o C do osiągnięcia gęstości około 1 x 10 8 /ml (co trwa około 2 godz.). 3) Odwirować 1,5 ml hodowli w probówkach Eppendorfa (3 min, mikrowirówka, 4 o C). 4) Zlać dokładnie supernatant, osad zawiesić w 1 ml jałowego roztworu I i odwirować jak wyżej. 5) Zlać dokładnie supernatant, a osad zawiesić w 0,2 ml jałowego roztworu II. 6) Zawieszone bakterie inkubować 15 min w lodzie. 7) Dodać DNA i trzymać przez dalsze 15 min w lodzie. 8) Przenieść na 50 sek. do łaźni wodnej o temp o C. 9) Natychmiast dodać 5 ml LB i inkubować w 37 o C bez wytrząsania przez 60 min. 10) Wysiać na odpowiednie płytki selekcyjne. Jeśli trzeba, komórki przed wysiewem można rozcieńczyć bądź zagęścić przez wirowanie. Izolacja całkowitego DNA (wg Chen i Kuo, 1993) 1) nocną hodowlę bakteryjną (1,5 ml) wirować przez 3 minuty przy obr./min. 2) osad zawiesić w 200 ul roztworu TESO, dodać 66 µl 5M NaCl, mieszać intensywnie przy użyciu worteksu przez 1 minutę i odwirować 4 minuty / 12 tys. obr./min. w temp. pokojowej 3) zebrać supernatant, dodać równą objętość mieszaniny fenol:chloroform (nasyconej 1M Tris HCl o ph 8,0) 4) mieszać intensywnie przy użyciu worteksu przez minutę i odwirować 5 minut (12 tys obr./min) 5) zebrać fazę wodną i dodać równą objętość chloroformu, zworteksować przez minutę i zwirować 5 minut jw. 6) do zebranej fazy wodnej dodać 2 objętości etanolu (96%) oraz 1/10 objętości roztworu III do lizy alkalicznej 7) DNA wytrącać przez 30 minut w -20 C 8) preparat odwirować 20 minut w 4 C, 12 tys obr./min. 9) osad przemyć 2 razy 70% etanolem, wysuszyć i zawiesić w 100 µl buforu TE TESO: 40 mm Tris-HCl (ph 8,0) 1mM EDTA (ph 8,0) 1% SDS 20 mm NaAc 25

26 ROZTWORY I BUFORY ZYMOGRAFIA Żel dolny 10% (rozdzielający) - 3,6 ml woda destylowana - 30 mg w 750 µl 1% SDS żelatyna typu A ze skóry wieprzowej (Sigma, G8150) µl bufor 3M Tris/HCL, ph 8,8-2,5 ml 30% roztwór akrylamidu/bisakrylamidu - 75 µl 10% roztwór SDS µl 10%APS - 3,75 µl TEMED SDS- siarczan dodecylu sodu, APS- nadsiarczan amonu, TEMED (N,N,N, N -tetrametyloetylenodiamina) Żel górny 4% (zagęszczający) - 2,8 ml woda destylowana - 1,25 ml bufor 0,5M Tris/HCl, ph 6,8-625 µl 30% roztwór akrylamidu/bisakrylamidu - 50 µl 10% roztwór SDS - 250µl 10%APS - 3,75 µl TEMED Bufor do elektroforezy ph 8,6-25 mm Tris mm Glicyna - 0,1% SDS Bufrem Laemmli ego metoda zymografii - 4 ml 0,5M bufor Tris/HCl o ph 6,8-6 ml glicerol - 2 ml woda destylowana - 1 g SDS - 10 mg błękit bromofenolowy 26

27 OZNACZANIE AKTYWNOŚCI -laktamazy Bufor fosforanowy ph = 7 0,1 M (wyjściowy) Bufor I Tris HCl ph = 7,3 NaCl 0,03 M 0,03 M Bufor II Tris HCl ph = 7,3 0,03 M sacharoza 20 % Roztwór EDTA ph = 8,0 20 mm Roztwór nitrocefinu (świeżo przygotowany): Nitrocefin 1 mg DMSO 1 ml Bufor fosforanowy ph = 7,0 50 mm 19 ml 27

28 Elektroforeza SDS-PAGE Składnik Żel rozdzielający (15 %) Żel zagęszczający (4 %) 30 % roztwór akrylamid : bis-akrylamid (29:1) 2,5 ml 0,33 ml 10 % SDS 50 μl 25 μl 10 % APS 27,5 μl 19 μl TEMED 7,5 μl 3,75 μl 1 M Tris-HCl; ph 6,8-0,312 ml 1 M Tris-HCl; ph 8,8 1,875 ml - woda 0,54 ml 1,81 ml Roztwór do barwienia żeli poliakryloamidowych Odczynnik 1 % r-r wyjściowy Coomasie Briliant Blue metanol kwas octowy woda dejonizowana RAZEM Ilość 31,25 ml 125 ml 25 ml 68,75 ml 250 ml Roztwór do odbarwienia żeli poliakryloamidowych odbarwiacz mocny Odczynnik metanol kwas octowy woda dejonizowana RAZEM Ilość 350 ml 100 ml 550 ml 1000 ml Roztwór do odbarwienia żeli poliakryloamidowych odbarwiacz słaby Odczynnik metanol kwas octowy woda dejonizowana RAZEM Ilość 50 ml 75 ml 875 ml 1000 ml 28

29 Zalecana literatura 1) Kunicki-Goldfinger W.J.H. Życie bakterii. PWN, ) Salyers A.A, Whitt D.D. Mikrobiologia. PWN, ) Biologia molekularna bakterii PWN, 2006 pod redakcją J. Baj i Z. Markiewicza. 4) Brown T. A. Genomy. PWN, ) Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L. Biochemia. PWN,