MAGNETYCZNY REZONANS JĄDROWY WODORU

Transkrypt

1 MAGNETYCZNY REZONANS JĄDROWY WODORU 1 NMR, ( 2 NMR, 3 NMR) Trzy aktywne izotopy wodoru: % spin ½ Mz ( T) % spin Mz ( T) 3 0 spin ½ Mz ( T)

2 Przykładowe widmo 1 NMR wykonane w roztworze: Widmo protonowe, 1 NMR ( 1 MRJ): Położenie sygnałów (przesunięcie chemiczne, ppm) Wzorzec: tetrametylosilan, Si(C 3 ) 4 0 ppm Typowy zakres przesunięć chemicznych: 0 15 ppm Struktura sygnałów (krotność lub multipletowość, sprzężenie spin-spin) Intensywność sygnałów, intensywność integralna ( całka ) Skala δ ( przesunięć chemicznych ), skala τ = 10 - δ

3 Równocenność / nierównocenność chemiczna atomów Protony (grupy protonów) homotopowe = równocenne chemicznie Protony (grupy protonów) enancjotopowe = równocenne chemicznie (?) Protony (grupy protonów) diastereotopowe = nierównocenne chemicznie Cl Cl Br C F Br C R* równocenne chemicznie (homotopowe) nierównocenne chemicznie (diastereotopowe) równocenne chemicznie (enancjotopowe) nierównocenne chemicznie (!) Metody spektroskopowe i ich zastosowania do identyfikacji związków organicznych Praca zbiorowa pod redakcją W.Zielińskiego i A.Rajcy Wydawnictwa Naukowo-Techniczne, Warszawa, 2000 Spektroskopowe metody identyfikacji związków organicznych R.M.Silverstein, F.X.Webster, D.J.Kiemle Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2007

4 Równocenność / nierównocenność chemiczna atomów Cl Br Cl Cl równocenne (układ A 2 ) Cl Br nierównocenne (układ AB lub AX) Cl Br Br Br??? układ A 2 B lub A 3 Atomy wodorów w grupach C 3 i C 2 w związkach łańcuchowych są chemicznie równocenne ( uśrednienie przesunięć chemicznych) Wyjątek: centrum chiralne obok grupy!!!

5 Równocenność / nierównocenność chemiczna atomów RC 2 C 3 R RC 2 C 2 R' R R' układ A 3 układ A 2 R R ' CRR'R'' C 2 R R '' R układ AB Spektroskopia MRJ w fazie ciekłej, w achiralnym środowisku, nie rozróżnia enancjomerów, a rozróżnia diastereoizomery. (R)(S) = (S)(R), (R)(R) = (S)(S), (R)(S) (S)(S),...

6 Równocenność / nierównocenność chemiczna atomów X X X X X Y X Y równocenne A 2 nierównocenne AB lub AX

7 Równocenność / nierównocenność chemiczna atomów ax ax eq Cl eq Cl CCl eq ax Proces szybki / wolny w skali czasu NMR

8 Równocenność / nierównocenność chemiczna atomów Ukryte wiązanie podwójne O N C 3 C 3 N O N 3 C C 3 N OR 3 C C 3 O N R2 R1 O N R1 R2

9 Rozpuszczalniki stosowane w 1 NMR Aceton-d ppm Acetonitryl-d ppm Benzen-d ppm Chlorek metylenu-d ppm Chloroform-d 7.3 ppm Dimetyloformamid-d 6 (DMF) 2.9 ppm, 8.0 ppm Dimetylosulfotlenek-d 6 (DMSO) 2.6 ppm Metanol-d ppm Woda (D 2 O) 4.8 ppm C3 C 3 3 C Si C 3 (Wg materiałów firmy BRUKER) Wzorzec: tetrametylosilan (TMS), (C 3 ) 4 Si DSS Wzorzec zewnętrzny (external reference) Wzorzec wewnętrzny (internal reference) Wzorzec wtórny (secondary reference) 0.00 ppm ppm TMS C3 C 3 3 C Si C 2 C 2 C 2 SO 3 Na DSS

10 Kilka przesunięć chemicznych 1 NMR (ppm) Elektroujemność podstawnika: C CF 3 -F 4.26 C 3 -Cl 3.05 C 3 -Br 2.68 C 3 -I 2.16 C 3 -OC C 3 -N(C 3 ) C 3 -SC C 3 -Li (C 3 ) 4 Si 0.00 Rząd wiązania: C 3 C C 2 C CC 1.49 C Ilość grup metylowych: C C 3 C C 3 C 2 C C 3 C 2 C(C 3 ) Ilość heteroatomów: C C 3 Cl 3.05 C 2 Cl CCl Atom wodoru przy heteroatomie: O (alif.) 1 5 O (Ar) 4 10 O (kwas) 9 12 S 3 4 N 2 3 5

11 Kilka przesunięć chemicznych 1 NMR (ppm) B o X N O 3.8 O 6.2 O C N N N N N ca elektronów π 20 elektronów π Chaitanya S.Wannere, Paul von Ragué Schleyer, Organic Letters, 5(5), 2003,

12 Zmiany przesunięcia chemicznego 1 NMR wywołane metalem przejściowym: do ± 600 ppm Cl N N Fe 3+ N N 1 NMR (CDCl 3 ) protony pirolowe: ppm proton mezo: ppm protony Ar: ppm (J.Wojaczyński, Praca Doktorska, Wrocław, 1998)

13 D J n J( 1-1 ) Wielkość sprzężenia J( 1-1 ): od 0 do 42 z zazwyczaj nie przekracza kilkunastu z Oddziaływanie spin spin -sprzężenie skalarne J, sprzężenie pośrednie -sprzężenie dipol-dipol D, sprzężenie bezpośrednie Wielkość sprzężenia jest niezależna od natężenia pola magnetycznego Wielkość sprzężenia wyrażamy w hercach (z) Sprzężenia J i D są dodatnie lub ujemne! Uwaga na znak! od a do b od a do b!!! w tym drugim przypadku a może być równe 0!!

14 podczas pomiarów w roztworze sprzężenie D uśrednia się do zera i nie wpływa na strukturę widma B o α D ~ [3cos 2 (α) 1] (r -3 ) α = o D = 0 Sprzężenia J i D są dodatnie lub ujemne! Uwaga na znak! od a do b od a do b!!! w tym drugim przypadku a może być równe 0!! Stałe sprzężenia J: od 0 do z (!!) Sprzężenia J( 1-1 ): od 0 do 42 z; ale znane są sprzężenia rzędu 1000 z i większe!!

15 Sprzężenie pośrednie (skalarne) J sprzężenie geminalne 2 J gem sprzężenie wicynalne 3 J vic sprzężenie dalekiego zasięgu n J 2 J gem 2 J( 1-1 ) 1 J( 13 C- 1 ) 3 J(5-6)

16 Geminalna stała sprzężenia 2 J gem (atom sp 3 ) 2 J gem = (+ 6) (- 20) z (- 12) (- 14) C (- 11) (- 18) C 3 C N N C C 2 C N X (- 3) (- 9) (+ 6) (- 1.4) O O -6.1

17 Geminalna stała sprzężenia 2 J gem (atom sp 2 ) R X C C X = F N Li C R O C C C C O N C C C 3 C Wodorek dodać...

18 Wicynalna stała sprzężenia 3 J vic Zależność Karplusa 3 J = 8.5 cos 2 φ 0.3 (0 90 o ) 3 J = 9.5 cos 2 φ 0.3 ( o ) φ 3 J [z] kąt [ o ] O C C C C C C C C C C C 2 9 z 6 14 z z 4 10 z 3 7 z

19 COO N 2 R COO N 2 R N 2 R COO R O N C N C R C N O C R O C N C R C N O C R O C N C R C N O C R O C N C R C N O C R O C N C R C N O C R O C N C R C N O C R O 3 J( 15 N- 15 N) 3 J( 13 C- 13 C) 3 J( 13 C- 1 ) 3 J( 1-1 ) 3 J( 13 C- 1 ) 3 J( 15 N- 1 ) 3 J = Acos 2 (φ + α) + Bcos(φ + α) + C

20 3 J = Acos 2 (φ + α) + Bcos(φ + α) + C 3 J [z] kąt φ [ o ] A.Ejchart, Scalar Couplings in Structure Determination of Proteins Bulletin of the Polish Academy of Sciences; Chemistry, 47(1) (1999) 1

21 C (- 3) (- 1) z 2 3 z 3 J orto = z 4 J 5 meta = 2 3 z J para = z C 2 C C 2 3 J( 1-1 ) 0 z 4 J( 1-1 ) 0 z 2 J ax-eq = (- 11) (- 13) z 3 J ax-ax = z 3 J ax-eq = 2 5 z 3 J eq-eq = 2 5 z Sprzężenie W ok. 1 z

22 Konstrukcja multipletów Widma NMR dzielą się na widma pierwszego i drugiego rzędu. W widmach pierwszego rzędu: δ >> J brak atomów magnetycznie nierównocennych sprzężenia pomiędzy atomami chemicznie równocennymi nie wpływają na krotność (multipletowość) sygnałów; np. sygnał grupy C 3 jest singletem, znak stałej sprzężenia nie wpływa na strukturę multipletu, δ i J można odczytać wprost z widma W widmach drugiego rzędu: δ J, i / lub są atomy nierównocenne magnetycznie sprzężenia pomiędzy atomami chemicznie równocennymi i znak stałej sprzężenia wpływają na strukturę sygnałów Trudna analiza multipletów

23 C C C C C C C C C

24 C C 3 J = 10 z 10 z 10 z 10 z

25 C C C 2 J = 10 z J = 5 z J = 5 z 10 z 5 z 5 z

26 C C C C J = 10 z J = 5 z J = 2 z 5 z 2 z 10 z

27 C C C 2 J = 10 z J = 2 z J = 2 z 10 z 2 z 2 z

28 C 3 3 C C C 3 Praca domowa: jak wygląda sygnał czerwonego atomu wodoru

29 Przykłady widm protonowych (widma pierwszego rzędu)

30

31

32

33

34

35

36

37 Układ A 3 MNX A 3 M 2 X

38 Nierównocenność protonów w grupie C 2 (widmo w CDCl 3 ) Układ A 3 MNX C 2 3 C C C 3 N N(C 3 ) 2 C 2 3 C C C 3 N 2 ppm

39

40

41

42 Układ AA MM X A 2 M 2 X

43 Widma protonowe drugiego rzędu

44 J δ widmo drugiego rzędu AX AM AB

45 XC 2 -C 2 Y A 2 X 2 A 2 M 2 A 2 B 2

46 -C 2 C 3 A 2 X 3 A 2 B 3

47 J δ widmo drugiego rzędu J J AX δ x δ y AM b AB a J δ = a*b δ x = δ 0 δ/2 δ y = δ 0 + δ/2

48 X J = 7 z Układ spinowy AX 2 AB 2 A δ = 1 ppm (500 z) 5 δ = 0.1 ppm (50 z) δ = 0.02 ppm (10 z) 5 4 δ A δ B = (δ 5 + δ 7 ) / 2! dla δ = 0 ppm pozostanie tylko jedna linia (układ A 3 ) 8 7 δ B 3 2 J AB = (ν 1 - ν 4 ) + (ν 6 ν 8 ) / 3 1

49 NIERÓWNOCENNOŚĆ MAGNETYCZNA Równocenność / nierównocenność magnetyczna: dotyczy atomów równocennych chemicznie Dwa atomy są równocenne magnetycznie, kiedy: są równocenne chemicznie stałe sprzężenia tych atomów z dowolnym innym atomem w cząsteczce są identyczne δ = δ δ = δ A 2 X 2?? X 3 J() 4 J() AA XX (AA BB )

50 Z Z Z Y Z Układ spinowy AA XX (AA BB )

51 A A' N = ν 1,2 ν 1,7 K = ν 3 ν 4 = ν 5 ν 6 M = ν 9 ν 10 = ν 11 ν 12 (2O) 2 = (ν 3 ν 5 ) 2 = (ν 4 ν 6 ) 2 (2P) 2 = (ν 9 ν 11 ) 2 = (ν 10 ν 12 ) 2 X X X' 1,2 7,8 L = [(2O) 2 K 2 ] 0.5 = [(2P) 2 M 2 ] 0.5 N = J AB J AB L = J AB J AB K = J AX J BB M = J AA J BB E. W. Garbisch, Journal of Chemical Education, 45(5), 1968, (6), 1968, (7), 1968,

52 Układ AA MM X A 2 M 2 X

53 Programy do obróbki widm NMR: MestRe-C 2.3a SpinWorks

54 OPTYMALIZACJA POMIARU I BŁĘDY ( 1 NMR)

55 Przygotowanie próbki Próbka o odpowiednim stężeniu, rozpuszczona w odpowiedniej ilości deuterowanego rozpuszczalnika, bez osadu i stałych zanieczyszczeń. Czy można użyć rozpuszczalnika nie deuterowanego? Tak, ale... Brak sygnału deuteru; brak sygnału używanego do regulacji jednorodności pola i do stabilizacji pola. Można ewentualnie użyć sygnału FID-u. CCl 3, C 2 Cl 2... konieczność usuwania sygnału rozpuszczalnika. CCl 4, CS 2, freon... można użyć; ew. zastosować rozpuszczalnik deuterowany w kapilarze. Można użyć mieszanki, np. C 2 Cl 2 /CD 2 Cl 2 w celu minimalizacji kosztów, w specyficznych pomiarach ( 13 C, 15 N, 19 F, 31 P...) Wzorzec: zewnętrzny lub wewnętrzny. Można użyć sygnału resztkowego rozpuszczalnika.

56 Eksperyment impulsowy NMR... czas D1 PW AQ FT SW Parametry eksperymentu: (ozn. BRUKER, VARIAN) ilość powtórzeń (number of scans) NS, nt zwłoka relaksacyjna (relaxation delay) D1 długość impulsu (pulse width) P1, PW czas akwizycji (acquisition time) AQ, at zakres pomiaru (sweep width) SW ilość punktów TD/SI, np/nf

57 Czynniki wpływające na intensywność sygnału próbki stężenie próbki długość impulsu maksymalne wzbudzenie dla impulsu 90 o (w parametrach długość impulsu podana jest w µs! Trzeba sprawdzić parametr pw90!) stopień zrelaksowania próbki, zależny od sumy czasów D1 i AQ (d1 i at); D1 + AQ > 2 3 T 1 z z T1: dla s lub dłużej (!) Typowe parametry: 1 : d1 = 0 s, at = 3 5 s, pw = o B o M x y zaburzenie relaksacja α x y D1 PW AQ α = 0 ο 360 ο

58 Niepełna relaksacja próbki

59 Dobór czułości odbiornika: receiver gain gain gain = n lub 0 39 za mała wartość źle wykorzystana czułość aparatu za duża wartość obcięcie sygnału A t (sek) Jeśli gain = 0 za duży, należy zmniejszyć pw (np. o 50%)

60 Dobór czasu akwizycji (AQ, at) PW D1 AQ at, sw oraz np są zależne od siebie. Zmiana at powoduje zmianę np ( i odwrotnie). Zmiana sw powoduje zmianę at. A sygnał szum t (sek) A t (sek) (ppm)

61 Rozdzielczość spektralna parametr wynikający z SW i ilości punktów wykorzystanych do konstrukcji widma 8 K (8 192 pkt) 32 K ( pkt)

62 Dopełnianie FID-u zerami ( zero-filling ) A sygnał szum A t (sek) t (sek) np (TD) ilość komórek pamięci do rejestracji sygnału fn (SI) - ilość komórek pamięci do konstrukcji widma

63 SW, O1 Sygnał zawinięty SW O1 [z] SW Dobór sw i o1 dla nieznanych rozpuszczalników: 1. sw = 40 ppm; wykonać wstępne widmo (np. nt = 4) 2. Na ekranie wyświetlić zakres, gdzie są sygnały, zastosować polecenie movesw 3. Wykonać dobre widmo 4. Uwaga: nie zostawiać sygnałów poza zakresem sw NT, BS nt wielokrotność 4 lub 8 bs umożliwia kontrolę widma przed zakończeniem pomiaru (bs = 4, 8,...64)

64 Matematyczna obróbka widma (zmiana kształtu sygnału BRUKER) A FT Mnożenie przez funkcję wykładniczą (Expotential Multiplication, EM) y = exp(-at/t a ) t (sek) EM, FT LB = 1 y A t (sek) t (sek) FT Mnożenie przez funkcję Gaussa (Lorentzian-to-Gauss Transformation) y = exp(at/t a -bt 2 /t a 2 )) y A GM, EM, FT LB = -1.2 GB = 0.5 t (sek) t (sek) LB = dla 1 LB = 1 2 dla 13 C EF lub EM i FT A t (sek) LB = -1.2; GB = 0.1 1; GF (Bruker)

65 Matematyczna obróbka widma (funkcje ważące wg VARIAN) A t (sek) Expotential function y = exp(-t. π. lb) lb > 0 y lb > 0 t lb<0 Gaussian function y = exp(-(t/gf) 2 ) gb > 0 exp(-t. π. lb). exp(-(t/gf) 2 ) gb > 0; lb < 0 sinebell y = sin(t. p/2. sb)

66 Jak zastosować funkcje ważące (Varian) ft transformacja Fouriera wft - transformacja Fouriera + funkcje ważące Wartości lb=n, gf=n i sb=n wyłączają funkcje, pomimo polecenia wft (Uwaga na polecenia złożone!) Dwie użyteczne procedury: Poszerzenie linii (zmniejsza szumy, traci się na rozdzielczości. Przydaje się w 13 C NMR) lb = dla 1 NMR lb = 1 2 dla 13 C NMR Następnie transformacja poleceniem wft (gf=n, sb=n) Zwiększenie rozdzielczości najlepiej poleceniem resolv Procedura aktywuje dwie funkcje z parametrami: lb = /(a. SW) oraz gf = b. SW, gdzie a=0.1 i b=0.3. Można grać procedurą zmieniając parametry a i b: resolv(a,b). Zwiększenie rozdzielczości zaburza linię podstawową i fałszuje całkę! Można stosować ręczny dobór parametrów: wstawić wartości lb i gf, i zastosować wft Interaktywne dobieranie funkcji: instrukcja obsługi aparatu.

67 BŁĘDY I IC PRZYCZYNY Przesunięcie chemiczne niedoskonałość wzorca ( wewnętrzny TMS) błąd do ± 0.5 ppm (!!). W precyzyjnych pomiarach należy stosować wzorzec zewnętrzny. efekty stężeniowe, temperatura próbki, asocjacja związku, itp. rozdzielczość spektralna ( z) typowa dokładność δ( 1 ): nie więcej niż ± 0.01 ppm Wartość stałej sprzężenia J rozdzielczość spektralna ( z) (!!!) nakładanie się sygnałów typowa dokładność J: nie więcej niż ± 0.3 z Intensywność integralna: niepełna relaksacja próbki rozdzielczość spektralna zaburzenia linii podstawowej widma, nieprawidłowa faza widma

68 Tematy związane nie tylko z 1 NMR wpływ temperatury na widmo efekt Overhausera presaturacja sygnału (usuwanie sygnału rozpuszczalnika) echo spinowe rezonans podwójny ( homodecoupling )

69 Wpływ temperatury na widmo Ph N N N + N- O C 2 C 3 N O Ph N C 2 C 3 N N + - C 2 C K 303 K 253 K

70 C 3 N 1 C CDCl K C 2 1 1, K 3

71 Badanie odległości między atomami: JĄDROWY EFEKT OVERAUSERA (Nuclear Overhauser Effect, NOE) Efekt Overhausera zmiana intensywności sygnału atomu położonego w pobliżu innego atomu naświetlanego jego częstością rezonansową J(,) = 0 z (duża odległość liczona po wiązaniach) D(,) 0 z (mała odległość liczona poprzez przestrzeń) υ 0

72 I o widmo odniesienia naśw. widmo zaburzone I naśw. I intensywność integralna sygnału niezaburzonego I o intensywność integralna sygnału zaburzonego widmo różnicowe I - I o η współczynnik wzmocnienia η = (I I o )/I o

73 Pomiar efektu Overhausera Widmo odniesienia Widmo naświetlone Widmo naświetlone - widmo odniesienia O (B.Furman et al.)

74 A AX AMX ββ αβ βα αα W widmie NMR obserwowane są bezpośrednio wyłącznie przejścia jednokwantowe

75 ββ αβ 3 4 1,4 2,3 βα 1 αα 2 ββ αβ βα 1,4 2,3 1 αα 1 4 przejścia jednokwantowe 5 przejście dwukwantowe 6 przejście zerokwantowe

76 υ o krótki czas naświetlania: truncated driven NOE (TOE) długi czas naświetlania: steady state NOE selektywny impuls 180 o : transient NOE dη/dt ~ 1/r 6 50% η maksymalna wartość η dla układu 1 1 : 50% duża odległość między atomami mała odległość między atomami czas naświetlania [s]

77 NOE współczynnik wzmocnienia sygnału 1 { 1 } η = (I - I o ) / I o I = I o (1+η) η { 1 } -1 log ωτ c ω częstość rezonansowa 1 τ c czas korelacji cząsteczki

78 50 % 50 % 28 % 50 % -13 % 0 % 28 % -13 % η [%] log ωτ c % 49 % 1 % -0.4 % 49 % 1 % -0.4 % 50 % 0 % α η [%] log ωτ c %

79 NOE wykonanie eksperymentu Próbka: eliminacja zanieczyszczeń paramagnetycznych: kationów metali przejściowych (np. Cr 3+ z chromianki) tlenu atmosferycznego rozpuszczonego w roztworze Odgazowanie próbki: przepuszczanie gazu obojętnego mało skuteczne procedura zamrażanie próżnia rozmrażanie 3 5 razy zastosowanie specjalnej probówki NMR

80 PRESATURACJA SYGNAŁU

81 Uboczny skutek eksperymentu NOE: usunięcie sygnału z widma Widmo odniesienia υ 0 Widmo naświetlone Selektywne naświetlanie: wyrównanie obsadzeń poziomów energetycznych PRESATURACJA SYGNAŁU usuwanie sygnału rozpuszczalnika przez jego selektywne naświetlanie. ZASTOSOWANIE: usuwanie silnego sygnału rozpuszczalnika, np. w próbkach białek i DNA w środowisku 2 O (nie D 2 O!!)

82 PRESATURACJA SYGNAŁU (usuwanie sygnału rozpuszczalnika) 2 O

83 Szerokość sygnału zależy od czasu relaksacji T 2??? Szeroki sygnał = krótki T 2 Wąski sygnał = długi T 2 początek rejestracji sygnału

84 ECO SPINOWE

85 exp(-t / T 2 ) 90 o 180 o τ τ Dwie przyczyny zaniku sygnału: czynniki aparaturowe (niejednorodność pola) relaksacja spin-spin t = 0 τ 2τ Carr-Purcell-Meiboom-Gill D1 90 o (τ 180 o τ) n -FID y x f s s f f po impulsie 90 o po czasie τ s po impulsie 180 o po czasie τ

86 REZONANS PODWÓJNY (homodecoupling, odsprzęganie) ν o ββ βα αβ αα υ 0 υ 0

87