dobry punkt wyjściowy do analizy nieznanego związku

Transkrypt

1 spektrometria mas

2 dobry punkt wyjściowy do analizy nieznanego związku cele: wyznaczenie masy cząsteczkowej związku wyznaczenie wzoru empirycznego określenie fragmentów cząsteczki określenie niedoboru wodoru (wynikającego z wiązań wielokrotnych lub obecności pierścienia)

3 widmo EI-MS (jonizacja elektronami) m/z = 77 - pik podstawowy (najintensywniejszy = 100%) M - pik molekularny

4 kryterium dobrego rozdziału pików -zdolność rozdzielcza R = M n /(M n -M m ) jonizacja w fazie gazowej (EI, CI, ICP) jonizacja desorpcyjna ( FD, FAB, MALDI) jonizacja ewaporyzacyjna (termosprej, elektrosprej)

5 jonizacja chemiczna (CI) uwypukla pik molekularny - często nie widać pików fragmentacyjnych w CI obserwuje się pik M+1 i produkty addycji reagującego gazu

6 EI CI FD desorpcja polem (field desorption) skutecznie eliminuje fragmentację

7 desorpcyjne metody jonizacji desorpcja polem (FD) field desorption bombardowanie szybkimi atomami (FAB) fast atom bombardment - bombardowanie atomami gazu szlachetnego Xe, Ar; próbka rozpuszczona w matrycy spektrometria mas jonów wtórnych (LSIMS) bombardowanie jonami cezu zamiast gazu szlachetnego; popularne matryce: glicerol, alkohol nitrobenzylowy (NBA) desorpcja plazmowa (PD) plasma desorption - wykorzystanie izotopów promieniotwórczych np. Cf desorpcja laserowa - najczęściej MALDI - desorpcja laserowa wspomagana matrycą matrix assisted laser desorption - pozwala na analizę związków > 2 kda w połączeniu z detekcją czasu przelotu MALDI-TOF (krótki impuls lasera) kwas nikotynowy jako matryca - pozwala na desorpcję makromolekuł kda

8 jonizacja ewaporyzacyjna (termosprej, elektrosprej) - często w połączeniu z HPLC - czyli MS jako detektor ładunek gromadzi się na powierzchni kropelek, które przy odparowaniu w końcu eksplodują dając jony dodatnie lub ujemne

9 w widmie ES (ESI) mało fragmentacji, natomiast często M+23 (Na + ) lub M+1 (H + ) a nawet M+n (+ n H + ) (M+H) +, (M+Na) + są trwalsze niż M +

10 w widmie prostego peptydu widać piki. M+1, M+23, jak również fragmenty powstałe przez zerwanie wiązań peptydowych

11 magnetyczny analizator mas

12 kwadrupolowy analizator mas

13 pułapka jonów trzy sposoby pracy pułapki: 1. stopniowo uwalnia jony o rosnącej m/z 2. selekcjonuje jony o wybranej wartości m/z 2 przekazuje energię wyselekcjonowanym jonom by wywołać ich fragmentację - zastosowanie do tandemowej spektrometrii nas (MS-MS)

14 tandemowa spektrometria mas pierwszy spektrometr wytwarza jon prekursora (w pułapce) - często (M+H) + lub (M+Na) + drugi spektrometr analizuje produkty fragmentacji prekursora dzięki pułapkowaniu jonów można analizować skomplikowane analizy bez konieczności chromatografowania - szybkie analizy zastosowanie do sekwencjonowania białek! - MS-MS - obecnie praktycznie jedyna licząca się metoda sekwencjonowania (dawniej metoda Edmana)

15 detektor czasu przelotu - time of flight (TOF) jon o mniejszej m/z pokonuje określony dystans szybciej (w polu elektrycznym) stosowany jedynie do technik impulsowych czyli: desorpcja plazmowa i desorpcja laserowa (MALDI) zaleta: duża czułość (brak szczelin) ograniczenia: mniejsza zdolność rozdzielcza

16 EI -MS ma długą tradycję i nadal wielkie znaczenie dostarcza dzięki znacznej fragmentacji wielu informacji o strukturze dostępne są obszerne biblioteki widm minusy: - trudności w jonizacji makromolekuł, szczególnie wrażliwych - czasem brak jonu molekularnego lub trudności z jego identyfikacją

17 pik molekularny - rozpoznanie i użyteczne reguły - w razie wątpliwości (w widmie EI-MS) posłużyć się CI - reguła azotowa: M + zawierający jeden N ma masę nieparzystą - fragmentacja M + parzystego daje produkt nieparzysty (wyjątki) i odwrotnie - trwałość jonów molekularnych (i tendencja do tworzenia pików molekularnych): związki aromatyczne > alkeny sprzężone> krótkie alkany - piki M-15 (- metyl) M-18 (-woda) itp. stanowią dość pewne potwierdzenie M +

18 określenie wzoru cząsteczkowego - w pikach widzimy masy poszczególnych izotopów a nie średnie masy atomowe - stąd zawsze są małe piki M+1 i M+2 dla cząsteczek zawierających jedynie C, H, O, N, F, P oraz I % M+1 = 1,1n + 0,36x (M+ = 100%) n- liczba węgli, x- liczba azotów w cząsteczce obecność Br i Cl łatwa do rozpoznania - daje charakterystyczny wzór pików w obecności S lub Si stosunkowo intensywny pik M+2 (%M) 79 Br Br Cl Cl 32,5 12 C C 1,1 14 N N 0,36 32 S S 4,4

19 wysokorozdzielczy pomiar M + masa monoizotopowa - masa cząsteczki zawierającej wyłącznie izotopy najbardziej rozpowszechnione masy monoizotopowe CO i N 2 ~ 28 u - na spektrometrze niskiej rozdzielczości bez różnicy precyzyjniej CO: M( 12 C) + M( 16 O) = 27,9949 u N 2 : 2m( 14 N) = 28, 0062 u na spektrometrze wysokiej rozdzielczości te różnice widać masa piku molekularnego może być dowodem na wzór cząsteczkowy! są tabele mas monoizotopowych (fragment poniżej): 203 C 8 H 15 N 2 O 4 203,1032 C 8 H 17 N 3 O 3 203,1271 C 8 H 19 N 4 O 2 203,1509 C 9 H 17 NO 4 203,1158

20 widmo dynorfiny A (polipeptyd) odległość 0,5 stąd z=2 (przyłączenie dwu H + ) M= (m/z)*z - z = 2146

21 widmo ESI mioglobiny końskiej (piki wynikające z przyłączania nh + czyli z = n) n+1 n = mn+ 1 1, 008 m m n n+ 1 n = 1304,8 1, ,4 1304,8 = 12,008 n M + n 1, 008 m n = n M = 16952

22 widmo ESI mieszaniny dwu polimerów - każdy z nich jest mieszaniną związków (jonizacja dodatnia) główny polimer m = 44 = masa monomeru zakładając n = 1 widać rozkład mas (najwięcej frakcji zbudowanej z 22 merów m/z= 969,6 )

23 korzyści z określenia wzoru na podstawie MS: C n H m X x N y O z m. in. wskaźnik niedoboru wodoru (ilość cząsteczek H 2 potrzebnych do wysycenia) m x w = n y 2 atomów tlenu, siarki we wzorze nie uwzględniamy oprócz tego pierścień daje 1 np. benzen w = 4 (3 wiązania podwójne + pierścień)

24 fragmentacja i przegrupowania - szczególnie w widmach EI

25