Badanie aktywności antygrzybicznej propolisu pszczelego wytwarzanego przez pszczołę miodną Apis mellifera

Transkrypt

1 III LICEUM OGÓLNOKSZTAŁCĄCE IM. BOHATERÓW WESTERPLATTE W GDAŃSKU Badanie aktywności antygrzybicznej propolisu pszczelego wytwarzanego przez pszczołę miodną Apis mellifera Zuzanna Dąbrowska Klasa II b Opiekun pracy: mgr Anna Osieczko Gdańsk, 2015

2 Streszczenie Badania zostały przeprowadzone w celu oznaczenia aktywności antygrzybicznej propolisu zebranego z sześciu pasiek województwa pomorskiego. Zarówno test dyfuzyjny jak i metoda rozcieńczeniowa potwierdziły wysoką wrażliwość drożdży z gatunków Candida albicans, Candida glabrata i Candida krusei na składniki kitu pszczelego, przy czym zaobserwowano dość znaczne różnice w skuteczności działania poszczególnych preparatów. Wykazano ponad to, że inkubacja drożdży w zawiesinie zawierającej dodatek zaledwie 1% objętości ekstraktu propolisu powoduje całkowite uśmiercenie komórek już w ciągu jednej godziny. W pracy znaleziono zależności pomiędzy parametrami aktywności antygrzybicznej, a świeżością pobranego kitu. Uzyskane wyniki sugerują, że propolis pobrany w niedługim czasie od wytworzenia go przez pszczoły zachowuje najwyższą jakość i aktywność przeciwdrobnoustrojową. Jednoznaczne potwierdzenie tych przypuszczeń wymagałoby jednak wykonania badań na większej liczbie próbek. W dostępnej literaturze, w której prezentowano wyniki badań aktywności propolisu innych autorów, znaleziono potwierdzenie moich obserwacji. Wstęp Propolis jest jedynym produktem pszczelim, który na świecie znalazł tak szerokie zastosowanie w leczeniu chorób wewnętrznych i zewnętrznych. Wytwarzany z pączków niektórych drzew i roślin kwiatowych, częściowo mieszany z woskiem i wydzieliną gruczołów pszczelich. Pszczoły wykorzystują kit jako materiał wzmacniający konstrukcję ula, a także utrzymujący gniazdo w odpowiednich warunkach higienicznych [7]. Propolis charakteryzuje się złożonym i dość zróżnicowanym składem chemicznym. Jedną z najbardziej wartościowych właściwości propolisu jest jego działanie antybiotyczne [4]. Celem mojej pracy badawczej była identyfikacja i charakterystyka najbardziej aktywnych ekstraktów propolisu oraz ustalenie jakie parametry wpływają na skuteczność działania tego produktu. Przeprowadzone przeze mnie doświadczenia będą pomocne w selekcji najbardziej skutecznego propolisu, który znajdzie zastosowanie w zwalczaniu drobnoustrojów i w lecznictwie. Praca badawcza, dzięki uprzejmości pana dr Piotra Szwedy, została zrealizowana na Wydziale Chemicznym Politechniki Gdańskiej. Materiał i metody: Propolis został samodzielnie pozyskany z sześciu różnych pasiek w czerwcu 2015r. (Tab.1.) Tab.1. Wykaz zebranych próbek propolisu. PASIEKA Wodnica Szczodrowo Szczodrowo Bobowo Lubań Gdańsk NUMERY PRÓBEK RASA, LINIA PSZCZÓŁ , 26, 27 Kraińska: Niemka Kraińska 31, 32, 33, 34, 35 Mieszane pszczoły 1, 2, 4, 8, 11 3, 5, 6, 9 Kraińska: (dzikie trutowisko) 8.Włoska: Buckfast 5, 9. Kraińska: Jugo 3. Kraińska: Kortówka 6. Kraińska: Troisec 7, 10, 12, 28, 29, Kaukaska 30.Włoska:Buckfast Kraińska: Nieska POŻYTEK METODA POBRANIA Brzoza, topola, olcha Skrobanie beleczek i ścianek ula Brzoza, świerk, modrzew Propolis zebrany w grudniu Brzoza, świerk, modrzew Skrobanie starych beleczek Topola, olcha, świerk, śliwa, rośliny zielne Propolis zeskrobany z beleczek Brzoza, topola, czereśnia, świerk, rośliny zielne Świeży propolis zebrany z powałki Brzoza, świerk, rośliny zielne Świeży propolis z beleczek i powałki

3 Ekstrakty propolisu przygotowano w 75% roztworze etanolu. Propolis dodawano do alkoholu w stosunku 1:3 (m./obj. na 1 g propolisu stosowano 3 ml alkoholu). Ekstrakcję prowadzono 48 godzin w temperaturze pokojowej. Oddzielenie ekstraktu propolisu od fragmentów nierozpuszczonych przeprowadzono poprzez wirowanie (3500 obr./min.; wirówka laboratoryjna Sigma). 1. Badanie aktywności ekstraktów propolisu metodą dyfuzyjną. Sterylne, rozgrzane podłoże minimalne YNB agar zaszczepiano komórkami wzorcowych szczepów drożdży: Candida albicans 10231; Candida glabrata DSM II 226; Candida krusei DSM 6128, po czym wylewano na płytki Petriego z metalowymi tulejkami (ø=5 mm). Po zastygnięciu agaru usuwano tulejki, w wyniku czego w agarze powstały dołki, do których wprowadzano po 50 μl ekstraktów propolisu. Płytki inkubowano 24 godziny w temperaturze 37⁰C, po czym obserwowano i mierzono strefy zahamowania wzrostu drożdży. 2. Badanie aktywności ekstraktów propolisu za pomocą metody seryjnych rozcieńczeń. Celem tej części badań było wyznaczenie parametrów MIC (Minimal Inhibitory Concentration - minimalnego stężenia hamującego) oraz MFC (Minimal Fungicidal Concentration - minimalnego stężenia grzybobójczego) badanych ekstraktów. Oznaczenia wykonano w 96 - dołkowych płytkach titracyjnych. W pierwszym etapie przygotowano gradient stężenia ekstraktu. Do studzienek pierwszej kolumny płytek dodano po 180 μl podłoża RPMI (rekomendowane do badania aktywności przeciwgrzybowej) oraz 20 μl ekstraktu propolisu. Do celek kolejnych kolumn płytki titracyjnej wprowadzono po 100 μl pożywki. Gradient stężenia uzyskano przez przeniesienie 100 μl mieszaniny z celek kolumny nr 1 do kolumny nr 2, po czym operacje powtarzano przenosząc zawiesinę do kolejnych celek. Dzięki tej operacji stężenie składników propolisu w każdej następnej kolumnie było dwukrotnie niższe. W kolejnym etapie oznaczenia, do celek płytki titracyjnej wprowadzono po 100 μl zawiesiny badanych szczepów drożdży, w każdym przypadku stężenie komórek wynosiło około 2-5x10 4. Finalnie stężenie ekstraktów w kolejnych celkach płytki wynosiło: 1-5%, 2-2,5%, 3-1,25%, 4-0,63%, 5-0,31%, 6-0,15%, celka nr 7 - kontrola czystości podłoża, nr 8 - kontrola wzrostu komórek bez dodatku propolisu. Płytki inkubowano 24 godziny w temperaturze 37⁰C, po czym wizualnie sprawdzono przy jakim stężeniu ekstraktu propolisu nastąpiło zahamowanie wzrostu badanych szczepów. Badanie parametru MFC przeprowadzono poprzez przeniesienie niewielkiej ilości zawiesin z kolejnych celek płytki titracyjnej (za pomocą replikatora specjalny stempel) na podłoże Candida Chrom Agar. Płytki inkubowano 24 godziny w temperaturze 37⁰C po czym obserwowano wzrost (lub brak wzrostu) komórek drożdżowych w miejscu naniesienia zawiesin z kolejnych celek. Parametr MIC wyznaczano dla szczepów referencyjnych jak i izolatów wyselekcjonowanych. 3. Oznaczanie kinetyki grzybobójczego działania propolisu. Do zawiesiny komórek C. albicans (liczba komórek 1x10 4 /ml) w podłożu RPMI wprowadzono ekstrakt propolisu (stężenia 1% obj.) Równolegle przygotowano zawiesinę komórek drożdży bez dodatku propolisu. Zawiesiny inkubowano w temperaturze 37⁰C. Po 1, 3, 6 i 24 godzinach pobierano po 25 μl z każdej z zawiesin i wysiewano na podłoże agarowe - Candida Chrom Agar. Po 24-godzinnej inkubacji porównywano liczbę kolonii drożdżowych, które wyrosły na płytkach z podłożem Candida Chrom Agar, na które posiewano próbę kontrolną oraz inkubowaną z propolisem.

4 Wyniki 1. Badanie aktywności ekstraktów propolisu metodą dyfuzyjną (patrz Zdj.1.). Po 24 godzinach inkubowania płytek oceniano strefy zahamowania wzrostu na trzech gatunkach drożdży. Następnie wizualnie wybrano dwanaście najbardziej aktywnych ekstraktów. Propolis ze Szczodrowa nie został wykorzystany w dalszych badaniach, gdyż wykazywał zbyt małą aktywność. S.Z. P.K. Zdj.2. Porównanie kolorów przygotowanych ekstraktów propolisu, od ciemno brązowego po jasny żółty. To zróżnicowanie świadczy o dużej różnicy składu preparatów. Zdj.1. Wyniki badania propolisu metodą dyfuzyjną na Candida albicans. P.K. próba kontrolna S.Z. jedna ze stref zahamowania 2. Badanie aktywności ekstraktów propolisu za pomocą metody seryjnych rozcieńczeń. Otrzymane wyniki badań parametru MIC (Tab.2.) sporządzono na 12 najbardziej aktywnych ekstraktach, wykazują one zahamowanie wzrostu drożdży nawet przy minimalnym % stężeniu propolisu. Dla potwierdzenia wyników wykonano jeszcze jedną próbę na 5 najbardziej aktywnych preparatach, następnie użyto je w kolejnym badaniu MFC (Zdj.2.) i MIC (Tab.3, 4, 5). Tab.2. Minimalne stężenie hamujące ( wartości w %). Badanie zostało przeprowadzone w dwóch powtórzeniach. MIC szczepy referencyjne 0.63 Candida albicans Candida glabrata Candida krusei 0.63 Zdj. 3. Minimalne stężenie grzybobójcze (MFC). Pieczątka wykonana na podłożu Candida Chrom Agar: a) Candida ablicans 10231, b) Candida krusei DSM 6128, c) Candida glabrata DSM II 226.

5 Doświadczenie przeprowadzone na wyselekcjonowanych szczepach drożdży wykazuje, że do zahamowania ich wzrostu potrzebne jest większe stężenie propolisu niż w przypadku szczepów referencyjnych (patrz Tab.3, 4, 5). Candida albicans Tab.3. Minimalne stężenie hamujące (wartości podane w %). MIC Próbka Próbka Próbka Próbka Próbka Candida glabrata Tab.4. Minimalne stężenie hamujące (wartości podane w %). MIC Próbka 1 Próbka 2 Próbka 12 Próbka Próbka Candida krusei Tab.5. Minimalne stężenie hamujące (wartości podane w %). MIC Próbka Próbka 2 Próbka 12 Próbka 29 Próbka Oznaczanie kinetyki grzybobójczego działania propolisu. Uzyskane wyniki pokazują, że całkowite zahamowanie rozwoju drożdży występuje już po godzinie inkubacji ich wraz z propolisem (patrz Zdj.3.). 0.H. 1.H. 2.H. 6.H. 24.H Zdj.4. Posiew szczepów Candida ablicans w odstępach czasowych: 0, 1, 2, 6 i 24 godziny. Górne płytki - posiew drożdży, dolne - posiew drożdży wraz z dodatkiem propolisu.

6 Dyskusja Propolis od dawna stosowany jest jako naturalny środek o różnorodnych właściwościach leczniczych. Znanych jest wiele przypadków jego skutecznego wykorzystania podczas leczenia różnego rodzaju chorób, w przypadku których inne środki okazały się mało efektywne lub nieskuteczne [4]. Przeprowadzone badania potwierdziły wysoką aktywność przeciwgrzybiczą propolisu, wszystkie próbki zadziałały hamująco na wzrost badanych szczepów. W doświadczeniach preparaty wykazały zróżnicowaną skuteczność działania. Można również zauważyć, że spośród trzech badanych gatunków, izolaty Candida krusei i Candida glabrata wykazują zbliżoną wrażliwość, natomiast Candida albicans są bardziej odporne na działanie składników kitu pszczelego (Tab.2.). Podstawowym składnikiem propolisu są substancje pochodzenia roślinnego [5]: substancje żywiczne i pyłek kwiatowy (razem ok. 55% składu) [7]. Przygotowane ekstrakty propolisu mają różne barwy (Zdj.2), co potwierdza znaczące różnice w składzie chemicznym tego produktu w zależności od bazy pożytkowej (Tab.1.), z której korzystają pszczoły. Wśród preparatów zdecydowanie najwyższą aktywność wykazywały niemal wszystkie próbki z pasieki zlokalizowanej w Gdańsku (próbki numer 7, 12, 29, 30), propolis ze Szczodrowa zdecydowanie mniejszą. Do niedawna sądzono, że propolis pochodzący z różnych rejonów geograficznych, ma inne właściwości antybiotyczne, które są zależne od składu chemicznego danej próbki. Udowodniono, że skład różni się ilościowo pod względem zawartości poszczególnych związków chemicznych, jednak te różnice nie wpływają na aktywności kitu [4]. W innych analizach również zauważono odmienny skład i stopień aktywności biologicznej propolisu. W związku z tym dokładniej zbadano działanie przeciwdrobnoustrojowe kitu pochodzącego z różnych regionów geograficznych. Efektem przeprowadzonych doświadczeń było stwierdzanie, że wszystkie próbki wykazują zbliżony stopień aktywności, podobnie jak w moich badaniach. Różnice dostrzeżone w działaniu terapeutycznym mogą być wytłumaczone różną procentową zawartością wosku i zanieczyszczeń znajdujących się w tych próbkach [7]. Wysoką aktywność biologiczną propolisu potwierdzono w licznych badaniach prowadzonych przez autorów z różnych regionów geograficznych. Wysoką aktywność grzybobójczą (MFC w zakresie μg/ml) wykazywały także preparaty kitu pszczelego pozyskiwane z argentyńskich pasiek [3]. Potencjalną przydatność propolisu z Portugalii w leczeniu infekcji grzybiczych wywoływanych przez Candida albicans, Trichophyton rubrum oraz Aspergillus fumigatus wykazano w pracy zespołu doktora Falcao [2]. Badania właściwości przeciwdrobnoustrojowych propolisu badano także w polskich ośrodkach naukowych. W Katedrze Technologii Leków i Biochemii Wydziału Chemicznego Politechniki Gdańskiej wykazano znaczną wrażliwość klinicznych izolatów Candida albicans, Candida glabrata i Candida krusei w stosunku do czterech preparatów kitu pszczelego pochodzących z pasiek z południa Polski (okolice Wrocławia) [6]. Z kolei doktor Wojtyczka i współpracownicy wykazali dużą skuteczność działania propolisu pozyskiwanego z pasieki zlokalizowanej w miejscowości Kamianna (Polska południowa okolice Nowego Sącza)

7 w stosunku do bakterii Staphylococcus [8]. Z przeprowadzonych przeze mnie badań można wywnioskować, że również rasa pszczoły nie ma znaczenia na skuteczność wytwarzanego przez nią propolisu, gdyż najaktywniejsze próbki są wytworzone przez różne rasy pszczół (Tab.1.). Z pewnością dość duże znaczenie ma czas przechowywania propolisu [1]. Najistotniejsze w składzie chemicznym kitu są flawonidy, które w pewnym stopniu decydują o jego aktywności. Średnia zawartość tych związków wynosi około 8% [4]. W miarę upływu czasu te substancje ulatniają się i preparat traci swoje właściwości. Najaktywniejsze preparaty propolisu zostały pobrane świeżo po wytworzeniu go przez pszczoły (Tab.1.). Liczne dane zawarte w literaturze świadczą, że wiele preparatów leczniczych w trakcie przechowywania traci częściowo lub całkowicie właściwości lecznicze. Dotyczy to także propolisu. Profesor Kiwalkina badała propolis zbierany przez dziesięć lat w tym samym okresie i udowodniła, że w odpowiednich warunkach jego aktywność przeciwbakteryjna zachowuje się dość długo [7]. Ekstrakty propolisu nie tylko hamują wzrost grzybów, ale wykazują znaczącą aktywność grzybobójczą. Inkubacja drożdży wraz z dodatkiem 1% obj. ekstraktu propolisu powoduje śmierć wszystkich komórek już w ciągu jednej godziny (Zdj.4.). Przeprowadzone przeze mnie badania jaki i dane literaturowe jednoznacznie potwierdzają przydatność propolisu w zwalczaniu chorób infekcyjnych wywołanych przez grzyby. Bibliografia 1. Cizmarik J. and Matel I. (1970) Examination of the chemical composition of propolis. Isolation and identification of the 3,4-dihydroxycinnamic acid (caffeic acid) from propolis. Experientia,. 2. Falcão SI, Vale N, Cos P, Gomes P, Freire C, Maes L, Vilas-Boas M. (2014) In vitro evaluation of Portuguese propolis and floral sources for antiprotozoal, antibacterial and antifungal activity. Phytother Res. 28(3): Isla MI, Dantur Y, Salas A, Danert C, Zampini C, Arias M, Ordóñez R, Maldonado L, Bedascarrasbure E, Nieva Moreno MI. (2012) Effect of seasonality on chemical composition and antibacterial and anticandida activities of Argentine propolis. Design of a topical formulation. Nat Prod Commun. 7(10): Kędzia B, Hołęderna-Kędzia E. (2009) Propolis w leczeniu chorób skóry. Toruń, Humana Divinis, ISBN Kędzia B. Skład chemiczny i aktywność biologiczna propolisu pochodzącego z różnych rejonów świata, Borgis - Postępy Fitoterapii 1/ Szweda P, Gucwa K, Kurzyk E, Romanowska E, Dzierżanowska-Fangrat K, Zielińska Jurek A, Kuś PM, Milewski S. (2015) Essential Oils, Silver Nanoparticles and Propolis as Alternative Agents Against Fluconazole Resistant Candida albicans, Candida glabrata and Candida krusei Clinical Isolates. Indian J Microbiol. 55(2): Tichonov AI, Jarnych TG, Czernych WP, Zypaniec IA, Tichonova SA. (2007) Teoria i praktyka wytwarzania leczniczych preparatów propolisowych. Apipol-Farma, ISBN Wojtyczka RD, Dziedzic A, Idzik D, Kępa M, Kubina R, Kabała-Dzik A, Smoleń-Dzirba J, Stojko J, Sajewicz M, Wąsik TJ. (2013) Susceptibility of Staphylococcus aureus clinical isolates to propolis extract alone or in combination with antimicrobial drugs. Molecules. 12;18(8):