Białko chimeryczne, sekwencja, konstrukt, komórka roślinna, sposób otrzymywania białka chimerycznego, transgenicznej rośliny, transgeniczna roślina

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (51) Int.Cl. C12N 15/82 ( ) A61K 39/00 ( ) A01H 5/00 ( ) C07K 16/18 ( ) C07K 14/435 ( ) C12N 15/12 ( ) (54) Białko chimeryczne, sekwencja, konstrukt, komórka roślinna, sposób otrzymywania białka chimerycznego, transgenicznej rośliny, transgeniczna roślina (73) Uprawniony z patentu: Instytut Chemii Bioorganicznej PAN, Poznań,PL Instytut Biotechnologii i Antybiotyków, Warszawa,PL Instytut Parazytologii im. Witolda Stefańskiego PAN, Warszawa,PL (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 12/04 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 04/09 (72) Twórca(y) wynalazku: Andrzej B. Legocki,Poznań,PL Katarzyna Miedzińska,Rawicz,PL Magdalena Czaplińska,Łęczyca,PL Anna Modelska,Poznań,PL Tomasz Pniewski,Poznań,PL Andrzej Płucienniczak,Warszawa,PL Małgorzata Kęsik,Warszawa,PL Anna Porębska,Warszawa,PL Halina Wędrychowicz,Warszawa,PL Juliusz Mieszczanek,Warszawa,PL Luiza Jedlina-Panasiuk,Warszawa,PL (74) Pełnomocnik: Aleksandra Twardowska, Jan Wierzchoń & Partnerzy (57) Przedmiotami wynalazku są białko chimeryczne, sekwencja, konstrukt, komórka roślinna, sposób otrzymywania białka chimerycznego, transgenicznej rośliny, transgeniczna roślina. Ogólnie wynalazek dotyczy sposobu wywoływania odpowiedzi immunologicznej, obejmującego podawanie szczepionki przez układ pokarmowy. Przedmioty wynalazku służą do otrzymywania szczepionek doustnych przeciwko motylicy wątrobowej. PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotami wynalazku są białko chimeryczne, sekwencja, konstrukt, komórka roślinna, sposób otrzymywania białka chimerycznego, transgenicznej rośliny, transgeniczna roślina. Ogólnie wynalazek dotyczy sposobu wywoływania odpowiedzi immunologicznej, obejmującego podawanie szczepionki przez układ pokarmowy. Przedmioty wynalazku służą do otrzymywania szczepionek doustnych przeciwko motylicy wątrobowej. Motylica wątrobowa (Fasciola hepatica) jest pasożytem wewnętrznym bydła. Zaliczana jest do przywr digenicznych, co oznacza, że w cyklu życiowym wyróżnia się kilka stadiów rozwojowych, zachodzących z udziałem żywiciela pośredniego - ślimaka błotniarki moczarowej. Zwierzę zostaje zaatakowane po spożyciu roślin, na których znajdują się otorbione formy inwazyjne motylicy - metacerkarie. W przewodzie pokarmowym kręgowców otoczka metacerkarii ulega rozpuszczeniu, a młodociana postać poprzez jamę otrzewnową wędruje do wątroby i przedzierając się przez miąższ tego narządu dociera do przewodów żółciowych, gdzie stopniowo osiąga dojrzałość płciową. Choroba wywołana przez motylicę wątrobową, zwana chorobą motyliczą lub fascjolozą, powoduje chudnięcie zwierząt, spadek wydajności w produkcji mleka, obniżenie płodności a także może prowadzić do śmierci zwierzęcia (Kadłubowski i wsp. 1999). Jest to więc choroba o ogromnym znaczeniu gospodarczym, powodująca olbrzymie straty ekonomiczne. Ponadto odnotowuje się coraz więcej przypadków zachorowań wśród ludzi - szczególnie w krajach rozwijających się, gdzie przypuszcza się, że zakażony może być co trzeci mieszkaniec, a cięższe przypadki zakażeń motylicą wątrobową mogą zakończyć się śmiercią. Motylicą wątrobowa uważana jest za jeden z najistotniejszych weterynaryjnych problemów pasożytniczych na świecie, równocześnie to właśnie szczepienia ochronne stają się najbardziej efektywną i opłacalną interwencją medyczną. O ich skuteczności decyduje nie tylko ich zdolność immunizacyjna, ale także dostępność, na którą wpływa głównie cena. Obecne badania skupiają się również na obniżeniu kosztów uzyskania szczepionek. Leczenie polega na stosowaniu środków przeciwmotyliczych, a zapobieganie - na zwalczaniu ślimaka, pośredniego żywiciela pasożyta oraz na osuszaniu łąk i pastwisk. Jak do tej pory nie ma skutecznej szczepionki, chociaż podejmowanych jest wiele prób mających na celu znalezienie odpowiedniego antygenu motylicy, który wywołałby wysoką odpowiedź immunologiczną. Do tej pory jako szczepionki wykorzystywano antygeny pochodzące z motylicy (Wędrychowicz i Klockiewicz, Acta Parasitologica 1994, 39:173). Wędrówka przywry wewnątrz tkanek żywiciela ostatecznego możliwa jest dzięki wydzielanym enzymom proteolitycznym, w tym proteinaz cysternowych. (Piacenza L. i wsp. Parasitol Int., 1998, 47S:266), które rozpuszczają białka substancji międzykomórkowej - najpierw ścian przewodu pokarmowego, później przewodów żółciowych i wątroby. Jest on więc czynnikiem kluczowym, który pozwala na rozwój pasożyta, a także pierwszym elementem kontaktu pasożyt - żywiciel. Enzymy proteolityczne odgrywają bardzo ważną rolę w cyklu życiowym wszystkich pasożytów, gdyż umożliwiają inwazję komórek i tkanek gospodarza - degradują elementy układu immunologicznego, hydrolizują białka żywiciela na własne potrzeby żywieniowe. W wyniku ewolucji enzymy stały się bardziej specyficzne co wpłynęło na sukces adaptacyjny pasożytów. Proteinaza cysteinowa należy do grupy białek zwanych katepsynami L (cahtepsin like protein). Znane są dwie niejednorodne formy tych enzymów L1 i L2 (27 kda i 29,5 kda). cdna proteinazy cysteinowej zostało zastosowane jako szczepionka przeciwmotylicza z zakończoną sukcesem immunizacją szczurów (Kofta i wsp., Vaccine 2000, 18:2985). Jeszcze kilkanaście lat temu uważano, że enzymy proteolityczne wydzielane przez komórki gastrodermalne motylicy wątrobowej zaangażowane są tylko do ułatwienia penetracji tkanki gospodarza i przyswajania składników odżywczych. Obecnie wiadomo, że katepsyny L mogą ciąć przeciwciała w regionie zawiasowym i chronić pasożyta przed atakiem immunologicznym. Ponadto mają zdolność fragmentacji fibrynogenu tak, że tworzy on skrzepy otaczające wędrującą w organizmie żywiciela przywrę i przez to osłabiają skuteczność odpowiedzi immunologicznej, hamując dostęp makrofagów. Jedna z katepsyn jest też obecna u dorosłych przywr w gruczołach Melisa, gdzie uczestniczy w wytwarzaniu jaj. Oznacza to więc, że enzym ten jest wydzielany na każdym etapie życia pasożyta. Transgeneza umożliwiła wykorzystanie organizmów zwierzęcych i roślinnych jako swoistych bioreaktorów. Otrzymywane tą drogą organizmy transgeniczne produkują białka antygenowe, które wprowadzają system immunologiczny w stan gotowości przed inwazją patogenów (Charon i wsp., Genetyka zwierząt, PWN, Warszawa, 2000). W szczepionkach tego typu materiał szczepionkowy

3 PL B1 3 stanowią pojedyncze antygeny - białka wirusowe, bakteryjne bądź pasożytnicze. Stymulacja układu immunologicznego jest możliwa, gdy białko zachowuje niezmienioną, natywną strukturę, co oznacza, że czynniki chorobotwórcze organizmów wyższych wymagają zwykle eukariotycznego systemu ekspresji. Dlatego też produkcja takich białek w drożdżach, czy też bakteriach, pomimo że tańsza i bardziej wydajna, ze względu na brak możliwości odpowiedniej modyfikacji białek często okazuje się nieskuteczna. Opis patentowy US (opublikowany ) opisuje rozwiązanie dotyczące roślin wytwarzających peptydy lityczne. Poza opisem US rozwiązanie dotyczące stabilizującego połączenia polipeptydów z peptydem litycznym ubikwityny oraz sposobu wytwarzania poprzez subklonowanie kwasu nukleinowego kodującego sekwencje peptydów litycznych do wektora plazmidu zawierającego promotor i sekwencję kodującą polipeptyd ubikwitynę, w którym sekwencja polipeptydu ubikwityny jest połączona z 5' końcem sekwencji kwasu nukleinowego peptydu litycznego ulegającego translacji jako polipeptyd fuzyjny przedstawione jest także w opisach patentowych US (opublikowany ) oraz US (opublikowany ) i US (opublikowanym ). Przy czym opisy US i US opisują ponadto rozwiązania dotyczące konstruktów genowych połączenia peptydu litycznego ubikwityny, produktów białkowych z nich otrzymywanych oraz ich wytwarzania i zastosowania. Opis patentowy US (opublikowany ) opisuje rozwiązanie dotyczące nowych związków zawierających element rozpoznania ubikwityny oraz białkowy czynnik wiążący. Wynalazek dotyczy także zastosowania tych związków w celu zmodulowania poziomu i/lub aktywności białka docelowego. Związki te są przydatne w zastosowaniu przeciwko infekcjom, stanach zapalnych, nowotworach i chorobach genetycznych, a także jako herbicydy i insektycydy. Opis patentowy US (opublikowany ) opisuje wynalazek dotyczący ekspresji ubikwityny. Rozwiązanie przedstawia system przyłączenia ubikwityny, umożliwiający możliwy do regulowania wysoki poziom wytwarzania heterologicznych białek posiadających destabilizujące reszty aminokwasowe w pozycji terminalnej. Białka fuzyjne ubikwityny ulegające ekspresji w drożdżach są cięte precyzyjnie in vivo przez hydrolazy endogeniczne specyficzne dla ubikwityny do heterologicznych białek drożdży takich jak ludzka alfa-1-antytrypsyna, ludzki gamma-interferon i ludzkie białko wirusa HIV, wszystkich które inicjują z resztami destabilizującymi. Wektor ekspresji zawierający syntetyczny gen monomerycznej ubikwityny drożdży został skonstruowany i ulegał ekspresji pod kontrolą drożdżowego promotora regulatorowego dla glukozy. System ten może być zastosowany do podwyższenia poziomu ekspresji w przypadku białek wykazujących niski poziom ekspresji oraz do wytwarzania białek posiadających destabilizujące reszty aminokwasowe w pozycji terminalnej. W opisach patentowych US (opublikowanym ) oraz US (opublikowanym ) przedstawiony jest sposób tworzenia lub modyfikowania struktury białka na poziomie białka bądź genu w celu wytwarzania specyficznych amino-końców in vivo lub in vitro. Sposoby te opierają się na nienaturalnym wprowadzeniu połączenia białko-ubikwityna oraz stwierdzeniu, że czas pół-rozpadu białka in vivo jest funkcją N-końcowego aminokwasu białka. Opis patentowy US (opublikowany ) opisuje sposób wytwarzania syntetycznych produktów białkowych zawierających do około czterdziestu reszt aminokwasowych powiększonych o ubikwitynę na końcu karboksylowym ulegających ekspresji w komórkach prokariotycznych takich jak E.coli. Proces ten można zastosować do wytwarzania peptydów zawierających od 2 do ok. 40 reszt aminokwasowych i jest w szczególności dostosowany do produkcji peptydów zawierających od 5 do 40 reszt aminokwasowych. Opis patentowy US (opublikowany ) dotyczy klasy generycznej ubikwitynospecyficznych proteaz, które specyficznie rozcinają grupy przy grupie C-końcowej reszty ubikwityny w białku fuzyjnym ubikwityny, niezależnie od jego wielkości. Dokładniej wynalazek dotyczy proteaz ubikwityno-specyficznych z klasy wyizolowanej z komórki oraz wyizolowanych sekwencji DNA kodujących białka tej klasy. Próby wytworzenia antygenów dla celów szczepionkowych przeprowadzane w hodowlach komórkowych ssaków lub owadów związane były z bardzo dużymi kosztami, koniecznością ciągłej kontroli procesu syntezy i precyzyjnego oczyszczania preparatów szczepionkowych tak by nie stanowiły potencjalnego źródła czynników wywołujących odczyny alergiczne bądź wystąpienia reakcji autoimmunologicznych. Bioreaktory roślinne są znacznie tańsze i bezpieczniejsze. Białka powstające w komórce roślinnej na bazie egzogennego DNA mają identyczny skład aminokwasów, ulegają podobnym modyfikacjom

4 4 PL B1 oraz uzyskują analogiczne właściwości do tych pojawiających się w procesie patogenezy w organizmie gospodarza. Rośliny transgeniczne we wszystkich komórkach zawierają fragment obcego DNA, kodujący odpowiedni antygen i produkują określone białko antygenowe. Wprowadzony obcy gen jest przekazywany potomstwu. Rośliny zmodyfikowane mogą być spożywane w stanie surowym, dzięki czemu pominięte zostają koszty związane z oczyszczaniem antygenu. Doustna droga immunizacji wydaje się najdogodniejsza ze względu na nieinwazyjny i bezbolesny sposób podania, wysoką efektywność ogólnoustrojowej odpowiedzi (McGhee J.R., Lamm M.E., Strober W. 1999, w: Mucosal Immunology (Ogra P.L., Lamm M.E., Bienenstock J., Mestecky J., Strober W., McGhee J.R., red.), str , Academic Press). Opisy patentowe: US (opublikowany ), US (opublikowany ) opisują kompozycje farmaceutyczne zawierające kwasy nukleinowe, białka, przeciwciała i inhibitory oraz ich zastosowanie do ochrony zwierząt przed chorobami spowodowanymi pasożytami układu pokarmowego. Opis patentowy US (opublikowany ) opisuje rozwiązanie dotyczące sekwencji nukleotydowych kodujących enzymy aminopeptydazy pasożytów układu pokarmowego, ich antygeny oraz ekwiwalenty funkcjonalne i zastosowanie ich jako szczepionki przeciwko tym pasożytom. W opisie patentowym US (opublikowanym ) przedstawiona jest szczepionka przeciwko pasożytom układu pokarmowego, zawierająca proteazę serynową otrzymaną z motylicy wątrobowej. Opisy patentowe US (opublikowany ), US (opublikowany ), US (opublikowany ), US (opublikowany ), US (opublikowany ) oraz US (opublikowany ) opisują sposoby otrzymywania białek proteinazy cysteinowej, przeciwciał, związków inhibujących aktywność proteinazy cysteinowej nicieni, a także ich zastosowanie jako kompozycji farmaceutycznych do ochrony zwierząt przed chorobami wywoływanymi przez pasożyty układu pokarmowego, wyizolowane rekombinowane komórki wykazują ekspresję. W opisie US kompozycja zawierająca poszczególne, wyizolowane cząsteczki kwasu nukleinowego stanowi szczepionkę rekombinowanego wirusa. Opis patentowy US (opublikowany ) opisuje sposób zwalczania pasożytów układu pokarmowego w zwierzętach będących żywicielami ostatecznymi, polegający na dostarczeniu doustnie zwierzęciu białka antyparazytologicznego, w formie lekarstwa bądź pożywienia, tak by białko to trafiło do pasożyta. Białko antyparazytologiczne może być inhibitorem enzymu pasożyta, na przykład inhibitorem enzymu trawiennego takiego jak inhibitor proteinazy cysteinowej. Zgodnie z tym rozwiązaniem białko antyparazytologiczne jest białkiem ulegającym ekspresji w transgenicznej kukurydzy i ryżu, stanowiących paszę dla zwierząt. Pomimo opisanych powyżej wstępnych badań poświęconych dostarczeniu szczepionki przeciwko motylicy wątrobowej istnieje ciągła potrzeba uzyskania skutecznych narzędzi pozwalających na łatwe uzyskiwanie skutecznych szczepionek uodparniających przed tym pasożytem. Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie środków, które mogłyby być wykorzystane do otrzymywania szczepionki przeciwko motylicy wątrobowej. Szczególnym celem wynalazku jest dostarczenie białek chimerycznych, które zawierałyby wybrane antygeny pochodzące z proteinazy cysteinowej izolowanej z Fasciola hepatitca i mogłyby być wykorzystane do szczepień przeciwko motylicy wątrobowej, a także narzędzi pozwalających na ich ekspresję, zwłaszcza w układach roślinnych. Szczególnym celem wynalazku jest dostarczenie środków pozwalających otrzymać transgeniczną roślinę, która mogłaby być zastosowana do produkowania jadalnych szczepionek przeciwko motylicy wątrobowej. Nieoczekiwanie realizacja tak określonego celu i rozwiązanie opisanych w stanie techniki problemów związanych z białkami powstającymi w komórkach na bazie egzogennego DNA zostały osiągnięte w niniejszym wynalazku. Przedmiotem wynalazku jest białko chimeryczne charakteryzujące się tym, że zawiera sekwencję aminokwasową pochodzącą z sekwencji proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją aminokwasową wybraną spośród sekwencji białka rdzeniowego HBc (hepatitis B core) albo sekwencji ubikwityny. Korzystnie, białko według wynalazku zawiera jedną z następujących sekwencji: sekwencję domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją białka rdzeniowego HBc, albo sekwencję domeny liderowej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją białka rdzeniowego HBc, albo sekwencję domeny kata-

5 PL B1 5 litycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją białka rdzeniowego HBc oraz resztami glicynowymi, tworzącymi strukturę mostka glicynowego albo sekwencję domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją ubikwityny. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sekwencja kodująca białko chimeryczne, charakteryzująca się tym, że zawiera sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową pochodzącą z sekwencji proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową wybraną spośród sekwencji białka rdzeniowego HBc albo sekwencji ubikwityny. Korzystnie sekwencja według wynalazku zawiera jedną z następujących sekwencji: sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc, albo sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową domeny liderowej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc, albo sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc oraz reszty glicynowe, albo sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją nukleotydową kodującą ubikwitynę. Szczególnie korzystne sekwencje zostały przedstawione na fig. 1 - fig. 14. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest konstrukt zawierający sekwencję kodującą białko chimeryczne, charakteryzujący się tym, że jako sekwencję kodującą białko chimeryczne zawiera zdefiniowaną powyżej sekwencję kodującą białko chimeryczne według wynalazku. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest komórka roślinna charakteryzująca się tym, że zawiera konstrukt według wynalazku zdefiniowany powyżej. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania białka chimerycznego, charakteryzujący się tym, że obejmuje wprowadzenie wektora do komórek Agrobacterium tumefaciens metodą elektroporacji, transformację roślin szczepem bakteryjnym zawierającym ten wektor i ekspresję białka chimerycznego, przy czym wektor zawiera konstrukt według wynalazku zdefiniowany powyżej. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania transgenicznej rośliny, charakteryzujący się tym, że obejmuje wprowadzanie wektora do komórek Agrobacterium tumefaciens metodą elektroporacji, transformację roślin szczepem bakteryjnym zawierającym ten wektor, i regenerację roślin, przy czym wektor zawiera konstrukt według wynalazku zdefiniowany powyżej. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest transgeniczna roślina, charakteryzująca się tym, że posiada komórki transformowane konstruktem według wynalazku zdefiniowanym powyżej. Zgodnie z wynalazkiem sekwencję kodującą proteinazy podzielono na odcinki kodujące domenę katalityczną oraz liderową enzymu, gdyż wykorzystanie całej sekwencji kodującej proteinazy cysteinowej mogłoby powodować powstawanie w pełni aktywnego enzymu z zachowaniem jego aktywności hydrolitycznej, mogącej powodować zaburzenia rozwoju roślin transgenicznych. W szczególnej realizacji wynalazku fragmenty te połączono z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc (hepatitis B core) wirusa HBV. Takie chimeryczne geny umieszczono pod kontrolą promotora konstytutywnego 35S CaMV w wektorze binarnym ROK2 otrzymując pmkcrok2 i pmlcrok2. Dodatkowo wykonano wektory z wykorzystaniem sekwencji domeny katalitycznej, połączonej z białkiem rdzeniowym HBc oraz kilkoma resztami glicynowymi, a także podłączono sekwencję katalityczną do ubikwityny. Plazmidy te zostały wprowadzone do roślin z wykorzystaniem procedur pozwalających na ich integrację do genomu roślinnego. Załączone figury pozwalają na lepsze wyjaśnienie istoty wynalazku. Figura 1 przedstawia sekwencję kodującą białko hybrydowe rdzeniowa część HBV::liderową część proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej. Fragment włączono do wektora ROK2 w miejsca powstałe po trawieniu nukleazą restrykcyjną BamHI i SacI. Figura 2 przedstawia sekwencję kodującą białko hybrydowe rdzeniowa część HBV::część katalityczną proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej. Fragment włączono do wektora pigcmt7 w miejsca powstałe po trawieniu nukleazą restrykcyjną Ndel i Hindlll. Figura 3 przedstawia sekwencję kodującą część katalityczną proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej. Fragment włączono do wektora pigcmt7 w miejsca powstałe po trawieniu nukleazą restrykcyjną Ndel i Hindlll. Figura 4 przedstawia sekwencję kodującą część katalityczną proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej. Fragment włączono do wektora Bluescript SK(-) w miejsca powstałe po trawieniu nukleazą restrykcyjną BamHI i Hindlll.

6 6 PL B1 Figura 5 przedstawia sekwencję kodującą część katalityczną proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej. Fragment włączono do wektora Bluescript SK(-) w miejsca powstałe po trawieniu nukleazą restrykcyjną BamHI i Hindlll. Figura 6 przedstawia sekwencję kodującą białko hybrydowe rdzeniową część HBV::katalityczna część proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej. Fragment włączono do wektora ROK2 w miejsca powstałe po trawieniu nukleazą restrykcyjną BamHI i SacI. Figura 7 przedstawia sekwencję kodującą białko hybrydowe ubikwityna::katalityczna część proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej. Fragment włączono do wektora ROK2 w miejsca powstałe po trawieniu nukleazą restrykcyjną Xbal i BamHI. Figura 8 przedstawia sekwencję kodującą białko hybrydowe rdzeniowa część HBV::liderowa część proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej. Fragment włączono do wektora pigcmt7 w miejsca powstałe po trawieniu nukleazą restrykcyjną Ndel i Hindlll. Figura 9 przedstawia sekwencję kodującą część katalityczną proteazy cysternowej motylicy wątrobowej. Fragment włączono do wektora pigcmt7 w miejsca powstałe po trawieniu nukleazą restrykcyjną Ndel i Hindlll. Figura 10 przedstawia sekwencję kodującą białko hybrydowe rdzeniowa część HBV::katalityczna część proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej. Fragment włączono do wektora pigcmt7 w miejsca powstałe po trawieniu nukleazą restrykcyjną Ndel i Hindlll. Figura 11 przedstawia sekwencję kodującą białko hybrydowe rdzeniowa część HBV::katalityczna część proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej. Fragment włączono do wektora Bluescript SK (-) w miejsca powstałe po trawieniu nukleazą restrykcyjną EcoRI i Hindlll. Figura 12 przedstawia sekwencję kodującą białko hybrydowe ubikwityna::katalityczna część proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej. Fragment włączono do wektora Bluescript SK(-) w miejsca powstałe po trawieniu nukleazą restrykcyjną EcoRI i Xhol. Figura 13 przedstawia sekwencję kodującą białko hybrydowe rdzeniowa część HBV::liderowa część proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej. Fragment włączono do wektora ROK2 w miejsca powstałe po trawieniu nukleazą restrykcyjną BamHI i SacI. Figura 14 przedstawia sekwencję kodującą białko hybrydowe rdzeniowa część HBV::katalityczna część proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej. Fragment włączono do wektora ROK2 w miejsca powstałe po trawieniu nukleazą restrykcyjną BamHI i Asp718. Wklonowany Fragment zawiera na początku (do miejsca cięcia nukleazą restrykcyjną EcoRI) i na końcu (od miejsca cięcia nukleazą restrykcyjną Hindlll) sekwencję pochodzącą z wektora Bluescript SK (-). Figura 15 przedstawia analizę transformantów metodą PCR z zastosowaniem specyficznych starterów oligonukleotydowych. Potwierdzona jest obecność transgenów w wektorze: a - pmkcrok2, A. tumefaciens LBA4404pMKCROK2, b - pmlcrok2, A. tumefaciens LBA4404pMLCROK2, c - A.tumefaciens EHAlOSMOTUBIKatROK, d-a.tumefaciens EHAlOSMOTGlyKatROK; Figura 15a: 1-8. A.t LBA4404 pmkcrok2, 9. kontrola negatywna, 10. marker DNA 1 kpz (Sig ma), E.coli pmkcrok2, 18. kontrola pozytywna, pmkcrok2; Figura 15b: 1-5. A.t LBA4404 pmlcrok2, 6-8. E.coli pmlcrok2, 9. marker DNA 1 kpz (Sigma), 10 kontrola pozytywna pmlcrok2; Figura 15 c: 1=10. A.tumefaciens, EHA105MOTUBIKatROK, 11. kontrola pozytywna pmotu- BIKatROK, 12. marker DNA l kpz (Sigma); Figura 15 d: 1-10 A.tumefaciens EHA105MOTGlyKatROK, 11 kontrola pozytywna MOTGlyKatROK, 12. marker DNA 1 kpz (Sigma) Figura 16 przedstawia analizę PCR pod kątem obecności hybrydowej sekwencji MotKat - C lub MotLid - C. Użyto starterów MotLS i MotL3 specyficznej do sekwencji domeny liderowej oraz Mot5 i MotK3 dla sekwencji domeny katalitycznej; Figura 16a: sałata nietransformowana 1 - kontrola negatywna, 2 kontrola pozytywna pmkcrok, 3. woda - kontrola negatywna, 5. marker DNA 1 kpz (Sigma), próbki DNA z roślin transgenicznych; Figura 16 b: 1- marker DNA 1 kpz (Sigma), 2-12 próbki DNA z roślin transgenicznych; kontrola pozytywna pmlcrok; woda - kontrola negatywna Figura 17 przedstawia analizę PCR pokolenia T1 transformowanych roślin sałaty na obecność transgenów: a - MotKat -C, b - MotLid - C; Figura 17 a: genotyp A1, 15. kontrola pozytywna, 16. kontrola negatywna, 12. marker DNA 1 kpz,

7 PL B1 7 Figura 17b genotyp A1, genotyp A2, 22. kontrola pozytywna, 23. kontrola negatywna, 13,24. marker DNA 1 kpz. Figura 18 przedstawia hybrydyzację typu Western ekstraktu białkowego z liofilizatu sałaty transformowanej za pomocą wektora pmlcrok2, gdzie kolejne ścieżki oznaczają: 1. marker białkowy (Promega) 2. preparat białkowy liofilizatu kontrolnego, nietransformowanego 3. preparat białkowy liofilizatu kontrolnego, nietransformowanego z dodatkiem antygenu (100 ng) 4. kontrola pozytywna, oczyszczone białko hybrydowe zawierające fragment liderowy proteinazy cysternowej połączony z białkiem c wirusa HBV (100 ng) 5,6. preparat białkowy liofilizatu transgenicznego, zaznaczono produkt - białko antygenowe wielkości 28,8 kda. Figura 19 przedstawia hybrydyzację typu Western ekstraktu białkowego z liofilizatu sałaty transformowanej za pomocą wektora pmkcrok2, gdzie kolejne ścieżki oznaczają: 1. marker białkowy (Promega) 2. preparat białkowy liofilizatu kontrolnego, nietransformowanego 3. preparat białkowy rośliny kontrolnej, nietransformowanej z dodatkiem antygenu (100 ng) 4. kontrola pozytywna, oczyszczone białko hybrydowe zawierające fragment katalityczny proteinazy cysteinowej połączony z białkiem c wirusa HBV (100 ng) 5,6. preparat białkowy liofilizatu transgenicznego, zaznaczono produkt - białko antygenowe wielkości 43,2 kda Figura 20 przedstawia analizę immunoenzymatyczną metodą ELISA na potwierdzenie ekspresji antygenu w roślinach sałaty: a) kontrola roślin, do których wprowadzono sekwencje liderową proteinazy cysteinowej połączoną z białkiem c wirusa HBV, gdzie: c- - ekstrakt białkowy z sałaty nietransgenicznej - - ekstrakt białkowy sałaty nietransgenicznej z dodatkiem antygenu 0,5 ng, 1 ng, 2 ng, 3 ng, 8ng ekstrakt białkowy z sałaty transgenicznej zawierający fragment liderowy proteinazy - cysteinowej połączony z białkiem c wirusa HBV(100 ng) b) kontrola roślin, do których wprowadzono sekwencje katalityczną proteinazy cysteinowej połączoną z białkiem c wirusa HBV, gdzie: ekstrakt białkowy z sałaty transgenicznej zawierający fragment katalityczny proteinazy cysteinowej połączony z białkiem c wirusa HBV (100 ng) - ekstrakt białkowy sałaty nietransgenicznej Figura 21 przedstawia analizę immunoenzymatyczną metodą ELISA na potwierdzenie ekspresji antygenu w liofilizacie sałaty: a) analiza liofilizatu zawierającego sekwencję domeny liderowej proteinazy cysteinowej połączonej z białkiem c wirusa HBV, gdzie: - liofilizat sałaty transgenicznej - liofilizat sałaty nietransgenicznej - liofilizat sałaty nietransgenicznej z dodatkiem antygenu 1,5 ng, 6 ng, 12 ng - II przeciwciało - kontrola negatywna, układ bez dodatku II przeciwciała poliklonalnego anty L5 b) analiza liofilizatu zawierającego sekwencję domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej połączonej z białkiem c wirusa HB V, gdzie: - liofilizat sałaty transgenicznej liofilizat sałaty nietransgenicznej liofilizat sałaty nietransgenicznej z dodatkiem antygenu 1,5 ng, 6 ng, 12 ng II przeciwciało - kontrola negatywna, układ bez dodatku II przeciwciała poliklonalnego anty K4 Figura 22 przedstawia bakteryjny plazmid ekspresyjny pigcmt7 (4056 pz.), który powstał w oparciu o plazmid pigdm1, który jest plazmidem z grupy Co1E1 Enterobacter agglomerans. Plazmid pigcmt7 powstał przez dostawienie genu oporności na chloramfenikol, polilinkera wraz z promotorem RNA polimerazy z faga T7 oraz sekwencją kodującą kodon stop transkrypcji pochodzącą z faga T7, przy czym:

8 8 PL B1 ARG t-rna - gen argininowy trna dla kodonów AGA i AGG ORI - origin replikacji plazmidu ppigdm1 Cm-R - gen oporności na chloramfenikol T7 - promotor stop - terminacja transkrypcji. Figura 23 przedstawia roślinny plazmid ekspresyjny ROK2, gdzie: RB - prawa sekwencja flankowa LB - lewa sekwencja flankowa pnos - promotor Nos NPT II (Kanamycyna R) - gen oporności na kanamycynę tnos - terminator Nos pcamy 35S - promotor wirusa mozaiki kalafiora Poniżej zaprezentowano przykładowe realizacje zdefiniowanego powyżej wynalazku. P r z y k ł a d 1. Konstrukcja wektorów do transformacji roślin Pierwszy wariant dotyczył konstrukcji wektora pmkc35srok zawierającego sekwencję domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej połączonej z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc (hepatitis B core) wirusa HBV. Drugi wariant doświadczenia dotyczył konstrukcji wektora pmlc35srok zawierającego sekwencję domeny liderowej proteinazy cysteinowej połączonej z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc (hepatitis B core) wirusa HBV. Trzeci wariant dotyczy konstrukcji wektora p35smotkatubirok zawierającego sekwencję domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej połączonej z sekwencją kodującą ubikwitynę. Czwarty wariant dotyczył konstrukcji wektora p35smotglykatrok zawierającego sekwencję domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej połączonej z sekwencją kodującą ubikwitynę oraz resztami glicynowymi. Bakterie zawieszone w glicerolu i przechowywane w ultrazamrażarce (temperatura -70 C) rozmrażano w łaźni lodowej. Do rozmrożonych bakterii dodawano 1-20 ng DNA plazmidowego, lekko mieszano i inkubowano w lodzie 2-6 min. Bakterie przenoszono do schłodzonej kuwety do elektroporacji. Kuwetę umieszczano w aparacie do elektroporacji i włączano łuk elektryczny. Parametry elektroporacji wynosiły 25 μf i 2500 V. Po elektroporacji zawieszano bakterie w 1 ml pożywki SOC i przenoszono odpowiednio do kolbki. Bakterie wytrząsano przez 1-2 godz. w 28 C, rpm. Zawiesinę bakterii wysiewano na pożywki YEB z antybiotykami w stężeniu rifampicyna 100 mg/l i kanamycyna 50 mg/l i hodowano 2 dni w 28 C. Wstępną selekcję transformowanych komórek, przeprowadzano na podłożu z dodatkiem czynników selekcyjnych w stężeniu rifampicyna 100 mg/l i kanamycyna 50 mg/l. Drugą metodą była wizualizacja odcinka wprowadzonego DNA poprzez namnożenie go metodą PCR (na zagotowanych komórkach A. tumefaciens przez 10 min w 150 μl wody) z zastosowaniem specyficznych starterów oligonukleotydowych. Wyrosłe agrobakterie posiewano na 10 ml płynnego podłoża YEB z antybiotykami w stężeniu rifampicyna 100 mg/l i kanamycyna 50 mg/l w 100 ml kolbkach Erlenmayera i hodowano w temp. 28 C. Po godzinach hodowli zawiesiną agrobakterii inokulowano na świeżą pożywkę YEB z antybiotykami w stężeniu rifampicyna 100 mg/l i kanamycyna 50 mg/l w stosunku 1:100 i prowadzono dalej hodowlę w temp. 28 C do osiągnięcia przez bakterie logarytmicznej fazy wzrostu. Fazę wzrostu bakterii oceniano na podstawie pomiaru OD zawiesiny przy długości fali 600 nm. P r z y k ł a d 2. Transformacja i otrzymywanie roślin transgenicznych T a b e l a 1 Warianty przeprowadzonych doświadczeń Wariant doświadczenia Szczep Agrobacterium Odmiana sałaty LT-12 A.tumefaciens LBA4404 pmkc35srok Syrena LT-13 A.tumefaciens LBA4404 pmlc35srok Bipp Burple LT-14 A.tumefaciens EHA105MOTUBIROK Aramir LT-16 A.tumefaciens EHA105SMOTGlyKatROK Aramir

9 PL B1 9 Nasiona pobierano do kolby i przez 2 min płukano w 70% etanolu. Następnie zbierano etanol a nasiona przepłukiwano sterylną wodą. Później inkubowano przez 20 min w 25% roztworze komercyjnego wybielacza Clorox z dodatkiem detergentu Tween 20 (stężenie 0,01%). Następnie materiał przemywano 4-5 razy po 2-3 minuty sterylną wodą destylowaną, aż do całkowitego wypłukania Clorox'u. Wysterylizowane nasiona sałaty wykładano na szalki z 0,8% agarem. Nasiona kiełkowały w temp C, w warunkach słabego oświetlenia. Po upływie 2-3 dni odcinano liścienie, umieszczano w zawiesinie A. tumefaciens i inkubowano przez 10 min, lekko mieszając. Po inokulacji liścienie wykładano stroną brzuszną na pożywkę LR3A. Kokulturę prowadzono przez 2-4 dni, w ciemności, w temp. 28 C. Po zakończeniu kokultury liścienie przenoszono na pożywkę selekcyjną LR3A z antybiotykami w stężeniu kanamycyna 200 mg/l i augmentyna 300 mg/l. Liścienie, na których powstawał kalus, co 5 dni przeszczepiano na świeżą pożywkę LR3A z antybiotykami w stężeniu kanamycyna 200 mg/l i augmentyna 300 mg/l. Regenerujące rośliny odcinano od kalusa i przeszczepiano na pożywkę LR2A z antybiotykami w stężeniu kanamycyna 200 mg/l i augmentyna 300 mg/l. Gdy rośliny osiągały rozmiar około 2-3 cm, przenoszono je do słoików zawierających pożywkę 1/2SH z antybiotykami w stężeniu kanamycyna 200 mg/l i augmentyna 300 mg/l. Ukorzenione rośliny wysadzano do doniczek zawierających piasek zmieszany z perlitem w stosunku 1 : 1 i adaptowano do warunków in vivo. Zebrane z pierwotnych transformantów nasiona sterylizowano i wykładano na szalki Petriego zawierające 0,8% agar z dodatkiem antybiotyków w stężeniu kanamycyna 200 mg/l i augmentyna 300 mg/l. Nasiona kiełkowały przez 1-2 dni w temperaturze 28 C w ciemności. Rozwijające się z nasion siewki przenoszono do doniczek oraz warunków in vivo. Regeneracja roślin T a b e l a 2 Warunki regeneracji roślin Hodowla roślin w warunkach in vitro w pokoju hodowlanym - temperatura C - fotoperiod 16/8 - natężenie światła fluorescencyjnego ok luksów Hodowla roślin w warunkach in vivo w szklarni - temperatura C w dzień, C w nocy - fotoperiod 14/10 (14 h światła i 10 h ciemności) w okresie jesienno-zimowym oraz oświetlenie naturalne wiosną i latem. - nawożenie: azofoska P r z y k ł a d 3. Ekspresja i analiza. Analiza transformowanych bakterii Wstępną selekcję transformantów przeprowadzono na podłożu z dodatkiem czynnika selekcyjnego, na którego oporność zawierał wprowadzany fragment DNA (rifampicyna 100 mg/ml, kanamycyna 50 mg/ml). Kolejnym etapem była analiza transformantów metodą PCR z zastosowaniem specyficznych starterów oligonukleotydowych. T a b e l a 3 Startery oligonukleotydowe używane do reakcji PCR oraz do sekwencjonowania gen starter Sekwencja startera t przyłączenia, C Wielkość produktu, pz MotLidC MOTL5 MOTL3 GGA TCC ATA TGT CGA ATG ATG ATT TG ATA CGA TTG TTC GTC TCA TAC GGG A MotKatC MOT5 MOTK3 TGA CTG GCG TGA ATC TGG TTA TG TTC CAC ACA TGT TAC CTC GAT TCC MotKatGly MOTGlyS MOTGly3 GAA TTT GGA GCT ACT GTG GAG AGC TTA AAC AAC AGT AGT TCCG MotKatUbi UBIROCK MOTKATRO GGG GTC TAG ACC ATG CAG ATT TTC GTC AAA ACT TTG GGG GAT CCT TAA TGG ATG CCG GAA ATC GTG CC

10 10 PL B1 Potwierdzenie obecności transgenów w wektorze: a - pmkcrok2, A. tumefaciens LBA4404pMKCROK2, b - pmlcrok2, A. tumefaciens LBA4404pMLCROK2, c - A. tumefaciens EHA105MOTUBIKatROK, d - A. tumefaciens EHA105MOTGlyKatROK przedstawiono na fig. 15. Analiza mieszańców pokolenia T0 metodą PCR. Uzyskane rośliny transgeniczne sprawdzono pod kątem obecności hybrydowej sekwencji Mot- Kat - C lub MotLid - C za pomocą metody PCR. Użyto starterów MotLS i MotLS specyficznej do sekwencji domeny liderowej oraz Mot5 i MotK3 dla sekwencji domeny katalitycznej. Rośliny z transformacji LT14 i LT16 znajduje się w fazie regeneracji w warunkach in vitro na pożywce ½SH lub w multi-platach w warunkach in vivo. Sprawdzenie transformowanych roślin sałaty na obecność transgenów: a- MotKat -C, b - MotLid - C przedstawiono na fig. 16. Kolejnym etapem było wyprowadzenie jednorodnego pod względem genetycznym pokolenia transformantów T1. Wybrano po dziesięć nasion z pięciu linii transformantów F0 a następnie przeanalizowano rośliny metodą PCR na obecność sekwencji wprowadzonych genów. Sprawdzenie pokolenia T1transformowanych roślin sałaty na obecność transgenów: a-motkat -C, b - MotLid - C przedstawiono na fig. 17. Analiza uzyskanych transformantów T1 metodami immunologicznymi Wykorzystanie metod immunologicznych pozwala nam na wykrycie poziomu ekspresji białka. Do chwili obecnej nie dysponujemy przeciwciałami monoklonalnymi anty- MotKat i anty- MotLid. Mamy natomiast przeciwciała poliklonalne. Białko hybrydowe można więc wykryć wykorzystując przeciwciała monoklonalne anty - C, które posiadamy w pracowni oraz przeciwciała poliklonalne anty - MotKat i anty - MotLid w kanapkowym teście ELISA. Z roślin, które w teście ELISA dały najwyższy sygnał wyizolowano białko do hybrydyzacji typu Western Blot. Uzyskano pozytywny wynik, wskazujący na obecność białka w roślinach [fig. 18, 19]. Analiza typu Western nie jest metodą pozwalającą na dokładne oszacowanie ilości białka. Ponadto, jak widać na żelach, białko może ulegać fragmentacji, bądź też agregacji- stąd w kontroli pozytywnej nie uzyskujemy jednego, wyraźnego prążka. Musimy również pamiętać, że białko wprowadzone do rośliny jest białkiem chimerycznym, które oprócz domeny motyliczej zawiera białko wirusowe. Białko to ma zdolność tworzenia struktur, przypominających wirusowy kapsyd. Stad, mimo iż Western przebiega w warunkach denaturujących, część domen pozostaje złączona, dając na żelu dodatkowe sygnały w postaci większej ilości prążków. Dla dokładnego określenia zawartości antygenu w materiale roślinnym, posługiwano się opracowanym testem ELISA. Przebadano wszystkie rośliny pokolenia T1 (transformanty T1) testem ELISA na obecność białek hybrydowych celem wyselekcjonowania roślin, w których zachodzi najwyższa ekspresja. Tylko rośliny o najwyższej ekspresji antygenu były hodowane na masę zieloną [fig. 20]. Wynik testu ELISA wskazuje, że nie we wszystkich roślinach dochodzi do ekspresji białka, mimo iż ich transgeniczność została potwierdzona na poziomie DNA. Uzasadnionym wiec wydaje się sprawdzenie roślin testem immunologicznym zanim przystąpi się do gromadzenia materiału do liofilizacji. Dzięki temu możemy wyeliminować rośliny, które dają niski sygnał a przez to rozrzedzają" stężenie antygenu w liofilizacie. Liście roślin, które dały najwyższy sygnał w teście ELISA zbierano i liofilizowano, aby zagęścić materiał. Uzyskany materiał sprawdzono testem ELISA, aby oszacować ilość antygenu do dalszych doświadczeń [fig. 21]. Przeprowadzone analizy pokazują, że poprzez selekcję roślin udało nam się uzyskać wysoki poziom antygenu w liofilizacie. Dzięki opracowanemu testowi immunologicznemu, możliwe stało się określenie poziomu antygenu w liofilizatach i zaplanowanie doświadczenia z immunizacją zwierząt. Test ELISA wskazuje, że poziom antygenu wynosi około 10 μg w 1 g liofilizatu zawierającego domenę liderową genu proteinazy cysteinowej połączonej z białkiem c wirusa HBVoraz 12 μg antygenu w 1 g liofilizatu zawierającego domenę katalityczną genu proteinazy cysteinowej połączonej z białkiem c wirusa HBV. P r z y k ł a d 4. Immunizacji myszy za pomocą materiału transgenicznego. Grupy myszy: Do eksperymentu użyto 10 - tygodniowych samic myszy rasy Balb/C. Utworzono trzy grupy doświadczalne liczące po 6 myszy każda oraz jedną grupę składającą się z czterech myszy: A - grupa, której podawano liofilizat zawierający antygen - białko hybrydowe składające się z domeny liderowej genu proteinazy cysteinowej połączonej z białkiem c wirusa HBV

11 PL B1 11 B - grupa, której podawano liofilizat zawierający antygen - białko hybrydowe składające się z domeny katalitycznej genu proteinazy cysteinowej połączonej z białkiem c wirusa HBV C - grupa, której podawano liofilizat sałaty nietransgenicznej D - grupa, której podawano bufor PBS Materiał roślinny użyty do eksperymentu. Liofilizat z liści sałaty odmiany Bipp Burple i Syrena zawierający chimeryczne białko-fragment liderowy proteinazy cysternowej połączony z białkiem c wirusa HBV oraz fragment domeny katalitycznej połączony z białkiem c. Jako kontrolę stosowano liofilizat sałaty nietransgenicznej tej samej odmiany, co sałata transgeniczna. Droga immunizacji. Liofilizat podawano drogą pokarmową przy użyciu tubki gastrycznej. Schemat immunizacji: a) Grupy immunizowane A i B otrzymały liofilizat sałaty transgenicznej. Grupa kontrolna C otrzymała liofilizat sałaty nietransgenicznej. Grupa D otrzymała bufor PBS. Immunizacja dwukrotna w określonym odstępie czasowym. Dawka każdej immunizacji dla odpowiedniej grupy myszy wynosiła: Dawka antygenu: 1 g liofilizatu zawiera: MLC - 10 μg antygenu MKC -12 μg antygenu I immunizacja. Myszom podawano po 100 ng antygenu, czyli po 10 mg liofilizatu zawieszanego w 200 μl buforu PBS - MLC. Myszom podawano po 100 ng antygenu, czyli po 8,3 mg liofilizatu zawieszanego w 200 μl buforu PBS - MKC. Po podaniu antygenu myszom odstawiono karmę na 20 godzin. 1. Pobieranie materiału od zwierząt. Pobieranie krwi odbywa się ze splotu pozagałkowego przy użyciu tubki kapilarnej w ilości 150 μl przed rozpoczęciem doświadczenia, 2 i 4 tygodnie po I immunizacji oraz 2 i 4 tygodnie po II immunizacji. Pobieranie kału odbywa się w tym samym czasie, co pobieranie krwi. 2. Przygotowanie materiału do analizy. KREW: a) bezpośrednio po pobraniu odwirowano w Eppendorfach, 4 C, 3 rpm, 20 min. b) odseparowaną surowicę przechowywano w -20 C do czasu wykonania analiz KAŁ: a) pobrany materiał rozcierano w buforze PBS w stosunku 1:5 tłuczkiem polipropylenowym b) odwirowano 10 min, 4 C, 12 rpm. c) supernatant oddzielano i magazynowano w - 20 C do dalszych analiz. 3. Analiza immunologiczna. Zebrane próbki po odmrożeniu są wykorzystane do przeprowadzenia testów za pomocą wysokoczułej metody ELISA. a) Opłaszczono płytkę polisorp (Nunc) antygenem K+C (domena katalityczna z białkiem c wirusa HBV) lub L+C (domena liderowa z białkiem c wirusa HBV) w stężeniu 1 μg/ml w buforze PBS w ilości 50 μl/dołek b) Inkubowano płytkę w 4 C przez noc. c) Trzykrotnie odpłukano buforem fosforanowym (PBS) z dodatkiem Tween (0,05%), ph 7,4. d) Blokowano 5% odtłuszczonym mlekiem rozpuszczonym w buforze PBS, 30 min w temperaturze pokojowej, 380 μl/dołek e) odpłukano jak w ptk.c. f) Nałożono próbki surowicy w odpowiednich, gradientowych rozcieńczeniach po 40 μl/dołek g) Inkubowano 2 godziny w temperaturze pokojowej, h) Odpłukano jak w ptk.c i) Inkubowano z przeciwciałami anty mysie IgG i IgA skoniugowanymi z alkaliczną fosfatazą w ilości 100 μl/dołek. Rozcieńczenie przeciwciał 1:2 tys., czas inkubacji 1 godzina w 37 C. j) Odpłukano jak w ptk.c k) Inkubowano z substratem do alkalicznej fosfatazy, 100 μl/dołek, 30 min w ciemności. l) Zatrzymano reakcję 1N kwasem siarkowym m) Odczytano reakcję w czytniku firmy BioRad, model 550. Długość fali λ 405 nm.

12 12 PL B1 Zastrzeżenia patentowe 1. Białko chimeryczne, znamienne tym, że zawiera sekwencję aminokwasową pochodzącą z sekwencji proteinazy cysternowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją aminokwasową wybraną spośród sekwencji białka rdzeniowego HBc (hepatitis B core) albo sekwencji ubikwityny. 2. Białko według zastrz. 1, znamienne tym, że zawiera jedną z następujących sekwencji: - sekwencję domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej - połączoną z sekwencją białka rdzeniowego HBc, - sekwencję domeny liderowej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej - połączoną z sekwencją białka rdzeniowego HBc, - sekwencję domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej - połączoną z sekwencją białka rdzeniowego HBc oraz resztami glicynowymi, - tworzącymi strukturę mostka glicynowego albo - sekwencję domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej - połączoną z sekwencją ubikwityny. 3. Sekwencja kodująca białko chimeryczne, znamienna tym, że zawiera sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową pochodzącą z sekwencji proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową wybraną spośród sekwencji białka rdzeniowego HBc albo sekwencji ubikwityny. 4. Sekwencja według zastrz. 3, znamienna tym, że zawiera jedną z następujących sekwencji: cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc, - sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową domeny literowej proteinazy cysternowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc, cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc oraz reszty glicynowe, albo cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją nukleotydową kodującą ubikwitynę. 5. Sekwencja według zastrz. 3, znamienna tym, że została wybrana spośród sekwencji przedstawionych na fig. 1 - fig Konstrukt zawierający sekwencję kodującą białko chimeryczne, znamienny tym, że jako sekwencję kodującą białko chimeryczne zawiera sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową pochodzącą z sekwencji proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą sekwencję aminokwasową wybraną spośród sekwencji białka rdzeniowego HBc albo sekwencji ubikwityny. 7. Konstrukt według zastrz. 6, znamienny tym, że jako sekwencję kodującą białko chimeryczne zawiera jedną z następujących sekwencji: cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc, - sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową domeny liderowej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc, cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc oraz reszty glicynowe, albo cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją nukleotydową kodującą ubikwitynę. 8. Komórka roślinna, znamienna tym, że zawiera konstrukt zawierający sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową pochodzącą z sekwencji proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową wybraną spośród sekwencji białka rdzeniowego HBc albo sekwencji ubikwityny. 9. Komórka według zastrz. 8, znamienna tym, że zawiera konstrukt zawierający jedną z następujących sekwencji: cysternowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc,

13 PL B sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową domeny literowej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc, cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc oraz reszty glicynowe, albo cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją nukleotydową kodującą ubikwitynę. 10. Sposób otrzymywania białka chimerycznego, znamienny tym, że obejmuje wprowadzenie wektora do komórek Agrobacterium tumefaciens metodą elektroporacji, transformację roślin szczepem bakteryjnym zawierającym ten wektor i ekspresję białka chimerycznego, przy czym wektor zawiera konstrukt zawierający sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową pochodzącą z sekwencji proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową wybraną spośród sekwencji białka rdzeniowego HBc albo sekwencji ubikwityny. 11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że obejmuje wprowadzanie konstruktu zawierającego jedną z następujących sekwencji: cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc, - sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową domeny liderowej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc, cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc oraz reszty glicynowe, albo cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją nukleotydową kodującą ubikwitynę. 12. Sposób otrzymywania transgenicznej rośliny, znamienny tym, że obejmuje wprowadzanie wektora do komórek Agrobacterium tumefaciens metodą elektroporacji, transformację roślin szczepem bakteryjnym zawierającym ten wektor, i regenerację roślin, przy czym wektor zawiera konstrukt obejmujący sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową pochodzącą z sekwencji proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową wybraną spośród sekwencji białka rdzeniowego HBc albo sekwencji ubikwityny. 13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że obejmuje wprowadzanie konstruktu zawierającego jedną z następujących sekwencji: cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc, - sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową domeny literowej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc, cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc oraz reszty glicynowe, albo cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją nukleotydową kodującą ubikwitynę. 14. Transgeniczna roślina, znamienna tym, że posiada komórki transformowane konstruktem zawierającym sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową pochodzącą z sekwencji proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową wybraną spośród sekwencji białka rdzeniowego HBc albo sekwencji ubikwityny. 15. Transgeniczna roślina według zastrz. 14, znamienna tym, że posiada komórki transformowane konstruktem zawierającym jedną z następujących sekwencji: cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc, - sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową domeny literowej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc, cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc oraz reszty glicynowe, albo

14 14 PL B1 cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją nukleotydową kodującą ubikwitynę. Rysunki

15 PL B1 15

16 16 PL B1

17 PL B1 17

18 18 PL B1

19 PL B1 19

20 20 PL B1